JP2011522219A - マイクロ流体チップ装置およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、マイクロ流体に関し、特に磁性マイクロビーズ上での複数の吸着および脱着工程を用いた1つまたは複数の結合パートナーによるPCR反応を含む結合アッセイを実施するためのマイクロ流体チップ装置に関する。開示するものとしてはまた、上記マイクロ流体チップ装置内で磁性マイクロビーズを操作する方法、ならびに上記マイクロ流体チップ装置の使用および磁性マイクロビーズ上で行われるマイクロスケールでの結合アッセイの感度および効果を増強するための磁性マイクロビーズの操作方法がある。
本発明の目的は、マイクロ流体チップ装置内で磁性マイクロビーズを操作することによりアッセイの性能および効果を改善することである。改善された効果および感度は、本発明のマイクロ流体マイクロチップ装置により達成され、当該チップ装置では、液体流中の気泡形成および磁性マイクロビーズのクラスター化は、液体流をまずマイクロ流体チャネルシステムの反応チャンバー内のマイクロ流体ピラーフィルタに通じさせ、その後に、チャネルシステム内で磁性マイクロビーズと接触させる液体流を別のマイクロ流体ピラーシステムを通じて運搬し、それにより、クラスター化磁性マイクロビーズを解離させるかまたは脱会合させることによって、防止される。マイクロ流体チップ装置の適用性は、いわゆるステアリングプレート上にステアリングロッドのための穴を設けた装置を提供することによってさらに高まり、そのステアリングロッドは、例えば液体接続部および電気ニードルと一緒になって、測定インターフェース上でのマイクロ流体チップ装置と外部装置との間でのさらなる電気的接触および液体接触の正確な嵌込みを容易にするものである。ステアリングプレートを有するマイクロ流体チップ装置および測定インターフェースはすべて、安定化底面、いわゆるドッキング・ステーション上に配置される。ステアリングプレート上のステアリングロッドとマイクロチップ装置上の穴は、外部装置とマイクロ流体チップ装置との間での電気的および/または流体的な連結の正確な嵌込みを容易にする。これは、マイクロ流体チップ装置が結合アッセイ、単離、濃縮、分離、検出、ならびにPCRおよび分析されるべき試料中に存在する余剰の検出可能な標識に起因するバックグラウンドの低減ならびに標的結合パートナーもしくは結合ペアを形成するその対応物の検出を行うための手段が完全に組み込まれて提供されない場合に、特に有用である。
磁性マイクロビーズと関連する生体学的固相支援結合アッセイ(biological solid phase assisted binding assay)を実施するためのマイクロ流体のオンチップ・システムを用いた場合、磁性マイクロビーズはクラスター化する傾向を示す。クラスター化は、試料中に存在する標的結合パートナーが磁性マイクロビーズ上に効率よく付着することを妨げ、また洗浄工程での効率的な洗浄も妨げる。本発明の1つの態様によれば、磁性マイクロビーズクラスターをマイクロ流体ピラーフィルタに通じさせることにより、磁性マイクロビーズクラスターを分離または脱会合させることができた。磁性マイクロビーズを操作することにより、その表面は開放され、マイクロ流体チャネルシステムの全体を通じて全方向から周囲溶液が接触でき、それによって、標的結合パートナーとその対応物との間の反応性が改善されて、固定化された結合ペアの形成が増加した。結合アッセイの感度が向上した。本発明の他の態様によれば、磁性マイクロビーズ上に固定化された結合ペアの向上した精製度および向上した未結合の反応物や溶液の除去もまた達成された。したがって、反応速度が加速され得ることで、結合アッセイの効率が改善され、より信頼性のある精度の高い結果を導くことができた。本発明の他の形態によれば、液体をマイクロ流体ピラーに通じて輸送した場合、気泡が壊された。これにより、気泡形成により結果が歪められるという問題は解決された。
