JP4453090B2 - 生体試料反応用チップおよび生体試料反応方法 - Google Patents

Description

本発明は、核酸増幅などの生体試料反応を行うための、生体試料反応用チップおよび生体試料反応方法に関するものである。

ガラス基板等に微細流路が設けられたマイクロ流体チップを使用して、化学分析や化学合成、あるいはバイオ関連の分析などを行う方法が注目されている。マイクロ流体チップは、マイクロTotal Analytical System (マイクロＴＡＳ)や、Lab-on-a-chip等とも呼ばれ、従来の装置に比較して試料や試薬の必要量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ないなどのメリットがあり、医療診断、環境や食品のオンサイト分析、医薬品や化学品などの生産等、広い分野での利用が期待されている。試薬の量が少なくてよいことから、検査のコストを下げることが可能となり、また、試料および試薬の量が少ないことにより、反応時間も大幅に短縮されて検査の効率化が図れる。特に、医療診断に使用する場合には、試料となる血液など検体を少なくすることができるため、患者の負担を軽減できるというメリットもある。

試薬や試料として用いるＤＮＡやＲＮＡなどの遺伝子を増幅する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法がよく知られている。ＰＣＲ法は、ターゲットのＤＮＡと試薬を混合したものをチューブに入れて、サーマルサイクラーという温度制御装置で、５５℃、７２℃、９４℃の３段階の温度変化を数分の周期で繰り返し反応させるもので、ポリメラーゼという酵素の作用により温度サイクル１回あたり、約２倍にターゲットＤＮＡだけを増幅することができる。

近年、特殊な蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲという方法が実用化され、増幅反応を行いながらＤＮＡの定量ができるようになった。リアルタイムＰＣＲは、測定の感度、信頼性が高いことから、研究用、臨床検査用に広く使われている。

しかし、従来の装置では、ＰＣＲに必要な反応液の量は数十μｌが標準的であり、また、１つの反応系では基本的に１つの遺伝子の測定しかできないという問題があった。蛍光プローブを複数入れてその色で区別することにより４種類程度の遺伝子を同時に測定する方法もあるが、それ以上の遺伝子を同時に測定するためには反応系の数を増やすしかなかった。検体から抽出されるＤＮＡの量は一般に少量であり、また試薬も高価なため同時に多数の反応系を測定することは困難であった。

特許文献１には、半導体基板上に集積化されたマイクロウェルを作製して、当該ウェルの中でＰＣＲを行うことにより、微量のサンプルで、多数のＤＮＡ試料を一度に増幅して解析を行う方法が開示されている。
特開２０００−２３６８７６号公報

しかし、特許文献１には、ウェル内に微量のサンプルを導入する具体的な方法については示されていない。実際、１μｌ以下の微量な反応液を定量して反応容器に効率よく供給することは従来困難であった。

本発明の目的は、少ない反応液を簡易な方法で反応容器に供給し、効率よく反応処理を行うことが可能な、生体試料反応用チップおよび生体試料反応方法を得ることである。

本発明に係る生体試料反応用チップは、複数の反応容器と、各々の前記反応容器の一端と接続され、反応液を導入する開口部を備えた第１の流路と、各々の前記反応容器の他方の端部と接続された第２の流路と、を備え、前記第１の流路の毛管力をＡ、前記第１の流路と前記反応容器の接続部分の毛管力をＢ、前記反応容器の毛管力をＣ、前記反応容器と前記第２の流路の接続部分の毛管力をＤ、前記第２の流路の毛管力をＥ、とすると、Ａ＜Ｂ＜Ｃ＜ＤかつＥ＜Ｄであることを特徴とする。

本発明によれば、反応容器内に、毛管力により反応液を充填することができるので、ピペットで定量することが難しい非常に少量の反応液を、所定量反応容器内に供給することができる。このように、少ない反応液を簡易な方法で反応容器に供給し、効率よく反応処理を行うことが可能となる。また、反応液の量が少量でよいため、コストを下げることが可能となり、また、反応時間も大幅に短縮されて処理の効率化が図れる。また、一度に多数の反応容器内で処理を行うことができるため、多数のサンプルを用いた検査等を少ない試薬の量で効率よく行うことができる。

また、各々の前記反応容器には、反応に必要な試薬を塗布しておくことができる。
これにより、使用者は、反応液を充填するだけで簡易に検査等を行うことができる。

本発明に係る生体試料反応方法は、上記の生体試料反応用チップを用いた生体試料反応方法であって、前記第１の流路内に前記開口部から前記反応液を供給し、前記反応容器に前記反応液を充填する工程と、前記第１の流路および前記第２の流路に、前記反応液と混和せず前記反応液よりも蒸発しにくい液体を充填する工程と、生体試料反応処理を実行する工程とを備えたものである。

