CN113528625A - 一种微流控核酸检测方法及应用 - Google Patents

一种微流控核酸检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种微流控核酸检测方法，所述方法包括使用碟式微流控芯片进行核酸检测；其中，所述碟式微流控芯片的反应单元中包括一个或多个加样池、微通道、压力平衡通道和反应池，所述加样池的样品在芯片转动过程中在离心力作用下经过微通道到达反应池进行反应。本发明可以在完成加样后，由仪器自动化完成包括核酸提取，扩增，检测等步骤在内的全流程核酸检测。本发明可兼容环介导等温扩增(LAMP)，重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等多种不同核酸扩增方法。本发明可以在90分钟内对21样本进行同时检测，检测灵敏度达到0.5拷贝/微升，可以用于乡村，社区等不具备大型核酸检测设备地区的快速病原体感染筛查。

Description

一种微流控核酸检测方法及应用
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体涉及一种微流控核酸检测方法及应用。
背景技术
微流控技术，是指在尺寸为微米级别的管道内操纵微量液体的技术。由于流体在微尺度下的独特流体性质，比如层流、液滴等，微流控技术可以实现宏观尺度下难以实现的操作。微流控芯片，又称芯片实验室或者微全分析系统，是指将分析检测所需的采样、稀释、反应、分离、检测等操作单元集成在同一个微芯片上完成。与传统检测模式相比，微流控芯片具有液体流动可控，试样消耗量少，分析速度快等诸多优点，并已成为流体物理，材料学，化学，生物学，医学等多学科交叉的新型热点研究领域。
核酸是生物体的遗传物质，在生物体的遗传、变异和蛋白质合成中具有十分重要的意义。核酸检测是指以生物特异性核酸为检测对象的分析检测过程，主要包括核酸提取、扩增和检测等步骤。目前最常用的核酸提取方式为磁珠法。但磁珠法需要裂解，结合，洗涤，洗脱等步骤，操作复杂。聚合酶链式扩增法是最常用的扩增手段，但聚合酶扩增方法涉及变性、复性、扩增三种不同温度，对设备的温度控制要求更高。近年来，等温核酸扩增技术，如环介导等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(RPA)等，受到了越来越多的关注。和免疫检测相比，核酸检测不需要相应的免疫应答时间，可以缩短检测窗口期，并且特异性强，灵敏度高。核酸检测已经被广泛应用于病原体检测，癌症诊疗等方面。然而，常规的核酸检测通常需要复杂操作，并依赖大型设备和专业技术人员。这种检测模式局限了其应用领域，尤其不适合远离传统实验室的现场快速检测。
微流控核酸检测将核酸检测和微流控技术结合起来，可以实现微型化快速核酸检测。目前已有一些商用化的微流控核酸检测平台。然而这些检测装置仍然面临着设备复杂，成本高等问题，且很多设备只进行了核酸扩增和检测流程，并未集成核酸提取步骤，需要提前将样本裂解后加入装置进行扩增，未能实现真正的集成式自动化核酸检测。现有技术虽然可以用于核酸提取、扩增和检测，但仍然需要手动对反应液体进行操控，自动化，集成化程度低。并且现有技术通量低。现有技术只集成了核酸扩增和检测，并未集成核酸提取功能，检测时需要先进性核酸提取，使用时步骤较为繁琐。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种微流控核酸检测方法和应用。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种微流控核酸检测方法，所述方法包括使用碟式微流控芯片进行核酸检测；
其中，所述碟式微流控芯片的反应单元中包括一个或多个加样池、微通道、压力平衡通道和反应池，所述加样池的样品在芯片转动过程中在离心力作用下经过微通道到达反应池进行反应。
根据本发明第一方面的方法，其中，所述检测方法包括以下步骤：
(1)将样本分别加入碟式微流控芯片的加样池内，并将加样池封闭；
(2)将仪器进样针内分别加入核酸释放剂和核酸扩增剂；
(3)将碟式微流控芯片置入全自动核酸检测仪中；
(4)启动核酸检测仪，仪器自动完成后续核酸提取和扩增过程；
