CN107884562B - 粒子的磁标记方法和标记装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种粒子的磁标记方法和标记装置。本发明提供一种磁标记方法，能够高效地在过滤器上对过滤器上捕获的粒子进行磁标记。所述磁标记方法通过磁珠对具有多个贯通孔的过滤器上捕获的粒子进行标记，包括：向捕获了粒子的过滤器面供应含有磁珠的悬浮液；通过从所述过滤器面向另一侧过滤器面输送所述悬浮液的一部分，来形成含有所述磁珠的液体接触所述过滤器的双面的状态；以及将含有所述磁珠的液体从所述另一侧过滤器面向捕获了所述粒子的过滤器面的方向逆向输送。

Description

粒子的磁标记方法和标记装置
技术领域
本公开涉及通过磁粒子(以下，也称为磁珠)来标记粒子的方法和用于标记的装置。本公开尤其涉及在过滤器上通过磁珠而对过滤器上捕获的粒子进行磁标记的方法和其中使用的标记装置。
背景技术
作为分离悬浮液中所含的粒子、尤其是活体试样中的稀有细胞的方法，存在磁分离和大小分离。磁分离是依赖于分离对象的细胞中表达的蛋白质的方法。另一方面，大小分离是利用了粒子的大小或变形能力的差异的方法。
在进行稀有细胞的分离的一般的方法中，仅通过某一种方法来进行。作为利用了大小分离的方法，例如，开发了使用具有预定的特性的过滤器的方法(例如，日本专利特开第2015-087382号公报)。
另一方面，近年来，从提高稀有细胞的分离精度的观点出发，提议了同时使用磁分离和大小分离原理不同的分离方法(日本专利特表第2009-511001号公报以及Sci TranslMed 5，179ra47(2013))。
发明内容
稀有细胞中除了血中循环肿瘤细胞/Circulating Tumor Cell(CTC)、CTC之外，还存在免疫细胞等医学上重要的细胞。作为CTC的一个例子，有从原发肿瘤组织或转移肿瘤组织游离的癌细胞。这些癌细胞通过血液或淋巴管而被运送到其他的脏器等，由此引起转移。另外，血液中的CTC，由于认为作为转移性的癌的治疗效果的判定或预后预测的因子而有用，因此CTC的分析被积极地进行。
但是，CTC等稀有细胞在10ml的血液中通常仅含0～10个左右，因此为了更准确地进行分析，要求从待测体高精度地分离或浓缩稀有细胞。
本申请人如日本专利特开第2015-087382号公报所述，开发了能够通过使用具有预定的特性的过滤器，来从血液高效分离稀有细胞的方法。但是，血液中除了稀有细胞之外，大量含有红细胞或白细胞等血细胞成分(红细胞为几百亿个左右、白细胞为几千万个左右)、尤其是白细胞的大小与稀有细胞同程度或比它更大，因此即使在使用上述过滤器的情况下，也存在与稀有细胞一起被捕获的情况。
在白细胞与稀有细胞一起被捕获的情况下，本发明的发明人发现了例如以下两个问题。第一，血液(待测体)中所含的稀有细胞是微量，而白细胞是大量的，因此过滤器上捕获的白细胞的量相对于稀有细胞的数量多，因此，将白细胞的一部分检测为稀有细胞，其结果，容易产生假阳性。第二，在进行对稀有细胞特异的基因突变的检测的情况下，仅检测白细胞的基因型而没有检测到稀有细胞，其结果有时容易产生假阴性。
由此可知，需要高效率分离过滤器捕获的白细胞和稀有细胞。
本公开在一个或多个实施方式中，提供能够在过滤器上高效地对过滤器上捕获的粒子进行磁标记的方法和标记装置。
本公开在一个方式中，涉及一种磁标记方法，通过磁珠对具有多个贯通孔的过滤器上捕获的粒子进行标记，所述方法包括：向捕获了粒子的过滤器面供应含有磁珠的悬浮液；通过从所述过滤器面向另一侧过滤器面输送将所述悬浮液的一部分，来形成含有所述磁珠的液体接触所述过滤器的双面的状态；以及将含有所述磁珠的液体从所述另一侧过滤器面向与捕获了所述粒子的过滤器面的方向逆向输送。
本公开在一个方式中涉及一种标记装置，用于通过磁珠来标记粒子，包括：能够保持过滤器的过滤器部；能够向所述过滤器部导入含有磁珠的悬浮液的导入流路；能够保持或排出通过了所述过滤器部的液体的排出流路；能够向所述过滤器部供应所述悬浮液的输送单元；以及控制所述输送单元的控制部，其中，所述控制部控制所述输送单元，以使得以成为含有所述磁珠的液体与所述过滤器的双面接触的状态的方式，从一侧过滤器面向另一侧过滤器面输送所述悬浮液的一部分，并且从所述另一侧过滤器面逆向输送含有磁珠的液体。
根据本公开，在一个方式中，能够在过滤器上高效进行通过磁珠对过滤器上捕获的粒子的标记。
附图说明
图1示出能够在本公开的磁标记方法中使用的细胞标记装置的一个例子；
图2示出说明本公开的磁标记方法的步骤的一个例子的概略示意图；
图3是示出实施例1以及比较例1和2中残留的(未被磁捕获的)白细胞数的一个例子的图表；
图4示出实验例1中使用的稀有细胞捕获回收装置的一个例子；
图5示出能够在本公开的细胞回收方法中使用的细胞捕获回收装置的结构的一个例子。
具体实施方式
血液中可能存在血中循环肿瘤细胞/CTC等稀有的细胞。CTC是从原发肿瘤组织或转移肿瘤组织游离，浸润到血液的细胞。由于考虑到癌的转移是癌细胞通过血管或淋巴管运送到体内的其他部位并增殖从而引起的，因此报告了血液中的CTC数与癌的转移的可能性和预后存在关系。另外，稀有细胞中除了CTC之外，还含有免疫细胞等医学上重要的细胞。因此，预想血液中的稀有细胞的分析今后将更加盛行。
10ml的血液中通常含有几百亿个红细胞，几千万个白细胞，CTC等稀有细胞通常为0～10个左右。因此，为了进行更准确的分析，需要以高精度进行从血液等的待测体分离和回收稀有细胞。
稀有细胞中不光存在比血细胞的大小大的癌细胞，还存在小型的细胞和变形能力高的细胞。作为小型的细胞，例如可举出人结肠癌细胞等(市售的SW620(细胞株名，人结肠癌细胞)被确认为小型的细胞)。作为变形能力高的细胞，例如可举出人癌细胞等(市售的SNU-1(细胞株名，人癌细胞)被确认为变形能力高的细胞)。
本申请人确立了通过使用预定的过滤器，来能够以高捕获率捕获小型的细胞和变形能力高的细胞方法(例如，日本专利特开第2015-087382号公报)。
但是，如上所述，即使在使用该过滤器来分离了血液等待测体的情况下，也存在待测体中大量包含的白细胞与稀有细胞一起被捕获的情况。因此，要求用于进一步分离稀有细胞和白细胞的处理。另外，为了分析分离后的稀有细胞，需要进行各种各样的处理。
另一方面，如上所述，由于稀有细胞在待测体中存在的数量极少，因此需要尽量避免基于过滤器的分离或标记等处理、进一步需要尽量避免回收时的损失。因此，提议了在过滤器上捕获了细胞的状态下，进行用于上述的分离或分析的各种各样的处理。过滤器上的处理通过在将各种处理液供应过滤器并与细胞反应之后，输送并去除未反应的处理液来进行。即，过滤器具有作为B/F分离(结合/游离(Bound/Free)分离)的反应场所的功能，能够在不伴随细胞的损失的情况下进行各种各样的处理。
在该过滤器上的各种处理中，本发明的发明人发现存在可得到充分的处理效果的处理和得不到充分的处理效果的处理的问题。具体而言，存在如下问题：抗体染色能够充分染色，但是通过磁粒子进行的标记的标记效率非常低，不能充分进行磁标记。
鉴于上述问题，尝试从过滤器回收稀有细胞等细胞并进行基于磁粒子的标记，但是该方法中存在由过滤器捕获的稀有细胞的损失的发生程度在操作者间或实验间等差异大的问题、以及再现性低的问题。另外，产生了在进行标记处理之后，不能够充分地分离未反应的剩余的磁粒子和细胞的情况。其结果为，存在如下问题：在作为后段的处理步骤的磁分离时，稀有细胞卷入大量存在的剩余的磁粒子中，一起被磁分离等，由此分离精度降低。
本公开在一个方式中，基于本发明人们发现的如下新的见解：在细胞被过滤器捕获的状态下进行磁粒子标记时，以捕获了细胞的过滤器整体被含有磁粒子的悬浮液覆盖的方式，输送含有磁粒子的悬浮液，之后，将含有所述悬浮液中所含的磁粒子的液体向与悬浮液的输送方向相反方向输送(逆向输送)，由此能够提高基于磁粒子的标记效率，能够将细胞和大量存在的剩余的磁粒子分离。
本公开在一个方式中，基于本发明的发明人发现的如下新的见解：由于过滤器上捕获的细胞数与稀有细胞相比白细胞更多，因此如果用磁粒子标记作为不是回收目标细胞的白细胞，则能够提高稀有细胞的分离精度。具体而言，如下所述。即，作为稀有细胞的CTC中明显存在表达EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule，上皮细胞粘附分子)以及cytokeratin(细胞角蛋白)等上皮细胞抗原的组，或这些上皮标记的表达降低、并引起表达如Vimentin(波形蛋白)那样的间充质细胞抗原的上皮间质转化的组。因此，通过特定的抗原，难以识别全部CTC。因此，基于本发明的发明人发现的如下见解：替代CTC，以磁粒子来标记和分离已知具有特定的抗原的白细胞，由此能够进一步提高CTC和白细胞的分离精度，并能够与抗原无关地回收全部CTC。另外，CTC等稀有细胞的分析中的本公开的标记对象不限于白细胞，也可以是稀有细胞。
根据本公开，能够在过滤器上对该过滤器捕获的细胞高效地进行磁粒子标记的机理不清楚，但是可以如下推测。
在向具有多个贯通孔的过滤器输送全血并过滤的情况下，全血作为层流而输送，因此流路的壁面附近的流速降低，结果是在壁面周围的过滤器上，不是捕获对象的红细胞、白细胞未被过滤，残留较多。在该状态下进行染色处理以及标记处理的情况下，在作为溶解性的试剂的抗体染色液中，通过试剂自身的扩散能够充分染色，但是在基于磁粒子的标记中，不能使磁粒子充分接触壁面周围的白细胞，标记效率低。作为该理由，可以考虑到如下情况：白细胞大量存在的壁面周围的流速比过滤器中央部慢，而且磁粒子的扩散比较平稳。与此相对，本公开的方法中，输送悬浮液，使得过滤器的两个主面与含有磁粒子的液体接触，之后逆向输送。通过使含有磁粒子的液体浸渍过滤器的两个主面，被过滤器捕获的细胞能够在过滤器的细胞捕获面、与细胞捕获面相反侧的过滤器面这两者的面(过滤器上面和过滤器下面)以及贯通孔内与悬浮液接触，细胞与悬浮液(磁粒子)接触的表面积大幅度增加。在这种状态下，从与过滤器的捕获面相反侧的过滤器面向细胞捕获面(从过滤器下面侧向上面侧)逆向输送，由此嵌入过滤器的贯通孔的细胞从孔游离，并且通过由该逆向输送产生的乱流来搅拌含有磁粒子的悬浮液，因此进一步提高细胞和磁粒子的接触频率。其结果，考虑能够提高磁粒子标记效率。但是，本公开也可以不限于该机理而解释。
[磁粒子(磁珠)的标记方法]
本公开在一个方式中，涉及通过磁珠对具有多个贯通孔的过滤器上捕获的粒子进行标记的方法(本公开的标记方法)。本公开的标记方法在一个方式中，包括：向捕获了粒子的过滤器面供应含有磁珠的悬浮液；通过将所述悬浮液的一部分从所述过滤器面向另一侧过滤器面输送，来形成含有所述磁珠的液体接触所述过滤器的双面的状态；以及将含有所述磁珠的液体从所述另一侧过滤器面向捕获了所述粒子的过滤器面的方向逆向输送。另外，本公开的标记方法在一个方式中，包括：向捕获了所述粒子的过滤器的上面供应含有磁珠的悬浮液；以所述悬浮液的上部液面和下部液面夹着所述过滤器的方式，将所述悬浮液的一部分向所述过滤器的下面侧输送；以及对所述过滤器，从所述过滤器的下面侧向上面侧输送。
根据本公开的标记方法，在一个或多个实施方式中，关于过滤器上捕获的粒子的磁珠标记，能够在无需从过滤器回收的情况下在过滤器上高效地进行。
本公开的标记方法包括向捕获了粒子的过滤器面供应含有磁珠的悬浮液。
含有磁珠的悬浮液的供应量无特别限制，可以根据过滤器的过滤面积等而适当决定。供应量在一个或多个实施方式中，从在过滤器上高效且均匀地悬浮磁珠的观点出发，为每过滤面积(28mm2)50μL以上或100μL以上，或从以少量的液体高效且均匀地悬浮磁珠的观点出发，为500μL以下或300μL以下。
含有磁珠的悬浮液中的磁珠的含量(固体部分浓度)在一个或多个实施方式中，从使磁珠和细胞有效反应的观点出发，为0.0025％以上或0.004％以上，从抑制磁珠和细胞的非特异性反应的观点出发，为0.0625％以下或0.0375％以下。