本発明によれば、反応容器内に、毛管力により反応液を充填することができるので、ピペットで定量することが難しい非常に少量の反応液を、所定量反応容器内に供給することができる。このように、少ない反応液を簡易な方法で反応容器に供給し、効率よく反応処理を行うことが可能となる。また、反応液の量が少量でよいため、コストを下げることが可能となり、また、反応時間も大幅に短縮されて処理の効率化が図れる。また、一度に多数の反応容器内で処理を行うことができるため、多数のサンプルを用いた検査等を少ない試薬の量で効率よく行うことができる。

さらに、第１の流路および第２の流路に、反応液と混和せず反応液よりも蒸発しにくい液体を充填するようにしたので、各々の反応容器を分離して、反応容器間でのコンタミネーションを防止することができる。また、反応処理中に、反応液が蒸発するのを防止することもできる。

また、前記生体試料反応処理は核酸増幅を含む処理であり、前記反応液には、ターゲット核酸、核酸を増幅するための酵素、及びヌクレオチドが所定の濃度で含まれており、前記反応容器には、予めプライマーが塗布されていることとすることができる。
また、リアルタイムＰＣＲ処理を行う場合には、反応装置内に予め蛍光プローブを塗布しておいてもよい。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１によるマイクロリアクターアレイ（生体試料反応用チップ）１０の概略構成を示す上面図、図１（Ｂ）は、マイクロリアクターアレイ１０を図１（Ａ）に示すＢ方向から見た正面図、図１（Ｃ）は、図１（Ａ）のＣ−Ｃ断面図である。図に示すように、核酸検出装置１０は、透明基板１０１，１０２、反応液導入用流路（第１の流路）１０３、排気用流路（第２の流路）１０４、反応容器１０５、開口部１０６〜１０９を備えている。

図１に示すように、マイクロリアクターアレイ１０は、透明基板１０１，１０２を貼り合わせて構成されている。透明基板１０１には、反応液導入用流路１０３、排気用流路１０４、及び開口部１０６〜１０９が形成されている。開口部１０６，１０７は、それぞれ反応液導入用流路１０３の端部と接続されている。図１に示すように、反応液導入用流路１０３及び排気用流路１０４は、幅５００μｍ、深さ５００μｍに形成されている。

透明基板１０２には、複数の反応容器１０５が形成されている。反応容器１０５は、５００μｍ×７５０μｍ、深さ１００μｍに形成されている。反応容器１０５は反応液導入用流路１０３及び排気用流路１０４と連通するように形成されている。隣り合う反応容器１０５間の距離は、反応容器１０５間での反応液の混合を防止できるように十分に確保されている。

透明基板１０１，１０２は例えばガラス基板とすることができ、その場合には、反応液導入用流路１０３、排気用流路１０４、及び開口部１０６〜１０９及び反応容器１０５はエッチングやサンドブラスト法によって形成することができる。

なお、反応容器１０５の内壁面は親液性に、反応液導入用流路１０３及び排気用流路１０４の内壁面は撥液性となるように表面処理を施しておくことが望ましい。また、反応液導入用流路１０３及び反応容器１０５の内壁面にはタンパク質などの生体分子の非特異吸着を抑制する表面処理が施されていることが望ましい。

図２は、マイクロリアクターアレイ１０の各部の大小関係を説明する模式図である。図２は図１（Ａ）のＣ−Ｃ断面を示している。図に示すように、反応液導入用流路１０３の幅をａ、反応液導入用流路１０３と反応容器１０５の接続部分の幅をｂ、反応容器１０５の深さをｃ、反応容器１０５と排気用流路１０４の接続部分の幅をｄ、排気用流路１０４の幅をｅ、とすると、以下の関係が成り立つ。
ａ＞ｂ＞ｃ＞ｄ
ｅ＞ｄ

一般に、液体が微細な流路内に進入する際には、以下の式で表される毛管力Ｐが作用する。
Ｐ＝（ｌγcosθ）／Ｓ
ここで、ｌは流路の流れに垂直な断面の周長、Ｓはその面積、γは表面張力、θは接触角、である。ここでは、γ、θは一定、ａ〜ｅ以外の流路の幅は５００μｍで一定であるので、反応液導入用流路１０３の毛管力をＡ、反応液導入用流路１０３と反応容器１０５の接続部分の毛管力をＢ、反応容器１０５の毛管力をＣ、反応容器１０５と排気用流路１０４の接続部分の毛管力をＤ、排気用流路１０４の毛管力をＥ、とすると、以下の関係が成り立つ。
Ａ＜Ｂ＜Ｃ＜Ｄ
Ｅ＜Ｄ

