DE102011088741B4 - Verfahren und Anordnung zum Markieren und Separieren von Zellen aus einer Zellsuspension - Google Patents

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Abstract

Verfahren zum Separieren von Zellen aus einer Zellsuspension (8), wobei in der Zellsuspension (8) befindliche Zielzellen (8.1) mittels funktionalisierten Magnetbeads markiert und anschließend separiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass – eine Zweifluidsonde (1) in einen Behälter (2) mit suspendierten funktionalisierten Magnetbeads (2.1) oder einer Zellsuspension (8) eintaucht, wobei in einem äußeren Rohr (1.1) der Zweifluidsonde die Zellsuspension (8) oder suspendierte funktionalisierte Magnetbeads (2.1) zugeführt werden und durch ein inneres Rohr (1.2) ein Zellsuspension-Magnetbead-Gemisch abgesaugt wird, – das Gemisch durch einen Inkubationsleiter (3) transportiert wird, in dem eine Inkubation der Magnetbeads mit den Zielzellen erfolgt, – dem Gemisch eine Pufferlösung zugeführt wird und – in einem Mikrokanal-Netzwerk (4) in einer ersten Verzweigung (5.1) eines Hauptkanals (4.8) unter Wirkung eines bewegten Magnetfeldes die mit Magnetbeads markierten Zielzellen im Hauptkanal (4.8) weiter transportiert werden, während die nicht markierten Zellen zu einem Ausgang des Mikrokanalnetzwerkes (4) transportiert werden.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Separieren von Zellen aus einer Zellsuspension, beispielsweise von Blutzellen, wobei in der Zellsuspension befindliche Zielzellen mit magnetisierbaren Partikeln markiert und anschließend separiert werden.
  • Vorrangiges Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Analyse von Zellgemischen für chemische und biologische Prozesse, beispielsweise das Separieren kranker Blutzellen.
  • Im Stand der Technik ist eine Reihe von Möglichkeiten zur Separation von Zielzellen aus Zellgemischen mittels magnetisierbarer Partikel bekannt.
  • In US 5,186,827 A ist eine Anordnung zur magnetischen Separation beschrieben, bei der ein Magnetfeld auf einen nichtmagnetischen Behälter wirkt, in dem sich ein Testmedium aus magnetisch markierten und magnetisch nicht markierten Teilchen befindet.
  • US 6,143,577 A beschreibt eine weitere Separationsvorrichtung für magnetisch markierte und nicht markierte Zellen in einem spiralförmig aufgewickelten Schlauch mit Hilfe eines inhomogenen Magnetfeldes. Die markierten Zellen werden im Schlauch immobilisiert und nicht markierte Zellen verzögert transportiert.
  • Ein ähnliches Prinzip ist in WO 2010/121315 A1 offenbart, wobei in einer Ausführungsform ein rotierender Magnet verwendet wird.
  • Ferner ist in US 2004/0018611 A1 eine in einem Mikrokanalsystem realisierte Separationseinrichtung dargestellt, in der magnetisch markierte Zielanalyte von nicht markiertem Material getrennt werden. Die magnetisch markierten Teilchen werden im Kanalsystem immobilisiert. Das System verfügt nicht über getrennte Ausgänge für magnetisch markierte Analyte und nicht magnetischem Material. Ein kontinuierlicher Betrieb ist nicht möglich.
  • Aus US 3,902,994 A ist eine Vorrichtung zur magnetischen Separierung von magnetischen und nichtmagnetischen Partikeln in einer Flüssigkeit bekannt, bei der eine kontinuierlich bewegte Matrix innerhalb und außerhalb eines magnetischen Feldes bewegt wird.
  • In US 5,968,820 A ist ein Verfahren zur Separierung von Zellen beschrieben, bei dem Zellen mit Bereichen bestimmter magnetischer Feldstärke in einem Flüssigkeitskanal einem magnetischen Feld ausgesetzt werden.