作为磁珠(磁粒子)，没有特别限制，能够根据作为标记对象的粒子的种类等而适当决定。作为磁珠，在一个或多个实施方式中，能够使用为了磁标记细胞等粒子而使用的公知的磁珠或今后可能开发的磁珠。作为磁珠，在一个或多个实施方式中，可举出在表面上固定了与作为标记对象的粒子的结合分子特异性反应的物质的磁粒子(珠)。作为该物质，在一个或多个实施方式中，可举出亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、抗体和抗原等。对磁珠的大小，没有特别限制，能够根据粒子的大小而适当决定。在作为标记对象的粒子的大小为如白细胞、CTC那样直径为5μm～20μm的情况下，在一个或多个实施方式中，从提高标记效率的观点出发，为1μm以下、0.8μm以下或0.5μm以下。从提高磁分离效率的观点出发，为0.05μm以上、或0.1μm以上。
本公开的标记方法包括：将向捕获了粒子的过滤器面(粒子捕获面或过滤器上面)供应的悬浮液的一部分，向另一侧过滤器面(粒子捕获面的相反侧的过滤器面(相反面或过滤器下面))输送，由此作为含有磁珠的液体与过滤器的两个面(粒子捕获面和相反面这两个面)接触的状态。另外，在一个或多个实施方式中，该悬浮液的输送可包括以含有磁珠的液体的上部液面和下部液面夹着过滤器的方式，向过滤器的下面侧输送悬浮液的一部分。该输送在一个或多个实施方式中，可以以含有磁珠的液体被保持在相反侧的过滤器面附近的方式进行。该输送在一个或多个实施方式中，从相反面侧由泵吸引而进行，使得悬浮液通过过滤器，并且含有磁珠的液体接触过滤器的两个面。即，本公开的标记方法中，在将悬浮液的一部分朝向粒子捕获面的相反侧的过滤器面侧积极地输送这一点上，与液体无意中浸透甚至扩散到过滤器、并且该液体到达过滤器下面附近的现象不同。
在一个或多个实施方式中，作为含有磁珠的液体，只要是含有磁珠的液体则不特别限定，可以举出含有供应到过滤器面的磁珠的悬浮液、以及该悬浮液与其他液体混合稀释的液体等。含有磁珠的液体中的磁珠的浓度(固体成分的浓度)在一个或多个实施方式中，为0.00009％以上、0.00012％以上或0.00021％以上，或0.0581％以下、0.0415％以下或0.00249％以下。作为其他的液体，在一个或多个实施方式中可以举出磷酸缓冲生理盐水(PBS)、PBS-BSA(例如0.2％)、PBS-EDTA(例如1mg/ml)和缓冲液、等张液(isotonicsolution)和水等水性溶剂。作为缓冲液，在一个或多个实施方式中，可举出Tris-HCl缓冲液等Tris缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液等。另外，作为等张液，可举出生理盐水、蔗糖等张液、葡萄糖等张液、甘露糖等张液等。
作为向相反面侧输送的悬浮液的比例，在一个或多个实施方式中，从过滤器双面与含有磁珠的液体充分接触的观点出发，为向粒子捕获面供应的悬浮液的10％以上、20％以上、或40％以上，从相反面侧向粒子捕获面侧输送时高效输送全部悬浮液的观点出发，为90％以下、80％以下或60％以下。
在一个或多个实施方式中，从提高被过滤器捕获的粒子和磁珠的反应效率的观点出发，悬浮液的流速为过滤器的每开口面积0.07mm/秒以上、0.1mm/秒以上或0.3mm/秒以上，同样地从提高被过滤器捕获的粒子和磁珠的反应效率的观点出发，为过滤器的每开口面积14mm/秒以下、1.4mm/秒以下或0.7mm/秒以下。从提高被过滤器捕获的粒子和磁珠的反应效率的观点出发，悬浮液的流量为0.05μL/分以上、0.1μL/分以上或0.2μL/分以上，同样地从提高被过滤器捕获的粒子和磁珠的反应效率的观点出发，为10000μL/分以下、1000μL/分以下或500μL/分以下。本公开中的“过滤器的每开口面积的流速”是指通过过滤器的开口部(孔)的液体的速度。每开口面积的流速在一个或多个实施方式中，能够通过体系整体的流量除以开口部(孔)的总面积来计算出。本公开中的“流量”是指每单位时间流过的液体的量(体积)。作为流量，在一个或多个实施方式中，可以举出单位时间通过过滤器的液体的量(体积)。
本公开的标记方法包括：针对双面浸渍了悬浮液的过滤器，从粒子捕获面的相反侧的过滤器面侧向捕获了粒子的过滤器面侧(从过滤器下面侧到上面侧)输送(逆流)。对两个主面与含有磁珠的液体接触的状态(浸渍的状态)的过滤器，从相反面侧向粒子捕获面侧输送，使含有磁珠的悬浮液流动输送，并且通过使过滤器上捕获的粒子从过滤器游离，能够提高磁珠与作为标记对象的粒子的反应性，能够提高标记效率。
逆流在一个或多个实施方式中，可以仅输送位于与粒子捕获面相反侧的过滤器面侧(过滤器下面侧)的悬浮液，也可以输送与悬浮液不同的液体。作为与悬浮液不同的液体，在一个或多个实施方式中，可以举出磷酸缓冲生理盐水(PBS)、PBS-BSA(例如0.2％)、PBS-EDTA(例如1mg/ml)和缓冲液、等张液和水等水性溶剂。作为缓冲液，在一个或多个实施方式中，可举出Tris-HCl缓冲液等Tris缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液等。另外，作为等张液，可举出生理盐水、蔗糖等张液、葡萄糖等张液、甘露糖等张液等。
在一个或多个实施方式中，从相反面侧向粒子捕获面侧的输送流速(逆流流速)可以根据使过滤器捕获粒子时的待测体的流速而适当决定。在一个或多个实施方式中，逆流流速可以比待测体的流速快，也可以比待测体的流速慢。作为逆流流速，在一个或多个实施方式中，可举出待测体流速的1/10倍以上的流速、1/5倍以上的流速、1/2倍以上的流速、1倍以上的流速、2倍以上的流速、3倍以上的流速、或5倍以上的流速。关于逆流流速，在一个或多个实施方式中，从提高磁珠的标记效率的观点出发，可举出比待测体的流速快。
关于从相反面侧向粒子捕获面侧的输送流速，在一个或多个实施方式中，从进一步提高磁珠的标记效率的观点出发，为过滤器的每开口面积0.01mm/秒以上、0.1mm/秒以上或1mm/秒以上，从抑制对细胞的损伤抑制的观点出发，为过滤器的每开口面积150000mm/秒以下、100000mm/秒以下或50000mm/秒以下。从提高磁珠的标记效率的观点出发，逆流流量为10μL/分以上、100μL/分以上或1000μL/分以上，从抑制对细胞的损伤的观点出发，为1亿μL/分以下、5000万μL/分以下或1000万μL/分以下。
在一个或多个实施方式中，从使含有磁珠的液体高效输送到粒子捕获面的观点出发，逆流的液体的量为每过滤面积(28mm2)50μL以上或100μL以上，或从维持悬浮液的浓度的观点出发，为1000μL以下、500μL以下或300μL以下。
对过滤器的向悬浮液的浸渍、以及从上述相反面侧向粒子捕获面侧的输送(逆流)的进行次数，没有特别限制，可以是一次以上，也可以是两次以上。
在一个或多个实施方式中，从进一步提高磁珠的标记效率的观点出发，本公开的标记方法也可以包括在上述的逆流之后搅拌含有粒子捕获面的磁珠和作为标记对象的粒子的液体。在一个或多个实施方式中，作为搅拌，可举出移液。
在一个或多个实施方式中，从进一步提高磁珠的标记效率的观点出发，本公开的标记方法也可以包括搅拌后静置。在一个或多个实施方式中，从使粒子和磁珠充分反应的观点出发，静置时间为1分钟以上、5分钟以上、或10分钟以上，从防止粒子和磁珠的非特异反应的观点出发，为60分钟以下、45分钟以下或30分钟以下。
在一个或多个实施方式中，从进一步提高磁珠的标记效率的观点出发，本公开的标记方法可以包括：在移液后，将含有磁珠和标记对象的粒子的液体进行过滤器过滤，之后静置。由此，能够将含有标记对象的粒子的过滤器上预先捕获的粒子再次捕获到过滤器上，能够使该粒子和磁珠再次接触。在一个或多个实施方式中，静置优选在过滤器的双面被含有磁珠和标记对象的粒子的液体覆盖的状态下进行。
在一个或多个实施方式中，从提高被过滤器捕获的粒子和磁珠的反应效率的观点出发，过滤器过滤的输送流速为过滤器的每开口面积0.07mm/秒以上、0.1mm/秒以上或0.3mm/秒以上，同样地从提高被过滤器捕获的粒子和磁珠的反应效率的观点出发，为过滤器的每开口面积14mm/秒以下、1.4mm/秒以下或0.7mm/秒以下。从提高过滤器捕获的粒子和磁珠的反应效率的观点出发，悬浮液的流量为0.05μL/分以上、0.1μL/分以上或0.2μL/分以上，同样地从提高过滤器捕获的粒子和磁珠的反应效率的观点出发，为10000μL/分以下、1000μL/分以下或500μL/分以下。
在一个或多个实施方式中，从使粒子和磁珠充分反应的观点出发，静置时间为1分钟以上、5分钟以上、或10分钟以上，从防止粒子和磁珠的非特异反应的观点出发为60分钟以下、45分钟以下、或30分钟以下。
在一个或多个实施方式中，为了清洗标记中未使用的多余的磁珠，本公开的标记方法也可以输送清洗液。在一个或多个实施方式中，作为清洗液，可以举出磷酸缓冲生理盐水(PBS)、PBS-BSA(例如0.2％)、PBS-EDTA(例如1mg/ml)和缓冲液、等张液和水等水性溶剂。在一个或多个实施方式中，作为缓冲液，可举出Tris-HCl缓冲液等Tris缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液等。另外，作为等张液，可以举出生理盐水、蔗糖等张液、葡萄糖等张液、甘露糖等张液等。
在一个或多个实施方式中，本公开的标记方法可以预先在过滤器上捕获粒子，也可以包括：在供应含有磁珠的悬浮液之前，使用过滤器捕获粒子。关于过滤器的粒子捕获，在一个或多个实施方式中，可以通过向过滤器供应并以过滤器过滤含有作为标记对象的粒子的待测体而进行。
在一个或多个实施方式中，从使待测体中的粒子的捕获率提高的观点出发，待测体的流速为每开口面积0.01mm/秒以上、0.05mm/秒以上、或0.1mm/秒以上，从同样的观点出发，为100mm/秒以下、50mm/秒以下、25mm/秒以下、10mm/秒以下、5mm/秒以下、或2mm/秒以下。在一个或多个实施方式中，从提高待测体中的粒子的捕获率的观点出发，待测体的流量为0.01ml/分以上、0.05ml/分以上、或0.1ml/分以上，从同样的观点出发，为100ml/分以下、50ml/分以下、25ml/分以下、或10ml/分以下。
在一个或多个实施方式中，本公开的标记方法可以包括：在供应含有磁珠的悬浮液之前，向捕获了粒子的过滤器面的相反侧的过滤器面侧的流路填充液体。在一个或多个实施方式中，液体的填充也可以以该液体浸渍捕获了粒子的过滤器的方式进行。作为液体，在一个或多个实施方式中，可举出能够作为上述清洗液而使用的液体。
在一个或多个实施方式中，本公开的标记方法也能够使用具有分离部的装置等而进行，该分离部具备具有多个贯通孔的过滤器。本公开的标记方法从能够提高操作性、且即使少量的磁珠悬浮液也能够高效标记的观点出发，在一个或多个实施方式中，优选由过滤器的上部开放的开放系统的装置进行。
在一个或多个实施方式中，本公开的标记方法的悬浮液的供应、输送和搅拌等上述处理可以自动进行，也可以手动进行。另外，也可以手动进行一部分处理，自动进行剩余的处理。
作为用于本公开的标记方法中的过滤器，在一个或多个实施方式中，可举出能够捕获待测体中的稀有细胞的过滤器。关于过滤器，在一个或多个实施方式中，优选至少能够捕获小型的癌细胞、变形能力高的癌细胞、或这两方面的细胞的过滤器。另外，关于过滤器，在一个或多个实施方式中，优选至少能够捕获SNU-1、SW620或这两者的过滤器，更优选能够捕获待测体中的CTC的过滤器。作为过滤器，在一个或多个实施方式中，可以使得用现有公知或今后开发的能够捕获稀有细胞的过滤器。作为过滤器，在一个或多个实施方式中，可举出日本专利特开第2015-087382号公报中记载的过滤器、以及日本专利特愿第2016-057313中记载的过滤器等。另外，例如，可以举出含有大量短轴径为1μm～50μm的椭圆、正圆或矩形等贯通孔的片状的单膜，优选除无纺布之外的物质。
关于过滤器的材质，在一个或多个实施方式中，可举出镍、SUS(Steel UseStainless，不锈钢)、金、银、铜、铝、钨、或铬等金属。
