DE69635377T2

DE69635377T2 - Effiziente anreicherung und detektion von ausgesäten tumorzellen

Info

Publication number: DE69635377T2
Application number: DE69635377T
Authority: DE
Inventors: Jurgen Schmitz; Stefan Miltenyi; Fawn Qian; Aaron Kantor
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH; Amcell Corp
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH; Amcell Corp
Priority date: 1995-08-28
Filing date: 1996-08-23
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2016-08-24
Also published as: EP0850417A1; WO1997008557A1; US6190870B1; DE69635377T3; CA2229001A1; EP0850417B2; EP0850417B1; US20010000751A1; DE69635377D1; ATE308754T1; AU6859696A; EP0850417A4

Description

Hintergrund
Eines der größten Probleme, mit denen ein praktizierender Onkologe zu kämpfen hat, ist die Metastase von malignen Tumorzellen von der primären Stelle zu vielfachen, entfernten Stellen. In den meisten Fällen von Krebs sind es die metastatischen Läsionen, die den Patienten töten. Während Chirurgie oft gegen einen primären Tumor wirksam ist, kann sie nicht das gesamte maligne Gewebe entfernen, wenn der Tumor bereits metastasiert hat. Beispielsweise entwickelt ein Drittel der Patientinnen mit operablem Brusttumor Metastasen nach der primären Therapie. Adjuvans-Therapie kann diese Prognose verbessern, erfordert jedoch die Identifikation von Hochrisiko-Patientinnen. Den primären Tumor durch seine Größe und das Stadium von Knötchen unter den Achseln zu bewerten, ist für diesen Zweck nicht ausreichend.
Knochen und Knochenmark sind häufige Stellen von Metastasen, doch radiologische und szintographische Verfahren können Einbindung von Knochen nur nachweisen, wenn bereits Zerstörung von Knochenmatrix eingetreten ist. Die Gegenwart von epithelialen Tumorzellen im Knochenmark korreliert im Allgemeinen mit herkömmlichen Risikofaktoren, wie z.B. Größe und histologischer Grad des primären Karzinoms, entfernte Metastase und Einbindung von Lymphknoten. Klinische Folgeuntersuchungen zeigten eine signifikant erhöhte Rückfallsrate unter jenen Patienten, die epitheliale Tumorzellen im Knochenmark zum Zeitpunkt des primären chirurgischen Eingriffs aufwiesen.
Es gibt demnach Bedarf an Verfahren, die die Detektion von verbreiteten Tumorzellen zu einem Zeitpunkt ermöglichen, zu dem sie sich noch nicht zu unheilbaren Makrometastasen entwickelt haben. Solch eine Diagnose könnte hilfreich sein zur Festlegung der Prognose, zur Entscheidung, ob eine bestimmte Therapie indiziert ist, und zur Bereitstellung eines Mittels, um die Wirksamkeit der Therapie zu überwachen. Solch eine Diagnose kann mit der im Vergleich zu normalen Knochen- und Blutzellen unterschiedlichen Morphologie von Tumorzellen arbeiten. Tumorspezifische Antigene an der Zelloberfläche können nachgewiesen werden. Wenn die Tumorzelle eine andere Entwicklungslinie aufweist als blutbildende Zellen, beispielsweise Epithelkarzinome, so können gewebespezifische Marker verwendet werden, um die Tumorzellen zu identifizieren.
Verfahren zur Detektion von Krebszellen, die sich ausgehend von kleinen lokalisierten primären Tumoren in Knochenmark, peripheres Blut und sekundäre Lymphorgane verbreiten; wurden bereits beschrieben. Morphologische Analysen können durch Cytospin-Präparate von Knochenmark-Abstrichen, Zellproben von peripherem Blut oder Lymphknoten durchgeführt werden, gefolgt von May-Grunwald-Giemsa-Färbung und Untersuchung durch Lichtmikrosopie (Molino et al. (1991)). Alternativ dazu können Cytospin-Präparate oder Abstriche von Zellen ebenfalls mit tumorspezifischen oder gewebespezifischen Antikörpern gefärbt werden. Diese Verfahren weisen den Nachteil von äußerst geringer Empfindlichkeit auf und sind zeit- und arbeitsaufwendig. Bis zu 100 zu untersuchende Objektträger können erforderlich sein, um die Gegenwart einer einzelnen Tumorzelle nachzuweisen.
Verbreitete Tumorzellen wurden auch durch die Verwendung von Umkehr-Transkriptase und Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) nachgewiesen. PCR kann verwendet werden, um mRNA von Prostata-spezifischem Antigen (PSA) oder Cytokeratin-19-mRNA zu amplifizieren. Diese Verfahren haben mehrere Nachteile, insbesondere in Bezug auf geringe Empfindlichkeit und falsche positive Resultate.
Es wurde gezeigt, dass Brustkarzinomzellen aus einer Blutprobe des peripheren Bluts durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) identifiziert oder isoliert werden können (Gross et al. (1995)). Der hohe technologische Aufwand, der für FACS erforderlich ist, stellt jedoch für die routinemäßige Verwendung zur medizinischen Diagnose ein Hindernis dar. FACS-Analyse oder -Sortierung ist ein zeitaufwendiges und kostspieliges Verfahren. Durchflusszytometrie hat den zusätzlichen Nachteil, dass es schwierig ist, große Mengen an Zellen oder Mehrfachproben zugleich zu sortieren oder zu analysieren.
Auch ein alternativer Ansatz zur Zellsortierung wurde bereits beschrieben, wobei magnetische Mikropartikel, gebunden an Antikörper, verwendet werden, um auf spezifische Zelltypen zu selektieren. Shpall et al. (1991) beschreiben ein Verfahren und eine Vorrichtung zur immunmagnetischen Reinigung von Brustkrebszellen aus Knochenmarkzellproben zur autologen Transplantation bei Karzinompatientinnen, die hochdosierte Chemotherapie erhalten.
Ein verbessertes magnetisches Sortierungsverfahren, in dem Tumorzellen aus peripherem Blut oder anderen Gewebequellen getrennt werden könnten und das ermöglicht, Mehrfachproben im Labor zu untersuchen, würde für den Bereich der onkologischen Diagnostik zahlreiche Vorteile bereitstellen.
Relevante Literatur
Detektion von verbreiteten Tumorzellen durch Morphologie an Cytospin-Präparaten oder Blutabstrichen wird in Molino et al., Cancer 67, 1033 (1991), beschrieben. Die Verwendung desselben Verfahrens in Verbindung mit Antikörperfärbung für gewebe- oder tumorspezifische Antigene wird in Redding et al., The Lancet 3, 1271 (1983); Schlimok et al., P.N.A.S. 84, 8672 (1987); Moul et al., Urology 43, 68 (1994); Menard et al., Br. J. Cancer (1994); Osborne et al., Cancer Res. 51, 2706 (1991); Cote et al., J. Clin. Oncol. 9, 1749 (1991); Bretton et al., The Prostate 25, 108 (1994); und Oberneder et al., Urol. Res. 22, 3 (1994), beschrieben.