  • US 2009/01488 57 A1 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Untersuchung akustischer Geräte, wobei eine Mehrzahl von Partikeln in einer Agens, die eine bestimmte Affinität zu einem Analyten besitzen, sich in einem magnetischen Feld befinden und ein Resonator ein Signal zur Identifizierung der Partikel erzeugt.
  • Ferner ist aus WO 2009/008925 A2 ein Mikrofluidikgerät zum Manipulieren von Partikeln in einer Flüssigkeit bekannt, bei dem in einem Gerät ein Kanal mit einem Einlass- und mehreren Auslasskanälen angeordnet ist, der einem magnetischen Feld ausgesetzt ist, welches bestimmte Partikel zu einem bestimmten Ausgang leitet.
  • WO 2011/089603 A1 beschreibt ein System zur magnetischen Separation magnetisierbarer Zellen eines Zellgemischs, bei dem ein Zellgemisch unter definierten Bedingungen durch eine Röhre geführt wird, die eine Vielzahl von Abschnitten aufweist, durch welche ein magnetischer Fluss geleitet wird.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein kontinuierliches arbeitendes und automatisiertes technisches System für die biomagnetische Separation zu schaffen, welches sich durch eine hohe Effizienz auszeichnet.
  • Die Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Verfahren, welches die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist, und mit einer Anordnung, welche die in Anspruch 5 angegebenen Merkmale aufweist, gelöst.
  • Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
  • Bei dem Verfahren werden einer Zellsuspension mit z. B. Liganden funktionalisierte Magnetbeads zugeführt, die sich an Zielzellen, z. B. kranke Zellen im Blut spezifisch binden und die anschließend näher untersucht werden können. Zu diesem Zweck sollen möglichst viele Zielzellen mit Magnetpartikeln markiert werden und vor der eigentlichen Analyse die Zellen entfernt werden, die magnetisch nicht markiert sind.
  • Die Liganden sind auf den Oberflächen der Magnetbeads immobilisiert. Die Immobilisierung erfolgt nach allgemein bekannten Verfahren. Liganden sind beispielsweise Antikörper, die spezifisch an passende Antigene binden. Die Bindung erfolgt nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip, nur eben auf molekularer Ebene. Antigene befinden sich auf der Oberfläche von Zellen und sind beispielsweise für Krebszellen charakteristisch. Mittels der Bindung der Antikörper an die Antigene erfolgt die spezifische Kopplung der Magnetbeads an die Zellen, wodurch dann unter Einwirkung eines magnetischen Feldes die Trennung dieser Magnetbead-Zielzell-Komplexe von den Zellen, an die keine Magnetbeads gekoppelt sind, erfolgt.
  • Sowohl die Inkubation des Magnetbead-Zell-Gemisches als auch die Separation der Zielzellen (Magnetbeads binden spezifisch an diese Zellen) sowie der ungebundenen Magnetbeads können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kontinuierlich und diskontinuierlich erfolgen.
  • Das Mischen der Zellsuspension und der suspendierten Magnetbeads erfolgt in einem ersten Verfahrensschritt mit einer Zweifluidsonde, die auf dem Prinzip des doppellumigen Katheters beruht, der in einen Behälter mit einer Suspension von Magnetbeads eingetaucht ist. Diese Anordnung gewährleistet eine hohe Wahrscheinlichkeit eines Kontaktes zwischen den Zielzellen und Magnetbeads. Eine Zweifluidsonde ist beispielsweise in der Schrift DE 10 2008 039 117 B3 beschrieben.
