DE102009043426B4

DE102009043426B4 - Vorrichtung und Verfahren zur Gewinnung, zum Nachweis und zur Analyse von Zellen in einem mikrofluidischen System

Info

Publication number: DE102009043426B4
Application number: DE102009043426A
Authority: DE
Inventors: Alexander Frey; Dr. Hiltawsky Karsten; Dr. Sickert Daniel
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens AG
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2009-09-29
Publication date: 2012-05-24
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: US20110076684A1; DE102009043426A1

Abstract

Vorrichtung zur Gewinnung und zum Nachweis von Zellen in einer biologischen Flüssigkeit mit einem mikrofluidischen System, umfassend a) mindestens einen mikrofluidischen Kanal mit geringem Querschnitt, der mit zellspezifischen Bindungsmolekülen ganz oder teilweise beschichtet ist und der keine den Fluidstrom teilende Strömungshindernisse aufweist, und b) mindestens eine Vorrichtung zur Erzeugung eines gleichförmigen und veränderbaren Flüssigkeitsstroms durch den mikrofluidischen Kanal, wobei das Verhältnis Breite zu Höhe des Kanals im Bereich von 1000:1 bis 1:1 liegt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Gewinnung, zum Nachweis und zur Analyse von Zellen in einer biologischen Flüssigkeit mit einem mikrofluidischen System sowie ein Verfahren zur Gewinnung und gegebenenfalls zur Analyse von Zellen in einer biologischen Flüssigkeit unter Verwendung eines mikrofluidischen Systems. Das erfindungsgemäße Verfahren dient insbesondere zur Gewinnung und zur Analyse von zirkulierenden Tumorzellen und findet somit bevorzugt Anwendung in der Tumordiagnostik.
Ein Patient, der an einer bösartigen Tumorerkrankung leidet, durchläuft in der Regel mehrere Krankheitsstadien, die von der Art, der Größe und dem Wachstum des Tumors abhängen. Charakteristisch für einen bösartigen Tumor ist dessen unreguliertes und fortschreitendes invasives Wachstum, das ab einem gewissen Stadium die ursprüngliche Organgrenze überschreitet. Typischerweise führt dieses organübergreifende Wachstum in der Spätphase einer Tumorerkrankung zur Ausbildung von Metastasen, d. h. einer Ausbildung von neuem Tumorgewebe an anderen Körperstellen als der ursprünglichen primären Tumorlokalisation.
Inzwischen ist bekannt, dass diese Metastasen durch sogenannte „zirkulierende” Tumorzellen hervorgerufen werden. Die zirkulierenden Tumorzellen lösen sich vom Primärtumor ab und zirkulieren mit dem Blut durch den Körper, wodurch es zur Ausbildung von Metastasen kommen kann. Die Anzahl der zirkulierenden Tumorzellen wird heute als neuer Parameter zur Prognose des Krankheitsverlaufs bei Patienten, die an einem metastasierenden Tumor leiden, genutzt. Nimmt die Zahl der zirkulierenden Tumorzellen unter der Therapie ab, so ist dies ein Indikator für eine erfolgreiche Therapie im Sinne eines Rückgangs der Metastasen bzw. des Primärtumors. Somit kann der Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen auch zur Therapieoptimierung verwendet werden.
Ein systematisches Auffinden dieser Zellen in frühen Tumorstadien ist mit bisher bekannten Verfahren möglich, allerdings nur mit begrenzter Genauigkeit. Eine große Herausforderung bei der Untersuchung von Blutproben besteht in der geringen Zahl von zirkulierenden Tumorzellen. Ein Untersuchungsverfahren muss daher so empfindlich sein, dass eine Tumorzelle pro Milliliter Blut detektiert wird. Gleichzeitig muss das Verfahren sehr spezifisch sein, weil in einem Milliliter Blut unter anderem circa zehn Millionen Leukozyten vorhanden sind, welche teilweise ähnliche Eigenschaften hinsichtlich beispielsweise Größe, Zellkern etc., und zum Teil ähnliche Oberflächeneigenschaften besitzen wie zirkulierende Tumorzellen.