(5)在扩增的过程中，仪器实时获取图像信息，并计算反应的荧光值。反应结束后，仪器输出结果。
根据本发明第一方面的方法，其中，步骤(1)中，所述样本的加入量为1～50微升，优选为1～20微升，更优选为1～10微升。
根据本发明第一方面的方法，其中，步骤(2)中，所述核酸释放剂的加入量为1～50微升，优选为1～20微升，更优选为1～10微升；和/或
所述核酸扩增剂的加入量为10～100微升，优选为10～50微升，更优选为10～25微升。
根据本发明第一方面的方法，其中，所述步骤(4)包括以下步骤：
(A)向加样池加入核酸释放剂，转动微流控芯片，将核酸释放剂与样本转移至反应池并混合；
(B)室温反应以完成核酸释放；
(C)向加样池添加核酸扩增剂，转动微流控芯片，将核酸扩增试剂转移至反应池并与样本混合；
(D)完成核酸扩增过程。
优选地，步骤(A)中，所述碟式微流控芯片的转动速度为100～10000转每分钟，优选为2000～8000转每分钟，更优选为3000～5000转每分钟；和/或
所述碟式微流控芯片的转动时间为1～60秒，优选为5～30秒，更优选为5～20秒。
优选地，步骤(B)中，所述反应时间为5～60分钟，优选为5～30分钟，更优选为5～20分钟。
优选地，步骤(C)中，所述碟式微流控芯片的转动速度为100～10000转每分钟，优选为2000～8000转每分钟，更优选为3000～5000转每分钟；和/或
所述碟式微流控芯片的转动时间为1～60秒，优选为5～30秒，更优选为5～20秒。
优选地，步骤(D)中，所述核酸扩增过程反应温度为60～67摄氏度；和/或
所述核酸扩增过程反应时间为50～90分钟。
本发明的第二方面提供了一种病原体感染筛查方法，所述方法包括第一方面所述的微流控核酸检测方法。
本发明可以在进样后由仪器实现包括核酸提取，扩增和检测在内的全流程自动化检测，并且通量高，最多可以实现21样本同时检测。
本发明在将样本加入微流控芯片后，可以由仪器自动化完成包括核酸提取、扩增和检测在内的全流程核酸检测，自动化，集成化程度高，方便使用。
本发明提供了一种自动化高通量微流控核酸检测方法。本发明可以在完成加样后，由仪器自动化完成包括核酸提取，扩增，检测等步骤在内的全流程核酸检测。本发明可兼容环介导等温扩增(LAMP)，重组酶聚合酶扩增技术(RPA)，聚合酶链式扩增(PCR)等多种不同核酸扩增方法。本发明可以在90分钟内对21样本进行同时检测，检测灵敏度达到0.5拷贝/微升，可以用于乡村，社区等不具备大型核酸检测设备地区的快速病原体感染筛查。
本发明适用于多种场合下的病原体核酸检测，尤其适合乡村、社区等缺乏大型核酸检测设备地区的快速病原体感染筛查。本发明操作简单，集成度高，在完成进样之后便可以实现包括核酸提取、扩增、检测在内的全流程自动化检测，并且可以实现二十一样本同时检测，对于不具备大型核酸检测设备和专业技术人员的地区具有很广泛的应用前景。
相比于现有技术中实验时需要依次加入各核酸检测试剂进行检测，本方法除了离心力实现样本分配外，还集成了试剂加注过程。本发明方法无需任何检测试剂预装，由微流控检测装置自动化完成除了样本加入外的全部试剂加注和核酸检测过程，集成化程度进一步提高，操作得到了最大程度的简化。在实际核酸检测过程中，涉及到如下过程：样本引入、检测试剂引入、样本与检测试剂转移并混合。现有技术多采用均通过手动引入样本与检测试剂或预装检测试剂的方法。本发明装置创造性地设置了检测试剂加注系统，样本通过手动引入，检测试剂通过检测装置自动加注，然后样本与试剂通过离心力作用混合。检测过程中检测试剂加注也是一个很重要的内容，为此本发明人特意设计了适配于我方微流控芯片的加样装置，并在微流控芯片上设置了两个加样孔，加样孔一用于手动引入样本，并用胶塞密闭；加样孔二用于自动引入检测试剂，这样一方面保证各检测单元进样量的一致性和准确性，另一方面最大限度的减少手动操作，使得检测过程更简便。另外，本发明中使用了硅胶层进行密封，硅胶层可以在进样针完成刺穿进样后仍然保证检测单元的密闭性，从而可以实现试剂多次添加的同时保证体系的密闭。
本发明的检测方法可以具有但不限于以下有益效果：