  • Das durch die Zweifluidsonde erzeugte Magnetbead-Zell-Gemisch wird in einem zweiten Verfahrensschritt über einen Inkubationsleiter, der als Schlauch ausgeführt sein kann, dem Mikrokanal-Netzwerk zugeführt. Aufgabe des Inkubationsleiters ist es, die Kontaktwahrscheinlichkeit von Magnetbeads und Zielzellen weiter zu erhöhen und eine Bindung zu Magnetbead-Zielzellen-Komplexen zu bewirken. Es hat sich gezeigt, dass der sich bedingt durch den Innendurchmesser des Inkubationsleiters von vorzugsweise 0,5 mm bis 3 mm ausbildende laminare Fluss sowohl die Kontaktwahrscheinlichkeit erhöht als auch die schnelle und sichere Inkubation günstig beeinflusst. Ursache dafür sind Diffusionseffekte sowie der sogenannte Pinch-Effekt, die beide eine Relativbewegung zwischen Zellen und Magnetbeads bewirken.
  • Das inkubierte Magnetbead-Zell-Gemisch wird in einem dritten Verfahrensschritt vom Inkubationsleiter direkt in einen ersten Eingang eines Mikrokanal-Netzwerkes geleitet, in dem die Separation unter Einwirkung magnetischer Felder erfolgt. An einem Ausgang der Mikrokanal-Netzwerke stehen die Magnetbead-Zielzell-Komplexe in hoher Konzentration beispielsweise zu Analysezwecken zur Verfügung. An einen anderen Ausgang des Mikrokanalnetzwerkes kann eine magnetisch nicht markierte Zellsuspension entnommen werden.
  • Besonders vorteilhaft ist dabei, dass die wesentlichen Funktionen „Mischung”, „Inkubation” und „Magnetseparation” in einem kontinuierlichen Prozess ablaufen. Das System kann deshalb vollständig automatisiert werden.
  • Da das System kontinuierlich arbeitet, ist es möglich, nach der biomagnetischen Separation das Zellgemisch (nachdem die ungebundenen Magnetbeads und die Magnetbead-Zielzell-Komplexe separiert wurden) für weitere Analysen weiter zu verwenden.
  • Vorteilhaft ist weiter, dass das fluidische System, bestehend aus Zweifluidsonde, Inkubationsleiter und Mikrokanal-Netzwerk, vollständig sterilisiert werden kann. Möglich ist auch, dass die mit dem Zellgemisch in Kontakt gekommenen Teile der Anordnung nach Gebrauch als Wegwerfteile entsorgt werden. Damit ist es insbesondere auch für medizinische Applikationen, wie beispielsweise die Isolation von im Blut zirkulierender Tumorzellen, besonders geeignet. Der technische Aufbau ist einfach, ebenso die Herstellung der einzelnen Komponenten.
  • Es sind Ausführungen des Mikrokanal-Netzwerkes als Durchflusssystem mit einem Ausgang für Magnetbead-Zielzell-Komplexe und ungebundene Magnetbeads, mit einem Ausgang oder mehreren Ausgängen für unmagnetisches Material, mit einem Eingang oder mit mehreren Eingängen für die Einleitung von Transportflüssigkeit in einfacher Weise realisierbar.
  • Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im Folgenden anhand von Zeichnungen näher erläutert.
  • Darin zeigen:
  • 1 eine schematische Darstellung des Funktionsprinzips,
  • 2 die Draufsicht auf das Chip mit rotierender Magnetscheibe,
  • 3 eine Darstellung der Verhältnisse im Kanal an der Position A,
  • 4 eine Darstellung der Verhältnisse im Kanal an der Position B,
  • 5 eine Darstellung der Verhältnisse im Kanal an der Position C,
  • 6 eine Darstellung der Verhältnisse im Kanal an der Position D und
  • 7 eine schematische Darstellung einer Gesamtanordnung.
  • Einander entsprechende Teile sind in allen Figuren mit den gleichen Bezugszeichen versehen.