図5Gは、直線状のCEチャネルおよびマイクロ流体チャネルシステムを有するシリコン層の上側の外観を図示するものであって、そこでの試料注入は圧力注入により行われるが、圧力注入と同時に電気的注入を用いることも可能である。反応チャンバー(202)から試料ループ(600)への圧力注入は、試料ループへの電気的注入と同時に行われてもよい。伝導度検出のための電気接触パッドまたは電極(505)ならびに薄膜電線(506)を示す。伝導度測定電極は、試料注入またはCEチャネルでの濃縮をモニタするために用いることができる。それは、圧力および/または電気的注入を同時に適用することで2本の平行な電極対間の試料濃縮を止めることが可能である。図中の試料注入ループ装置は、それぞれ4.1mm(23nl)および:6.3mm(35nl)であるが、マイクロ流体チップ装置のサイズに応じて変更可能である。ITP出力からCEチャネルの終わりまでの距離は、22.5mmである。試料注入ループは、中心間から100μmの位置でのダブルT分岐点に配置される。ダブルTからIPTまでの距離は好ましくは9.8mmであり、ITP出力からCEチャネルの終わりまでの距離は22.5mmであってよい。曲がりくねった形状のCEチャネルを有する試料注入ループは、その試料注入ループが4.1mmであっても、9.6mmであってもよい。ITP出力からCEチャネルの終わりまでの距離は例えば58mmであってよい。
本発明は、結合性物質、例えば核酸、タンパク質、抗体、抗原または酵素の効果および生物学的役割についての正確な評価を提供する。少量の多数の標的分析物を決定するための、および転写プロフィールを含むコンピュータで読み取り可能な定量的な結果を提供するための迅速かつ正確な方法は、医薬業界および製薬業界において有用である。ヒトおよび実験動物の遺伝子発現における既知の薬物および新規の薬物の効果は、容易に基準となり得るし、また医薬産業および診断産業ならびにホスピタルおよびヘルスセンターを含むヘルスケアにおける不可欠な知見を容易に提供する。主要な有用性は、ヘルスケア、処置モダリティー、医薬適応について有用な情報を、数値での正確な様式でコンピュータ処理され得るかまたは扱われ得る形式で提供することである。
(a) 複数の試料である可溶性の標的mRNA、好ましくはビオチンタグのごときアフィニティータグを有するポリ(T)プローブ、および検出可能な標識、好ましくは蛍光色素分子で標識され、標的mRNAと相補的な配列を有する複数の安定な一本鎖プローブ配列を含有する試料溶液を含む液体流であって、その相対的な量は決定されており、およびその複数のプローブ配列の各々は特有のサイズの大きさまたは質量を有する液体流を、2つの反応チャンバー(101、102)を有するマイクロ流体チャネルシステム(100)内に、注入口として働く連結部(201)を通じて導入し、液体流から気泡を取り除くためのマイクロ流体ピラーフィルタ(301)を通じ、続いて流体接続部(201、202、および203)をシールすることによって、磁性マイクロビーズ(401)と接触させる工程;
(b) 磁性マイクロビーズを少なくとも1つのマイクロ流体ピラーフィルタ(301または302)を通じて戻しおよび通過させて移動させ、磁性マイクロビーズ上に固定された標的mRNA−プローブ複合体を提供するのに好ましい条件下で十分な時間、固定反応およびハイブリダイゼーション反応を行わせる工程;
(c) 磁気ロッド(402)のスイッチを切り、液体流を液体接続部(202)から除去し、接続部(202)を閉じることにより、マイクロ流体ピラーフィルタ(302)上に固定(捕捉)された標的mRNA−プローブ複合体(ハイブリッド)を有する磁性マイクロビーズをトラップする工程;
(d) 磁気ロッド(402)のスイッチを入れ、磁性マイクロビーズを少なくとも1つのマイクロ流体ピラーフィルタ(301または302)を通じて戻しおよび通過させることにより、ハイブリダイゼーションに好都合な洗浄液を含む新しい液体流を導入することで、固定された標的mRNA−プローブ複合体を有する磁性マイクロビーズを精製する工程;