过滤面积不特别限定，在一个或多个实施方式中，为5mm2以上、或10mm2以上，或者2,000mm2以下、1,000mm2以下、500mm2以下、200mm2以下、150mm2以下、100mm2以下、80mm2以下、50mm2以下、40mm2以下、30mm2以下或25mm2以下。本公开中的“过滤面积”是指过滤器的整体面积中的、与含有磁珠的悬浮液或待测体接触的(输送的)部分的面积。
在一个或多个实施方式中，通过本公开的标记方法标记的粒子可以通过公知的磁分离装置而分离目标粒子。
本公开的标记方法在一个或多个实施方式中，即使在多种粒子被过滤器捕获的情况下，也能够根据由粒子的特性或粒子表达的蛋白质，对作为进行标记的对象的粒子进行特异标记。在一个或多个实施方式中，在CTC等稀有细胞的分析中，即使过滤器上捕获了稀有细胞和白细胞的情况下，根据本公开的标记方法，也能够以高的标记效率磁标记白细胞。因此，在本公开的标记方法的标记之后，对回收的悬浮液进行磁分离，由此能够高精度地分离稀有细胞和磁标记的白细胞，由此能够高精度地回收稀有细胞。在过滤器上捕获了稀有细胞和白细胞的情况下的一个或多个实施方式中，也可以替代白细胞，对稀有细胞进行磁标记。
在一个或多个实施方式中，标记后的回收可以通过向与过滤器的捕获粒子时的过滤方向相反的方向输送回收液而进行。回收液在一个或多个实施方式中，可以以如下方式进行：与后面叙述的细胞回收方法同样地，对捕获了细胞的所述过滤器，从与用于捕获细胞的待测体的流通方向相反的方向流通液体，以使得回收液的流通流量和待测体的流通流量之比([回收液的流量]/[待测体的流量])为25以上，或者以每开口面积1mm/秒以上的流速进行流通。具体的条件等与后述的细胞的回收方法相同。
作为本公开的粒子，无特别限定，可以举出人或人以外的动物的细胞。作为不特别限定的细胞的例子，可以举出稀有细胞、白细胞、红细胞、血小板和它们的未分化细胞等。稀有细胞是指人或人以外的动物的血液中所含的血细胞成分(红细胞、白细胞和血小板)以外的细胞。作为稀有细胞，在一个或多个实施方式中，可举出选自癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间充质系干细胞、胎儿细胞、干细胞、未分化白细胞、未分化红细胞以及它们的组合的组的细胞等。
作为本公开中的待测体，可以举出可包含应用于本公开的标记方法中的粒子细胞的试样。在一个或多个实施方式中，作为待测体，可举出血液待测体。在不特别限定的一个或多个实施方式中，作为血液待测体，从简便且迅速处理的观点以及抑制对血液中的稀有细胞的损伤的观点出发，可以举出血液或其稀释物等。
[标记装置]
本公开在一个方式中，涉及用于通过磁珠标记粒子的装置(本公开的标记装置)。本公开的标记装置包括能够保持过滤器的过滤器部；能够向过滤器部导入含有磁珠的悬浮液的导入流路；能够保持或排出通过了过滤器部的液体的排出流路；能够向过滤器部供应悬浮液的输送单元；以及控制输送单元的控制部。本公开的标记装置中，控制部控制输送单元，使得以向过滤器部供应的所述悬浮液的至少一部分通过所述过滤器部并被保持的方式输送所述悬浮液，并且将含有通过了的磁珠的液体逆向输送。根据本公开的标记装置，能够简便进行本公开的标记方法。
在一个或多个实施方式中，本公开的标记装置可以包括在过滤器的面乃至其附近搅拌液体的搅拌单元。
在一个或多个实施方式中，控制部也可以控制输送单元以使得将包含标记的粒子的待测体向过滤器部供应。控制部也可以控制输送单元，以使得以过滤器的每开口面积0.01mm/秒～100mm/秒的流速输送该待测体。控制部也可以控制输送单元，以使得逆向输送的流速比待测体的流速的1/10快。控制部也可以控制输送单元，以使得逆向输送的输送流速为过滤器的每开口面积0.01mm/秒以上。
以下，针对本公开的标记方法，对非限定性的一个实施方式进行说明。
使用图1所示的稀有细胞标记装置来进行说明。
图1中示出能够在本公开的标记方法中利用的稀有细胞标记装置的例子。
图1所示的稀有细胞标记装置包括：用于供应含有磁珠的悬浮液、清洗液和染色液等的供应口1，用于排出清洗液等废液的排出口2，设备上部3，设备下部4，过滤器部5，以及能够向箭头A和B方向输送液体的输送机构(未图示)。过滤器部5被配置在设备上部3和设备下部4之间。设备上部3具有流路6和用于固定过滤器部5的支承部件7，流路6与供应口1连通。设备下部4具有流路8和用于固定过滤器部5的支承部件9，流路8与排出口2连通。过滤器部5包含过滤器10和用于固定过滤器10的接合材料(例如，双面胶等)11、12。过滤器10通过接合材料11、12而与设备上部3和设备下部4固定。在连接供应口1和过滤器部5的流路6中，可以在过滤器部5的上部配置连接部(未图示)以及能够进行液体的切换的三通旋塞阀(未图示)。另外，在连接供应口1和过滤器部5的流路6中也可以配置(作为能够以恒定的压力输送的机构或能够以恒定流量输送的机构的)加压单元(未图示)，使得过滤中施加的压力变为恒定。另外，为了使过滤中施加的压力为恒定以上，也可以以注射泵吸引。
接着，使用图2，对使用了图1的稀有细胞标记装置的粒子的标记方法的例子进行说明。在本实施方式中，以如下方式为例子进行说明：作为过滤器使用能够捕获稀有细胞的过滤器，通过该过滤器而对含有稀有细胞的全血进行过滤器过滤，由此以磁珠对被过滤器捕获的白细胞进行标记。另外，图2中的灰色的部分示意性示出包含磁珠的部分。另外，本公开不限于该实施方式。
首先，使血液待测体通过流路6并输送到分离部，通过过滤器10进行过滤器过滤。由此，在过滤器10上捕获稀有细胞和白细胞。
然后，从提高试剂对白细胞的反应性的观点出发，也可以供应溶血剂并进行处理，由此去除过滤器10上残留的红细胞。
接着，从供应口1供应缓冲液，向流路8中填充缓冲液。缓冲液以浸渍过滤器10的细胞捕获面(上面)10a的方式供应。然后，向过滤器10的细胞捕获面10a供应含有磁粒子的悬浮液21(图2的(a))。从提高磁粒子和白细胞的反应性的观点出发，在悬浮液21的供应之前，也可以通过抗体对白细胞进行免疫染色。作为抗体，例如可举出与结合分子结合的抗体等。在一个或多个实施方式中，作为结合分子可举出生物素等。另外，作为磁粒子，例如也可以使用固定有与上述结合分子特异反应的物质的磁粒子。在一个或多个实施方式中，作为特异性反应的物质，可以举出链霉亲和素、以及中性亲和素等蛋白质。
以含有磁粒子的悬浮液21的一部分移动到细胞捕获面10a的相反侧的过滤器面(下面)10b侧(流路8侧)的方式，从过滤器10的细胞捕获面10a侧朝向过滤器面10b侧(图1和2的箭头A方向)输送悬浮液21(图2的(b))。
接着，从过滤器面10b侧朝向细胞捕获面10a侧(图1和2的箭头B方向)输送液体(逆向输送)(图2的(c))。由此，能够在过滤器10的细胞捕获面(上面)10a上搅拌从过滤器10游离的细胞的同时，对含有过滤器10的细胞捕获面10a的磁粒子的液体进行搅拌，其结果为，能够提高白细胞和磁粒子的接触频率，能够提高标记效率。输送的(逆向输送的)液体可以含有磁粒子，也可以不含有磁粒子。
接着，在过滤器10的细胞捕获面10a上，通过移液器等来搅拌含有磁粒子和细胞的悬浮液，之后静置预定时间。由此，能够进一步提高白细胞和磁粒子的接触频率，并能够提高标记效率。
接着，从细胞捕获面10a侧朝向相反侧的过滤器面10b侧(图1和2的箭头A方向)再次输送含有过滤器10的细胞捕获面10a的细胞和磁粒子的悬浮液23，之后静置预定时间(图2的(d))。由此，悬浮液中所含的细胞被过滤器10捕获。另外，磁粒子通过过滤器10，但是在通过过滤器10时，能够使磁粒子与被过滤器10捕获的细胞再次接触，因此能够进一步提高白细胞和磁粒子的接触频率，并且能够提高标记效率。该输送优选以过滤器10的细胞捕获面10a和相反侧的过滤器面10b被含有磁粒子的液体夹着的方式进行。
并且，在使含有磁粒子的液体23下降到靠近过滤器10的细胞捕获面10a的位置之后，从过滤器10的细胞捕获面10a侧(图1和2的箭头A方向)供应清洗液24(图2的(e))，以清洗液24的液面靠近过滤器10的细胞捕获面10a的方式进行输送(图2的(f))。由此，去除过滤器10上残留的未反应的磁粒子。清洗液24的输送可以反复进行多次。
可以在通过上述的磁粒子进行白细胞的标记之后，通过抗体对稀有细胞进行免疫染色。由此，能够高效进行分离回收后的稀有细胞的检测。作为抗体，例如可举出Cytokeratin那样的、识别在CTC的细胞内表达的抗原的抗体等。从使抗体与稀有细胞内的抗原反应的观点出发，可以在抗体标记之前进行固定处理和膜渗透处理。
最后，通过从过滤器面10b侧(图1和2的箭头B方向)输送回收液，将含有被过滤器10捕获的细胞(白细胞和稀有细胞)的回收液挤出至细胞捕获面10a上，使用移液器等对其进行回收。通过对回收的回收液另行进行磁分离，能够分离由磁粒子标记的白细胞和稀有细胞。
本公开可以涉及以下的一个或多个实施方式。
〔1〕一种磁标记方法，通过磁粒子对具有多个贯通孔的过滤器上捕获的粒子进行标记，所述方法包括：
向捕获了粒子的过滤器面供应含有磁粒子的悬浮液；
从所述过滤器面向另一侧过滤器面的方向输送所述悬浮液的一部分，由此形成含有所述磁珠的液体接触所述过滤器的双面的状态；以及
从所述另一侧过滤器面向捕获了所述粒子的过滤器面的方向逆向输送含有所述磁粒子的液体。
〔2〕根据〔1〕所述的标记方法，其中，所述方法包括：
在从所述另一侧过滤器面向捕获了所述粒子的过滤器面的输送之后，在捕获了所述粒子的过滤器面搅拌含有所述磁粒子的液体。
〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的标记方法，其中，所述标记方法包括：
将含有所述粒子的待测体向所述过滤器输送，由此使所述过滤器捕获所述粒子。
〔4〕根据〔3〕所述的标记方法，其中，所述待测体的流速为所述过滤器的每开口面积0.01mm/秒～100mm/秒。
〔5〕根据〔3〕或〔4〕所述的标记方法，其中，将所述逆向输送流速设为比所述待测体的流速的1/10快。
〔6〕根据〔1〕至〔5〕中任一项所述的标记方法，其中，所述逆向输送流速为所述过滤器的每开口面积0.01mm/秒以上。
另外，本公开除了上述方法之外，还提供以下的装置。以下的装置毫无疑问对本领域技术人员来说在上述记载中已经明确且充分公开。
(A1)一种磁标记装置，用于通过磁粒子对具有多个贯通孔的过滤器上捕获的粒子进行标记，包括：
向捕获了所述粒子的过滤器的上面供应含有磁粒子的悬浮液的单元；
以所述悬浮液的上部液面和下部液面夹着所述过滤器的方式，将所述悬浮液的一部分向所述过滤器的下面侧输送的单元；以及
对所述过滤器，从所述过滤器的下面侧向上面侧输送的单元。
(A2)根据(A1)所述的标记装置，包括：在从所述过滤器的下面侧向上面侧输送之后，搅拌所述过滤器的上面的悬浮液的单元。
(A3)根据(A1)或(A2)所述的标记装置，包括：将含有所述粒子的待测体向所述过滤器的上面输送的单元。
(A4)根据(A3)所述的标记装置，所述待测体输送单元以待测体的流速为所述过滤器的每开口面积0.01mm/秒～100mm/秒的方式输送。
(A5)根据(A3)或(A4)所述的标记装置，其中，
从所述过滤器的下面侧向上面侧输送的单元以从所述过滤器的下面侧向上面侧的输送流速比所述待测体的流速的1/10快的方式输送。
(A6)根据(A1)至(A5)中任一项所述的标记装置，其中，
从所述过滤器的下面侧向上面侧输送的单元以从所述过滤器的下面侧向上面侧的输送流速为所述过滤器的每开口面积0.01mm/秒以上的方式输送。
〔B1〕一种标记装置，用于通过磁粒子对粒子进行标记，包括：
能够保持过滤器的过滤器部；
能够向所述过滤器部导入含有磁粒子的悬浮液的导入流路；
能够保持或排出通过了所述过滤器部的液体的排出流路；
能够向所述过滤器部供应所述悬浮液的输送单元；以及
控制所述输送单元的控制部，
所述控制部控制所述输送单元，以使得以成为含有所述磁粒子的液体与所述过滤器的双面接触的状态的方式，将所述悬浮液的一部分从一侧过滤器面向另一侧过滤器面输送，并且从所述另一侧过滤器面逆向输送含有磁粒子的液体。
〔B2〕根据〔B1〕所述的标记装置，其包括搅拌液体的单元。
〔B3〕根据〔B1〕或〔B2〕所述的标记装置，其包括在所述过滤器面乃至其附近搅拌液体的单元。
