JP2000500871A

JP2000500871A - 生物学的分析用流体内の磁気粒子の分離方法及び設備ならびにその方法の応用

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Publication number: JP2000500871A
Application number: JP9539592A
Authority: JP
Inventors: ドゥサンジュリアンジャン−クロードビスコント
Original assignee: ビオコムエスエー
Priority date: 1996-05-07
Filing date: 1997-05-05
Publication date: 2000-01-25
Also published as: EP0855030A1; US6143577A; FR2748569B1; FR2748569A1; WO1997042503A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞、特に細菌、胎児細胞、骨髄株細胞及び循環性癌細胞の磁気免疫分離方法において、常磁性球上に標的細胞を固定すること、及び固定された細胞、遊離細胞及び余剰の常磁性球を含む標本に対し磁界を作用させて常磁性球を分離させることから成るタイプの方法であって、磁界が適用される長さよりもはるかに短かい断面をもつ管（２）の中で標本を循環させることを特徴とする方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的分析用流体内の磁気粒子の分離方法及び設備ならびにその方法の応用本発明は、希有な事象の生物学的分析のため流体内の磁気粒子を分離する方法及び設備に関する。本発明は、より特定的には、特に農産物加工業における品質管理及び医療診断の分野のみならず治療の分野においても、発生率の低い細胞型を標本中に検出し採取することを目的として利用されるものである。一例として、本発明の以下のような医学的利用分野を挙げることができる。 − 母親の血液中に存在する胎児細胞の分離。この場合、およそ１０００万個の非胎児細胞あたり１個の胎児細胞の割合で存在する細胞を選択的に収集することが問題となる。本発明を使用すると、羊膜細胞の危険な採取に置換できるはずである。 − 化学療法又は放射線療法による抗癌治療の後に破壊された骨髄を再度播種することを可能にする骨髄株細胞の調製。胎児細胞の場合と同様に、末梢血中の骨髄の細胞数は、約２０万あたり１個といったように他の細胞のものよりもはるかに少ない。 − 長期的な診査及び治療計画を決定するためにきわめて有利な循環性又は微小転移性癌細胞の早期検出。ここでも又、目的は、約５００万個の有核細胞あたり１個の細胞を分離し固定することにある。食品又は環境の生物学的制御の分野においては、目的は、培養増殖という従来の段階を経ることなく迅速に結果を得ることにある。期待される感度は、製品１グラム、さらには１０グラムあたり約１個の細胞（細菌、酵母又はカビ）である。先行技術においては、この目的を達成できる数多くの装置が存在している。なかでも、以下のようなものを挙げることができる： − サイズ、密度又は電荷の差異に基づく物理的方法（Ｄe Ｄure，１９７１；Ｚeiller，１９７２；Ｐretlow及びＰretlow，１９８２）。しかし、これらの方法には特異性が欠如している。 − 研究対象の細胞の表面に存在する抗原パターンに対し反応する抗体を支持体上に固定することから成るイムノアフィニティ方法（Ｆorsgren及びＳjognist ，１９８６；Ｌangone，１９８２）。アフィニティクロマトグラフィ（Ｈunt et al.，１９８２）といったようなイムノアフィニティ方法から派生したさまざまな方法が提案された。 − 英語の「Ｆluorecence Ａctivated Ｃell Ｓorting（蛍光励起細胞分離捕集）を略して「ＦＡＣＳ」と呼ばれる方法に属する螢光検出に結びつけられた細胞分離。この充分に記述されてきた方法は、細胞が中を進む液体流を含む精巧な機器を利用する。