  • 1 erläutert die Funktionsweise des Verfahrens und der Anordnung am Beispiel der Selektion von Blutzellen. Im Blut enthaltene Zielzellen sollen selektiert werden. Eine Blutprobe ist hierbei die zu betrachtende Zellsuspension. Mittels einer Zweifluidsonde 1 erfolgt die Kontaktierung der Zellsuspension mit magnetisierbaren Magnetbeads. Die Zweifluidsonde 1 wird durch eine konzentrische Rohranordnung gebildet. Durch das äußere Rohr 1.1 der Zweifluidsonde 1 wird die Zellsuspension in den Behälter 2 geleitet, in dem sich die magnetisierbaren Magnetbeads befinden. Die Strömungsgeschwindigkeit des Volumenstroms im äußeren Rohr 1.1 ist dabei kleiner als die Strömungsgeschwindigkeit im inneren Rohr 1.2 eingestellt, so dass die Magnetbeads aus dem Behälter 2 mit in das innere Rohr 1.2 gesaugt werden. Dabei erfolgt mit hoher Wahrscheinlichkeit bereits beim Eintritt des Gemisches von Zellsuspension und Magnetbeads in das innere Rohr 1.2 ein Kontakt zwischen Zellsuspension und Magnetbeads.
  • Das innere Rohr 1.2 ist mit dem Inkubationsleiter 3 verbunden. Die Funktion des inneren Rohres 1.2 kann auch vom Inkubationsleiter 3 mit übernommen werden. Beispielsweise kann der Inkubationsleiter 3 als Teflonschlauch ausgebildet sein, der in das äußere Rohr 1.1 der Zweifluidsonde 1 eingeführt wird.
  • Während des Flusses im Inkubationsleiter 3 erfolgt die spezifische Bindung der Magnetbeads an die Zielzellen. Es entsteht ein Gemisch aus Zellsuspension, Magnetbeads und Magnetbead-Zielzell-Komplexen. Der Inkubationsleiter 3 leitet dieses Gemisch in den Eingang 4.1 eines Mikrokanal-Netzwerkes 4. Gleichzeitig werden dem Gemisch, das im Hauptkanal 4.8 des Mikrokanal-Netzwerkes 4 transportiert wird, über weitere Eingänge des Mikrokanal-Netzwerkes mindestens eine Pufferlösung zugeführt. Im dargestellten Beispiel werden zwei Pufferlösungen verwendet, die über Pufferkanäle 9 mit den Eingängen 4.2 und 4.3 dem Gemisch aus Zellsuspension, Magnetbeads und Magnetbead-Zielzell-Komplexen im Hauptkanal 4.8 zugeführt werden.
  • Mit einer rotierenden Magnetscheibe 6 wird ein Magnetfeld erzeugt, dessen Feldlinien auf das durch den Mikrokanal strömende Gemisch aus Zellsuspension, Magnetbeads und Magnetbead-Zielzell-Komplexen einwirken. Durch die Einwirkung des Magnetfeldes wird die räumliche Verteilung von Zellsuspension, Magnetbeads und Magnetbead-Zielzell-Komplexen im bogenförmigen Hauptkanal 4.8 des Mikrokanal-Netzwerkes 4 beeinflusst, sodass an Verzweigungen jeweils Suspensionen mit unterschiedlichen Konzentrationen der Bestandteile des Gemischs entnommen werden. Im dargestellten Beispiel ist ein Ausgang 4.5 für die Zellsuspension ohne magnetisch markierte Zielzellen, ein Ausgang 4.6 für eine Mischung aus Zellsuspension ohne magnetisch markierte Zielzellen und Pufferlösung sowie ein Ausgang 4.7 für Zellsuspension mit durch Magnetbeads markierten Zielzellen und Pufferlösung vorgesehen.