Zum Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen ist seit 2008 ein Produkt der Firma Veridex LLC (CellSearch^TM) im Handel, mit welchem die Anzahl zirkulierender Tumorzellen in einer Blutprobe bestimmt werden kann und die Tumorzellen als solche identifiziert werden können. Das Volumen der mit diesem System zu untersuchenden Blutprobe beträgt maximal 7,5 ml. Das CellSearch^TM-System beruht auf der Verwendung von Anti-EpCAM-Antikörpern, die an mikroskopisch kleine, magnetische Eisenteilchen gebunden sind. Dabei wird ausgenutzt, dass die meisten zirkulierenden Tumorzellen auf ihrer Oberfläche das Ep-CAM-Antigen aufweisen. Mit Hilfe der magnetischen Anti-EpCAM-Teilchen werden die Tumorzellen in einem ersten Arbeitsschritt magnetisch angereichert. In einem weiteren Arbeitsschritt werden die angereicherten zirkulierenden Tumorzellen gefärbt und mikroskopiert. Derzeit ist das Verfahren der Firma Veridex LLC nur als Indikator für den Krankheitsverlauf von Patienten mit einem metastasierenden Tumorleiden für Brustkrebs und Prostatakrebs zugelassen. Zur Diagnose von frühen Stadien einer Tumorerkrankung (mit deutlich weniger zirkulierenden Tumorzellen) erscheint das Verfahren als eher ungeeignet. Zum einen ist das maximal zu prozessierende Blutvolumen auf 7,5 ml begrenzt, welches in einer Blutentnahme gewonnen werden muss. Die Blutentnahme ist per se ein methodischer Nachteil bei der Suche nach wenigen zirkulierenden Zellen, weil von den typischerweise vorhandenen 5.000 ml Blut nur ein kleiner Anteil entnommen werden kann. Dadurch ergibt sich allein aufgrund von statistischen Schwankungen (Poisson-Verteilung) eine große Messungenauigkeit. Des Weiteren haben inzwischen andere Untersuchungen gezeigt, dass mit dem im CellSearch^TM-Test verwendeten Anreicherungsverfahren, bei dem magnetische Beads verwendet werden, keine maximale Ausbeute erreicht werden kann (vgl. Nagrath, Nature 450(7173): 1235–1239, 2007).
In der WO 2008/130977 A2 ist ein Verfahren zum Sortieren von Partikeln (wie zum Beispiel Zellen) durch eine unbeschichtete Mikrokanalstruktur beschrieben. Die Zellsortierung erfolgt hierbei durch die Ausnutzung von fluidischen Eigenschaften der Partikel. Es ist allerdings fraglich, ob auf diese Weise eine ausreichende Spezifität bzgl. der Unterscheidung von Leukozyten und zirkulierenden Tumorzellen erreicht werden kann.
Derzeit sind Biochips mit einer Mikrokanalstruktur im Einsatz, zum Beispiel von der Firma febit. Dieser Chip wird aber nicht von Flüssigkeiten mit festen Bestandteilen (wie Zellen oder Bakterien) durchströmt, sondern mit Flüssigkeiten, die insbesondere Nukleinsäuren bzw. Nukleotide enthalten. Weiterhin ist dieser Chip so ausgelegt und chemisch vorbereitet, dass er mit Nukleotidketten bestückt werden kann. Bei der Bestückung mit Nukleotidketten ist zu beachten, dass eine ortsabhängige Variation der Nukleotidketten durchaus erwünscht ist, weil diese als Fängermoleküle bei der nachfolgenden Durchspülung der Kanäle dienen. Auf diese Weise können ortsabhängig unterschiedliche Nukleinsäuren gefangen und detektiert werden. Eine homogene Beschichtung mit einer einzigen Nukleinsäure wird derzeit in der Anwendung nicht praktiziert. Ebenfalls wird bei dieser Art von Nukleinsäure-Detektion darauf geachtet, dass die durchspülte Flüssigkeit keine zellulären Bestandteile enthält. Daher ist es nicht naheliegend, die Beschichtung der Kanäle so auszulegen, dass zelluläre Bestandteile an der Wand spezifisch binden können (z. B. durch Proteine/Antikörper). Weiterhin wird mit dieser Art von Detektion auch nicht versucht, klassische Immunoassays nachzuahmen, so dass die Beschichtung der Chipkanäle mit Antikörpern ebenfalls nicht naheliegend ist. Insbesondere ist die Einbringung von Antikörpern wie anti-EpCAM weder vorgesehen noch bekannt.
Keines der Verfahren zum Auffinden von zirkulierenden Zellen aus dem Stand der Technik liefert derzeit befriedigende Ergebnisse bezüglich der aufzufindenden Zellen und insbesondere bezüglich eines Nachweises von zirkulierenden Tumorzellen im Blut.