１本のレーザが螢光を励起し、かくして容器内の細胞を電気的に偏向させることのできる信号を誘発する。この方法はきわめて有効で、約１００％の選別を達成できるが、大規模な集団の分離捕集には適していない。 − 細胞が摂取した（Ｍelville et al.，１９７５）又は抗体を媒介にして細胞に選択的に固定された磁気粒子（Ｍolday et al.，１９７７）の利用に基づいている英語の「Ｍagnetic Ａffinity Ｃell Ｓorting磁気親和性細胞分離捕集）を略した「ＭＡＣＳ」と呼ばれる磁気分離方法。ＦＡＣＳ及びＭＡＣＳ方法は、今日充分に知られており、工業的な利用が既に始まっている。一般に、これらの方法の各々を用いて得られる結果は、有効性に関してほとんど差異がなく、７０〜１００％の回収を可能にする。しかしながら、これらの方法は、考慮対象の異なる利用分野に対して多かれ少なかれ適合性を有している。本発明は同様に、細胞表面に存在するか又は遊離した補足的物質に特異的に統合できる物質がその表面上に固定化される磁気粒子の使用に基づくものである。分析は、前記磁気粒子が導入された生物学的媒質を磁界に付すことによって、液体媒質内で行なわれる。又はＳigmaといった会社が販売しているタイプの微小球である。ミクロンサイズのこれらの常磁性微小球はその表面に、考慮対象となっている利用分野に応じて異なるリガンドを備えることができる。これらのリガンドは、先行技術で記述された技法により微小球の表面に固定されており、これらのリガンドとしては、以下のものが考えられる： − Ｔリンパ球の表面で発現されたタンパク質ＣＤ２，ＣＤ４，ＣＤ８といったような、或る細胞型の表面に存在する抗原特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体。これらの抗体は、例えば免疫グロブリンを媒介にして微小球の表面に固定される。 − 例えば、可変的なサイズをもちビオチニル化され、従ってストレプタビジンを媒介して微小球の表面に固定されたオリゴ（ｄＴ）又はオリゴ（ｄＡ）などのオリゴヌクレオチド。これらのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションにより、含有核酸をハイブリッド形成できる状態にするような形で予め処理された標本のＲＮＡ又はＤＮＡを精製又は抽出することを可能にする。常磁性球の表面に固定されたこれらのオリゴヌクレオチドの使用は、ＰＣＲによる増幅プロトコル又はＰＣＲ後のクローニングのための準備段階となることもできるし、或いは又、固相での配列決定のために利用することもできる。かくしてリガンドが充てんされた球は、磁界の作用による研究対象の事象の隔離を実現する目的で、場合によって予備処理を受けた標本と接触させられる。しかしながら、この技法の利用は、多数の取扱い作業を必要とする欠点をもち、いくつかの稀な細胞を含む磁石の作用によって多少とも凝集された球の集合体を導き出す。約１対１０といった、細胞数に対する球の数の不均衡は、このときこれらの細胞の同定及び収集を不可能にする。細胞核を解放するものの後に目による同定や利用を不能にする洗浄剤の作用、又は分離した細胞の抗体によるもの、さらには可変的な形で作用する分離剤の利用といったように、これらの欠点を削減するためのさまざまな解決法が先行技術において提案されている。ところで、或る種の場合においては、例えば造血株細胞の場合のように治療を目的とした細胞の再利用が考えられているという理由で、又は胎児細胞の場合のようにシグナルを増幅するため細胞のインビトロでの再培養を理由として、分離された細胞の死活性がきわめて重要となる。上述の微小球を使用する以上で記述した従来の技法はこのとき、細胞に対し損傷作用をもつ可能性があり、分離カラムの利用を妨げ、細胞に複雑で外傷を及ぼす経路を課すことになる。従って技術的現状の技法は完全に満足のいくものではない。特に、人為的な構造が、理論的に予測可能な性能を低減させる。実際、余剰の常磁性球は、時として標的細胞を完全に閉じ込める硬化組織を形成する傾向をもつ。標的細胞の出現率がきわめて低いことを考えると、この現象はきわめて有害である。なお、分離作業は、誤りの源である面倒で反復的なプロトコルを綿密に遵守することを必要とする。