Die Verwendung von Umkehr-Transkriptase und Polymerasekettenreaktion zur Detektion von Expression von tumor- oder gewebespezifischen Genen aus Proben von peripherem Blut, Knochenmark oder Lymphknoten wird in Seiden et al., J. Clin. Oncol. 12, 2634 (1994); Katz et al., Urology 43, 765 (1994); Schoenfeld et al., Cancer Res. 54, 2986 (1994); und Datta et al., J. Clin. Oncol. 12, 475 (1994), beschrieben.
Detektion und Trennung von Tumorzellen aus peripherem Blut durch Durchflusszytometrie wird in Gross et al., P.N.A.S. 92, 537 (1995), beschrieben. Verfahren, die immunomagnetische Trennungen verwenden, werden in Shpall et al., Bone Marrow Transplantation 7, 145 (1991); Kemmer et al., J. Immunol. Methods 147, 197 (1992); und Griwatz et al., Suppl. J. Exp. Clin. Cancer Res. 13, Nr. 3 (Abstract) (1994), beschrieben.
Korrelationen zwischen der Gegenwart von verbreiteten Tumorzellen in blutbildenden Organen und herkömmlichen Risikofaktoren werden in Schlimok et al., Eur. J. Cancer 27, 1461 (1991); Huvos et al., Ann. Surg. 173, 44 (1971); International (Ludwig) breast cancer study group, Lancet 335, 1565 (1990); und DeMascarel et al., Br. J. Cancer 66, 523 (1992), beschrieben.
Magnetische Hochgradienten-Zellsortierung wird in Miltenyi et al., Cytometry 11, 231-238 (1990), beschrieben. Molday beschreibt in US 4.452.773 die Herstellung von magnetischen Eisen-Dextran-Mikrokügelchen und stellt eine Zusammenfassung bereit, die die verschiedenen Mittel zur Herstellung von Partikeln beschreibt, die zur Anbindung an biologische Materialien geeignet sind. Eine Beschreibung von polymeren Beschichtungen für magnetische Partikel, die bei HGMS verwendet werden, sind in DE 3720844 (Miltenyi) und in Miltenyi et al., US 5.385.707 , zu finden. Verfahren zur Herstellung von superparamagnetischen Partikeln werden im US-Patent Nr. 4.770.183 beschrieben.
Verfahren werden zur Identifikation von verbreiteten, nicht blutbildenden Tumorzellen aus einer Probe blutbildender Zellen, wie z.B. aus Knochenmark, Lymphe oder peripherem Blut, bereitgestellt. Die Tumorzellen werden magnetisch mit Antikörper markiert, die auf gewebespezifische Antigene gerichtet sind. Das Markieren für zytoplasmatische Antigene erfolgt durch ein Verfahren der Permeabilisierung und Fixierung der Zellen. Magnetisches Sortieren wird verwendet, um die markierten Tumorzellen von den normalen Zellen der blutbildenden Probe zu trennen. Die an Tumorzellen angereicherte Zellfraktion ist als eine Quelle von DNA, RNA und exprimierten Proteinen zur weiteren Charakterisierung des metastatischen Zellphänotyps und zur Quantifizierung und Charakterisierung der Anzahl an Tumorzellen, die sich vom primären Tumor ausgehend verbreitet haben, nützlich.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A bis 1D zeigen die Charakterisierung von menschlicher epithelialer Antigen- (HEA-) und Cytokeratin-8/18-Expression während der magnetischen Anreicherung von experimentell zugesetzten Brustkarzinomzellen aus einer Probe von an Leukozyten reichen, über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen.
Die 2A bis 2C zeigen die Charakterisierung von CD45- und Cytokeratin-8/18-Expression während der magnetischen Anreicherung von Tumorzellen aus einer Fraktion von an Leukozyten reichen, über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen aus peripherem Blut von einer Brustkrebspatientin mit entfernten Metastasen oder aus Kontrollproben.
BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es werden Verfahren bereitgestellt, die magnetische Sortierung verwenden, um die Gegenwart von seltenen verbreiteten Tumorzellen aus Proben von blutbildenden Zellen zu identifizieren. Die Tumorzellen sind im Allgemeinen von der Stelle des primären Tumors entfernt, und ihre Gegenwart in den Proben von blutbildenden Zellen eines Patienten kann Hinweise auf das metastatische Potenzial des Tumors geben. Die Zellprobe kann mit einem permeabilisierenden Mittel und Fixierungsmittel behandelt werden, um zytoplasmatische Proteine nachzuweisen. Antikörper, die auf Tumorantigene gerichtet sind, oder Abstammungs-spezifische Antigene werden verwendet, um die Tumorzellen magnetisch zu markieren. Die markierten Zellen werden von unmarkierten, blutbildenden Zellen durch magnetische Trennung getrennt. Die Fraktion von an Tumorzellen angereicherten Zellen ist zur Quantifizierung der Tumorzellen und als eine Quelle von Tumorzellen zur weiteren Charakterisierung nützlich.
Antigene, die Marker für bestimmte Zelltypen sind, können Proteine, Kohlenhydrate, Lipide oder andere komplexe Biomoleküle sein. In manchen Typen von Tumoren wurden spezifische Antigene identifiziert, die an den malignen Zellen in erhöhten Konzentrationen exprimiert werden. Dennoch ist es häufiger, Tumorzellen zu finden, die keine charakteristischen Antigene aufweisen. In zahlreichen Fällen haben die Tumorzellen zahlreiche phänotypische Marker mit dem Zelltyp gemeinsam, von dem sie abstammen. Beispielsweise exprimieren Karzinome Antigene, die für Epithelzellen typisch sind, Lymphome solche, die für Lymphozyten typisch sind, usw. Solche Antigene können auch an Zellen von anderen Abstammungen exprimiert werden oder können in nachweisbaren Konzentrationen auch nur bei Zellen mit einer bestimmten Abstammung gefunden werden, z.B. ein gewöhnliches Leukozyten-Antigen, Epithelmembranantigen usw. Die Letztgenannten werden auch als "gewebespezifische" Antigene bezeichnet. Haben sich Tumorzellen bereits aus ihrem Ursprungsgewebe verbreitet, so können die Tumorzellen die einzigen Zellen dieser Abstammung sein, die in einer Population von Zellen einer anderen Abstammung vorhanden sind. Beispielsweise metastasieren von Epithel abstammende Karzinome zum Knochenmark, das aus blutbildenden Zellen besteht. Diese Expression von gewebespezifischen Antigenen kann dann eine Grundlage für Trennung und Detektion der Tumorzellen sein.
Die Verbreitung von Tumorzellen durch das blutbildende System ist medizinisch gesehen als ein früher Hinweis auf Metastasenbildung von großer Bedeutung. Blutbildende Zellen stammen in Bezug auf ihre Entwicklung von einer gemeinsamen embryonalen Quelle ab und haben ein gemeinsames antigenes Profil für gewebespezifische Antigene gemeinsam. Quellen für Proben von blutbildenden Zellen umfassen Blut und Fraktion davon, insbesondere Präparate von über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen, Aphorese- oder Leukophorese-Proben; Lymphe und Lymphknoten; und Knochenmark. Die Bezeichnung "blutbildende Zellen" sollte sich auf die normalen Zellpopulationen beziehen, die in Blut, Knochenmark, Lymphe usw. zu finden sind, und umfassen Lymphozyten, z.B. B-Zellen, T-Zellen und natürliche Killerzellen, Knochenmarkzellen, z.B. Makrophagen, Monozyten, polymorphonukleare Zellen, Megakaryozyten, Basophile, Eosinophile, Neutrophile; usw.; Erythroidzellen, z.B.