  • In 2 ist eine Ausführung dargestellt, bei der das Mikrokanal-Netzwerk 4 in einem Fluidikchip 5 integriert ist. Er enthält eine Basisplatte und eine Deckplatte. In der Basisplatte befindet sich der bogenförmige Hauptkanal 4.8, der eine Eintrittsöffnung 4.1 für Zellsuspension sowie die Austrittsöffnung 4.5 für Zellsuspension ohne magnetisch markierte Zielzellen, die Austrittsöffnung 4.6 für Zellsuspension ohne magnetisch markierte Zielzellen und Puffer sowie die Austrittsöffnung 4.7 für Zellsuspension mit Magnetbead-Zielzell-Komplexen und Puffer aufweist. In den Hauptkanal 4.8 münden die Kanäle 9.1 und 9.2 für die Pufferlösungen mit den zugehörigen Eintrittsöffnungen 4.2 und 4.3.
  • Die 3 bis 6 erläutern die Wirkung des rotierenden Magnetfeldes auf die Verteilung der Bestandteile des durch den Hauptkanal 4.8 strömenden Gemischs aus Zellsuspension, Magnetbeads und Magnetbead-Zielzell-Komplexen. Die Feldlinien der rotierenden Magnetscheibe 6 durchdringen den Hauptkanal 4.8 und wirken somit auf das durch den Mikrokanal strömende Gemisch aus Zellsuspension, Magnetbeads und Magnetbead-Zielzellen-Komplexen ein. Die Magnetscheibe 6 enthält mehrere Einzelmagnetanordnungen 7, welche jeweils aus einem oberen Magnet 7.1 und einem unteren Magnet 7.2 bestehen. Durch die Einwirkung des Magnetfeldes wird die räumliche Verteilung von Zielzellen 8.1, z. B. Krebszellen im Blut, und Magnetbeads 8.3 im Hauptkanal 4.8 beeinflusst, sodass an dessen Austrittsöffnungen 4.5, 4.6 und 4.7 jeweils Suspensionen mit unterschiedlichen Konzentrationen der Bestandteile des Gemischs entnommen werden können. In den Draufsichten 3B, 4B, 5B und 6B sind Orte A, B, C und D im Hauptkanal 4.8 markiert. Aus den zugehörigen Schnittdarstellungen 3A, 4A, 5A und 6A ist erkennbar, dass sich die nicht markierten Zellen 8.2 im Verlauf ihres Weges von A nach C in Richtung des äußeren Randes des Hauptkanals 4.8 bewegen, so dass sie an der Position C diesen nahezu vollständig durch die Austrittsöffnung 4.6 verlassen. Die Zielzellen 8.1 verbleiben infolge der magnetischen Wirkung auf der kreisförmigen Bahn und verlassen den Hauptkanal 4.8 durch die Austrittsöffnung 4.7.
  • In 7 ist eine Ausführungsform der Anordnung zum Separieren von Zellen aus einer Zellsuspension im Zusammenwirken mit einem Kühlmodul und weiteren Bauelementen zur Einspeisung und Entnahme der Fluid-Komponenten dargestellt.
  • Bezugszeichenliste
    • 1
    Zweifluidsonde
    1.1
    äußeres Rohr der Zweifluidsonde
    1.2
    inneres Rohr der Zweifluidsonde
    2
    Behälter
    2.1
    suspendierte Magnetbeads
    3
    Inkubationsleiter
    4
    Mikrokanal-Netzwerk
    4.1
    Eintrittsöffnung für Zellsuspension
    4.2
    Eintrittsöffnung für Puffer 1
    4.3
    Eintrittsöffnung für Puffer 2
    4.4
    Eintrittsöffnung für Puffer 3
    4.5
    Austrittsöffnung für Zellsuspension
    4.6
    Austrittsöffnung für Zellsuspension und Puffer
    4.7
    Austrittsöffnung für Zellsuspension, Puffer und Magnetbeads
    4.8
    Hauptkanal
    5
    Fluidikchip
    5.1
    erste Verzweigung
    5.2
    zweite Verzweigung
    6
    Rotierende Magnetscheibe
    7
    Einzel-Magnetanordnung
    7.1
    oberer Magnet
    7.2
    unterer Magnet
    8
    Zellsuspension
    8.1
    Zielzelle
    8.2
    unmarkierte Zelle
    8.3
    Magnetbead
    9
    Pufferkanäle
    9.1
    Kanal für Puffer 1
    9.2
    Kanal für Puffer 2

Claims (10)