〔B4〕根据〔B1〕至〔B3〕中任一项所述的标记装置，所述控制部控制所述输送单元，以使得将含有所述标记的粒子的待测体向所述过滤器部供应。
〔B5〕根据〔B4〕所述的标记装置，所述控制部控制所述输送单元，以使得以所述过滤器的每开口面积0.01mm/秒～100mm/秒的流速输送所述待测体。
〔B6〕根据〔B4〕或〔B5〕所述的标记装置，所述控制部控制所述输送单元，以使得所述逆向输送的流速比所述待测体的流速的1/10快。
〔B7〕根据〔B1〕至〔B6〕中任一项所述的标记装置，所述控制部控制所述输送单元，以使得所述逆向输送的输送流速为所述过滤器的每开口面积0.01mm/秒以上。
[回收待测体中的细胞的方法]
为了以高精度分析稀有细胞，要求以高精度回收过滤器上捕获的细胞。因此，本公开在其他方式中，涉及能够以高回收率从过滤器回收过滤器上捕获的细胞的方法。
作为从血液分离或回收特定的成分的方法，例如，日本专利特开第2015-087382号公报中公开了以具有预定特性的过滤器处理血液并使过滤器捕获血液中的稀有细胞，并且对其进行分析的方法。
在检查之外的用途中也进行从体液回收细胞。例如，日本专利特开平第10-201470号公报(日本专利特许4412621)中公开了为了进行造血干细胞移植等，从骨髓等体液回收目标细胞的方法。日本专利特开平第10-201470号公报的实施例中公开了如下方法：通过将骨髓或末梢血等导入到无纺布，在由无纺布捕获白细胞或CD(cluster ofdifferentiation，分化群)34阳性细胞之后，使具有17.2mPa·s以上31.8mPa·s以下的粘度的液体逆流，由此回收无纺布上捕获的白细胞或CD34阳性细胞。
但是，日本专利特开平第10-201470号公报的方法中存在如下问题：用于回收的回收液的粘度必需为5mPa·s以上31.8mPa·s以下，用于回收液的组成受到限定。另外，如上所述，日本专利特开平第10-201470号公报是用于造血干细胞移植等的细胞的分离回收方法，因此存在如下问题：以大量的回收液量进行捕获单元上捕获的细胞的回收，因此不适合将回收后的细胞提供应分析。
日本专利特开第2015-087382号公报中没有公开回收过滤器上捕获的稀有细胞的技术。
本申请人确立了如下方法：如上所述，通过使用预定的过滤器，能够以高捕获率捕获SW620那样的小型的细胞和SNU-1那样的变形能力高的细胞(例如，日本专利特开第2015-087382号公报)。
另一方面，稀有细胞的分析例如通过稀有细胞的观察和数量的计测、以及测定从稀有细胞提取的核酸等而进行。为了高精度进行这些分析，需要从过滤器分离并回收过滤器上捕获的稀有细胞。
本发明的发明人在锐意研究的过程中，发现如下情况：在从捕获了稀有细胞的过滤器回收稀有细胞时，以回收液的流通流量相对于捕获稀有细胞时的待测体的流通流量之比([回收液的流量]/[待测体的流量])为25以上的方式使回收液逆流，由此能够以高回收率且少量的回收液来回收细胞。另外，本发明的发明人发现如下情况：相对于捕获稀有细胞的过滤器，以过滤器的每开口面积1mm/秒以上的流速来使回收液逆流，由此能够在抑制对细胞的损伤的同时，以高回收率回收过滤器上捕获的细胞。
本发明的发明人发现如下情况：作为能够以高回收率且少量的回收液回收过滤器上捕获的稀有细胞的原因之一，在稀有细胞的过滤(捕获)时稀有细胞或混合存在的其他的细胞堵塞一部分的孔，在回收时的过滤器上混合存在堵塞的孔和未堵塞的孔，其结果为，回收液的流通的按压力没有充分作用于堵塞的孔上捕获的稀有细胞。并且发现如下情况：从与用于捕获细胞的待测体的流通方向相反的方向流通回收液，并且，通过将该流速设置为流通回收液的过滤器面(过滤器的细胞捕获面的相反侧的过滤器面)中产生乱流的流速，能够以高回收率且少量的回收液来回收过滤器上捕获的稀有细胞。
日本专利特开平第10-201470号公报中公开了如下内容：以流速约5ml/分向聚酯无纺布制造的过滤器中流通末梢全血50ml之后，以100ml/分流通粘度超过17mPa·s的回收液30ml，由此回收过滤器中捕获的细胞(实施例1～5)。另一方面，该文献中还公开了如下内容：在替代上述粘度的回收液而使用粘度为1.0mPa·s的回收液(生理盐水)时，回收率为31％以下(比较例1和2)。
与此相对，根据本公开的方法，将回收液的流通流量相对于细胞捕获时的待测体的流通流量之比或回收液的流速设定为特定的范围，且使用特定的过滤器(具有多个贯通孔的过滤器)，由此不管回收液的粘度如何，也能实现能够以高回收率回收过滤器上捕获的细胞。进一步，本公开的方法即使在日本专利特开平第10-201470号公报中不能得到充分的回收率的粘度的回收液的情况下，也能够实现能以高回收率回收。即，本公开的方法是与日本专利特开平第10-201470号公报的技术思想完全不同的技术。
另外，日本专利特开平第10-201470号公报的方法是为了进行造血干细胞移植等，从白细胞、血小板和红细胞的混合物选择性有效地回收白细胞的方法，日本专利特开平第10-201470号公报中，作为捕获细胞(白细胞)的单元，优选地例示了无纺布这类每体积的表面积大的物质。与此相对，本公开的方法是为了进行分析、诊断等，能够用于被具有多个贯通孔的过滤器捕获的稀有细胞的回收中的技术。即，日在本专利特开平第10-201470号公报和本公开的方法中，目的完全不同。另外，对日本专利特开平第10-201470号公报中使用的无纺布和本公开使用的具有多个贯通孔的过滤器来说，细胞被捕获的机理或被捕获的状态差异大，本公开的方法和日本专利特开平第10-201470号公报是完全不同的技术思想。
本公开中“流通流量”是指单位时间流过的液体的量(体积)。在一个或多个实施方式中，作为流通流量，可以举出单位时间通过过滤器的液体的量(体积)。
本公开中“过滤器的每开口面积的流速”是指通过过滤器的开口部(孔)的液体的速度。在一个或多个实施方式中，每开口面积的流速可以通过流通流量除以开口部(孔)的总面积来计算。
[细胞的回收方法]
本公开在一个方式中涉及从具有多个贯通孔的过滤器回收被所述过滤器中捕获的细胞的方法(本公开的回收方法)。本公开的回收方法在一个方式中，包括：在捕获了细胞的所述过滤器上，从与用于细胞的捕获的待测体的流通方向相反的方向，以回收液的流通流量和待测体的流通流量之比([回收液的流量]/[待测体的流量])为25以上的方式，流通回收液；以及回收所述过滤器上停留的回收液。另外，本公开的回收方法在一个方式中，包括：从与用于捕获细胞的待测体的流通方向相反的方向，以每开口面积1mm/秒以上的流速，向捕获了细胞的所述过滤器流通回收液；以及回收所述过滤器上停留的回收液。
根据本公开，在一个或多个实施方式中，能够以高回收率回收过滤器上捕获的细胞。根据本公开，在一个或多个实施方式中，能够抑制对细胞的损伤，并且以高回收率回收过滤器上捕获的细胞。另外，根据本公开，在一个或多个实施方式中，能够以少量的回收液(例如，能够容纳在微管的水平)回收细胞。
本公开的回收方法包括：对捕获了细胞的、具有多个贯通孔的过滤器，从与用于捕获所述细胞的待测体的流通方向相反的方向流通回收液。在一个或多个实施方式中，回收液的流通以回收液的流通流量和待测体的流通流量之比([回收液的流量]/[待测体的流量])为25以上的方式进行，或者以每开口面积1mm/秒以上的流速流通来进行。对具有多个贯通孔的过滤器，以上述流通条件使回收液逆流，由此能够在一个或多个实施方式中，在抑制对细胞的损伤的同时，以高回收率回收过滤器上捕获的细胞。作为本公开的回收方法中“从逆方向流通(逆流)”，也可以是指为了捕获细胞而从导入了待测体的一侧的过滤器面的相反侧的过滤器面导入回收液，或从待测体的流通时待测体流出的一侧(下游侧)向流入待测体的一侧(上游侧)流入回收液。
在一个或多个实施方式中，回收液的流通流量和待测体的流通流量之比([回收液的流量]/[待测体的流量])为25以上，从提高从过滤器回收细胞的回收率的观点出发，为100以上、150以上、200以上、300以上或400以上。从抑制对细胞的损伤的观点出发，为100,000以下、50,000以下或25,000以下。另外，从进一步提高细胞的回收率的观点出发，为1,000以上、1,200以上、1,500以上、2,000以上、2,200以上或4,000以上，从同样的观点出发，为15,000以下、12,000以下或10,000以下。
从提高从过滤器回收细胞的回收率的观点出发，在一个或多个实施方式中，回收液的流量为25ml/分以上、50ml/分以上、100ml/分以上、110ml/分以上或120ml/分以上。从抑制对细胞的损伤的观点出发，为100,000ml/分以下、50,000ml/分以下或10,000ml/分以下。另外，从进一步提高细胞的回收率的观点出发，为300ml/分以上、500ml/分以上或550ml/分以上，从同样的观点出发，为7,000ml/分以下、6,000ml/分以下、5,000ml/分以下、4,000ml/分以下、3,000ml/分以下、2,000ml/分以下或1,000ml/分以下。
作为回收液的流速，在一个或多个实施方式中，从在为了捕获细胞而导入待测体的一侧的过滤器面的相反侧的过滤器面中产生乱流、提高从过滤器回收细胞的回收率的观点出发，为每开口面积1mm/秒以上、5mm/秒以上、10mm/秒以上、15mm/秒以上、20mm/秒以上、25mm/秒以上、30mm/秒以上、或35mm/秒以上。从抑制细胞的损伤的观点出发，为100,000mm/秒以下、50,000mm/秒以下、30,000mm/秒以下、10,000mm/秒以下或5,000mm/秒以下。从进一步提高细胞的回收率的观点出发，为100mm/秒以上、150mm/秒以上或160mm/秒以上，从同样的观点出发为4,000mm/秒以下、3,500mm/秒以下、3,000mm/秒以下、2,000mm/秒以下或1,500mm/秒以下。
在一个或多个实施方式中，回收液的流通量和待测体的流通量之比([回收液的容积]/[通过过滤器的待测体的容积])为低于0.6，从提高从过滤器回收细胞的回收率的观点出发，为0.001以上、0.002以上、0.003以上、0.004以上或0.005以上。从使得容易进行回收的细胞的分析的观点出发，为低于0.6、0.5以下或0.4以下。另外，从进一步提高细胞的回收率的观点出发，0.006以上、0.007以上、0.008以上、0.009以上或0.01以上，从同样的观点出发为0.3以下、0.2以下或0.1以下。
回收液的流通压力为30kPa以上150kPa以下。在一个或多个实施方式中，从提高从过滤器回收稀有细胞的回收率的观点出发，回收液的流通压力为35kPa以上、40kPa以上、45kPa以上、50kPa以上或55kPa以上，从同样的观点出发为130kPa以下、或120kPa以下。
作为回收液，在一个或多个实施方式中，可举出磷酸缓冲生理盐水(PBS)、PBS-BSA(例如0.2％)、PBS-EDTA(例如1mg/ml)和缓冲液、等张液和水等水性溶剂。作为缓冲液，在一个或多个实施方式中，可举出Tris-HCl缓冲液等Tris缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液等。另外，作为等张液，可举出生理盐水、蔗糖等张液、葡萄糖等张液、甘露糖等张液等。
在本公开的回收方法中，回收液的粘度不限于日本专利特开平第10-201470号公报中限定的特定的范围，也可以是其他范围的粘度。回收液的粘度不特别限定，从进一步提高细胞的回收率的观点出发，在一个或多个实施方式中，25℃中的粘度为低于5mPa·s，或25℃中的粘度为0.5mPa·s以上。
在一个或多个实施方式中，为了满足上述流通压力或流量，回收液的流通可以使用能够使回收液流通的驱动力而进行。在一个或多个实施方式中，作为回收液的导入，可以举出使用从流路的出口方向(待测体流出的一侧(下游侧))加压的方法、使用从流路的入口方向(流入待测体的一侧(上游侧))减压的方法、使用注射泵、管式泵(也称滚筒泵或蠕动泵)或柱塞泵的方法、或者利用了机械驱动的方法等。