Retikulozyten, Plättchen und Erythrozyten; dendritische Zellen; und die Vorläufer davon. Stroma- und Fibroblastenzellen, die in Knochenmark zu finden sind, sind auch umfasst. Die Bezeichnung "Probe blutbildender Zellen", insbesondere unter Verweis auf Patientenproben, sollen geringe Anzahlen an verbreiteten Tumorzellen umfassen, die vorhanden sein können.
Gewebespezifische Antigene, die zur Trennung von Tumorzellen aus blutbildenden Zellen geeignet sind, werden als antigene Moleküle identifiziert, die in einer nachweisbaren Konzentration in den Target-Tumorzellen und in einer nicht nachweisbaren Konzentration in normalen, blutbildenden Zellen, die nachstehend als "Trennungsmarker" bezeichnet werden, vorhanden sind. Die Mehrheit der Trennungsmarker sind Proteine, obwohl tumorspezifische Mucine und Kohlenhydrate auch Verwendung finden. Im Allgemeinen ist der Unterschied der Expressionsniveaus zwischen Tumorzellen und blutbildenden Zellen zumindest ein 50faches, basierend auf Proteinquantifizierung, und noch häufiger beträgt der Unterschied zumindest etwa ein 500faches oder mehr.
Trennungsmarker können Zelloberflächenantigene sein oder können im Zytoplasma der Tumorzelle angeordnet sein. Geeignete Marker umfassen Cytokeratine, insbesondere Cytokeratin 8, 18 und 19, als einen Marker für Karzinome, die von Epithel abstammen, z.B. Adenokarzinome, die eine primäre Tumorstelle in der Brust, in den Ovarien, im Endometrium, in der Zervix, im Dickdarm, in der Lunge, im Pankreas, in der Speiseröhre, Prostata, im Dünndarm, Rektum, Uterus oder Bauch aufweisen können, oder Schuppenzellkarzinome, die eine primäre Stelle in den Lungen, in der Mundhöhle, Zunge, im Kehlkopf, in der Speiseröhre, Haut, Blase, Zervix, in dem Augenlid, in der Bindehaut, Vagina usw. aufweisen können. Epithelmembranantigen (EMA), menschliches embryonales Antigen (HEA-125), menschliche Milchfetttröpfchen, MBr1, MBr8, Ber-EP4, 17-1A, C26 und T16 sind ebenfalls als Marker für Karzinome nützlich. Desmin und muskelspezifisches Actin sind Trennungsmarker für Muskelsarkome. Alkalische Plazenta-Phosphatase, menschliches β-Choriongonadotropin und α-Fetoprotein sind Marker für trophoblastische Tumoren und Keimzellen tumoren. Prostata-spezifisches Antigen ist ein Marker für Prostata-Karzinome, karzinoembryonales Antigen für Kolon-Adenokarzinome, HMB-45 ist ein Marker für Melanome. Chromagranin-A und Synptophysin sind Marker für neuroendokrine und neuroektodermale Tumoren. Andere Antigene, die auf eine gewebespezifische Weise exprimiert werden, können auch Verwendung als Trennungsmarker verwenden. Im Allgemeinen schließt der blutbildende Ursprung von Leukämien und Lymphomen ihre Trennung durch die vorliegenden Verfahren aus, unter Ausnahme von Tumoren, die ein tumorspezifisches Antigen aufweisen, z.B. spezifische Idiotypen an B-Zell- oder T-Zelllymphomen usw.
Eine Probe von blutbildenden Zellen wird einem Patienten entnommen, der unter dem Verdacht steht, an einem Tumor mit möglicher Verbreitung in das Blut oder die Lymphe erkrankt zu sein. Bevorzugte Stellen für die primäre Tumorstelle sind die drainierenden Lymphknoten und Lymphgefäße, Blut und Knochenmark. Proben können aus Apherese-Patienten, die behandelt werden, um blutbildende Progenitorzellen zu mobilisieren, entnommen werden. Blutproben umfassen üblicherweise etwa 5 bis 100 ml Vollblut und können mit Antikoagulanzien, z.B. Heparin, EDTA, Citrat, Säurecitratdextrose oder Citratphosphatdextrose, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt behandelt werden. Blutproben können weiter fraktioniert werden, um an Fraktion von über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen angereichert zu werden. Knochenmarkaspirationen können an der Iliumkrone, am Sternum usw. durchgeführt und mit Antikoagulanzien behandelt werden. Die Probe kann Behandlungen wie z.B. Verdünnung in gepuffertem Medium, Konzentration, Filtration oder anderen groben Behandlungen unterzogen werden, die keine spezifische Trennung umfassen.
Geeignete Proben weisen etwa 10⁶, üblicherweise zumindest etwa 10⁷ und vorzugsweise 10⁸, kernhaltige Zellen auf. Detektion von Tumorzellen kann erreicht werden, wenn die Tumorzellen zumindest etwa 1 Zelle pro 10⁷ blutbildenden Zellen umfasst.
Ein Präparat aus kernhaltigen Zellen kann aus der Probe unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt werden, dass kernhaltige Zellen von Erythrozyten trennen kann. Die Verwendung von Ficoll-Paque-Dichtegradienten oder Schlämmung für solche Trennungen ist in der Literatur gut dokumentiert. Alternativ dazu können die Blutzellen in einer Lösung resuspendiert werden, die Erythrozyten selektiv lysiert, z.B. Ammoniumchloridkalium; Ammoniumoxalat; usw., oder Vollblut kann verwendet werden. Die Zellen können auch in einer Lösung von Saponin resuspendiert werden, das mit Membrancholesterin und anderen nicht-konjugierten β-Hydroxysterolen Komplexe bildet, was zur Bildung von Poren in der Zellmebran führt. Alle Zellen werden permeabilisiert, und die Erythrozyten setzen Hämoglobin frei. Die Erythrozyten-Ghosts werden dann durch Zentrifugation von kernhaltigen Zellen getrennt.