Ferner erlaubt auch der Nachweis von anderen Zellen als zirkulierenden Tumorzellen im Blut wertvolle diagnostische Hinweise. Beispielsweise können aus dem Nachweis zirkulierender Stammzellen, zirkulierender fetaler Zellen oder zirkulierender Bakterienzellen in einer Körperflüssigkeit diagnostische und prognostische Hinweise auf den Zustand eines Patienten erhalten werden.
Es besteht somit ein Bedarf nach einem Verfahren und einer Vorrichtung zur Gewinnung, zum Nachweis und zur Analyse von Zellen in einer biologischen Flüssigkeit, insbesondere von zirkulierenden Tumorzellen in einer biologischen Flüssigkeit, und der Erfindung liegt somit diese Aufgabe zugrunde. Das erfindungsgemäße Verfahren soll sich zur Gewinnung und zur Analyse von beliebigen Zellen und insbesondere beliebigen zirkulierenden Tumorzellen in einer biologischen Flüssigkeit eignen. Es soll sich insbesondere zur Gewinnung und zum Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen in einem Frühstadium der Erkrankung eignen, d. h., es soll die Gewinnung von zirkulierenden Tumorzellen in extrem geringen Blutkonzentrationen erlauben. Das Verfahren bzw. die Vorrichtung soll sich durch eine hohe Sensitivität und eine hohe Spezifität auszeichnen. Ferner soll die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren leicht handhabbar sein und sich zur Automatisierung eignen. Ferner soll die Vorrichtung erlauben, gewonnene und immobilisierte Zellen mit spezifischen Proteinmarkern zu verbinden, um die Zellen anschließend molekular-biologisch charakterisieren zu können. Ferner soll es möglich sein, die immobilisierten Zellen wiederzugewinnen und in erhöhter Reinheit und Konzentration zu eluieren. Ferner soll es möglich sein, die Nukleinsäuren der immobilisierten Zellen zu gewinnen. Insgesamt soll es möglich sein, die fraglichen Zellen zu charakterisieren.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass mit einer mikrofluidischen Kanalstruktur mit geringem Querschnitt, welche ganz oder teilweise mit zellspezifischen Bindungsmolekülen beschichtet ist und welche keine den Fluidstrom teilende Strömungshindernisse aufweist, ganze Zellen spezifisch angereichert und nachgewiesen werden können. Dazu ist eine langsame Fluidbewegung der Zellsuspension (z. B. Blut) notwendig, bei der eine spezifische Bindung der Zellen an die Wand der beschichteten Kanalstruktur erfolgt.
Die Erfindung betrifft somit eine Vorrichtung zur Gewinnung, zum Nachweis und gegebenenfalls zur Analyse von Zellen in einer biologischen Flüssigkeit mit einem mikrofluidischen System, umfassend a) mindestens einen mikrofluidischen Kanal mit geringem Querschnitt, der mit zellspezifischen Bindungsmolekülen ganz oder teilweise beschichtete ist und der keine den Fluidstrom teilende Strömungshindernisse aufweist, b) mindestens eine Vorrichtung zur Erzeugung eines gleichförmigen und veränderbaren Flüssigkeitsstroms durch den mikrofluidischen Kanal und gegebenenfalls c) mindestens eine Vorrichtung zur Analyse der genetischen Information der Zellen, sowie ein Verfahren zur Gewinnung, zum Nachweis und gegebenenfalls zur Analyse von Zellen in einer biologischen Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) eine Probe einer biologischen Flüssigkeit durch eine vorstehend definierte Vorrichtung mit einer definierten Geschwindigkeit V₁ leitet, so dass eventuell in der Probe vorhandene Zellen an die zellspezifischen Bindungsmoleküle gebunden werden, b) die Probe der biologischen Flüssigkeit und/oder eine geeignete Flüssigkeit durch die Vorrichtung mit einer definierten Geschwindigkeit V₂ ein- oder mehrmals leitet, so dass unspezifisch gebundene Bestandteile der Probe entfernt werden, c) die an die zellspezifischen Bindungsmoleküle gebundenen Zellen in geeigneter Weise detektiert, und gegebenenfalls d) die gebundenen Zellen ablöst und gegebenenfalls die genetische Information der Zellen analysiert, wobei das Verhältnis der Geschwindigkeiten V₁:V₂ im Bereich von 1:5 bis 1:10 liegt. Ferner betrifft die Erfindung die vorstehend genannte Vorrichtung zur Verwendung zur Diagnose und/oder Prognose des Stadiums einer bösartigen Tumorerkrankung bzw. zur Verwendung zur Therapieentscheidung oder Therapieanpassung bei einer bösartigen Tumorerkrankung bzw. während des Krankheitsverlaufs. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit, das die vorstehend genannte Vorrichtung zusammen mit Reagentien zur Detektion der Zellen und/oder Analyse der genetischen Information einer Zelle umfasst.