従って、本発明の目的は、研究対象でない細胞及び液体の除去及び洗浄の段階を削除する方法と同時に研究対象の要素の自動的選択及び遊離した常磁性球との隔離を提供することにある。本発明のもう１つの目的は、先行技術の方法において見られた人為的な構造を回避し、使用プロトコルを単純化することによって、磁気的方法の効率を改善することにある。本発明の目的は、標本中に非常に低い濃度で存在する生物学的材料の測定、分析及び処理を目的とする分離を容易にすることにある。上述の分野において求められている感度は、標本１ｇさらには１０ｇに対し細胞約１個の可能性がある。技術的現状においては、欧州特許ＥＰ２０６０７７号も知られている。この特許は、均質な磁界の中に置かれた管状セグメント内を循環させることによる磁気的免疫分離の一般的原理を開示している。或る種の利用ケースにおいては、余剰の粒子が管の始めであまりにも急速に引きつけられる可能性があり、標識づけされた又はされていない細胞の循環を遮断する凝集物が生成されたように思われた。標的細胞が稀なものであることを考慮すると、この状況はきわめてやっかいである。本発明は、不均一な磁界を作り上げることを提案することによってこの欠点を補正することを目指している。この特徴は、管状セグメントの上流部分の中に固定されていない粒子凝集物の形成を回避する。長さに比べ小さな断面をもつ管の中の標本の流れによって生成される流束に付随する不均一な磁界の適用は、粒子のより優れた分布を導き、より大きい寸法をもつ遊離した又は固定した細胞の同伴効果により凝集物の遊離を容易にする。これらの細胞は、次の強い磁界ゾーン内でもはや凝集せず孤立した形で再度固定されることになるように弱い磁界ゾーンで遊離させられている磁気粒子の凝集物上に、軽く圧力を及ぼす。これらの目的は、標本及び球の接触の後に、流束と磁気分離を同時に組合わせる方法及び設備によって、達成される。この目的で、本発明はまず第１に細胞、特に細菌、胎児細胞、骨髄株細胞及び循環性癌細胞の磁気分離方法において、常磁性球上に標的細胞を固定すること、及び固定された細胞、遊離細胞及び余剰の常磁性球を含む標本に対し磁界を作用させ常磁性球を分離させることから成るタイプの方法であって、磁界が適用される長さよりもはるかに短かい断面をもつ管の中で標本を循環させることを特徴とする方法に関する。標本は好ましくは、１秒あたり数センチメートルの速度で流れる。余剰の球は、標識づけされた又はされていない細胞に比べて密度が低いため、又は常磁性球はその強い磁界感度のため、管の壁に対し急速に引きつけられ、管の近位部分内に固定化される。固定されていない細胞は、磁界に対し感応せず、管を横断する。常磁性球上に固定された細胞は、管の遠位部分内で、管の壁に対し固定化される前に、管の内部で流束により駆動される。かくして、実施が簡単な異なる手段により標的細胞の回収を可能にする標本の構成成分の幾何学的分離が行なわれる。好ましい一実施形態によると、流束線がらせんの平面に対してほぼ垂直である磁界の中に置かれたらせん状に巻きつけられた管の中に標本を循環させる。有利には、管の断面は０．５〜３ミリメートルの間に含まれ、管の長さは１０センチメートルを上回る。好ましくは、管は、均質でない磁界の中に配置される。この磁界は、永久磁石又は電磁石により生成され得る。有利な変形形態に従うと、調製物は、分離管に連結されたタンクの中に導入され、かかるタンクは重力による標本の循環を確保するべく管に比べ高く配置されている。本発明は、同様に細胞特に細菌、胎児細胞、骨髄株細胞及び循環性癌細胞の磁気免疫分離用設備において、長さに比べてかなり短かい断面をもち、らせんを形成するべく巻きつけられた管及び、この管により形成されたらせんの平面に対してほぼ垂直な磁界を作り上げるように配置された少なくとも１つの磁石で構成されていることを特徴とする設備にも関する。特定の実施形態に従うと、この設備には、増大する断面をもつ２つの区分を呈し、第２の断面が第１の断面の少なくとも１０倍であるような管が含まれている。本発明は、以下のことを目的とする応用にも関する：・体外循環での血液の免疫ろ過・出産前診断・実験室での生物学的分析本発明は、制限的意味のない実施例に関する添付図面を参照しながら、以下で記述を読むことによって、より良く理解できることだろう。