Die Probe von blutbildenden Zellen wird selektiv an Tumorzellen angereichert. Reagenzien, die Tumor-Trennungsmarker spezifisch binden, wie zuvor beschrieben wurde, werden an kolloidale superparamagnetische Partikel gebunden. Besonders nützliche Reagenzien sind Antikörper, die für die Tumor-Trennungsmarker spezifisch sind. Ganze Antikörper können verwendet werden oder Fragmente, z.B. Fab, F(ab')₂, Leicht- oder Schwerkettenfragmente usw. Solche Trennungsantikörper können polyklonal oder monoklonal sein und sind im Allgemeinen im Handel erhältlich oder können alternativ dazu mittels Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, leicht hergestellt werden. Antikörper, die zur Verwendung ausgewählt werden, weisen ein geringes Niveau an nicht-spezifischer Färbung von blutbildenden Zellen auf und haben normalerweise eine Affinität von zumindest etwa 100 μM für das Antigen.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Trennungsantikörper an ein magnetisches Reagens wie z.B. ein superparamagnetisches Mikropartikel (Mikropartikel) gebunden. Molday ( US 4.452.773 ) beschreibt die Herstellung von magnetischen Eisen-Dextran-Mikropartikeln und stellt eine Zusammenfassung bereit, die die verschiedenen Mittel zur Herstellung von Partikeln beschreibt, die zur Anbindung an biologische Materialien geeignet sind. Eine Beschreibung von polymeren Beschichtungen für magnetische Partikel, die in magnetischer Hochgradienten-Zellsortierung (HGMS) verwendet werden, ist in DE 3720844 (Miltenyi) und US 5.385.707 zu finden. Verfahren zur Herstellung von superparamagnetischen Partikeln werden im US-Patent Nr. 4.770.183 beschrieben. Die Mikropartikel weisen üblicherweise einen Durchmesser von weniger als etwa 100 nm und üblicherweise einen Durchmesser von mehr als etwa 10 nm auf. Das exakte Verfahren zur Bindung ist für die praktische Durchführung der Erfindung nicht maßgeblich, und zahlreiche Alternativen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Direkte Bindung bindet die Trennungsantikörper an die Partikel. Indirekte Bindung kann durch mehrere Verfahren erreicht werden. Die Antikörper können an ein Mitglied eines Hochaffinitäts-Bindungssystems, z.B. Biotin, gebunden sein, und die Partikel können an das andere Mitglied, z.B. Avidin, gebunden sein. Auch können Antikörper zweiter Stufe verwendet werden, die speziesspezifische Epitope der Antikörper, z.B. Anti-Maus-Ig, Anti-Ratten-Ig usw., erkennen. Indirekte Bindungsverfahren ermöglichen die Verwendung einer einzelnen, magnetisch gebundenen Einheit, z.B. Antikörper, Avidin usw., mit einer Vielzahl von Trennungsantikörpern.
Ein bevorzugtes Verfahren verwendet Hapten-spezifische Antikörper zweiter Stufe, gebunden an die magnetischen Partikel, wie in der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung Nr. 08/52.112 beschrieben wird. Die Hapten-spezifischen Antikörper weisen üblicherweise eine Affinität von zumindest etwa 100 μM für das Hapten auf. Die Antikörper werden an das geeignete Hapten konjugiert. Geeignete Hapten umfassen Digoxin, Digoxigenin, FITC, Dinitrophenyl, Nitrophenyl usw. Verfahren zur Konjugation des Haptens an Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Wenn dies auch für die praktische Durchführung der vorliegenden Verfahren nicht erforderlich ist, kann es nützlich sein, die Zellen während der anfänglichen Färbung mit Immunzytochemie-Reagenzien zu behandeln. Solche Reagenzien sind häufig markierte Antikörper, die zur Identifikation von Tumorzellen im angereicherten Zellpräparat verwendet werden, hierin Analyse-Antikörper. Diese können enzymkonjugierte Antikörper, z.B. Meerrettichperoxidase, Phosphatase usw., haptenierte Antikörper, z.B. Biotikonjugate, Digoxigeninkonjugate usw., oder mit einem Fluorochrom konjugierte Antikörper, z.B. Phycoerythrin, FITC, Rhodamin, Texas-Rot, Allophycocyanin usw., umfassen. Die Analyse-Antikörper können Spezifität für jedes beliebige der zuvor beschriebenen Tumorantigene aufweisen oder können für Marker spezifisch sein, die an blutbildenden Zellen exprimiert werden. Reagenzien können auch Blockie rungsmittel umfassen, die nicht-spezifische Markierung reduzieren, z.B. Fc-Rezeptor-Blockierungsmittel, Peroxidase-Blockierungsmittel usw. Markierung kann aus praktischen Gründen dasselbe indirekte Bindungssystem verwenden wie die magnetischen Partikel. Beispielsweise kann eine Mischung aus Digoxigenin-gebundenen Antikörpern in Kombination mit Anti-Digoxigenin-Antikörper, gebunden an magnetische Partikel, verwendet werden, gefolgt von Markieren mit einem fluorochromkonjugierten Antikörper, der gegen den Anti-Hapten-Antikörper gerichtet ist. Praktischerweise ist ein nicht-magnetischer, Fluorochrom-konjugierter Antikörper, der für einen Blutbildungszellmarker wie z.B. CD45 usw. spezifisch ist, in die Markierung eingebunden und wird so zur Analyse nach der Trennung verwendet.
Die Analyse-Antikörper können verwendet werden, um die Zellzusammensetzung mittels eines geeigneten Verfahrens, z.B. durch Mikroskopie, Durchflusszytoemtrie usw., zu beobachten, nachdem die Trennungsschritte durchgeführt wurden. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen direkt an einem Mikroskop-Objektträger oder einem Filter, z.B. einem Polycarbonatfilter, zur Immunzytochemie-Analyse eingefangen. Das direkte Einfangen ist von Vorteil, da es durch die Verarbeitungsschritte einen erhöhten Zellverlust gibt.
Wie zuvor beschrieben können Trennungsmarker an der Zelloberfläche oder im Zytoplasma, einschließlich der Nuklearmembran, der Tumorzellen gefunden werden. Ist der Trennungsmarker im Zytoplasma angeordnet, so ist es erforderlich, die Zellen zu permeabilisieren und zu fixieren, bevor sie an die Trennungsantikörper gebunden werden. Es wurde erkannt, dass es von Vorteil ist, die Zellen vor der Fixation zu permeabilisieren. Die Zellen werden in Färbungsmedium resuspendiert, das jedes beliebige Medium sein kann, das die Morphologie der Zellen aufrechterhält. Verschiedene Medien sind im Handel erhältlich und können gemäß der Beschaffenheit der Zellen verwendet werden, einschließlich Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Dulbecco's phosphatgepufferte Salzlösung (DPBS), RPMI, Iscove's Medium, PBS mit 5 ml EDTA usw. Ein bevorzugtes Medium ist phosphatgepufferte Salzlösung. Permeabilisierende Mittel sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen milde Detergenzien, wie z.B. Triton X-100, NP-40, Saponin usw. Ein bevorzugtes Permeabilisierungsmittel ist Saponin in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 0,5 %.
Eine Lösung von Fixierungsmittel wird dann zur Zellsuspension zugesetzt. Verschiedene Fixativa sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, einschließlich Formaldehyd, Paraformaldehyd, Formaldehyd/Aceton, Methanol/Aceton usw. Formaldehyd, das in einer Endkonzentration von etwa 1 bis 2 % verwendet wird, wurde als ein gutes Vernetzungs-Fixierungsmittel erkannt. Ist Saponin das Permeabilisierungsmittel, so wird es in allen darauf folgenden Inkubations- und Waschschritten zur intrazellulären Antikörper-Markierung in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 2 % eingebunden.
Die Trennungsantikörper werden zur Suspension von blutbildenden Zellen zugesetzt und über eine ausreichende Zeitspanne hinweg inkubiert, um die verfügbaren Antigene zu binden. Die Inkubation erfolgt üblicherweise zumindest etwa 2 Minuten lang und üblicherweise weniger als etwa 60 Minuten. Es ist wünschenswert, über eine ausreichende Konzentration von Antikörpern im Reaktionsgemisch zu verfügen, sodass die Wirksamkeit der magnetischen Trennung nicht durch einen Mangel an Antikörper eingeschränkt wird. Die geeignete Konzentration wird durch Titration bestimmt.