根据本公开的回收方法，在一个或多个实施方式中，能够以少量的回收液从过滤器以高回收率回收细胞。作为回收液的流通量，在一个或多个实施方式中，为10ml以下、8ml以下、6ml以下、5ml以下、4ml以下、2ml以下或1ml以下，或者0.05ml以上、0.1ml以上或0.2ml以上。
在一个或多个实施方式中，本公开的回收方法可以包括使含细胞的待测体流通过滤器。通过使待测体流通过滤器，能够使过滤器捕获待测体中可含有的稀有细胞。
从提高细胞的捕获率的观点出发，在一个或多个实施方式中，待测体的流通流量为0.01ml/分以上、0.05ml/分以上或0.1ml/分以上，从同样的观点出发，为100ml/分以下、50ml/分以下、25ml/分以下或10ml/分以下。
从提高细胞的捕获率的观点出发，在一个或多个实施方式中，待测体的流速为每开口面积0.01mm/秒以上、0.05mm/秒以上或0.1mm/秒以上，从同样的观点出发，为100mm/秒以下、50mm/秒以下、25mm/秒以下、10mm/秒以下、5mm/秒以下或2mm/秒以下。
待测体的流通量(通过过滤器的血液待测体的量)例如相对于5mm2～10,000mm2的过滤面积，为0.07ml以上、0.25ml以上、0.5ml以上、1ml以上、比1ml多的量、2ml以上、3ml以上或4ml以上。另外，在一个或多个实施方式中，从维持稀有细胞的捕获率的观点出发，待测体的流通量相对于5mm2～10,000mm2的过滤面积为6L以下、4L以下、2L以下、400ml以下、200ml以下、100ml以下、80ml以下、50ml以下、30ml以下、25ml以下、12ml以下、11ml以下、10ml以下、9ml以下或8ml以下。或者，在一个或多个实施方式中，从一次处理很多试样的观点、捕获易变形的细胞的观点以及维持稀有细胞的捕获率的观点出发，过滤器容量对于15mm2～200mm2的过滤面积，为比0.2ml多，或者低于130ml或130ml以下，从同样的观点出发，为0.8ml～90ml、0.8ml～60ml、2ml～50ml或2ml～40ml。
从提高细胞的捕获率的观点出发，在一个或多个实施方式中，待测体的流通压力(ΔP1)为0.1kPa以上或0.2kPa以上、或者2.6kPa以下、1.5kPa以下、1.3kPa以下、1.0kPa或0.5kPa以下。本公开的“待测体的流通压力”是指从系统的入口到出口的系统整体的压力差，例如，指包括流路在内的系统的压力差，所述流路包括从配置了待测体的容器到废液容器为止。因此，根据流路结构，也可以是记载以上的压力。流通压力(系统的压力差)能够以公知的方法使用市售的压力计测定，或基于流量和流路结构的关系而计算。
本公开的回收方法中使用的过滤器是具有多个贯通孔的过滤器。由于细胞被具有贯通孔的过滤器捕获，因此与无纺布相比，在一个或多个实施方式中，能够降低对细胞的损伤，以少量的回收液且高回收率从过滤器回收细胞。作为过滤器，在一个或多个实施方式中，可举出具有多个贯通孔的狭缝状的过滤器。作为贯通孔的形状，在一个或多个实施方式中，可举出圆角矩形或椭圆形。
作为本公开的回收方法中使用的过滤器，在一个或多个实施方式中，可举出能够捕获待测体中的稀有细胞的过滤器。作为过滤器，可以使用能够用于本公开的标记方法中的过滤器。
向流通待测体之后的过滤器，从与流通待测体的方向相反的逆方向流通回收液，由此从过滤器分离稀有细胞，包含分离的稀有细胞的回收液在过滤器上存在。在一个或多个实施方式中，本公开的回收方法也可以包括对流通回收液之后的过滤器上存在的回收液进行回收。在一个或多个实施方式中，回收液的回收也可以使用移液器等而进行。另外，在进行该回收时，可以搅拌回收液，也可以不搅拌回收液。
在一个或多个实施方式中，本公开的回收方法可以包括在过滤器上对过滤器上捕获的细胞进行处理。作为处理，在一个或多个实施方式中，可以举出固定处理、细胞膜渗透处理和染色处理等。
[稀有细胞的分析方法]
本公开作为其他方式，涉及血液待测体中的稀有细胞的分析方法(本公开的分析方法)，包括：通过本公开的回收方法来回收稀有细胞；以及以包含该细胞的动态观察或活性测定的方法来进行分析。根据本公开的分析方法，由于通过本公开的回收方法来回收稀有细胞，因此能够以高回收率回收稀有细胞。因此，根据本公开的分析方法，能够以高精度进行稀有细胞的计测或分析。
[细胞回收装置]
本公开作为其他方式，涉及细胞回收装置(本公开的细胞回收装置)。通过本公开的细胞回收装置，能够通过本公开的回收方法以高回收率进行细胞的回收。在一个或多个实施方式中，本公开的细胞回收装置能够进行从过滤器回收该过滤器上捕获的细胞、以及使用过滤器捕获细胞等。
本公开的细胞回收装置作为一个方式，包括：分离部，所述分离部包括用于捕获细胞的、具有多个贯通孔的过滤器、以及保持过滤器的保持部；至少一个导入流路，所述导入流路用于将含有细胞的待测体导入到分离部；至少一个输送单元，所述输送单元用于通过导入流路将所述待测体供应到分离部；排出流路，所述排出流路用于将通过了分离部的待测体向外部排出；容器，所述容器用于容纳用于回收分离部捕获的细胞的回收液；逆向输送单元，所述逆向输送单元用于从容器通过排出流路将回收液向分离部供应；以及控制部，所述控制部为了通过本公开的细胞回收方法进行细胞的回收而控制所述逆向输送单元。在一个或多个实施方式中，控制部控制逆向输送单元，以使得所述回收液的流通流量和所述待测体的流通流量之比([回收液的流量]/[待测体的流量])为25以上、以及/或者回收液的流速为每开口面积1mm/秒以上。
在一个或多个实施方式中，分离部至少包括过滤器，可拆装地安装在导入流路和排出流路上。作为过滤器，在一个或多个实施方式中，可以举出上述的过滤器。
作为输送单元和逆向输送单元，在一个或多个实施方式中，可举出加压单元、减压单元、注射泵、管式泵(也称滚筒泵或蠕动泵)、柱塞泵、或机械驱动等。
在一个或多个实施方式中，输送单元可以将用于处理待测体中的细胞的处理液通过导入流路而导入到分离部。作为处理液，在一个或多个实施方式中，可以举出固定处理、细胞膜渗透处理或染色处理等中使用的处理液。在一个或多个实施方式中，本公开的细胞回收装置可以具备用于容纳处理液的容器，所述处理液用于处理待测体中的细胞。
在一个或多个实施方式中，控制部能够记录细胞捕获时使用的过滤器和过滤条件等。在一个或多个实施方式中，控制部可以通过回收装置的计算机包括的处理器执行预定的程序来实现。
在一个或多个实施方式中，本公开的细胞回收装置包括回收向分离部供应的回收液的回收单元。作为回收单元，在一个或多个实施方式中，可举出吸嘴机构等。由吸嘴或移液器等吸引过滤器上部停留的回收液，由此能够回收细胞。
作为其他方式，本公开的细胞回收装置包括使得能够通过本公开的回收方法来进行细胞的回收的控制程序。
[细胞回收系统]
本公开作为其他方式，涉及细胞回收系统(本公开的细胞回收系统)。根据本公开的细胞回收系统，能够通过本公开的回收方法以高回收率进行细胞的回收。在一个或多个实施方式中，本公开的细胞回收系统能够进行从该过滤器回收过滤器上捕获的细胞、以及使用了过滤器的细胞的捕获等。
在一个或多个实施方式中，本公开的细胞回收系统包括：过滤器单元，所述过滤器单元具备过滤器和保持部，过滤器用于捕获细胞并具有多个贯通孔，保持部保持所述过滤器；分离单元，所述分离单元具备流路部和输送单元，流路部能够配置所述过滤器单元，输送单元能够使含有细胞的待测体通过所述流路部向所述过滤器流通；回收单元，所述回收单元具备流路部和逆向输送单元，流路部能够配置过滤器单元，逆向输送单元能够从与分离单元的流通方向相反的方向通过流路部向所述过滤器流通回收液；以及控制单元，所述控制单元为了通过本公开的细胞回收方法进行细胞的回收而控制所述逆向输送单元。在一个或多个实施方式中，控制单元控制分离单元的输送单元和回收单元的输送单元，以使得回收液的流通流量和待测体的流通流量之比([回收液的流量]/[待测体的流量])为25以上、以及/或者回收液的流速为每开口面积1mm/秒以上。在一个或多个实施方式中，过滤器单元在分离单元和回收单元的流路部上可拆装。根据本公开的细胞回收系统，在一个或多个实施方式中，在分离单元中进行细胞的捕获之后，能够将过滤器单元移到回收单元中，并且在回收单元中回收过滤器上捕获的细胞。
在一个或多个实施方式中，本公开的细胞回收系统包括：分离部，所述分离部具备过滤器和保持部，所述过滤器用于捕获细胞并具有多个贯通孔，所述保持部保持过滤器；至少一个导入流路，所述导入流路用于将含有细胞的待测体导入到分离部；至少一个输送单元，所述输送单元通过导入流路将待测体向分离部供应；排出流路，所述排出流路用于将通过了分离部的待测体向外部排出；容器，所述容器用于容纳回收液，所述回收液用于回收被分离部捕获的细胞；逆向输送单元，所述逆向输送单元用于从容器通过排出流路将回收液向分离部供应；以及控制单元，所述控制单元为了通过本公开的细胞回收方法进行细胞的回收而控制所述逆向输送单元。在一个或多个实施方式中，控制单元控制所述逆向输送单元，以使得所述回收液的流通流量和所述待测体的流通流量之比([回收液的流量]/[待测体的流量])为25以上、以及/或者回收液的流速为每开口面积1mm/秒以上。
图4中示出能够在本公开的回收方法或分析方法中利用的稀有细胞捕获回收装置的例子。如图4所示的稀有细胞捕获回收装置具有用于将待测体、清洗液、染色液等供应至过滤器的供应口41、排出口42、连通供应口41和排出口42的流路43、以及被配置在相当于流路43的一部分的位置的分离部。分离部包括过滤器44、以及保持过滤器44的过滤器保持器45。过滤器保持器45包括能够设置过滤器44的支承部(基座)46、固定过滤器44的O环47和罩48。通过在支承部46上设置过滤器44、在过滤器44的上面放置O环47和罩48、固定过滤器44，来形成包括具有孔的过滤器的分离部(过滤器设备)。连接供应口41与分离部、以及分离部与排出口42的流路43通过在分离部的两端连接Safido(商标)管(泰尔茂公司制)而形成。在连接供应口41与分离部的流路43中，也可以在分离部的上部配置连接部(未图示)以及能够进行液体的切换的三通旋塞(未图示)。另外，可以在连接供应口41和分离部的流路43上配置(作为能够以恒定的压力输送的机构或能够以恒流量输送的机构的)加压单元49并使对过滤施加的压力为恒定，或者以通过注射泵吸引从而使对过滤施加的压力为恒定以上的方式进行输送。
图5中示出能够在本公开的回收方法或分析方法中利用的稀有细胞捕获回收装置的其他例子。图5所示的稀有细胞捕获回收装置包括：用于将容器52内的待测体导入到分离部51的导入流路56；具备过滤器的分离部51；容纳回收液的容器55；以及用于排出从分离部51排出的废液的排出流路57。容纳回收液的容器55以能够通过排出流路57而向分离部51逆向输送回收液的方式，通过流路与排出流路57连接。容器55上连接有用于向分离部51逆向输送回收液的泵等输送单元。导入流路56上除了容纳待测体的容器52之外，例如，能够通过流路而与容纳清洗液的容器13、以及容纳用于处理待测体中的细胞的处理液的容器54连接。在排出流路57的一端能够配置用于回收废液的容器58。
本公开中，“细胞”无特别限定，可以举出人或人以外的动物的细胞。
本公开中的“稀有细胞”是指人或人以外的动物的血液中可含有的血细胞成分(红细胞、白细胞和血小板)以外的细胞。作为稀有细胞，在一个或多个实施方式中，可举出肿瘤细胞或癌细胞。一般将在血液中循环的肿瘤细胞或癌细胞称为CTC。作为血液中的稀有细胞数，也与待测体相关，有时在血液10ml中含有数个～数十个、多的时候为数百～千个。在一个或多个实施方式中，“稀有细胞”是选自癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间充质系干细胞、胎儿细胞、干细胞以及它们的组合构成的组中的细胞。
作为稀有细胞，在不特别限定的一个或多个实施方式中，可举出人结肠癌细胞、人胃癌细胞、人大肠癌细胞、人肺癌细胞、人肺癌细胞、人肺癌细胞、人肺癌细胞和人肺癌细胞等。