図３を用いて、マイクロリアクターアレイ１０に反応液を供給する方法を説明する。反応液には、ターゲット核酸、ポリメラーゼ、及びヌクレオチド（ｄＮＴＰ）が反応に適した所定の濃度で含まれている。
ターゲット核酸は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルから抽出したＤＮＡ、または抽出したＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡなどを用いることができる。
プライマーは反応液に含まれていてもよいが、本実施例のマイクロリアクターアレイでは、各反応容器１０５内に、予め塗付され乾燥状態で収容されている。それぞれの反応容器１０５には、異なるプライマーが塗付されており、同時に多数のＰＣＲが行えるようになっている。

まず、図３（Ａ）に示すように、開口部１０６から、ピペットやシリンジポンプ等を用いて反応液導入用流路１０３に反応液を供給すると、反応液は毛管力によって反応液導入用流路１０３を充填しながら進む。さらに、図３（Ｂ）に示すように、反応液が反応容器１０５との接続部分に達すると、反応液は毛管力により反応容器１０５内に浸入する。上述したように、反応液導入用流路１０３の幅ａ、反応液導入用流路１０３と反応容器１０５の接続部分の幅ｂ、反応容器１０５の深さｃの間には、ａ＞ｂ＞ｃの関係がある。このため、毛管力は、反応液導入用流路１０３内、接続部分、反応容器１０５内の順に大きくなるため、反応液は毛管力によって反応容器１０５内に進行し、反応容器１０５を充填する。

さらに、反応容器１０５内に浸入した反応液は、反応容器１０５と排気用流路１０４との接続部分で進行を停止する。これは、反応容器１０５と排気用流路１０４の接続部分の幅ｄ、排気用流路１０４の幅ｅの間には、ｅ＞ｄの関係があるため、毛管力は、排気用流路１０４内の方が接続部分よりも小さく、従って反応液は毛管力によって反応容器１０５から排気用流路１０４へ進行することができないからである。

以上のように、毛管力により、全ての反応容器１０５を反応液で満たすことができる。反応容器１０５の容積は約０．０４μｌであり、充填された反応液の量も約０．０４μｌとなる。これは従来のＰＣＲにおける反応液の一般的な量の例である２０μｌと比べると非常に少ない。従来、反応液の定量にはピペットを用いていたが、０．０４μｌほどの微量の反応液をピペットで定量することは難しい。しかし、本実施形態によれば、ごく微量の反応液を正確に反応容器１０５に導入することができる。

続いて、図３（Ｃ）に示すように、開口部１０６からピペットまたはシリンジポンプを用いて反応液導入用流路１０３にミネラルオイルを注入する。この時、反応液導入用流路１０３内に反応液が残っている場合には、開口部１０７から排出される。一方、反応容器１０５内の反応液は排気用流路１０４へ排出されず、ミネラルオイルが反応容器１０５との接続部分に達しても反応容器１０５内には侵入しない。なお、ミネラルオイルを反応液導入用流路１０３に充填する間は排気用流路１０４の２つの開口部１０８，１０９はテープなどによって塞いでおくことが望ましい。

さらに、図３（Ｄ）に示すように、開口部１０８からピペットまたはシリンジポンプを用いて排気用流路１０４にミネラルオイルを注入し、充填する。なお、ミネラルオイルを排気用流路１０４に充填する間は反応液導入用流路１０３の２つの開口部１０６、１０７はテープなどによって塞いでおくことが望ましい。

このように、反応液導入用流路１０３と排気用流路１０４にミネラルオイルを充填することによって、個々の反応容器１０５を分離して、反応容器１０５間でのコンタミネーションを防止することができる。また、反応処理中に、反応容器１０５内が乾燥することを防止することもできる。なお、ミネラルオイルの代わりに反応液と混和せず反応液よりも蒸発しにくい液体であれば用いることができる。