(e) 磁気ロッド(402)のスイッチを切り、液体流を液体接続部(202)を通じて取り除き、接続部(202)を閉じることにより、マイクロ流体ピラーフィルタの前後で、固定された標的mRNA−プローブ複合体を有する磁性マイクロビーズをトラップする工程;
(f) 二本鎖複合体を一本鎖にさせる変性溶液を含む新しい液体流を導入することによって、および磁気ロッド(402)のスイッチを入れ、磁気マイクロビーズを少なくとも1つのマイクロ流体ピラーフィルタ(301または302)を通じて戻しおよび通過させることにより、プローブを放出させるのに十分な時間変性させることで、磁性マイクロビーズ上に固定された標的mRNA−プローブ複合体からプローブを放出させる工程;
(g) 磁気ロッド(402)のスイッチを切ることで、固定された標的mRNAを有する磁性マイクロビーズをマイクロ流体ピラーフィルタ(302)にトラップし、任意の増幅および/または濃縮のために、プローブを含有する液体流をマイクロ流体チャネルの排水口に導き、その後、プローブを分離機に入れ、複数のプローブを互いから分離および区別し、各プローブの検出可能な標識(蛍光)の強度を視覚的に記録すること、およびソフトウェア関連の自動もしくは半自動の機器を用いることによって、試料溶液中に存在する標的mRNAの相対量に相当する視覚的に記録されたピーク(202)からプローブの量を計算する工程。
2.PCRキャビティからの同時の圧力注入/電気的注入。直線的なマイクロ流体チップ装置中にある注入ループまたは図5A〜5Iで示されるマイクロ流体チップ装置中のループ状のチャネルにおける平行の伝導度電極の間の濃縮試料。CE分離は試料注入後に行われる。
3.ゲル溶液インターフェースへの試料注入は、図5A〜5Iで示されるマイクロ流体チップ装置中の試料ループ(600)で行われる。CE分離は緩衝液中で行われる。
4.ゲル電気泳動はITP濃縮と共に行われる。CEチャネル全体はゲル溶液で充填する。CE分離はゲル溶液中で行われる。
5.試料注入は、図5E〜5Hで示されるダブルT注入マイクロ流体チップ装置において行われる。CE分離は、試料注入後に行われる。
本発明では、形状および機能の面での多くの変更、改変が可能であり、および均等物が存在し、ならびに本開示の利益を享受する当業者であればそれらに想到するであろう。
本発明は、現段階で考えられる好ましい実施形態を記載するが、本発明はそのようなものに限定されない。対照的に、本発明は、上記の詳細な説明の精神および目的の範囲内に含まれる様々な変更および均等な改善に及ぶものである。
Claims (35)
- 磁性マイクロビーズを操作するためのマイクロ流体チップ装置であって、
液体流の注入口および/または排水口として働く1以上のシール可能な液体接続部を有するチャネル中に少なくとも1つの反応チャンバーを有するマイクロ流体チャネルシステムを含み、
ここに、各々の反応チャンバーには、磁性マイクロビーズの直径よりも広い隙間を有する、ピラーロッドからなるマイクロ流体ピラーフィルタが少なくとも1つ備えつけられ、
前記の少なくとも1つのマイクロ流体ピラーフィルタが、液体流中に形成された気泡を壊すこと、および磁性マイクロビーズクラスターを分離することを特徴する、装置。 - マイクロ流体チャネルシステムが、磁気機器、電気機器、光学機器およびそれらの組み合わせからなる群より選択される機器をさらに含む、請求項1記載のマイクロ流体チップ装置。
- 機器が組込み型または外部接続型のものである、請求項2記載のマイクロ流体チップ装置。
- 機器が、単離、精製、濃縮、結合アッセイ、PCRおよびバックグラウンドの低減からなる群より選択される技術を実行するために用いられる、請求項3に記載のマイクロ流体チップ装置。
- 機器が磁気機器であり、当該磁気機器が外部から操作可能な磁気ロッドを1つ以上含む、請求項2記載のマイクロ流体チップ装置。