なお図面中、図１は、本発明に従った装置の正面図を表わす。図１’は、本発明に従った装置の正面図を表わす。図２は、短管の断面図を表わす。図３は、一変形実施形態の図を表わす。図４は、一変形実施形態の横断面図を表わす。図５は、ぜん動ポンプを利用する第２の変形実施形態の図を表わす。図６は、ぜん動ポンプを利用するもう１つの変形実施形態の図を表わす。図６’は、ぜん動ポンプを利用するもう１つの変形実施形態の図を表わす。図６”は、ぜん動ポンプを利用するもう１つの変形実施形態の図を表わす。図７は、磁気粒子の分離のためのろ過モジュールの断面図を表わす。図１は、本発明に従った装置の実施例の正面図を表わす。これは、らせん状に巻きつけられた短管（２）に連結され、ゲート弁（４）の備わった出口短管（３）で終結する約１０〜５０ミリリットルを収容できるレセプタクル（１）で構成されている。均等でない磁界を作り出すため放射方向に、永久磁石アセンブリ（５）が配置されている。磁石の配置は一例として示されているものであり、例えば平行な磁石の形などといった異なる配置も同様に応用可能である。磁石（５）は、サマリウム−コバルト棒磁石で構成されている。これらの棒磁石は、場合によって回転支持ディスク上にとりつけることができる。この変形形態により、この方法の１つの段階において、固定された常磁性球を短管の出口に向かって駆動することが可能となる。一例を挙げると、これらの棒磁石は、交互に±２０°回転する。最大駆動速度は、常磁性粒子に対する効率を最適化するような形で、秒あたり数ミリメートルである。磁石についてはさまざまな駆動モードを考慮することが可能である。すなわち：運動が流れの方向に連続的に行なわれる場合、細胞及び粒子の排出が容易になる。運動が流れの方向と逆方向に連続的に行なわれる場合、細胞及び粒子の排出が遅延される。運動が交番に行われる場合、細胞及び粒子の洗浄及び除去を容易にする粒子の攪拌を行なう。短管（２）の断面は約０．５ミリメートルである。これはＴＥＦＬＯＮ（登録商標）といった材料で作られている。長さは約５０センチメートルである。装置の利用は、以下の通りである：ａ）２ミリリットル入りピペット内にまずＰＢＳ（商品名）タイプの洗浄液を導入する；ｂ）予め常磁性粒子と共にインキュベートした血液標本（７）を吸込む。９ミリリットルの生理的血清（８）を添加する。ｃ）気泡の発生を入念に回避しながら、らせん状短管（２）にレセプタクル（１）を接続する。ｄ）らせんとの関係において約３０センチメートルだけレセプタクル（１）を高く配置する。ｅ）レセプタクル（１）と短管（２）の間に設けられたゲート弁（６）を開く。このとき液体は、レセプタクル（１）から静水圧の作用下で、らせん状短管（２）に向かって連続的に流出する。ｆ）洗浄液２０ミリリットルの半分を通過させた後、流出を止める。この段階中、例えば三角法の方向に２０°の移動、次に初期位置への復帰そして反三角法方向へ２０°の移動というサイクルを５回くり返すことによって、磁石（５）を交番回転させることにより、洗浄の効率を増大させることができる。次の段階は、ロゼット又は研究対象の細胞の核の回収から成る：１）ロゼットの回収らせん（２）を、棒磁石（５）の影響から離隔させ、洗浄液の残りの流出を再開する。この洗浄液は、常磁性粒子及びこの粒子の担体細胞を同伴することになる。かくして、研究対象の粒子は、常磁性粒子を通すものの細胞を通さないフィルタを用いたろ過によって回収できるようになる。２）研究対象の細胞核の回収細胞核を回収するためには、磁気の影響を維持し、硬化し着色された核を遊離させながら固定した細胞を溶解させる特性をもつ新しい試薬を作用させる。一例として、このような試薬は、以下のような混合で構成されている： − 例えば、ＣＥＴＲＩＭＩＤＥ（商品名）といった洗浄剤、 − 例えば、ホルムアルデヒドといった固定剤、 − 例えば、ヨウ化プロピジウムといった核着色剤。この混合物は、体積がらせん（２）のものを上回らないような形でレセプタクル（１）の中に導入される。着色剤は液体の進行の視覚化を容易にする。