本发明提供了一种自动化高通量微流控核酸检测方法。本发明可以在完成加样后，由仪器自动化完成包括核酸提取，扩增，检测等步骤在内的全流程核酸检测。本发明可兼容环介导等温扩增(LAMP)，重组酶聚合酶扩增技术(RPA)，聚合酶链式扩增(PCR)等多种不同核酸扩增方法。本发明可以在90分钟内对21样本进行同时检测，检测灵敏度达到0.5拷贝/微升，可以用于乡村，社区等不具备大型核酸检测设备地区的快速病原体感染筛查。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了本发明核酸检测流程示意图。
图2示出了本发明核酸检测微流控芯片的结构图。
图3示出了本发明实施例2中的一次检测结果。
附图标记说明：
1、硅胶层；2、胶塞；3、固定孔；4、胶塞密封圈；5密封层；6、通道层；7、密封孔；8、加样孔一；9、加样孔二；10、反应池；11、加样池一；12、加样池二；13、微通道；14、压力平衡通道。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
实施例1
本实施例用于说明本发明的核酸检测方法。
本发明采用碟式微流控芯片进行核酸检测。本发明的核酸检测方法包括以下步骤：
1.将样本分别加入核酸检测芯片的加样池内，并将加样池利用胶塞封闭。
2.将仪器进样针内分别加入核酸释放剂和核酸扩增剂。
3.将微流控核酸芯片置入全自动核酸检测仪中。
4.启动核酸检测仪，仪器自动完成后续核酸提取和扩增过程。，具体包括向加样孔加入核酸释放剂1-10微升；3000-5000转每分转速转动微流控芯片5-20秒，将核酸释放剂与样本转移至反应池并混合；室温反应5-20分钟以完成核酸释放；向加样孔添加10-25微升LAMP扩增试剂；以3000-5000转每分速度转动微流控芯片5-20秒，将核酸扩增试剂转移至反应池并与样本混合；在60-67摄氏度下反应50-90分钟以完成核酸扩增。
5.反应结束，仪器自动获取最终的荧光照片，并将结果输出。
本发明微流控核酸检测装置包括微流控芯片、控制系统、试剂加注系统、温控系统、运动系统、荧光检测系统等。
如图2所示，本发明装置的微流控芯片为碟式微流控芯片，本发明的微流控芯片具有三层结构：底层通道层6、中间层密封层5、顶层硅胶层1。
其中：
底层通道层6包含微通道结构，用于承载反应溶液和控制流体流动.
中间层密封层5中的加样孔一8、加样孔二9用于溶液的加注。
顶层硅胶层1用于密封加样孔二9。由于硅胶较软且具有一定弹性，可使用包括加样针穿透硅胶层进行自动加样在内方法完成加样，而仍可实现对加样孔的密封。顶层硅胶层附带有胶塞2和胶塞密封圈4。其中，加样孔一8对应于胶塞密封圈4上的密封孔7并在加样后通过胶塞2密封。
该微流控芯片的底层通道层6由多个反应单元组成，本实施例中提供的微流控芯片包括21个反应单元，可供21个样品的同步分析。每个反应单元中具有加样池一11、加样池二12、微通道13、压力平衡通道14以及反应池9。本实施例中，加样池为圆形结构，两端分别由微通道13和压力平衡通道12与反应池9的顶端两处不同位置连接。加样池二12顶端连接压力平衡通道14，保证了所加入的样品在离心力作用下，只能通过加样池底端微通道13进入反应池。反应池9的容积大于加样池的容积，保证了实现多步检测、多步反应的可能性。
样品加入加样池一11，并利用胶塞2将加样池一11封闭，用以防止样品泄漏以及环境对样品、样品间的污染。在芯片转动产生过程中，位于加样池的样品在惯性的作用下到达反应池10。由于整个单元在硅胶层1贴合后处于密封状态，压力平衡通道14的存在可以消除反应池10内的气体压力，保证样品顺利进入。
在一个优选方案中，在每个单元中，压力平衡通道14、微通道13的深度为500μm，加样池一11、加样池二12、反应池10的深度为1000μm。
实施例2
本实施例用于说明本发明的核酸检测方法
1.利用移液枪将待测假病毒样本，本实施例中采用SARS-CoV-2假病毒样本溶液，加入加样池一，体积为4微升，浓度分别为0拷贝/微升，0.5拷贝/微升，1拷贝/微升，10拷贝/微升，100拷贝/微升，1000拷贝/微升，10000拷贝/微升。利用胶塞将加样池封闭。
2.将仪器进样针内分别加入核酸释放剂和核酸扩增剂，本实施例采用核酸释放剂购自圣湘公司，扩增剂为LAMP核酸扩增试剂。
3.将微流控核酸芯片置入全自动核酸检测仪中。