- 機器が電気機器であり、当該電気機器が電気ニードルおよび電気薄膜素子からなる群より選択される電気接続部を含む、請求項2記載のマイクロ流体チップ装置。
- 電気薄膜素子が、加熱素子、温度測定素子、高電圧素子、伝導度測定素子およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項6記載のマイクロ流体チップ装置。
- マイクロ流体チャネルシステムが、組込み型または外部接続型の分画および分離機器をさらに含む、請求項1に記載のマイクロ流体チップ装置。
- 分画および分離機器が、等速電気泳動の予備分離または質量分析を行うかまたは行わないキャピラリー電気泳動を実施するための直線状またはループ状のチャネルを含む、請求項8記載のマイクロ流体チップ装置。
- マイクロ流体チャネルシステムが、蛍光を測定するための機器、UV/VIS吸収を測定するための機器、IRを測定するための機器、伝導度を測定するための機器、屈折率を測定するための機器および質量分析機器からなる群より選択される、組込み型または外部接続型の検出機器をさらに含む、請求項1記載のマイクロ流体チップ装置。
- シール可能な流体接続部が、漏出防止シールを含む流体接続部である、請求項1記載のマイクロ流体チップ装置。
- マイクロ流体チップ装置が2つの層を含む、請求項1記載のマイクロ流体チップ装置。
- マイクロ流体チップ装置が、穴を有する、下層および上層を含む、請求項12記載のマイクロ流体チップ装置。
- マイクロ流体チップ装置が、測定インターフェースを通じて外付けの検出機器、およびマイクロ流体チップ装置上の穴に嵌込まれるステアリングロッドを有するステアリングプレートと接触している、請求項13記載のマイクロ流体チップ装置。
- マイクロ流体チップ装置および外部装置が、ドッキング・プラットフォーム上に配置されている、請求項2記載のマイクロ流体チップ装置。
- 液体流についての注入口および/または排水口として働くシール可能な流体接続部を1以上有するチャネル中の少なくとも1つの反応チャンバーを有するマイクロ流体チャネルシステムを含み、当該少なくとも1つの反応チャンバーに磁性マイクロビーズの直径よりも大きい隙間を有するピラーロッドからなるマイクロ流体ピラーフィルタが少なくとも1つ提供されている、マイクロ流体チップ装置内の磁性マイクロビーズを操作することにより、磁性マイクロビーズの反応性表面を増加させる方法であって、
(a)液体流を、流体接続部から最初の反応チャンバー内に供給し、そこで、マイクロ流体ピラーフィルタが気泡を除去する工程;
(b)液体流を、液体流中または反応チャンバー内に存在する磁性マイクロビーズと接触させ、磁性ロッドのスイッチを入れることにより、当該磁性マイクロビーズを反応チャンバー内の別のマイクロ流体ピラーフィルタに通じさせ、それにより、マイクロ流体ピラーフィルタが磁性マイクロビーズにより形成されるクラスターを分離する工程;
(c)注入口を通じて別の液体流を入れる前の、試料溶液を排水口から除去する間に、磁性マイクロビーズを、チャネル中に移すかまたはいずれかのマイクロ流体ピラーフィルタの後方に移す工程;
(d)結合ペアを形成することができる標的またはその対応物が、少なくとも1つの処理工程にかけられるまで、新しい液体流を用いて工程(a)〜工程(c)を繰り返す工程;および
(e)標的またはその対応物のいずれかを1以上のさらなる処理工程にかける前に、標的またはその対応物を磁性マイクロビーズから放出させる工程を含む、方法。 - 1以上のさらなる処理工程が、磁気機器、電気機器、光学機器およびそれらの組み合わせからなる群より選択される機器を用いて実施される、請求項16記載の方法。
- 機器が、組込み型または外部接続型のものである、請求項17記載の方法。
- 少なくとも1つの処理工程が、単離、精製、濃縮、結合アッセイ、PCRおよびバックグラウンドの低減からなる群より選択されるものである、請求項16記載の方法。
- 標的またはその対応物に、検出可能な標識を付与する、請求項16記載の方法。