この混合物を１０分間らせんと接触状態に置く。核の遊離を容易にするため磁石の交番運動を起動させる。このとき、純粋な核を回収するため洗浄を行なうことができる。磁石（５）はつねに存在していることから、いかなる磁性粒子も調製物を汚染することはない。逆に、細胞は破壊されていることから、核の固定は分子ハイブリダイゼーション試薬の利用を意味する。これらの試薬により、定数外の動原体（トリソミー２１）の存在又は癌遺伝子の増幅された発現さらには特定の遺伝子Ｐ５３型の発現の存在といったような遺伝子異常を検出することが可能である。なお、化学量論的に着色された純粋な核は、腫瘍細胞の病期の特徴を示す倍数体レベルの定義づけを可能にする。図１’は、本発明に従った装置の１つの変形実施形態を示す。装置は、らせん状に巻きつけられた分離管（３５）に連結された試薬及び標本の３つの容器（３１〜３３）を含んでいる。自動式コック又はゲート弁が、分離管（３５）に向かっての各々の容器（３１〜３３）の流量を開閉する。この分離管は、交互の放射方向に星状に配置された永久磁石（３６）によって生成された磁界勾配内に置かれている。分離管（３５）の下流端は、一方では収集管（３７）内に、又他方では排出管（３８）内に通じている。フィルター上の収集システム（４０）、収集容器（４１）又は粒子流束検出器（４２）で形成された分析手段に向かって、廃棄物容器（３９）への流出を制御するためこれらの管の各々の上に、ゲート弁又はコックが具備されている。図２は、短管の１セグメントの断面図を表わす。ベルヌーイの力の作用下で、粒子は、速度が最も高い流体の中心に集中する傾向をもつ。磁束の作用下で、標識づけされた細胞（１２）に比較して・・・かつ標識づけされていない粒子（１２）に比較しても軽くかつ体積の小さい常磁性球（１０）は短管の壁（１３）に向かって非常に急速にひきつけられる。標準づけされていない細胞（１１）の進路は、磁束により混乱されず従って、これらの細胞は、磁束の中心にとどまり、ここで急速に出口に向かって駆動される。標識づけされた細胞（１２）は短管（２）の最後の部分に再び見い出される。場合によっては、短管は、増大する断面をもつ２つのセグメントによって作ることができ、この場合、第１のセグメントは余剰の球を保持するのに役立ち、第２のセグメントは標識づけされた細胞を保持するのに役立つ。図３及び図４は、一変形実施形態の中央断面図及び横断面図をそれぞれ表わしている。短管（２）は、プラスチック材料のプレート（１５）の中に作られた溝（１４）により形成される。これは、一方では、補給用レセプタクル（１）とのリンク用短管への連結を可能にするため一方の側方縁部上に、又他方では流体の排出を可能にするプレート（１５）を横断する横方向オリフィス（１６）と、通じている。装置は、２枚の対称なプレート（１５，１５'）で形成され、これらは互いの間に液体の循環用短管を構成するような形で連結されている。これらのプレートは、磁石（１７）用収納部を外部表面上に有している。図５は、ぜん動ポンプを使用する第２の変形実施形態の図を表わす。この変形形態においては、液体の進行は重力によってではなくぜん動ポンプによって条件づけされる。装置は、分離ループを形成する管状要素（２２）で構成されている。１方の端部は、前述の例と同様、処理された標本を吸込む。管状要素（２２）は、交番方向で、液体の移動方向に対して垂直に向けられた永久磁石（２４〜２８）の磁界の中に配置されている。管状要素（２２）は使い捨てであるため、その内部壁の汚染はことごとく避けることができる。この管状要素（２２）は、既知のタイプのぜん動ポンプ（２９）の吸込み管に連結されている。廃棄物は、ポンプ（２９）の出口で試験管（３０）内に収集される。管の内部の流体の循環は好ましくは、秒あたり約１cmの速度で連続的である。連続的循環により、分離管の壁上の細胞付着の形成が避けられる。図６，６および６”は、一変形実施形態の部分図を表わす。磁石は、交番方向で放射方向に磁化された複数の棒磁石（３３〜４０）で構成されている。カゴ形（３２）を形成する。この構造により、単数又は複数の管状要素（２２）を位置づけし、複数の標本を並行して処理することが可能になる。