  1. Verfahren zum Separieren von Zellen aus einer Zellsuspension (8), wobei in der Zellsuspension (8) befindliche Zielzellen (8.1) mittels funktionalisierten Magnetbeads markiert und anschließend separiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass – eine Zweifluidsonde (1) in einen Behälter (2) mit suspendierten funktionalisierten Magnetbeads (2.1) oder einer Zellsuspension (8) eintaucht, wobei in einem äußeren Rohr (1.1) der Zweifluidsonde die Zellsuspension (8) oder suspendierte funktionalisierte Magnetbeads (2.1) zugeführt werden und durch ein inneres Rohr (1.2) ein Zellsuspension-Magnetbead-Gemisch abgesaugt wird, – das Gemisch durch einen Inkubationsleiter (3) transportiert wird, in dem eine Inkubation der Magnetbeads mit den Zielzellen erfolgt, – dem Gemisch eine Pufferlösung zugeführt wird und – in einem Mikrokanal-Netzwerk (4) in einer ersten Verzweigung (5.1) eines Hauptkanals (4.8) unter Wirkung eines bewegten Magnetfeldes die mit Magnetbeads markierten Zielzellen im Hauptkanal (4.8) weiter transportiert werden, während die nicht markierten Zellen zu einem Ausgang des Mikrokanalnetzwerkes (4) transportiert werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur des Gemisches aus Zellsuspension und Magnetbeads durch Temperieren des Inkubationsleiters (3) eingestellt wird.
  3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Magnetpole auf einer Kreisbahn oberhalb und/oder unterhalb des Hauptkanals (4.8) rotieren.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einer oder mehreren zusätzlichen Verzweigungen weitere Selektionen erfolgen.
  5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zum Separieren von Zellen aus einer Zellsuspension (8), wobei in der Zellsuspension (8) befindliche Zielzellen (8.1) mit Magnetbeads markiert und anschließend separiert werden, aufweisend – eine Zweifluidsonde (1), welche in einen Behälter (2) eintaucht, in dem sich suspendierte Magnetbeads oder eine Zellsuspension (8) befinden, mit einem Rohr (1.1) zur Zuführung der Zellsuspension (8) oder zur Zuführung suspensierter Magnetbeads und einem zweiten Rohr (1.2) zur Absaugung eines Gemischs aus Magnetbeads und Zellsuspension, – einen Inkubationsleiter (3), – ein Mikrokanal-Netzwerk (4), welches einen Hauptkanal (4.8) mit einem Eingang (4.1) für die mit Magnetbeads versehene Zellsuspension und einen Ausgang für mit Magnetbeads markierte Zielzellen (4.7) sowie mehrere Verzweigungen enthält, die den Hauptkanal (4.8) mit mehreren Ein- und Ausgängen für das Zuführen von Pufferlösungen und das Ableiten nicht markierter Zellen verbindet, – eine bewegliche Magnetanordnung.
  6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die bewegliche Magnetanordnung aus rotierenden Scheiben, die jeweils mindestens zwei Magnetanordnungen (7) aufweisen, besteht, zwischen denen sich der Hauptkanal (4.8) befindet.
  7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Inkubationsleiter (3) einen Innendurchmesser von 0,5 mm bis 3 mm aufweist.
  8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass in Strömungsrichtung vor dem Eingang (4.1) ein Temperierungsmodul angeordnet ist.
  9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikrokanal-Netzwerk als Fluidikchip (5) ausgebildet ist.
  10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluidikchip (5) eine Deckplatte und eine Basisplatte aufweist, wobei die Basisplatte an ihrer Oberfläche Vertiefungen für Kanäle enthält, welche die Strömungskanäle (4.8, 9.1, 9.2) bilden.
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