Der Gegenstand der Erfindung beruht auf der Verwendung eines mikrofluidischen Systems. Mikrofluidische Systeme sind zentrale Handhabungssysteme für Fluide wie Flüssigkeiten oder Gase mit oder ohne Feststoffanteil in der Mikro- oder Nanotechnologie. Sie finden insbesondere im Bereich der Biomedizin Anwendung. Auf dem Fachgebiet sind zahlreiche Geräte bekannt und im Handel erhältlich, mit denen mikrofluidische Systeme gehandhabt werden können. Der Stofftransport in fluidischen Systemen erfolgt üblicherweise durch Bewegung des Fluids, wodurch die darin enthaltenen Substanzen weiter transportiert werden. Die Partikelbewegung hängt dabei neben den geometrischen Größen und den wirkenden Oberflächenkräften insbesondere von der Strömungsgeschwindigkeit des Fluids ab. Die Fluidbewegung findet üblicherweise in Kanalsystemen statt, wobei die Strömungsgeschwindigkeiten üblicherweise etwa 1–10 mm/s betragen. Die Geschwindigkeit der Teilchen in den Fluidkanälen hängt von der Größe des Kanalquerschnitts, dem Verhältnis Kanalgröße zu Partikelgröße, der Fluidgeschwindigkeit, der Haftung der Partikel an den Kanalwänden und der Form der Partikel ab.
Eine wesentliche Komponente der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist somit eine Kanalstruktur mit einem geringen Querschnitt bzw. Durchmesser (Mikrokanalstruktur). Bevorzugt ist die Querschnittsfläche kleiner als 0,04 mm² bei rundem Querschnitt, bei rechteckigem Querschnitt kleiner als 1 mm², bevorzugt kleiner als 0,1 mm², weiter bevorzugt zwischen 0,01 und 0,05 mm². Der Querschnitt kann jede beliebige für die Zwecke der Erfindung geeignete Form annehmen. Bevorzugt ist der Querschnitt rund, oval oder rechteckig. Es ist vorteilhaft, dass das Verhältnis von Breite zu Höhe des Kanals bei rechteckiger Form des Kanals hoch ist. Das Verhältnis von Breite zu Höhe des Kanals sollte 1:1 bis 1000:1, bevorzugt 1:1 bis 100:1 und besonders bevorzugt 5:1 bis 20:1 betragen. Im Falle eines runden Querschnitts sollte der Durchmesser dieser Kanalstruktur kleiner als 200 μm sein, bevorzugt beträgt er zwischen 50 und 100 μm. Im Falle eines rechteckigen Querschnitts sollte die Höhe einer rechteckigen Querschnittsseite kleiner als 200 μm sein und bevorzugt 40 bis 100 μm betragen. In einem Ausführungsbeispiel kann die Breite des rechteckigen Kanals beispielsweise 220 μm betragen, während die Höhe beispielsweise 65 μm beträgt. Die Querschnittsbreite des rechteckigen Querschnitts kann zwischen 100 μm und 10 mm frei gewählt werden. Das Produkt von Querschnittshöhe und Querschnittsbreite bestimmt die Querschnittsfläche, welche die maximal erreichbare Durchflussgeschwindigkeit bestimmt. Der Kanalquerschnitt ist so auszulegen, dass sich ein Flussprofil ausbildet, durch das möglichst viele Zellen beim Durchlaufen der Kanalstruktur mindestens einmal Kontakt mit der beschichteten Oberfläche der Kanalstruktur haben. Durch Einführung von Krümmungen bzw. Verengungen können zusätzliche Mischvorgänge erreicht werden, die dazu führen, dass jede Zelle bei vollständigem Durchlaufen der Kanalstruktur mindestens einmal Kontakt mit der Kanaloberfläche hat. Ferner ist wesentlich, dass die Kanalstruktur keine den Fluidstrom teilende Strömungshindernisse aufweist.