このような装置の利用は、以下のとおりに行なわれる、すなわち： − 予め常磁性粒子を受取った標本の中に分離管（２２）の自由端（２３）を浸漬する。 − 磁界内に配置された分離ループ内に細胞及び磁性粒子を通過させることになるポンプ（２９）を起動する。標識づけされた細胞によって構成されるロゼット及び磁気粒子はこのループ内で止まり、その他の細胞は排出されることになる。かくして、標識づけされていない細胞しか収集しないように標識づけされた細胞を除去することから成る、特に治療目的での細胞パージを行なうためには、ぜん動ポンプの代りに、標識づけされていない細胞の圧壊を避けるべく吸引式注射器又は負圧供給源といったようなその他の吸込み手段を用いることが好ましい。この実施形態には、以下のようないくつかの利点がある。 − 多数の標本の並行処理を可能にする。 − 各ステップの管理を自動化することができる。 − 非常に大量の処理が可能となる。 − 管状要素の処理ゾーンの上流の無用な体積を回避する。実際、標本の通過後、管を除去して、汚染されていない容器から試薬を通すことができる。非特異的細胞を回収する危険性は非常に低減される。なお、このとき、全ての管を同じ試薬容器内に沈めることができ、かくして操作は簡略化される。前述の変形形態の１つに従った処理システムの使用後固定されていない磁性球及び標識づけされた細胞の分離は、有利には、図７にその実施例が記述されているろ過装置を用いて行なわれる。胎児細胞又は微小転移と同じ程度に希有な事象の研究は、方法の全ステップがきわめて上質で高効率であることを意味する。まず第１に、抗体は、標的細胞の優れた回収を確保するため非常に有効であることが必要である。洗浄及び収集の操作の際の細胞損失を避けなくてはならない。同様に、非特異的な細胞のみならず、螢光性において細胞と混合しうるさまざまな残渣及び着色剤の結晶の結果としてもたらされる偽陽性を最小限におさえることも必要である。画像分析によって或る種の弁別を解決することができる。しかしながら、標本１個につき稀な要素がおよそ１〜５０個の場合、人為的な構造の全体数はこれらの値より低くとどまらなくてはならず、このためには、標識づけされた細胞及び標識づけされていない細胞の分離ラインの高い性能と細胞回収の質の良さが求められる。スライドグラス上への収集及び着色の通常の手順は、かかる必要条件と相容れない「ノイズ」を生成する。これに対して本発明に従ったろ過装置は、これらの必要条件を満たすことを可能にする。この装置は、使い捨ての成形シリコン製部品（４１）で構成されている。この部品（４１）は、約２ミリメートルの厚みを示しかつ、直径６ミリメートル及び高さ１０ミリメートルの１２の突出部分（５１）を呈する。通常は閉塞されているこれらの突出部分（５１）は、分離管（４２）の端部に具備された中空の針（４８）で孔あけすることができる。シリコン製部品（４１）は、剛性有孔プレート（４３）内に位置づけされる。孔は、部品（４１）の突出部分（５１）と相補的に配置される。このプレート（４３）は、気密な形でサポート（４５）に連結でき、つめ（４４）により所定の位置に維持できる。１つのＯリングがこの組立ての気密性を補完することになる。サポート（４５）は同様に、プレート（４３）の孔に向かい合って配置された孔も呈している。サポートは、負圧供給源に連結されている、微細孔ろ過膜（４７）がプレート（４３）とサポート（４５）の間に配置されている。これは有利には、２ミクロンの断面を示す小穴をもつポリカーボネート製の微細孔膜である。このろ過モジュールの作動は以下の通りである：部品（４１）は下部面の下に置かれた保護フィルムと共に納入される。単数又は複数の突出部分を開放することができる。微細孔膜を位置づけた後サポート（４３）上にプレート（４１）を置き、つめ（４４）を用いてアセンブリをロックする。分離管（２）は保護キャップと共に納入され、これが汚染をことごとく回避している。このキャップを引き抜き、部品（４１）の突出部分の１つを孔明けする。分離装置からのロゼットの収集に際しては、分離された常磁性粒子は膜を横断し、一方ロゼットは表面にとどまる。微細孔膜の多孔度は、およそ１ミクロン程度の断面を有する常磁性粒子を通すものの、約５ミクロンの断面を有するロゼットは通さない。