Wird ein magnetisch gebundener Antikörper zweiter Stufe verwendet, so kann die Zellsuspension gewaschen und in Medium wie zuvor beschreiben vor der Inkubation mit den Antikörpern zweiter Stufe resuspendiert werden. Alternativ dazu kann der Antikörper zweiter Stufe direkt zum Reaktionsgemisch zugesetzt werden. Werden direkt gebundene Trennungsantikörper verwendet, so kann die Zellsuspension direkt im nächsten Schritt verwendet oder gewaschen und in Medium resuspendiert werden.
Die Zellsuspension wird auf eine Trennungsvorrichtung aufgetragen. Beispiele für magnetische Trennungsvorrichtungen sind in WO 90/07380, PCT/US96/00953 und EP 438.520 beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird durch die Verwendung einer magnetischen Hochgradienten-Matrix von dicht gepackten ferromag netischen Kügelchen anstelle der Matrix nach dem Stand der Technik aus Stahlwolle, Drähten usw. eine Verbesserung bereitgestellt. Die Kügelchen weisen üblicherweise einen Durchmesser von zumindest etwa 200 μm und nicht mehr als etwa 1.000 μm, noch üblicher von zumindest etwa 250 μm und nicht mehr als etwa 300 μm, auf. Für optimale Leistung wird bevorzugt, dass die Zusammensetzung von Kügelchen im Allgemeinen bezüglich der Größe homogen ist und üblicherweise um nicht mehr als 15 % von der mittleren Größe variiert. Die Kügelchen bestehen aus einem ferromagnetischen Material (z.B. Eisen, Stahl usw.), die mit einer undurchlässigen Beschichtung beschichtet sein können, um den Kontakt von Zellen mit Metall zu vermeiden. Unter undurchlässiger Beschichtung wird eine polymere Beschichtung verstanden, die wesentlich weniger als 30 Gew.-% Wasser enthält, die das Durchdringen von Ionen nicht zulässt und die auf dem Kügelchen als ein Resultat von passiver Auftragung, Vernetzung oder Polymerisation eines relativ hydrophoben Polymers oder Co-Polymers gebildet ist. Geeignete Polymere umfassen Polystyrole, Polyacrylamide, Polyetherurethane, Polysulfone, fluorierte oder chlorierte Polymere wie z.B. Polyvinylchlorid, Polyethylene und Polypropylene, Polycarbonate und Polyester usw. Die Matrix der Kügelchen sollte eine angemessene Oberfläche aufweisen, um ausreichende Magnetfeldgradienten in der Trennungsvorrichtung zu schaffen, um wirksames Zurückhalten von magnetisch markierten Zellen zu ermöglichen. Das für eine bestimmte Trennung erforderliche Volumen kann empirisch bestimmt werden und variiert mit der Zellgröße, der Antigendichte an der Zelloberfläche, der Antikörperaffinität usw. Die Durchflussgeschwindigkeit wird durch die Größe der Säule bestimmt, erfordert jedoch im Allgemeinen eine Kanüle oder ein Ventil, um den Durchfluss zu regulieren.
Die markierten Zellen werden in der magnetischen Trennungsvorrichtung in Gegenwart eines magnetischen Feldes, bei üblicherweise zumindest etwa 100 mT, noch üblicher zumindest etwa 500 mT, üblicherweise nicht mehr als etwa 2 T, noch üblicher nicht mehr als etwa 1 T, zurückgehalten. Die Quelle des magnetischen Feldes kann ein Permanentmagnet oder ein Elektromagnet sein. Nach der anfänglichen Bindung kann die Vorrichtung mit jedem geeigneten physiologischen Puffer gewaschen werden, um ungebundene Zellen zu entfernen.
Die ungebundenen Zellen, die im Eluat enthalten sind, werden gesammelt, wenn das Eluat durch die Säule wandert. Die gebundenen Zellen, die die Tumorzellen enthalten, werden durch Aufheben des magnetischen Feldes und Eluieren in einem geeigneten Puffer freigesetzt. Die Zellen können in jedem geeigneten Medium gesammelt werden. Verschiedene Medien sind im Handel erhältlich und können gemäß der Natur der Zellen verwendet werden, einschließlich dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, PBS-EDTA, PBS, Iscove's Medium usw., häufig ergänzt mit fötalem Kälberserum, BSA, HSA usw.
In zahlreichen Fällen stellt ein einfacher Trennungsschritt ausreichend Anreicherung von Tumorzellen bereit. Die tatsächliche Wirksamkeit hängt von den bestimmten Trennungsmarkern und Antikörpern, die verwendet werden, sowie von den Konzentrationen an Tumorzellen in der Probe ab. Beispielsweise werden in kontrollierten Versuchen unter Verwendung von Cytokeratin als ein Marker für Karzinomzellen zumindest etwa 25 %, noch üblicher zumindest etwa 50 %, der Tumorzellen wiedergewonnen.
Ist größere Reinheit erwünscht, können zusätzliche Trennungsschritte durchgeführt werden. Die eluierte magnetische Fraktion kann über eine zweite magnetische Säule geführt werden, um die Anzahl an nicht-spezifisch gebundenen Zellen zu reduzieren. Höhere Reinheit von Tumorzellen wird auch durch die Durchführung von zwei Anreicherungsschritten, unter Verwendung von zwei verschiedenen, tumorspezifischen Trennungsmarkern, erzielt. Alternativ dazu kann eine Multiparameter-Trennung durchgeführt werden, durch Abreichern von blutbildenden Zellen aus der Probe. Geeignete Marker zur Abreicherung sind Antigene, die an blutbildenden Zellen umfassend exprimiert werden und an den Target-Tumorzellen nicht vorhanden sind, z.B. CD45 usw. Der Abreicherungsschritt kann zuerst durchgeführt werden, woraufhin ein Anreicherungsschritt folgt. Die Abreicherung wird im Wesentlichen wie für die Anreicherung beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die nicht-magnetische Fraktion gesammelt wird. Die Anreicherung wird dann an der an Leukozyten abgereicherten Fraktion durchgeführt.
Muss der Anreicherungsschritt zuerst durchgeführt werden, dann ist ein zusätzlicher Schritt nach der Anreicherung erforderlich, um die magnetische Markierung von den angereicherten Zellen zu entfernen. Dies kann durch jedes beliebige, geeignete Verfahren erfolgen. Beispielsweise kann die angereicherte Zellpopulation mit einer Lösung von Dextranase inkubiert werden, worin die Dextranase in einer ausreichenden Konzentration vorhanden ist, um im Wesentlichen alle Mikropartikel von den markierten Zellen zu entfernen. Üblicherweise ist die Reaktion nach zumindest etwa 15 Minuten abgeschlossen. Der Abreicherungsschritt kann dann wie zuvor beschrieben mit den Dextranase-behandelten Zellen durchgeführt werden. Ein anderes Verfahren zur Entfernung der magnetischen Markierung verwendet 3-(2-Pyridyldithio)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (SPDP) als einen Dithiothreit(DTT-) spaltbaren Linker.