Die Oberfläche der Kanalstruktur ist ganz oder teilweise mit zellspezifischen Bindungsmolekülen beschichtet. Diese Bindungsmoleküle sind spezifisch gegen typische Oberflächenstrukturen der nachzuweisenden Zellen gerichtet, so dass diese spezifisch an die Wand der Kanalstruktur gebunden werden können. Zellspezifische Bindungsmoleküle sind beispielsweise monoklonale oder polyklonale Antikörper, ein Antigen-bindendes Fragment davon, rekombinante Bindungsproteine oder ein Aptamer oder Mischungen derartiger Bindungsmoleküle. Je nach nachzuweisendem Zelltyp sind diese Bindungsmoleküle gegen spezifische Oberflächenantigene bzw. Membran- und Transmembranproteine gerichtet. Ein Beispiel hiefür ist der Anti-EpCAM-Antikörper, der an zirkulierende Tumorzellen bindet. Weitere Beispiele sind Antikörper gegen Cytokeratine und epitheltypische Proteine. Beispiele sind CK5, CK6, CK8, CK17, CK18, Ber-EP4, Her-2/neu, MCSP, CEA, EMA, MUC1.
Techniken zur Herstellung entsprechender Bindungsmoleküle sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Ebenso sind Techniken zur Fixierung und Verteilung dieser Bindungsmoleküle an der Oberfläche einer Kanalstruktur bekannt. Durch die Mikrokanalstruktur wird erreicht, dass eine große Oberfläche von dem zu untersuchenden flüssigen Medium angeströmt wird. Wird zusätzlich der Querschnitt der Mikrokanalstruktur klein gehalten sowie ein günstiger Kurvenverlauf der Mikrokanalstruktur gewählt, dann ergibt sich ein Flussprofil der Art, dass alle Bestandteile des flüssigen Mediums während der Passage der Mikrokanalstruktur Kontakt mit der Oberfläche haben. Eine kleine und flache Querschnittsfläche mit einem hohen Breite-zu-Höhe-Verhältnis ist dabei besonders vorteilhaft, wie vorstehend ausgeführt.
Die Mikrokanalstruktur kann aus beliebigen Materialien, die mit biologischen Flüssigkeiten kompatibel sind, hergestellt sein. Entsprechende Materialien sowie Verfahren zur Herstellung derartiger Mikrokanäle sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Die Mikrokanalstruktur kann in beliebiger Form ausgebildet sein. Sie kann in geradem Weg von Eingang zu Ausgang führen oder in beliebig vielen geraden Kanalabschnitten, welche durch gekrümmte Kanalabschnitte miteinander verbunden sind, wobei die Krümmung beliebig variieren kann. Bevorzugt ist eine Mäanderstruktur des Kanals, die halbkreisförmig oder kreisförmig verläuft. Die Kanalstruktur muss mindestens einen Ausgang und einen Eingang haben, damit die zu untersuchende Flüssigkeit hindurchgepumt werden kann.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst somit eine weitere Vorrichtung zur Erzeugung eines gleichförmigen und veränderbaren Flüssigkeitsstroms, zum Beispiel eine hierfür geeignete Pumpe. Derartige Pumpen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Bevorzugt kann eine derartige angeschlossene Pumpe die zu untersuchende Flüssigkeit mit variabler Geschwindigkeit durch die Kanalstruktur pumpen, d. h., sie besitzt eine variable Förderleistung. Die Flüssigkeit kann von links nach rechts oder umgekehrt oder kreisförmig gepumpt werden. Dabei darf die Flussgeschwindigkeit bzw. Strömungsgeschwindigkeit der Zellen, die an der beschichteten Oberfläche vorbeifließen, einen bestimmten Wert nicht überschreiten, damit eine spezifische Bindung überhaupt zustande kommt. Für den Fall des kreisförmigen Pumpens kann die Flüssigkeit auch durch ein Zwischenreservoir gepumpt werden.
Somit wird in einem ersten Schritt eine Probe der biologischen Flüssigkeit durch die Vorrichtung mit einer definierten Geschwindigkeit V₁ geleitet. Bei dieser Geschwindigkeit handelt es sich um eine langsame Geschwindigkeit, die den Zellen ermöglicht, eine spezifische Bindung mit den Bindungsmolekülen einzugehen. Bevorzugt beträgt die Geschwindigkeit V₁ 0,1–1 mm pro Sekunde. In einem nächsten Schritt wird entweder nochmals die Probe der biologischen Flüssigkeit, gegebenenfalls vermischt mit einer geeigneten, für die Zellen verträglichen Flüssigkeit, oder eine geeignete Flüssigkeit als solche mit einer definierten Geschwindigkeit V₂ durch die Kanalstruktur geleitet. Die Geschwindigkeit V₂ ist höher als die Geschwindigkeit V₁ und beträgt bevorzugt 1–10 mm pro Sekunde.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Abrissgeschwindigkeit unspezifisch gebundener Zellen bei raschem Durchpumpen höher ist als die Abrissgeschwindigkeit spezifisch gebundener Zellen, d. h., auch bei schnellerem Durchpumpen der Flüssigkeit löst sich eine spezifisch gebundene Zelle nicht mehr ab, unspezifisch gebundene Zellen werden jedoch abgelöst. Durch den langsamen Pumpschritt mit der Geschwindigkeit V₁ wird somit die Sensitivität des Verfahrens erhöht, durch den schnellen Pumpschritt der Geschwindigkeit V₂ wird die Spezifität des Verfahrens erhöht, indem unspezifisch gebunden Bestandteile abgelöst werden. Der Pumpschritt mit der Geschwindigkeit V₂ kann ein- oder mehrmals wiederholt werden.