球が無い状態で核を収集するためには、多孔度は１〜２ミクロンであってよい。着色は、ＩＰ又はＢＥＴ（商品名）タイプの螢光着色剤を用いてろ過の前に、さらには、固定システムから引き出した後のフィルタ上での着色によって行なうことができる。磁界勾配の中に置かれ長さに比較してはるかに小さな断面をもつ管によって形成された分離装置及び上述のようなろ過システムの組合せは、数多くの利点を呈する。このような組合せは、まず最初に、生物学的分析の自動化を容易にする。これは同様に、高水準の無菌性を必要とする治療目的での利用及び分析を行なうことも可能にする。常磁性球は、細胞の分離捕集、特に研究対象の細胞及びその他の細胞の分離を可能にする。フィルタは、血小板といったような或る種の余剰細胞ならびに余剰な常磁性球を除去することを可能にする。同様にこのフィルタは、小さい表面積の上に研究対象の稀な細胞を濃縮させて画像処理による分析を容易にするという機能をも有している。このフィルタは同様に、特に治療用利用分野のために、研究対象の細胞の培養を行なうことをも可能にする。このため、このフィルタは、細胞支持体として役立ち、細胞の増殖に有利に作用できる滋養性液体の補給を受けることができる。本発明は、制限的な意味のない例としての以上の記述により、より良く理解できることだろう。

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞、特に細菌、胎児細胞、骨髄株細胞及び循環性癌細胞の磁気免疫分離方法において、常磁性球上に標的細胞を固定すること、及び固定された細胞、遊離細胞及び余剰の常磁性球を含む標本に対し磁界を作用させて常磁性球を分離させることから成るタイプの方法であって、不均一な磁界が適用される長さよりもはるかに短かい断面をもつ管（２）の中で標本を循環させることを特徴とする方法。２．磁界勾配の中に置かれたらせん状に巻きつけられた管（２）の中で標本を循環させることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の磁気免疫分離方法。３．管の断面が０．５〜３ミリリットルの間に含まれていることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項のいずれか１項に記載の磁気免疫分離方法。４．管の長さは１０センチメートルを上回っていることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の磁気免疫分離方法。５．調製物は分離管に連結されたタンクの中に導入され、かかるタンクは重力による標本の循環を確保するべく管に比べ高く配置されていることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の磁気免疫分離方法。６．タンクの中に混合せずにかつ界面層無しで、第１の体積の標本と第２の体積の洗浄液を導入することを特徴とする請求の範囲第５項に記載の磁気免疫分離方法。７．調製物は、磁気勾配の中に置かれた管の中に吸収され、この管の下流端部がぜん動ポンプに連結されていることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の磁気免疫分離方法。８．磁石が、管との関係において、好ましくは交互運動に従って可動であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の磁気免疫分離方法。９．試薬及び標本が磁気分離管の中を０．１cm／秒〜１０cm／秒の速度で連続的に流れることを特徴とする請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載の磁気免疫分離方法。１０．常磁性球の直径よりも大きく固定された細胞の直径よりも小さい多孔度をもつ微細孔膜フィルターを用いて、その後のろ過段階を行なうことを特徴とする請求の範囲第９項に記載の磁気免疫分離方法。１１．常磁性球及びいくつかの余剰細胞の直径よりも大きく固定された細胞の直径よりも小さい多孔度をもつ微細孔膜フィルターを用いてその後のろ過段階を行なうことを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の磁気免疫分離方法。