Alternativ dazu kann der Anreicherungsschritt zuerst durchgeführt und der Abreicherungsschritt so modifiziert werden, dass große magnetische Kügelchen anstelle der Mikropartikel verwendet werden. Die Verwendung solcher magnetischen Kügelchen wurde bereits früher beschrieben, und die Reagenzien sind im Handel erhältlich. Die angereicherte Zellpopulation wird mit hochmagnetischen Polymerkügelchen von etwa 1 bis 10 μm Durchmesser, die an die Abreicherungs-Antikörpermischung konjugiert sind, inkubiert. Das Zellgemisch wird dann sehr nahe an ein magnetisches Feld platziert. Im Wesentlichen alle Zellen, die an die Polymerkügelchen gebunden sind, sind innerhalb von etwa 1 Minute und nicht mehr als etwa 5 Minuten an den Magneten gebunden. Die ungebundenen Zellen können dekantiert und verwendet werden.
Ein einziger Trennungsschritt stellt im Allgemeinen eine ausreichende Anreicherung von Tumorzellen dar, um Quantifizierung durch mikroskopische oder zytometrische Analyse durchführen zu können. Die Tumorzellen in der angereicherten Fraktion können durch Morphologie, Immunhistochemie, Färbung mit Fluorochromkonjugierten Antikörpern, die zwischen Tumorzellen und blutbildenden Zellen unterscheiden, und anderen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, quantifiziert werden. Eine Gegenfärbung, die für blutbildende Zellen spezifisch ist, kann aus praktischen Gründen ebenfalls eingebunden werden. Eine Kontrollprobe, die künstlich mit definierten Anzahlen an Tumorzellen versehen ist, kann als eine Kontrolle verwendet werden, um den Prozentsatz der Rückgewinnung von Tumorzellen zu berechnen. Diese Information kann verwendet werden, um die Anzahl an Tumorzellen in der ursprünglichen Patientenprobe zu bestimmen.
Die Tumorzellen können weiter bezüglich ihres Phänotyps durch PCR, ELISA, FISH, In-situ-FISH, kompetitive Hybridisierung, Fluoreszenzmarkierung ganzer Chromosomen, Immunhistochemie usw. charakterisiert werden. Die Expression einer Anzahl an Proteinen, die mit Malignität assoziiert sind, ist von Interesse, umfassend Onkogene, z.B. sis, src, yes, fgr, lck, abl, erbB, neu, fms, ras, mos, myc, myb, p53, fos, jun, rel usw.; Wirkstoffresistenzproteine, z.B. DHFR, p-Glykoprotein usw.; Metastasefaktoren, z.B. Metalloproteasen, Integrine, Angiogenesefaktoren, Kathepsin B usw.; und andere Charakteristika, die auf das Wachstum, das metastatische Potenzial und die Wirkstoffresistenz von Tumorzellen hinweisen. Der Status des Zellzyklus und der DNA-Gehalt der Tumorzellen sind auch von Interesse.
Verfahren, die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwenden, sind von Interesse: DNA oder RNA wird aus der Zellprobe isoliert, und PCR wird verwendet, um eine Region der RNA oder DNA durch die Verwendung von spezifischen Primern zu amplifizieren. Das Amplifikationsprodukt wird dann auf die Gegenwart von spezifischen Allelen analysiert. Die Analyse kann das Amplifikationsprodukt gemäß der Größe fraktionieren, um Fragmentlänge-Polymorphismen zu bestimmen, oder kann Hybridisierung verwenden, um die Abwesenheit oder Gegenwart einer spezifischen Sequenz zu bestimmen. Ein Prä-Amplifikationsschritt (PEP) mit spezifischen oder nichtspezifischen Primern kann verwendet werden. Bulk-PCR, worin DNA oder RNA aus einer Anzahl an Zellen in einer einzigen Reaktion amplifiziert wird, kann verwendet werden, um die Gegenwart von chromosomalen Translokationen, Onkogenexpression usw. nachzuweisen. Isolierte einzelne Zellen können auch durch PCR amplifiziert werden, üblicherweise in Kombination mit einem Prä-Amplifikationsschritt.
Amplifikation von DNA ermöglicht die Detektion von Genamplifikation, chromosomalen Translokationen, Genmutationen in Kodierregionen oder Regulationssequenzen, chromosomale Aneuploidien, viraler DNA, RFLPs usw. Amplifikation von RNA ermöglicht die Bestimmung der Expression von Genen wie z.B. Onkogenen, Tumorexpressionsgenen, Zyklinen, Kinasen, Regulations-DNA-Bindungsproteinen, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, viralen Proteinen, Adhäsionsmolekülen, Inhibitoren usw. und die Detektion von Allel-Varianten von exprimierten Genen. FISH ermöglicht die Detektion von Genamplifikation, chromosomalen Translokationen, Genmutationen, chromosomalen Aneuploidien, viraler DNA usw.
Um den Anforderungen eines klinischen Labors nachzukommen, kann ein Testset mit den Reagenzien und der Vorrichtung bereitgestellt werden, die erforderlich sind, um die vorliegende Erfindung durchzuführen. Solch ein Set kann Hapten-konjugierte spezifische Separationsmarker-Antikörper, z.B. Anti-Cytokeratin, Anti-EMA usw.; Anti-Hapten-Antikörper konjugiert an superparamagnetische Partikel; spezifische Trennungsmarker-Antikörper, die direkt and superparamagnetische Partikel konjugiert sind, und Säule(n), die zur Selektion geeignet ist/sind, insbesondere Säulen, die mit ferromagnetischen Kügelchen vorgepackt sind, enthalten. Komponenten können auch superparamagnetisch gebundene Leukozyten-spezifische Antikörper, z.B. Anti-CD45 usw., umfassen. Aus praktischen Gründen können Puffer für Erythrozytenlyse, Zellfixation und Permeabilisierung, Zellfärbung und -sammlung usw. eingebunden werden. Während einzelne Säulen verwendet werden können, wird erwartet, dass Mehrfachsäulen gleichzeitig laufen gelassen werden, und eine Vorrichtung für automatisierte oder manuelle Verfahren kann für solch einen Zweck bereitgestellt werden.
Die folgenden Beispiele sind als Veranschaulichung bereitgestellt und dienen in keiner Weise der Einschränkung.
VERSUCHSTEIL
Beispiel 1
Immunomagnetische Trennung von Brustkrebszellen aus künstlichen Gemischen von Blutzellen und Brustkrebszellen durch magnetische Hochgradienten-Zellsortie rung unter Verwendung eines Anti-Cytokeratin-8/18-Antikörpers, der chemisch an kolloidale superparamagnetische Mikropartikel gebunden ist.
Material und Verfahren
Zellprobenherstellung. An Leukozyten reiche, über Dichtegradient separierte weiße Blutzellen wurde aus mit Antikoagulans behandeltem peripherem Blut eines gesunden Donors durch Zentrifugation bei 400 × g hergestellt. Vier Proben zu je 5 ml über Dichtegradient separierte weiße Blutzellen wurden mit 30.000, 3.000, 300 und 0 Zellen der Mamma-Karzinomzelllinie SK-BR-3 vermischt.
Erythrozytenlyse und Permeabilisierung von kernhaltigen Zellen. Die Zellen wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und 0,1 % Saponin (Erythrozytenlyse/Cytokeratin-demaskierende Lösung) 5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Fixierung. Die Zellen wurden in PBS, 0,05 % Saponin und 2 % Formaldehyd 30 min lang bei Raumtemperatur fixiert und einmal in PBS mit 0,5 % BSA und 0,5 % Saponin (PBS/BSA/Saponinpufter) gewaschen.