Es war nicht naheliegend, dass Zellen, die bereits eine spezifische Bindung an einer beschichteten Oberfläche ausgebildet haben, von einer Flüssigkeit mit erheblich höherer Geschwindigkeit umspült werden können, ohne dass es zur Lösung der Bindung kommt. Dieser Effekt lässt sich nutzen, um zum Beispiel eine höhere Prozessierungsgeschwindigkeit einer definierten Flüssigkeitsmenge zu erreichen bzw. um zum Beispiel unspezifisch gebundene Moleküle immer wieder von der Oberfläche zu lösen (abzuwaschen). Bevorzugt enthält die Mikrokanalstruktur keine zusätzliche Oberflächenstrukturierung, so dass das sich ausbildende Flussprofil in weiten Teilen ähnlich ist und benutzt werden kann, um zum Beispiel mit einer variierenden Flussgeschwindigkeit unspezifisch gebundene Zellen aus der Mikrokanalstruktur gezielt herauszuwaschen.
Zum Ablösen unspezifisch gebundener Bestandteile der biologischen Flüssigkeit im Kanal können folgende Spülflüssigkeiten verwendet werden: Pufferlösungen, deren Salzgehalt, pH-Wert und eventuell vorhandene Zusatzstoffe Zellen nicht schädigen. Es kann auch die biologische Probe selbst nochmals durchgeleitet werden.
Die an zellspezifische Bindungsmoleküle gebundenen Zellen werden detektiert, zum Beispiel mit Fluoreszenzmarkern, die gegen die zu detektierenden Zellen gerichtet sind (zum Beispiel Anti-EpCAM-Fluoreszenzpartikel, Cytokeratin-Marker). Dadurch kann auch bei geringer Ortsauflösung einer optischen Detektionseinheit das Vorhandensein von spezifisch gebundenen zirkulierenden Tumorzellen geprüft werden (Sandwich-Prinzip). Ferner können Fluoreszenzmarker, die spezifisch gegen Antigene auf unspezifisch gebundenen Zellen, hauptsächlich Leukocyten, gerichtet sind (die sich somit nicht auf den Tumorzellen befinden, z. B. Anti-CD45) verwendet werden, um die Spezifität des Verfahrens zu erhöhen.
Bei der vorstehenden Verfahrensgestaltung kann die spezifische Bindung von zirkulierenden Tumorzellen kontinuierlich und mit Hilfe eines Mikroskops bzw. einer CCD-Kamera als optische Detektionseinheit beobachtet werden. Dazu muss die Kanalstruktur lichtdurchlässig und die Zellen müssen bevorzugt gefärbt oder fluoreszenzmarkiert sein.
Eine lichtdurchlässige Kanalstruktur wird beispielsweise durch eine Kanalstruktur aus Glas oder einem lichtdurchlässigen Polymer erzielt. Derartige Materialien sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Um die fraglichen Zellen anzufärben, bieten sich zwei Verfahren an. Die Zellen können vorher bei Vorliegen in der biologischen Flüssigkeit angefärbt werden. Hierbei ist jedoch nachteilig, dass große Mengen an Färbemedium benötigt werden. Daher werden bevorzugt die immobilisierten Zellen im Kanal angefärbt, indem nach Durchleiten der Probe und Spülen mit einem geeigneten Färbemedium durchgespült wird und überschüssiges Färbemedium anschließend mit einer Waschlösung ausgespült wird. Färbemedien für biologische Zellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und die Färbung wird nach den Angaben des jeweiligen Herstellers durchgeführt.