4.启动核酸检测仪，仪器自动完成后续核酸提取和扩增过程，具体包括向加样池二加入核酸释放剂4微升；4000转每分转速转动微流控芯片10秒，将核酸释放剂与样本转移至反应池并混合；室温反应10分钟以完成核酸释放；向加样池二添加17微升LAMP扩增试剂；以4000转每分速度转动微流控芯片10秒，将核酸扩增试剂转移至反应池并与样本混合；在65摄氏度下反应80分钟以完成核酸扩增。
5.在扩增的过程中，仪器实时获取图像信息，并计算反应的荧光值。反应结束后，仪器输出结果。
从结果中可以看出，各浓度阳性样本均产生扩增信号，表明待测样本被检出。阴性对照(0拷贝/微升)样本未产生扩增信号。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种微流控核酸检测方法，其特征在于，所述方法包括使用包括试剂加注系统和碟式微流控芯片的核酸检测装置进行核酸检测；
其中，所述碟式微流控芯片的反应单元中包括两个或两个以上加样池、微通道、压力平衡通道和反应池，所述加样池的样品在芯片转动过程中在离心力作用下经过微通道到达反应池进行反应；其中一个加样池中预装入待测样品，核酸释放剂和核酸扩增剂在检测过程中通过试剂加注系统分别加入其它加样池中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)将样本分别加入碟式微流控芯片的加样池内，并将加样池封闭；
(2)将试剂加注系统的进样针内分别加入核酸释放剂和核酸扩增剂；
(3)将碟式微流控芯片置入全自动核酸检测仪中；
(4)启动核酸检测仪，仪器自动完成后续核酸提取和扩增过程；
(5)在扩增的过程中，仪器实时获取图像信息，并计算反应的荧光值。反应结束后，仪器输出结果。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述样本的加入量为1～50微升，优选为1～20微升，更优选为1～10微升。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述核酸释放剂的加入量为1～50微升，优选为1～20微升，更优选为1～10微升；和/或
所述核酸扩增剂的加入量为10～100微升，优选为10～50微升，更优选为10～25微升。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)包括以下步骤：
(A)向加样池加入核酸释放剂，转动微流控芯片，将核酸释放剂与样本转移至反应池并混合；
(B)室温反应以完成核酸释放；
(C)向加样池添加核酸扩增剂，转动微流控芯片，将核酸扩增试剂转移至反应池并与样本混合；
(D)完成核酸扩增过程。
6.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于，步骤(A)中，所述碟式微流控芯片的转动速度为100～10000转每分钟，优选为2000～8000转每分钟，更优选为3000～5000转每分钟；和/或
所述碟式微流控芯片的转动时间为1～60秒，优选为5～30秒，更优选为5～20秒。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(B)中，所述反应时间为5～60分钟，优选为5～30分钟，更优选为5～20分钟。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的核酸检测方法，其特征在于，步骤(C)中，所述碟式微流控芯片的转动速度为100～10000转每分钟，优选为2000～8000转每分钟，更优选为3000～5000转每分钟；和/或
所述碟式微流控芯片的转动时间为1～60秒，优选为5～30秒，更优选为5～20秒。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的核酸检测方法，其特征在于，步骤(D)中，所述核酸扩增过程反应温度为60～67摄氏度；和/或
所述核酸扩增过程反应时间为50～90分钟。
10.一种病原体感染筛查方法，其特征在于，所述方法包括如权利要求1～9中任一项所述的微流控核酸检测方法。
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