１２．常磁性球及びいくつかの余剰細胞の直径よりも大きく固定された細胞の直径よりも小さい多孔度をもつ微細孔膜フィルターで構成されていることを特徴とする請求の範囲第１０項又は第１１項のいずれか１項に記載の磁気免疫分離方法の使用のためのろ過装置。１３．細胞特に細菌、胎児細胞、骨髄株細胞及び循環性癌細胞の磁気免疫分離用設備において、長さよりもかなり短かい断面をもつ管及びこの管が横断する空間の中に磁界を作り上げるように配置された少なくとも１つの磁石で構成されていることを特徴とする設備。１４．さらに、管の上流に配置されたタンクを含んで成ることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の細胞の磁気免疫分離用設備。１５．増大する断面をもつ２つの区分を呈し、第２の断面が第１の断面の少なくとも１０倍であるような管を含んでいることを特徴とする請求の範囲第１３項又は第１４項に記載の細胞の磁気免疫分離用設備。１６．らせんを形成する溝を呈し磁石を支持する２枚の対称なプレート（１５，１５）を有することを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の細胞の磁気免疫分離用設備。１７．細胞特に細菌、胎児細胞、骨髄株細胞及び循環性癌細胞の磁気免疫分離用設備において、長さよりもかなり短かい断面をもつ管によって構成されており、この管は、標本の吸込みのための第１の端部及びぜん動ポンプに連結された第２の端部を呈し、管は磁界勾配の中に置かれていることを特徴とする設備。１８．細胞特に細菌、胎児細胞、骨髄株細胞及び循環性癌細胞の磁気免疫分離用設備において、交番磁界がカゴ形に配置された永久磁石によって生成されていることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の設備。１９．負圧供給源に気密な形で連結されているサポート及び細胞分離管の下流端部の連結のための手段を有する補足的なカバーで構成され、互換性あるろ過膜がサポートとカバーの間に配置されていることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載の分離方法の使用のためのろ過装置。２０．カバーが有孔プレート及び単数又は複数の細胞分離管の端部によって孔をあけることのできるゾーンを呈する成形部品によって構成されていることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載のろ過装置。２１．細胞表面に存在するか又は遊離した補足的物質に特異的に結合することのできるリガンドを用いて常磁性微小球上に標的細胞を固定すること及び、不均質な磁界を横断し断面よりかなり大きい長さをもつ短管を横断して標本を循環させることを特徴とする、母親の血液中に存在する胎児細胞を分離する方法。２２．細胞表面に存在するか又は遊離した補足的物質に特異的に結合することのできるリガンドを用いて常磁性微小球上に標的細胞を固定すること及び、不均質な磁界を横断し断面よりかなり大きい長さをもつ短管を横断して標本を循環させることを特徴とする循環性又は微小転移性癌細胞の早期検出方法。２３．細胞表面に存在するか又は遊離した補足的物質に特異的に結合することのできるリガンドを用いて常磁性微小球上に標的細胞を固定すること及び、不均質な磁界を横断し断面よりかなり大きい長さをもつ短管を横断して標本を循環させることを特徴とする細胞、特に化学療法又は放射線療法による抗癌治療の後に破壊された骨髄を再度播種できるようにする骨髄株細胞の調製方法。２４．常磁性球の断面より大きく、固定された研究対象の細胞よりも小さい多孔度を示す膜フィルターを用いて、磁界の中に置かれた短管から再度出てくる細胞のろ過を行なうことを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の、細胞、特に化学療法又は放射線療法による抗癌治療の後に破壊された骨髄を再度播種できるようにする骨髄株細胞の調製方法。