本公开中，“待测体”可举出可应用于本公开的回收方法中的、可含有细胞的试样。作为待测体，在一个或多个实施方式中，可举出血液待测体。作为血液待测体，在一个或多个实施方式中，为含有构成血液的成分的试样，在不特别限定的一个或多个实施方式中，可举出血液、含有血细胞成分的血液来源物、血液或血液来源物混合存在的体液或尿、以及由它们制备的试样等。作为血液，可举出从活体采集的血液，作为所述活体，可举出人或人以外的动物(例如，哺乳类)。作为含有血细胞成分的血液来源物，可举出从血液分离或制备的且含有血细胞成分的、或者它们的稀释物/浓缩物，例如，包括去除了血浆的血细胞成分、血细胞浓缩物、血液或血细胞冷冻干燥物、对全血进行溶血处理并去除了红细胞成分的试样或溶血试样、离心分离血液、自然沉降血液、清洗血细胞、特定的成分等。其中，在不限定的一个或多个实施方式中，从简便且迅速处理的观点和抑制对血液中的稀有细胞的损伤的观点出发，作为含有所述血液的试样，优选含有血液或血细胞成分的血液来源的待测体。
本公开涉及以下一个或多个实施方式。
〔C1〕一种细胞的回收方法，从具有多个贯通孔的过滤器回收所述过滤器上捕获的细胞，所述回收方法包括：
向捕获了细胞的所述过滤器，从与用于捕获所述细胞的待测体的流通方向相反的方向流通回收液，
所述回收液的流通以所述回收液的流通流量和待测体的流通流量之比([回收液的流量]/[待测体的流量])为25以上的方式进行。
〔C2〕一种细胞的回收方法，从具有多个贯通孔的过滤器回收所述过滤器上捕获的细胞，所述回收方法包括：
向捕获了细胞的所述过滤器，从与用于捕获所述细胞的待测体的流通方向相反的方向，以所述过滤器的每开口面积1mm/秒以上的流速，流通回收液。
〔C3〕根据〔C1〕所述的回收方法，所述回收方法包括：
以所述过滤器的每开口面积1mm/秒以上的流速向所述过滤器流通所述回收液。
〔C4〕根据〔C1〕至〔C3〕中任一项所述的回收方法，所述回收方法包括：
通过以每开口面积0.01mm/秒～100mm/秒的流速向所述过滤器流通含细胞的待测体，来将所述细胞捕获在所述过滤器上。
〔C5〕根据〔C1〕至〔C4〕中任一项所述的回收方法，所述过滤器是能够捕获稀有细胞的过滤器。
〔C6〕根据〔C1〕至〔C5〕中任一项所述的回收方法，所述过滤器的材质选自包括镍、SUS、金、银、铜、铝、钨、和铬的组。
〔C7〕根据〔C1〕至〔C6〕中任一项所述的回收方法，所述细胞是稀有细胞。
〔C8〕一种血液待测体中的稀有细胞的分析方法，所述分析方法包括：
通过〔C1〕至〔C7〕中任一项所述的回收方法来回收稀有细胞；以及
以包括该细胞的动态的观察或活性测定的方法进行分析。
〔C9〕一种细胞回收装置，其包括：
分离部，所述分离部包括用于捕获细胞的、具有多个贯通孔的过滤器，以及保持所述过滤器的保持部；
至少一个导入流路，所述导入流路用于将含有细胞的待测体导入到所述分离部；
至少一个输送单元，所述输送单元用于通过所述导入流路将所述待测体供应到所述分离部；
排出流路，所述排出流路用于将通过了所述分离部的待测体向外部排出；
容器，所述容器用于容纳用于回收所述分离部捕获的细胞的回收液；
逆向输送单元，所述逆向输送单元用于从容器通过所述排出流路将回收液向分离部供应；以及
控制部，所述控制部控制所述逆向输送单元，以使得所述回收液的流通流量和所述待测体的流通流量之比([回收液的流量]/[待测体的流量])为25以上。
〔C10〕一种细胞回收装置，其包括：
分离部，所述分离部包括用于捕获细胞的、具有多个贯通孔的过滤器，以及保持过滤器的保持部；
至少一个导入流路，所述导入流路用于将含有细胞的待测体导入到分离部；
至少一个输送单元，所述输送单元用于通过所述导入流路将所述待测体供应到分离部；
排出流路，所述排出流路用于将通过了所述分离部的待测体向外部排出；
容器，所述容器用于容纳用于回收所述分离部捕获的细胞的回收液；
逆向输送单元，所述逆向输送单元用于从容器通过所述排出流路将回收液向分离部供应；以及
控制部，所述控制部控制所述逆向输送单元，以使得以每开口面积1mm/秒以上的流速进行所述回收液的流通。
〔C11〕一种细胞回收装置，其包括：〔C1〕至〔C7〕中任一项所述的回收方法的控制程序。
〔C12〕根据〔C9〕或〔C10〕所述的细胞回收装置，其包括：〔C1〕至〔C7〕中任一项所述的回收方法的控制程序。
〔C13〕根据〔C9〕至〔C12〕中任一项所述的细胞回收装置，其包括：回收向所述分离部供应的回收液的回收单元。
〔C14〕一种细胞回收系统，其包括：
过滤器单元，所述过滤器单元具备过滤器和保持部，所述过滤器用于捕获细胞并具有多个贯通孔，所述保持部保持所述过滤器；
分离单元，所述分离单元具备流路部和输送单元，所述流路部能够配置所述过滤器单元，所述输送单元能够使含有细胞的待测体通过所述流路部向所述过滤器流通；
回收单元，所述回收单元具备流路部和逆向输送单元，所述流路部能够配置过滤器单元，所述逆向输送单元能够从与所述分离单元的流通方向相反的方向通过所述流路部向所述过滤器流通回收液；以及
控制单元，所述控制单元控制所述分离单元的输送单元和所述回收单元的输送单元，以使得所述回收液的流通流量和所述待测体的流通流量之比([回收液的流量]/[待测体的流量])为25以上。
〔C15〕一种细胞回收系统，其包括：
过滤器单元，所述过滤器单元具备过滤器和保持部，所述过滤器用于捕获细胞并具有多个贯通孔，所述保持部保持所述过滤器；
分离单元，所述分离单元具备流路部和输送单元，所述流路部能够配置所述过滤器单元，所述输送单元能够使含有细胞的待测体通过所述流路部向所述过滤器流通；
回收单元，所述回收单元具备流路部和逆向输送单元，所述流路部能够配置过滤器单元，所述逆向输送单元能够从与分离单元的流通方向相反的方向通过流路部向所述过滤器流通回收液；以及
控制单元，所述控制单元控制所述分离单元的输送单元和所述回收单元的输送单元，以使得以每开口面积1mm/秒以上的流速进行所述回收液的流通。
示例
以下，使用实施例来对本公开进行进一步的说明。但是，本公开不限定于以下的实施例而解释。另外，下述的细胞捕获、标记装置和细胞捕获装置也可以组合多个单元而构成。
1.磁标记效率的确认
(实施例1)
使用图1所示的细胞捕获、标记装置，通过细胞(白细胞)的捕获和磁粒子来进行标记，并确认标记效率。
[细胞标记装置]
准备图1所示的细胞标记装置。图1的细胞标记装置包括设备上部3、包含过滤器10的过滤器部5、设备下部4、以及能够向箭头A方向和箭头B方向输送的输送机构(未图示)。过滤器10被配置在设备上部3和设备下部4之间，且通过双面胶11、12而被固定。作为过滤器10，使用具备多个贯通孔、且具有下述特性的过滤器。
<过滤器的特性>
·孔：短轴径：6.5μm、长轴径：88μm、面积：572μm2、形状：狭缝
·孔的中心间的间距：14μm×100μm(短轴径侧×长轴径侧)
·孔密度：714个/mm2
·开口率：41％
·膜厚：5μm
·材质：镍
·过滤面积：79mm2
[磁粒子标记]
使用图1的细胞标记装置，按照下述步骤1～8的顺序，由磁粒子标记血液中所含的细胞(白细胞)。
步骤1：向细胞标记装置导入含有稀有细胞和白细胞的血液8mL，过滤器过滤血液并大小选择地捕获稀有细胞和白细胞等细胞(过滤流量：100μL/分、流速：0.144mm/秒)。
步骤2：将包含针对CD45和CD50的抗体的抗体液、以及包含识别所述抗体的Biotin(生物素)化抗体的抗体液依次供应到过滤器，并与细胞反应，对CD45和CD50表达细胞(例如，白细胞)进行Biotin标记。抗体液以与过滤器的双面接触的方式，不仅停留在过滤器上部，也停留在过滤器下部。
步骤3：向滤器上面供应Neutravidin(中性亲和素)标记磁粒子悬浮液，以悬浮液的下面位于比过滤器下面靠下的位置的方式，从过滤器上部向图1的箭头A方向输送一部分。
步骤4：从过滤器下部向图1的箭头B方向逆向流动(逆流流量：10,000μL/分、流速：14.441mm/秒)。
步骤5：对过滤器上部的悬浮液进行移液。
步骤6：从图1的箭头A方向再次输送(250μL/分)过滤器上部的悬浮液(细胞和磁粒子的搅拌液)。
步骤7：从图1的箭头A方向输送不含磁粒子的清洗液。由此，去除未反应的磁粒子。
步骤8：从过滤器下部向图1的箭头B方向输送回收液，由移液器吸引过滤器上部停留的回收液，并与回收液一起回收由磁粒子标记的细胞(白细胞)和稀有细胞。
[标记效率的评价]
使用钕磁铁而对步骤8中回收的细胞进行磁分离。对没有被磁铁捕获而回收的白细胞的数量进行计数。其结果如图3所示。
(比较例1)
除了不进行步骤4～6之外，与实施例1同样地进行。其结果如图3所示。
(比较例2)
除了不进行步骤4之外，与实施例1同样地进行。其结果如图3所示。
如图3所示，通过实施例1的方法，能够大幅度降低残留的白细胞的数量、即未通过磁分离而被磁铁捕获的白细胞的数量。由此，根据实施例1的方法，可以说能够在过滤器上以高的标记效率对白细胞进行磁标记。
(实施例2)
[试样的制备]
以下述的顺序制备荧光和Biotin(生物素)标记的白细胞。
首先，使用真空采血管(EDTA 2K)从人体进行采血。
接着，按照HetaSep(STEMCELL公司)的附件，从采集的全血进行白细胞的分离。
针对由HetaSep分离的1×106个白细胞，在封闭液(Dulbecco(杜氏)PBS(-)中溶解10％山羊血清、0.000001％Avidin(亲和素)和0.2％BSA)中23℃下反应10分钟。离心，去除上清液之后，使用DulbeccoPBS(-)重新悬浮。再次离心，去除上清液。
接着，在溶解了10％山羊血清、0.01％Biotin、0.2％BSA的DulbeccoPBS(-)中，分别按照附件添加抗CD45抗体和抗CD50抗体来制备第一抗体反应液。以制备的第一抗体反应液使细胞(白细胞)悬浮，在23℃下反应15分钟。在离心、去除上清液之后，使用DulbeccoPBS(-)进行悬浮。之后，总共进行三次离心并去除上清液的步骤，充分清洗细胞。
在溶解了2μg/ml Hoechst33342、10％山羊血清和0.2％BSA的DulbeccoPBS(-)中，分别按照附件添加Alexa594标记抗小鼠IgG(Fab)和Biotin标记抗小鼠IgG(Fc)并制备第二抗体反应液。以制备的第二抗体反应液悬浮清洗的细胞、在23℃下反应15分钟。在离心、去除上清液之后，使用DulbeccoPBS(-)进行悬浮。总共进行三次离心并去除上清液的步骤，充分清洗细胞(白细胞)。
由此，制备含有荧光和Biotin标记的白细胞的试样。
[细胞的捕获]
将含有荧光和Biotin标记的白细胞(1×105个)的试样与实施例1同样地从箭头1方向导入到图1的细胞标记装置，以100μL/分的流量(流速：0.144mm/秒)过滤器过滤。
作为过滤器10，使用具备多个贯通孔、且具有下述特性的过滤器。
<过滤器的特性>
·孔：短轴径：6.5μm、长轴径：88μm、面积：572μm2、形状：狭缝
·孔的中心间的间距：14μm×100μm(短轴径侧×长轴径侧)
·孔密度：714个/mm2
·开口率：41％
·膜厚：5μm
·材质：镍
·过滤面积：28mm2。
[磁粒子标记]
将DulbeccoPBS(-)中溶解了0.2％BSA的溶液输送至图1的装置，并填充到流路8。在过滤器10的上面添加200μL的磁粒子液(Neutravidin标记磁粒子悬浮液，固体成分浓度：0.0125％)，磁粒子液的下面以位于比过滤器10靠下的方式，对添加的磁粒子液的一部分(100μL)进行输送过滤。使用逆流输送机构，以10000μL/分的流量逆流输送DulbeccoPBS(-)中溶解了0.2％BSA的溶液200μL(图1的箭头B方向)。在对过滤器10上的溶液(固体部分浓度：0.0062％)进行移液器搅拌之后，在23℃下反应15分钟。接着，以250μL/分的流量输送300μL的、含有过滤器10上面的白细胞的磁粒子液(图1的头A方向)，并在23℃下进一步反应15分钟。由此，用磁粒子对白细胞磁标记。
[磁粒子的清洗]
之后，将溶解了1mg/mL EDTA的DulbeccoPBS(-)1000μL添加到过滤器10的上面，然后以1000μL/分的流量输送(图1的箭头A方向)。总共进行4次该步骤，并清洗过滤器10上的剩余磁粒子。
[细胞的回收]