以上のような手順でマイクロリアクターアレイ１０に反応液を供給したら、マイクロリアクターアレイ１０をサーマルサイクラーに設置しＰＣＲ処理を行う。一般的には、まず、９４℃で２本鎖ＤＮＡを解離させる工程を実行し、次に、プライマーを約５５℃でアニーリングする工程を実行し、次に耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用して約７２℃で相補鎖の複製を行う工程を含むサイクルを繰り返す。
次に、マイクロリアクターアレイ１０を用いた、リアルタイムＰＣＲの実施方法について説明する。
マイクロリアクターアレイ１０をリアルタイムＰＣＲ反応用の反応装置として用いる場合、反応容器１０５の内壁にはＰＣＲ反応に用いるプライマーと蛍光プローブが予め塗布されており、１サイクル毎にＣＣＤセンサ等を用いて蛍光強度を測定する。特定の蛍光強度に到達したサイクル数から、初期のターゲット核酸の量を算出測定する。なお、リアルタイムＰＣＲの実施方法は上記のものに限られない。例えば、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎのような二本鎖結合蛍光色素を用いる場合には、蛍光プローブは不要である。

以上のように、実施の形態１によれば、反応容器１０５内に、毛管力により反応溶液を充填することができるので、ピペットで定量することが難しい非常に少量の反応液でも、所定量反応容器１０５内に供給することができる。また、反応液の量が少量でよいため、コストを下げることが可能となる。また、反応液の量が少なくなると、熱容量が小さくなるので、ＰＣＲのサイクルタイムが短縮でき反応時間が短縮されて処理の効率化が図れる。また、一度に多数の反応容器１０５内で処理を行うことができるため、多数のサンプルを用いた検査等を少ない試薬の量で効率よく行うことができる。また、各々の反応装置１０５に、ターゲット核酸の増幅と定量に必要なプライマー及び蛍光プローブを塗布しておくことにより、使用者は、反応液を充填するだけで簡易にＰＣＲ処理を行うことができる。

また、反応液を反応容器１０５内に充填した後、反応液導入用流路１０３と排気用流路１０４にミネラルオイルを充填してからＰＣＲ処理を行うようにしたので、各々の反応容器１０５を分離して、反応容器間でのコンタミネーションを防止することができる。また、反応処理中に、反応容器１０５内の反応液が蒸発するのを防止することもできる。

なお、実施の形態１では、マイクロリアクターアレイ１０をリアルタイムＰＣＲ反応用の反応装置として用いたが、遺伝子や生体試料を用いた様々な反応に利用することができる。例えば、特定のタンパク質を特異的に捕捉（例えば、吸着、結合等）する抗原、抗体、レセプター、酵素等のタンパク質、ペプチド（オリゴペプチド）等を反応容器１０５内に塗布しておき、反応液からターゲットのタンパク質を検出する処理等に用いることもできる。

図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１によるマイクロリアクターアレイの概略構成を示す上面図、図１（Ｂ）は、マイクロリアクターアレイを図１（Ａ）に示すＢ方向から見た正面図、図１（Ｃ）は、図１（Ａ）のＣ−Ｃ断面図である。 実施の形態１によるマイクロリアクターアレイの各部の大小関係を説明する模式図である。 実施の形態１によるマイクロリアクターアレイに反応液を供給する方法を説明する図である。

符号の説明

１０ マイクロリアクターアレイ、１０１，１０２ 透明基板、１０３ 反応液導入用流路、１０４ 排気用流路、１０５ 反応容器、１０６〜１０９ 開口部

Claims (4)

1. 複数の反応容器と、
   各々の前記反応容器の一端と接続され、反応液を導入する開口部を備えた第１の流路と、
   各々の前記反応容器の他方の端部と接続された第２の流路と、を備え、
   前記第１の流路の毛管力をＡ、前記第１の流路と前記反応容器の接続部分の毛管力をＢ、前記反応容器の毛管力をＣ、前記反応容器と前記第２の流路の接続部分の毛管力をＤ、前記第２の流路の毛管力をＥ、とすると、
   Ａ＜Ｂ＜Ｃ＜ＤかつＥ＜Ｄ
   であることを特徴とする生体試料反応用チップ。
2. 各々の前記反応容器には、反応に必要な試薬が塗布されていることを特徴とする請求項１に記載の生体試料反応用チップ。
3. 請求項１または請求項２に記載の生体試料反応用チップを用いた生体試料反応方法であって、
   前記第１の流路内に前記開口部から前記反応液を供給し、前記反応容器に前記反応液を充填する工程と、
   前記第１の流路および前記第２の流路に、前記反応液と混和せず前記反応液よりも蒸発しにくい液体を充填する工程と、
   生体試料反応処理を実行する工程と、を備えた生体試料反応方法。
4. 前記生体試料反応処理は核酸増幅を含む処理であり、前記反応液には、ターゲット核酸、核酸を増幅するための酵素、及びヌクレオチドが所定の濃度で含まれており、
   前記反応容器には、予めプライマーが塗布されていることを特徴とする請求項３に記載の生体試料反応方法。

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