- 標的またはその対応物に、アフィニティー標識を付与する、請求項16記載の方法。
- 標的またはその対応物を、磁性マイクロビーズ上に固定する、請求項21記載の方法。
- 磁性マイクロビーズ上に固定された標的またはその対応物を有する磁性マイクロビーズが、マイクロ流体チャネルシステム内に存在する、請求項22記載の方法。
- 標的またはその対応物に、検出可能な標識を付与しないことを特徴とする、請求項22記載の方法。
- 結合ペア複合体を形成させ、磁性マイクロビーズから放出された後に、標的またはその対応物を標識する、請求項16記載の方法。
- 標的およびその対応物が、抗体/抗原ペアである結合ペアを形成する、請求項16記載の方法。
- 標的およびその対応物が、標的ポリヌクレオチド配列または標的オリゴヌクレオチド配列および当該標的配列と相補的なプローブ配列である結合ペアを形成する、請求項16記載の方法。
- 標的ポリヌクレオチド配列または標的オリゴヌクレオチド配列または記録されるべきその相補的な対応物のいずれも標識されないが、その各々が両末端にユニバーサルプライマーを有する、請求項27記載の方法。
- 2つのユニバーサルプライマーが、1以上のPCRサイクルで検出または測定されるべき未標識配列を増幅するために用いられる、請求項28記載の方法。
- 検出または測定されるべき配列が、増幅の間に標識される、請求項29記載の方法。
- 組込み型または外部接続型の機器が、蛍光を測定するための機器、UV/VIS吸収を測定するための機器、IRを測定するための機器、伝導度を測定するための機器、屈折率を測定するための機器、質量分析機器、ならびに分画および分離機器からなる群より選択されるものである、請求項16記載の方法。
- 分画および分離機器が、等速電気泳動の予備分離または質量分析を行うかまたは行わないキャピラリー電気泳動を実施するための直線状またはループ状のチャネルを含む、請求項16記載の方法。
- 液体流が、試料、試薬、洗浄液および溶出液からなる群より選択されるものである、請求項16記載の方法。
- 請求項16記載の方法に従って、発現されたmRNAの相対的な量およびその核酸の変動を決定する方法であって、
標的mRNAおよびプローブおよび磁性マイクロビーズをハイブリダイズおよび捕捉する工程;
工程(a)〜工程(d)に従って洗浄する工程;
液体接続部およびマイクロ流体ピラーを通じて、少なくとも1種のデオキシヌクレオチドまたは少なくとも1種のジデオキシヌクレオチドの存在下で鋳型としてのmRNAを用いてプローブを伸長できる酵素を含む緩衝液を導入することにより、鋳型としての標的mRNAの5’末端を用いてその3’末端にあるプローブを伸長させる工程;
磁気ロッドのスイッチを入れ、それによって、精製された固定化標的mRNA−プローブ複合体を有する磁性マイクロビーズを、マイクロ流体ピラーフィルタに通じさせる工程:および
工程(a)〜工程(e)を用いて磁性マイクロビーズをトラップおよび精製した後に、伸長反応に好都合な条件下で、十分な時間、伸長反応を行わせる工程を含む、方法。 - 未標識の標的または相補的なポリ−もしくはオリゴ−ヌクレオチド配列であるその対応物に、2つのPCRサイクルを実施することによって余剰の検出標識に起因するバックグラウンドを低減させるために用いられるユニバーサルプライマーが付与される、請求項16記載の方法であって、
ここに、第一のPCRサイクルは検出可能な標識を備えた一方のユニバーサルプライマーと相補的な配列を用いて開始され、第二のPCRサイクルはアフィニティー標識を備えた他方のユニバーサルプライマーと相補的な配列を用いて開始され、それにより、複数の検出用標識されたおよびアフィニティー標識された二本鎖の標的または対応物の配列が形成され、それらを磁性マイクロビーズと接触させて、工程(a)〜工程(e)にかけることを特徴とする、方法。
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