使用逆流输送机构以10000μL/分的流量(14mm/秒)逆流输送DulbeccoPBS(-)中溶解了0.2％BSA的溶液1000μL(图1的箭头B方向)。并且，通过移液器吸引而全量回收过滤器10上的溶液1100μL。
[标记效率的评价]
使回收的悬浮液磁分离，将未被磁分离的(被磁铁捕获的)白细胞判断为未磁标记(或标记不充分)，并进行标记效率的评价。
即，使用钕磁铁，对回收的细胞进行磁分离。对未被磁铁捕获而回收的白细胞的数量进行计数。
具体而言，使用荧光显微镜对回收的悬浮液1000μL中所含的细胞中的、Alexa594和Hoechst33342两者都是阳性的细胞(磁分离后的白细胞数(LEUK-a))进行计数。
另一方面，使用血细胞计数机(Moxi-Z)，对标记后回收的悬浮液中的、未用于磁分离的悬浮液100μL中的白细胞计算白细胞浓度，并计算1000μL中的白细胞数(磁分离前的白细胞数(LEUK-b))。
使用得到的白细胞数(LEUK-a和LEUK-b)，通过下述式来计算未标记率。其结果示于下述表1。
[未标记率]＝{1-([LEUK-b]-[LEUK-a]/[LEUK-b])}×100
(实施例3～5)
除了使用与实施例2相同的制备方法而新制备的试样、且将磁粒子的悬浮液的逆流输送时的流量设为下述表1的流量之外，与实施例2同样地进行。其结果如下述表1所示。
(比较例3)
除了使用与实施例2相同的制备方法新制备的试样、且在磁粒子标记中不进行逆流输送之外，与实施例2同样地进行。即，在输送过滤添加到过滤器上面的磁粒子液(200μL)的一部分(100μL)之后，在由移液器搅拌过滤器上的溶液之后，在23℃下反应30分钟，由此进行磁粒子标记。其结果如下述表1所示。
Figure BDA0001425193660000381
*相对值：将比较例3的残留率(％)设为100时的残存率的相对值
如表1所示，通过实施例2～5的方法进行标记，由此能够将未标记率、即未被磁标记的(或标记不充分的)白细胞的比例降低至低于1％。即，可以说根据实施例2～5的方法，能够在过滤器上以高的标记效率磁标记白细胞。
(实施例6)
除了使用与实施例2相同的方法新制备的试样、以每次100μL、分两次进行磁粒子液的一部分的输送过滤后的逆流输送(总计的输送量：200μL)之外，与实施例2同样地进行。其结果在下述表2中示出。
(实施例7)
除了使用与实施例2相同的方法新制备的试样之外，与实施例2同样地进行。其结果如下述表2所示。
Figure BDA0001425193660000391
如表2所述，即使在实施例6和7的方法中任一者的情况下，也能够以高的标记效率在过滤器上磁标记白细胞。另外，可知通过至少进行一次磁粒子液的输送过滤后的逆流输送，来可获得期望的效果。
另外，在处理条件相同的实施例7和实施例2中未标记率不同的理由为，使用的待测体的差异、具体待测体中所含的白细胞的差异。上述实施例中，使用在白细胞的表面表达的CD抗原而进行了磁粒子的标记，但是存在因CD抗原的表达上个体间变动(个人差)或个体内变动而产生的待测体间差。考虑为基于该待测体间差，未标记率不同。此外，本公开的方法中，已经确认了只要是同一待测体，标记率就能够得到充分的再现性。
(实施例8)
除了使用与实施例2同样的方法新制备的试样之外，与实施例2同样地进行。其结果如下述表3所示。
(实施例9)
除了使用与实施例2同样的方法新制备的试样、且没有进行移液器搅拌之外，与实施例8同样地进行。其结果如下述表3所示。
Figure BDA0001425193660000401
如表3所示，通过实施例8和9的方法，能够在过滤器上以高的标记效率磁标记白细胞。尤其是，通过进行逆流输送后的移液器搅拌，能够进一步提高磁标记效率。
(比较例4)
除了使用与实施例2同样的方法新制备的试样、且在逆流输送前没有进行磁粒子液的一部分的输送(图2的(b))之外，与实施例8同样地进行。其结果与实施例8的结果一起如下述表4所示。
Figure BDA0001425193660000402
*相对值：将比较例4的残存率(％)设为100时的残留率的相对值
如表4所示，在逆流输送之前，通过对添加到过滤器上面的磁粒子液的一部分进行输送过滤，能够以高标记效率对过滤器上捕获的白细胞进行磁标记。即，可知通过将过滤器的双面浸渍在悬浮液之后逆流，来提高标记效率。
2.过滤器对细胞的捕获以及回收试验
(实验例1)
使用图4所示的稀有细胞捕获装置，进行血液待测体中的稀有细胞的回收。
过滤器使用具有下述特性的过滤器。具有下述特性的过滤器能够捕获SNU-1和SW620两者。
<过滤器的特性>
孔：短轴径：6.5μm、长轴径：88μm、面积：572μm2、形状：狭缝
孔的中心间的间距(短轴径侧×长轴径侧)：14μm×100μm
孔密度：714个/mm2
开口率：41％
膜厚：5μm
材质：镍
过滤面积：79mm2
构成了包括上述过滤器、以及包含逆流输送机构的输送单元的、图4所示的稀有细胞捕获和回收装置。作为固定过滤器的部件支承部46，使用了铝制的部件。使用该稀有细胞捕获和回收装置，在下述表5所示的条件下进行基于稀有细胞的过滤器过滤的捕获、以及从过滤器回收捕获的细胞。具体如下所述。
首先，进行通过过滤来捕获细胞。将包含已经用Celltracker green(细胞示踪绿色)染色的SNU-1的血液待测体7.5ml从图4的箭头A方向以恒压流通约30分钟(ΔP1＝0.75kPa：过滤流量0.25ml/分)(该低压下的流通也可以利用水位差，也可以利用与上述逆流输送机构相同或不同的泵)。由此，在过滤器上捕获SNU-1。然后，在通过两次流通PBS(-)4mL来进行过滤器的清洗之后，三次流通氯化铵溶液(ACS)900μL，在室温下溶血10分钟。流通PBS(-)4mL并清洗，更换设备内的液体。卸下连接供应口41与分离部的流路，在用盖玻片封住之后，通过显微镜观察来对过滤器上捕获的SNU-1的数量进行计数。
计数之后，取下盖玻片，将亚克力板放置在罩48上，亚克力板上设置有回收用的小孔，所述小孔设计为与过滤器上部的流路和位置、大小匹配。
之后，对过滤器上捕获的细胞进行回收。过滤器上，从与进行上述细胞的捕获的流通方向相反的方向(图4的箭头B方向)，使用逆流输送机构而流通了PBS(-)(回收液，粘度：0.95mPa·s)1ml(流量120ml/分)。用移液器吸引过滤器上部停留的回收液，并回收全量。通过显微镜观察对回收的液体中的SNU-1的数量进行计数。将回收的液体中的SNU-1的数除以过滤器上捕获的SNU-1的数，由此求出回收率。其结果如下述表5所示。
(实验例2)
除了将回收液的液量设为0.25ml、将流量设为6,000ml/分之外，与实验例1同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5中所示。
(实验例3)
除了将回收液的液量设为0.5ml、将流量设为6,000ml/分之外，与实验例1同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5中所示。
(实验例4)
除了将回收液的流量设为6,000ml/分之外，与实验例1同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5中所示。
(实验例5)
除了将回收液的液量设为0.25ml、且将流量设为600ml/分之外，与实验例1同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5中所示。
(实验例6)
除了将回收液的流量设为600ml/分之外，与实验例1同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5中所示。
(实验例7)
除了将过滤面积设为20mm2、将ΔP1设为0.4kPa(输送约60～120分钟)、将回收液的流量设为600ml/分之外，与实验例1同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5中所示。
(实验例8)
除了将过滤面积设为20mm2、且将ΔP1设为0.4kPa(输送约60～120分钟)之外，与实验例1同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5中所示。
(实验例9)
除了将过滤面积设为20mm2、将ΔP1设为0.4kPa(输送约30分钟)、将血液待测体量设为4ml之外，与实验例1同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例10)
除了将过滤面积设为20mm2、将ΔP1设为0.75kPa(输送约10分钟)、将血液待测体量设为4ml之外，与实验例1同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5中所示。
(实验例11)
首先，通过过滤器过滤来捕获细胞。从图4的箭头A方向以与实施例1同样的方法恒压流通含有已经由Celltracker green染色的SW620的血液待测体2ml(ΔP1＝0.4kPa：过滤流量0.25ml/分)。由此，在下述的过滤器上捕获SW620。与实验例1同样地溶血处理，用PBS(-)清洗之后，在过滤器上进行固定处理和细胞膜渗透处理。固定处理如下进行：流通4％多聚甲酰胺：PFA(多聚甲醛)(PBS(-)溶液)加满至过滤器附近之后，在室温下反应15分钟。细胞膜渗透处理如下进行：流通0.2％Triton-X100(PBS(-)溶液)加满至过滤器附近之后，在室温下反应15分钟。用PBS(-)清洗，更换设备内的液体。卸下连接供应口41与分离部的流路，在以盖玻片封住之后，通过显微镜观察对过滤器上捕获的SW620的数量进行计数。
计数之后，取下盖玻片，将设置有回收用的小孔的亚克力板放置在罩48上，所述小孔设计成与过滤器上部的流路和位置、大小匹配。
之后，对过滤器上捕获的细胞进行回收。从与进行上述细胞的捕获的流通方向相反的方向(图4的箭头B方向)，使用逆流输送机构向过滤器流通PBS(-)(回收液)1ml(流量6,000ml/分)。以移液器吸引过滤器上部停留的回收液，回收全量。通过显微镜观察对回收的液体中的SW620的数量进行计数。将回收的液体中的SW620的数量除以过滤器上捕获的SW620的数，求出回收率。其结果如下述表5中所示。
<过滤器的特性>
孔：短轴径：6.5μm、长轴径：9.8μm、面积：50μm2、形状：椭圆
孔的中心间的间距(短轴径侧×长轴径侧)：19μm×14μm
孔密度：3,759个/mm2
开口率：19％
膜厚：5μm
材质：镍
过滤面积：20mm2
(实验例12)
除了固定处理通过1％PFA(PBS(-)溶液)在室温下反应10分钟而进行、且细胞膜渗透处理仅仅使0.2％Triton-X100(PBS(-)溶液)流通过滤器(加满至过滤器附近的状态下的反应时间不算，仅在流通中的时间内进行反应)之外，与实验例11同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例13)
除了仅仅将固定处理变更为通过5mg/ml二甲基辛二酸盐(dimethylsuberimidate)：DMS(PBS(-)溶液)而在室温下反应10分钟、将细胞膜渗透处理变更为流通0.2％Triton-X100(PBS(-)溶液)之外，与实验例11同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5中所示。
(实验例14)
首先，通过过滤器过滤来捕获细胞。从图4的箭头A方向用与实施例1同样的方法恒压流通含有未染色的SW620的血液待测体2ml约8分钟(ΔP1＝0.4kPa：过滤流量0.25ml/分)。由此，在过滤器(除了过滤面积为20mm2之外与实验例1相同的过滤器)上捕获SW620。与实验例1同样地进行溶血处理，用PBS-EDTA清洗之后，在过滤器上，通过1％PFA(PBS(-)溶液)室温下固定处理10分钟，流通0.2％Triton-X100(PBS(-)溶液)进行细胞膜渗透处理。之后，进行FcR封闭处理，用荧光标记抗细胞角蛋白抗体染色。用PBS-EDTA清洗，更换设备中的液体。卸下连接供应口41与分离部的流路，用盖玻片封住之后，通过显微镜观察对过滤器上捕获的SW620的数量进行计数。