Magnetisches Markieren von Cytokeratin-8/18-exprimierenden Zellen. Die Zellen wurden mit Anti-Cytokeratin-8/18-mAb, konjugiert an kolloidale superparamagnetische Mikrokügelchen, in PBS/BSA/Saponin-Puffer 35 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert (Moll et al., Cell 31, 11 (1982)). Anschließend wurden an PE konjugierte Anti-Cytokeratin-8/18-mAb und biotinylierte HEA-125-mAb zugesetzt, und die Zellen wurden weitere 10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden in PBS/BSA/Saponin-Puffer gewaschen und mit CD45-FITC und Streptavidin-CyChrom 10 min lang bei Raumtemperatur in PBS/BSA/Saponin-Puffer gefärbt.
Positive Selektion von Cytokeratin-8/18-exprimierenden Zellen durch magnetische Hochgradienten-Zellsortierung (HGMS). Magnetisch markierte, Cytokeratin-8/18-exprimierende Zellen wurden durch zwei aufeinander folgende positive Selektionen an MiniMACS-Säulen angereichert (magnetisierbare Stahlkugel-Matrix, Miltenyi Bio tec GmbH, Bergisch Gladbach), die in einen MiniMACS-Permanentmagneten insertiert waren.
Durchflusszytometrische Analyse. Um die Wirksamkeit der magnetischen Anreicherung von Cytokeratin-8/18-exprimierenden SK-BR-3-Zellen zu bewerten, wurden Aliquoten von nicht-getrennten Zellen, magnetische und nicht-magnetische Zellfraktionen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACSscan (Becton Dickinson) analysiert. Daten von 5.000-17.000 Zellen wurden gesammelt und unter Verwendung von FACSscan Research Software (Becton Dickinson) oder CellQuest (Becton Dickinson) analysiert. Die Resultate sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Die 1A(i) bis 1D(i) zeigen HEA-125-Cychrom- gegenüber Cytokeratin-8/18-PE-Färbung von Zellen aus an Leukozyten reichen über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen, die etwa 10⁸ Leukozyten, vermischt mit 30.000 (1A(i)), 3.000 (1B(i)), 300 (1C(i)) und 0 (1D(i)) Zellen der Mamma-Karzinomzelllinie SK-BR-3, enthalten. Die Häufigkeiten von Krebszellen im Zählfenster (R1) sind angegeben. Die 1A(ii) bis 1D(ii) zeigen HEA-125-Cychrom- gegenüber Cytokeratin-8/18-PE-Färbung derselben Zellproben nach magnetischer Anreicherung von Cytokeratin-8/18-exprimierenden SK-BR-3-Zellen. Die Häufigkeiten von Krebszellen in den Zählfenstern (R1) sind angegeben. Die 1A(iii) bis 1D(iii) zeigen die Lichtstreuungs-Eigenschaften der angereicherten, Cytokeratin-8/18-exprimierenden SK-BR-3-Zellen, die in den 1A(ii) bis 1D(ii) gemessen wurden (Blende R1).
Beispiel 2
Immunomagnetische Anreicherung von Tumorzellen aus peripherem Blut von Brustkrebspatientinnen (M1-Patienten) durch magnetische Hochgradienten-Zellsortierung unter Verwendung eines Anti-Cytokeratin-8/18-Antikörpers, der chemisch an kolloidale superparamagnetische Mikropartikel gebunden ist.
Material und Verfahren
Zellprobentrennung. Leukozyten-reiche, über Dichtegradient separierte weiße Blutzellen wurden aus 30-40 ml frisch abgenommenem, mit Antikoagulans behandeltem peripherem Blut von Brustkrebspatientinnen mit weit voneinander entfernten Metastasen hergestellt. Blut wurde auf ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen übertragen, und phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) wurde zu einem Endvolumen von 50 ml zugesetzt. Die Proben wurden bei 400 × g 35 min lang (ohne Bremse) zentrifugiert. Die obere Plasmaschicht wurde verworfen, und die Leukozyten-Schicht (etwa 5 ml) wurde auf ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen übertragen. 5-ml-Proben von über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen von normalen Donoren wurden als negative Kontrollen verwendet. 2,8 × 10⁴ Zellen der Brustkarzinom-Zelllinie BT474 wurden zu 5 ml über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen von einem gesunden Donor als eine positive Kontrolle zugesetzt. Erythrozytenlyse, Permeabilisierung von kernhaltigen Zellen und Fixierung wurden wie für Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Magnetisches Markieren von Cytokeratin-8/18-exprimierenden Zellen. Die Zellen wurden mit Anti-Cytokeratin-8/18-mAb, konjugiert an kolloidale superparamagnetische Mikroperlen, in PBS/BSA-Saponin-Puffer 35-45 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden an PE konjugierte Anti-Cytokeratin-8/18-mAb und biotinylierte Anti-NEA-125-mAb oder biotinylierte CD45-mAb zugesetzt, und die Zellen wurden in PBS/BSA/Saponin-Puffer gewaschen und mit Streptavidin-CyChrom (und CD45-FITC, sofern die Zellen mit biotinylierten Anti-HEA-125-mAb gefärbt waren) 10-15 min lang bei Raumtemperatur in PBS/BSA/Saponin-Puffer gefärbt.
Positive Selektion von Cytokeratin-8/18-exprimierenden Zellen durch magnetische Hochgradienten-Zellsortierung (HGMS). Magnetisch markierte, Cytokeratin-8/18-exprimierende Zellen wurden durch zwei aufeinander folgende positive Selektionen an MiniMACS-Säulen (magnetisierbare Stahlkugel-Matrix, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach), die in einen MiniMACS-Permanentmagneten insertiert waren, angereichert.
Durchflusszytometrische Analyse. Um die Wirksamkeit der magnetischen Anreicherung von Cytokeratin-8/18-exprimierenden Zellen zu bewerten, wurden Aliquoten von nicht-getrennten Zellen und von magnetischen und nicht-magnetischen Zellfraktionen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACSscan (Becton Dickinson) analysiert. Daten von 5.000-17.000 Zellen wurden gesammelt und unter Verwendung von FACSscan Research Software (Becton Dickinson) oder CellQuest (Becton Dickinson) analysiert.
Resultate
Die Analyse von Patient 1 ist in den 2B(i) und 2B(ii) gezeigt. Die 2A(i) bis 2C(i) zeigen CD45-Cychrom- gegenüber Cytokeratin-8/18-PE-Färbung von Zellen aus an Leukozyten reichen, über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen eines gesunden Donors (2A(i)), von Zellen aus an Leukozyten reichen, über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen einer Brustkrebspatientin mit weit voneinander entfernten Metastasen (2B(i)) und von Zellen aus an Leukozyten reichen, über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen eines gesunden Donors, vermischt mit Zellen aus einer Mamma-Karzinomzelllinie BT474 (2C(i)). 28.000 BT474-Zellen wurden mit über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen, die etwa 1,5 × 10⁸ Leukozyten enthielten, vermischt. Die Häufigkeiten von Krebszellen in den Zählfenstern (R1) sind angegeben. Die 2A(ii) bis 2D(ii) zeigen CD45-Cychrom- gegenüber Cytokeratin-8/18-PE-Färbung derselben Zellproben nach magnetischer Anreicherung von Cytokeratin-8/18-exprimierenden Krebszellen. Die Häufigkeiten von Krebszellen in den Zählfenstern (R1) sind angegeben.