Erfindungsgemäß können beliebige biologische Flüssigkeiten auf das Vorhandensein von Zellen untersucht werden. Beispiele für biologische Flüssigkeiten sind Vollblut, Plasma, Speichel, Bronchiallavage, Ascitesflüssigkeit, Liquor, angereicherte Fraktionen aus den vorstehenden biologischen Flüssigkeiten wie z. B. durch Dichtegradientenzentrifugation, Hämolyse oder Filterung gewonnene angereicherte Vollblutfraktionen etc. Beispiele für die in der biologischen Flüssigkeit vorkommenden Zellen sind zirkulierende Tumorzellen, Bakterienzellen, Pilzzellen, embryonale Zellen, Immunzellen, Stammzellen, fetale Zellen etc., aber auch Zellfragmente davon. Bevorzugt sind die Zellen zirkulierende Tumorzellen oder Bakterienzellen.
Die Aufbereitung der biologischen Proben für die Durchleitung durch die Mikrokanalstruktur ist einem Fachmann gut bekannt. Wesentlich ist, dass die Viskosität der Probe in geeigneter Weise so herabgesetzt wird, dass die Probe kanalgängig wird. Beispielsweise ist Blut ungerinnbar zu machen.
Im Falle eines positiven Nachweises von Zellen, insbesondere zirkulierenden Tumorzellen, können diese aufgebrochen werden und die genetische Information der Zelle (zum Beispiel DNA, mRNA oder miRNA) kann in der gleichen oder in einer nachgeschalteten Mikrokanalstruktur analysiert werden Entsprechende Detektionsvorrichtungen sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Ein solches Detektionsverfahren lässt sich – zusammen mit der Mikrokanalstruktur und der Pumpvorrichtung – leicht auf einem Chip implementieren, wodurch sich Vorteile bei der Prozessierung und bei den Kosten ergeben. Bei der Prozessierung erspart man sich mindestens einen Verarbeitungsschritt, da die angereicherten zirkulierenden Zellen bzw. Tumorzellen für die weitere Analyse nicht aus der Mikrokanalstruktur extrahiert werden müssen. Hinsichtlich der Kosten ist es vorteilhaft, dass eine (verhältnismäßig) teure weitere Analyse der Zellen, insbesondere der zirkulierenden Tumorzellen (z. B. miRNA-Analyse), auf dem gleichen Chip nur dann durchgeführt werden würde, wenn ein positiver Nachweis auf zirkulierende Tumorzellen überhaupt erfolgt ist. Dies ist deshalb wichtig, weil gerade im Screening voraussichtlich nur wenige Fälle mit einem positiven Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen zu erwarten sind, so dass der erste Schritt in einem Detektionsverfahren (Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen) günstig sein muss. Der zweite Schritt in einem Detektionsverfahren (z. B. Charakterisierung der zirkulierenden Tumorzellen mittels miRNA-Analyse) ist insbesondere bei einem positiven Nachweis von CTC sinnvoll und würde dann auch höhere Kosten rechtfertigen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt zur Diagnose und/oder Prognose des Stadiums einer bösartigen Tumorerkrankung oder zur Erstdiagnose verwendet. Weiter bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der Vorrichtung für Therapieentscheidung oder Therapieanpassung bei einer bösartigen Tumorerkrankung bzw. während des Krankheitsverlaufs verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dabei auf alle metastasierenden Tumorarten anwendbar, insbesondere solche epithelialer Herkunft, d. h. auf alle Karzinome und Adenokarzinome, wenn z. B. ein anti-EpCAM-Antikörper für die Beschichtung der Kanalstruktur verwendet wird. Es eignet sich aber auch zum Nachweis anderer Tumorarten mesenchymaler Herkunft wie z. B. Sarkome oder Leukämien, wenn die Kanalstruktur mit Antikörpern beschichtet wird, die spezifisch gegen Antigene dieser Tumorarten gerichtet sind.
Ferner können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch fetale Zellen zum Nachweise fetaler Anomalien gewonnen und analysiert werden. Ebenso eignet es sich zum Nachweis von im Blut zirkulierenden Bakterienzellen, zum Beispiel als Hinweis auf eine beginnende oder bestehende Sepsis.
Weiterhin eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung autologer Stammzellen aus dem Blut für therapeutische Zwecke. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Stammzellen angereichert und extrahiert werden und therapeutisch, zum Beispiel bei vernarbten Herzmuskelgewebe nach Myokardinfarkt oder bei Parkinson-Erkrankung, eingesetzt werden.
Weiterhin können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch Proteine, die von einer Zelle exprimiert werden, über fluoreszenzmarkierte Antikörperzellen nachgewiesen werden. Damit lässt sich beispielsweise der Gewebeursprung eines Tumors lokalisieren, wodurch sich das Verfahren besonders zur Frühdiagnostik einer Tumorerkrankung eignet.