计数之后，取下盖玻片，将设置有回收用小孔的亚克力板放置在罩48上，所述回收用小孔设计成与过滤器上部的流路和位置、大小匹配。
之后，对过滤器上捕获的细胞进行回收。过滤器上，从与进行了上述细胞的捕获的流通方向相反的方向(图4的箭头B方向)，使用逆流输送机构向过滤器流通PBS-EDTA(回收液)1ml(流量6,000ml/分)。用移液器吸引过滤器上部停留的回收液，回收全量。通过显微镜观察对回收的液体中的SW620的数量进行计数。将回收的液体中的SW620的数量除以过滤器上捕获的SW620的数量，求出回收率。其结果如下述表5所示。
(实验例15)
首先，通过过滤器过滤来捕获细胞。使用树脂制的部件并作为固定过滤器的部件，从图4的箭头A方向恒流量流通含有已经用Celltrackergreen染色的SUN-1和已经用Celltracker orange(细胞示踪橙色)染色的SW620的血液待测体8ml约32分钟(过滤流量0.25ml/分)。由此在过滤器(与实验例1相同的过滤器)上捕获SNU-1和SW620。然后，在用PBS-EDTA 2mL进行四次过滤器的清洗之后，三次流通ACS 900μL，与实验例1同样地在室温下进行溶血(为了提高回收后的计数的准确性)。用PBS-BSA 2mL清洗4次，更换设备中的液体。
然后，对过滤器上捕获的细胞进行回收。从与进行上述细胞的捕获的流通方向相反的方向(图4的箭头B方向)，使用逆流输送机构流通PBS-BSA(回收液、粘度：1.50mPa·s)1ml(流量600ml/分)。之后，用移液器搅拌过滤器上部的回收液两次之后，用移液器对过滤器上部停留的回收液500μl进行吸引回收，然后同样地回收两次搅拌之后的剩余的全量。通过显微镜观察来对回收的液体中的SNU-1和SW620的数量进行计数。将回收的各细胞的数量除以添加的各细胞的数量，由此求出各细胞的回收率。其结果如下述表5所示。
(实验例16)
除了将回收液的流量设为316ml/分(流通压力58kPa)之外，与实验例15同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例17)
除了将过滤面积设为28mm2、将过滤流量设为0.1ml/分、将使用的细胞设为已经用Celltracker green染色的NCI-H1650(人肺癌)之外，与实验例15同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例18)
首先，通过过滤器过滤来捕获细胞。使用树脂制的部件并作为固定过滤器的部件，从图4的箭头A方向恒流量流通含有未染色的NCI-H1650的血液待测体8ml(过滤流量0.1ml/分)。由此，过滤器(除了过滤面积为28mm2之外与实验例1相同的过滤器)上捕获NCI-H1650。然后，对捕获的NCI-H1650进行溶血处理、固定、细胞膜渗透处理或抗体染色等细胞染色，最后用蔗糖·葡萄糖基的等张液进行清洗，由此更换设备中的液体。
然后，对过滤器捕获的细胞进行回收。从与进行了上述细胞的捕获的流通方向相反的方向(图4的箭头B方向)，使用逆流输送机构流通上述等张液(回收液、粘度：1.75mPa·s)1ml(流量600ml/分)。之后，用移液器搅拌过滤器上部的回收液两次之后，回收过滤器上停留的回收液250μl，接着在同样回收搅拌两次之后剩余的全量。通过显微镜观察对回收的液体中的NCI-H1650的数量进行计数。通过将回收的各细胞的数量除以添加的各细胞的数量，由此求出各细胞的回收率。其结果如下述表5所示。
(实验例19)
除了将回收液的液量除以0.5ml之外，与实验例18同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5中所述。
(实验例20)
除了将回收液的液量设为0.5ml、过滤流量设为1ml/分之外，与实验例18同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例21)
除了将过滤面积设为28mm2、将过滤流量设为1ml/分、将回收液的液量设为0.5ml、将流量设为100ml/分、将使用的细胞设为已经用Celltracker green染色的NCI-H1975(人肺癌)之后，与实验例15同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例22)
除了将使用的细胞设置成已经用Celltracker orange染色的SW620之外，与实验例21同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例23)
除了将使用的细胞设置成已经用Celltracker green染色的NCI-H1650之外，与实验例21同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例24)
除了将使用的细胞设成已经用Celltracker green染色的NCI-H1650、在溶血之后增加固定处理之外，与实验例21同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例25)
除了将回收液的流量设成50ml/分之外，与实验例21同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例26)
除了将回收液的流量设为50ml/分之外，与实验例22同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例27)
除了将回收液的流量设为50ml/分之外，与实验例23同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例28)
除了将回收液的流量设为25ml/分之外，与实验例21同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例29)
除了将回收液的流量设为25ml/分之外，与实验例22同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例30)
除了将回收液的流量设为25ml/分之外，与实验例23同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(实验例31)
除了将回收液的流量设为25ml/分之外，与实验例24同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(比较实验例1)
除了将回收液的流量设为10ml/分、将使用的细胞设为已经用Celltracker green染色的SNU-1之外，与实验例21同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(比较实验例2)
除了将回收液的流量设为5ml/分之外，与比较实验例1同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(比较实验例3)
除了将回收液的流量设为2.5ml/分之外，与比较实验例1同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(比较实验例4)
除了将回收液的流量设为1ml/分之外，与比较实验例1同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
(比较实验例5)
除了将使用的细胞设为已经用Celltracker orange染色的SW620之外，与比较实验例3同样地进行细胞的捕获和回收。其结果如下述表5所示。
Figure BDA0001425193660000491
Figure BDA0001425193660000501
如表5所示，任何实验例中均能够以超过50％的回收率从过滤器回收细胞。另外，能够以少的回收液量实现高的回收率。
上述实验例1～30中，在使用逆流输送机构的回收液的流通之后，全量回收过滤器上部停留的回收液，但是也存在以过滤器上残留微量的回收液的方式回收之后、再次进行使用逆流输送机构的回收液的流通、由此能够进一步提高回收率的情况。
如表5所示，通过将回收液的流速(每开口面积)设为至少15mm/秒以上、优选36mm/秒以上，能够以超过70％的高的回收率从过滤器回收细胞。

Claims (14)

1.一种磁标记方法，通过磁珠对具有多个贯通孔的过滤器上捕获的粒子进行标记，所述方法包括：
向捕获了粒子的过滤器面供应含有磁珠的悬浮液；
通过从所述过滤器面向另一侧过滤器面输送所述悬浮液的一部分，来形成含有所述磁珠的液体与捕获了所述粒子的过滤器面和所述另一侧过滤器面接触的状态；
从包含所述磁珠的液体与捕获了所述粒子的过滤器面和另一侧过滤器面双面接触的状态，将含有所述磁珠的液体从所述另一侧过滤器面向捕获了所述粒子的过滤器面的方向逆向输送；以及
将所述悬浮液从捕获了所述粒子的过滤器面向另一侧过滤器面输送，并排出所述悬浮液。
2.根据权利要求1所述的标记方法，所述方法包括：
在所述逆向输送之后，在捕获了所述粒子的过滤器面搅拌含有所述磁珠的液体。
3.根据权利要求1所述的标记方法，所述方法包括：
从与用于捕获所述粒子的待测体的流通方向相反的方向，向捕获了粒子的所述过滤器流通回收液，对所述过滤器上停留的回收液进行吸引回收。
4.根据权利要求1所述的标记方法，所述方法包括：
通过将含有所述粒子的待测体向所述过滤器输送，来使所述过滤器捕获所述粒子。
5.根据权利要求4所述的标记方法，其中，
所述待测体的流速为所述过滤器的每开口面积0.01mm/秒～100mm/秒。
6.根据权利要求4或5所述的标记方法，其中，
将所述逆向输送的流速设为比所述待测体的流速的1/10快。
7.根据权利要求1所述的标记方法，其中，
所述逆向输送的流速为所述过滤器的每开口面积0.01mm/秒以上。
8.一种标记装置，用于通过磁珠来标记粒子，所述标记装置包括：
过滤器部，所述过滤器部能够保持过滤器；
导入流路，所述导入流路能够向所述过滤器部导入含有磁珠的悬浮液；
排出流路，所述排出流路能够保持或排出通过了所述过滤器部的液体；
输送单元，所述输送单元能够向所述过滤器部供应所述悬浮液；以及
控制部，所述控制部控制所述输送单元，
所述控制部控制所述输送单元，以使得以成为含有所述磁珠的液体与捕获了所述粒子的过滤器面和另一侧过滤器面接触的状态的方式，从一侧过滤器面向另一侧过滤器面输送所述悬浮液的一部分，并且从包含磁珠的液体与捕获了所述粒子的过滤器面和所述另一侧过滤器面双面接触的状态，从所述另一侧过滤器面逆向输送含有磁珠的液体，之后，将所述悬浮液从捕获了所述粒子的过滤器面向另一侧过滤器面输送，并排出所述悬浮液。
9.根据权利要求8所述的标记装置，其包括：
在所述过滤器的面乃至其附近搅拌液体的单元。
10.根据权利要求8所述的标记装置，其还包括：
回收单元，所述回收单元回收过滤器部上捕获的粒子，
所述控制部控制所述回收单元，以使得从与用于捕获所述粒子的待测体的流通方向相反的方向，向捕获了粒子的所述过滤器流通回收液，对所述过滤器上停留的回收液进行吸引回收。
11.根据权利要求8所述的标记装置，其中，
所述控制部控制所述输送单元，以使得将含有标记的粒子的待测体向所述过滤器部供应。
12.根据权利要求9所述的标记装置，其中，
所述控制部控制所述输送单元，以使得以所述过滤器的每开口面积0.01mm/秒～100mm/秒的流速输送待测体。
13.根据权利要求11所述的标记装置，其中，
所述控制部控制所述输送单元，以使得所述逆向输送的流速比所述待测体的流速的1/10快。
14.根据权利要求8所述的标记装置，其中，
所述控制部控制所述输送单元，以使得所述逆向输送的流速为所述过滤器的每开口面积0.01mm/秒以上。
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