Generell eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnose jeder Art von Erkrankungen, die durch zelluläre Komponenten hervorgerufen wird bzw. mit einer Veränderung zellulärer Komponenten in einer Körperflüssigkeit einhergeht.
Das Verfahren lässt sich ambulant von einem Arzt durchführen, kann aber auch in einer Klinik durchgeführt werden. Somit betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnose, Prognose und Therapiekontrolle der vorstehend genannten Erkrankungen.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch ein Kit, das die erfindungsgemäße Vorrichtung zusammen mit Reagentien zur Detektion der Zellen und/oder zur Analyse der genetischen Information einer Zelle umfasst (molekulare Diagnostik). Derartige Reagenzien sowie deren Verwendung sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden nach Angaben des Herstellers verwendet.

Claims

Vorrichtung zur Gewinnung und zum Nachweis von Zellen in einer biologischen Flüssigkeit mit einem mikrofluidischen System, umfassend a) mindestens einen mikrofluidischen Kanal mit geringem Querschnitt, der mit zellspezifischen Bindungsmolekülen ganz oder teilweise beschichtet ist und der keine den Fluidstrom teilende Strömungshindernisse aufweist, und b) mindestens eine Vorrichtung zur Erzeugung eines gleichförmigen und veränderbaren Flüssigkeitsstroms durch den mikrofluidischen Kanal, wobei das Verhältnis Breite zu Höhe des Kanals im Bereich von 1000:1 bis 1:1 liegt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zusätzlich zur Analyse von Zellen dient und zusätzlich mindestens eine Vorrichtung zur Analyse der genetischen Information der Zellen umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zellspezifischen Bindungsmoleküle gegen ein Oberflächenantigen der Zellen gerichtet sind und aus einem Antikörper, einem Antigen-bindenden Fragment davon, einem rekombinanten Bindungsprotein oder einem Aptamer oder Gemischen davon ausgewählt sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zellspezifischen Bindungsmoleküle gegen zirkulierende Tumorzellen gerichtet sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Mikrofluidik-Chip ausgebildet ist.
Verfahren zur Gewinnung und zum Nachweis von Zellen in einer biologischen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine Probe einer biologischen Flüssigkeit durch eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einer definierten Geschwindigkeit V₁ leitet, so dass eventuell in der Probe vorhandene Zellen an die zellspezifischen Bindungsmoleküle gebunden werden, b) die Probe der biologischen Flüssigkeit und/oder eine geeignete Flüssigkeit durch die Vorrichtung mit einer definierten Geschwindigkeit V₂ ein- oder mehrmals leitet, so dass unspezifisch gebundene Bestandteile der Probe entfernt werden, und c) die an die zellspezifischen Bindungsmoleküle gebundenen Zellen in geeigneter Weise detektiert, wobei das Verhältnis der Geschwindigkeiten V₁:V₂ im Bereich von 1:5 bis 1:10 liegt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zusätzlich zur Analyse von Zellen dient und dass man zusätzlich die gebundenen Zellen ablöst und die genetische Information der Zellen analysiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe einer biologischen Flüssigkeit aus Vollblut, Plasma, Speichel, Bronchiallavage, Ascitesflüssigkeit, Liquor oder angereicherten Fraktionen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das zellspezifische Bindungsmolekül gegen ein Oberflächenantigen der Zellen gerichtet ist und aus einem Antikörper, einem Antigen-bindenden Fragment davon, einem rekombinanten Bindungsprotein oder einem Aptamer oder Gemischen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die gebundenen Zellen mittels Anfärben oder durch Verwendung fluoreszenzmarkierter Antikörper detektiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Geschwindigkeit V₁ in Schritt a) zwischen 0,1 und 1 mm/s beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Geschwindigkeit V₂ in Schritt b) zwischen 1 und 10 mm/s beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das zellspezifische Bindungsmolekül gegen zirkulierende Tumorzellen gerichtet ist.
Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Gewinnung und zur Analyse von Zellen in einer biologischen Flüssigkeit.
Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen zirkulierende Tumorzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Flüssigkeit aus Vollblut, Plasma, Speichel, Bronchiallavage, Ascitesflüssigkeit, Liquor oder angereicherten Fraktionen davon ausgewählt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung zur Diagnose und/oder Prognose des Stadiums einer bösartigen Tumorerkrankung sowie zur Erstdiagnose.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung zur Therapieentscheidung oder Therapieanpassung bei einer bösartigen Tumorerkrankung oder während des Krankheitsverlaufs.
Kit umfassend eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zusammen mit Reagentien zur Detektion der Zellen und/oder zur Analyse der genetischen Information einer Zelle.