Cytokeratin-8/18-exprimierende Tumorzellen wurden zu einer Häufigkeit von 11,7 % (2B(ii)) angereichert. Etwa 3.110 Cytokeratin-8/18-exprimierende Krebszellen wurden aus 38 ml Blut (2,56 × 10⁸ Leukozyten) angereichert. Dies entspricht einer Häufigkeit von 1,21 × 10^–5.
Die Resultate von einem gesunden Donor sind in den 2A(i) und 2A(ii) gezeigt. Keine Cytokeratin-8/18-exprimierende Zelle wurde aus den 5 ml der Zellprobe der über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen (1,54 × 10⁸ Leukozyten) des normalen gesunden Donors 1 angereichert. Eine Cytokeratin-8/18-exprimierende Zelle wurde aus den 5 ml Probe der über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen (1,54 × 10⁸ Leukozyten) des gesunden Donors 2 angereichert.
Cytokeratin-8/18-exprimierende Tumorzellen aus Patient 2 wurden bei einer Häufigkeit von 12,5 % angereichert, was sich auf etwa 10.800 Cytokeratin-8/18-exprimierende Krebszellen angereichert aus 30 ml Blut (1,92 × 10⁸ Leukozyten) belief. Dies entspricht einer ursprünglichen Proben-Tumorzellenhäufigkeit von 5,63 × 10^–5. Den Lichtstreuungseigenschaften zufolge sind die Brustkrebszellen größer als Lymphozyten und sogar als Monozyten. Färbung des Epithelzell-spezifischen Oberflächenantigens HEA-125 zeigte eine beträchtliche Heterogenität im Expressionsniveau an den Tumorzellen.
Patient 3 wurde zum Zeitpunkt der Durchführung der Versuchsreihe Bestrahlungstherapie unterzogen. Cytokeratin-8/18-exprimierende Tumorzellen wurden durch das Trennungsverfahren zu einer Häufigkeit von 0,51 % angereichert. Etwa 68 Cytokeratin-8/18-exprimierende Krebszellen wurden aus 30 ml Blut (5,68 × 10⁷ Leukozyten) angereichert. Dies entspricht einer Häufigkeit in der ursprünglichen Probe von 1 Tumorzelle pro 8,4 × 10⁵ Leukozyten.
Die Daten in Tabelle 2 fassen die Resultate von Tumorzellanreicherung der Zellen von Brustkrebspatientinnen zusammen. Tabelle 2

* CK-8/18* bezeichnet Zellen, die positiv für Cytokeratin 8/18 durch zytoplasmatisches Färben sind.

Beispiel 3
Vergleichende immunomagnetische Isolierung von Brustkrebszellen aus künstlichen Gemischen von Blutzellen und Brustkrebszellen durch magnetische Hochgradienten-Zellsortierung unter Verwendung von entweder Anti-Cytokeratin-8/18-mAb oder HEA-125-mAb, chemisch gebunden an kolloidale superparamagnetische Mikropartikel.
Material und Verfahren
1. Zellproben-Herstellung
An Leukozyten reiche, über Dichtegradient separierte weiße Blutzellen wurden aus mit Antikoagulans behandeltem, peripherem Blut eines gesunden Donors durch Zentrifugation bei 400 × g hergestellt. Zwei Proben von 5 ml über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen wurden mit 20.000 Zellen der Mamma-Karzinomzelllinie BT474 vermischt. Erythrozytenlyse, Permeabilisierung und Fixierung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Magnetische Markierung. Die Zellen wurden entweder mit Anti-Cytokeratin-8/18-mAb, konjugiert an kolloidale superparamagnetische Mikroperlen, oder HEA-125-mAb, konjugiert an kolloidale superparamagnetische Mikroperlen, in PBS/BSA/Saponin-Puffer 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden an PE konjugierte Anti-Cytokeratin-8/18-mAb und biotinylierte HEA- 125-mAb zugesetzt, und die Zellen wurden weitere 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden in PBS/BSA/Saponin-Puffer gewaschen und mit CD45-FITC und Streptavidin-CyChrom 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS/BSA/Saponin-Puffer gefärbt.
Positive Selektion von Cytokeratin-8/18-exprimierenden Zellen durch magnetische Hochgradienten-Zellsortierung (HGMS). Magnetisch markierte, Cytokeratin-8/18-exprimierende Zellen wurden durch zwei aufeinander folgende positive Selektionen an MiniMACS-Säulen, die in einen MiniMACS-Permanentmagneten insertiert waren, angereichert.
Durchflusszytometrische Analyse. Um die Wirksamkeit der magnetischen Anreicherung von BT474-Zellen zu bewerten, wurden Aliquoten von nicht-getrennten Zellen und von magnetischen und nicht-magnetischen Zellfraktionen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACSscan (Becton Dickinson) analysiert. Daten von 5.000-17.000 Zellen wurden gesammelt und unter Verwendung von FACSscan Research Software (Becton Dickinson) oder CellQuest (Becton Dickinson) analysiert.
Resultate:
BT474-Zellen, die unter Verwendung von Anti-Cytokeratin-Antikörpern isoliert worden waren, wurden zu einer Häufigkeit von 7,05 % angereichert. Etwa 4.200 BT474-Zellen wurden aus 5 ml über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen (5,26 × 10⁷ Leukozyten) mit einer Rückgewinnungsrate von 21 % angereichert. Ein Hintergrund-Niveau von einer "positiven Zelle" wurde in der Kontrolltrennung von 5 ml über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen ohne zugesetzte Krebszellen detektiert.
Durch Anti-HEA-125-Antikörper isolierte BT474-Zellen wurden zu einer Häufigkeit von 26,03 % angereichert. Etwa 3.890 BT474-Zellen wurden aus 5 ml über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen (8,68 × 10⁷ Leukozyten) mit einer Rückgewinnungsrate von 19,5 % angereichert. Keine "positiven Zellen" wurden in der Kontroll trennung von 5 ml über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen ohne zugesetzte Krebszellen nachgewiesen.
Das Verfahren wurde mit zwei verschiedenen Proben von 0,3 ml über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen, vermischt mit 50.000 Zellen der Mamma-Karzinomzelllinien BT474 und SK-BR-3 wiederholt, doch es wurden weder Permeabilisierung noch Fixierung durchgeführt. Die Lebendzellen wurden mit HEA-125-mAb, konjugiert an kolloidale superparamagnetische Mikroperlen, in PBS/BSA 20 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden HEA-125-FITC zugesetzt, und die Zellen wurden weitere 10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Lebensfähige SK-BR-3-Zellen wurden von einer Häufigkeit von 4,73 % in der Ausgangspopulation auf eine Häufigkeit von 81,84 % angereichert. Etwa 20.800 SK-BR-3-Zellen wurden aus 0,3 ml über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen (6,18 × 10⁶ Leukozyten) bei einer Rückgewinnungsrate von 42 % rückgewonnen. Lebensfähige BT474-Zellen wurden von einer Häufigkeit von 5,28 % auf eine Häufigkeit von 81,39 % angereichert. Etwa 22.000 SK-BR-3-Zellen wurden aus 0,3 ml über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen (7,45 × 10⁶ Leukozyten) gewonnen, was eine Rückgewinnungsrate von 44 % ergab.
Beispiel 4
Es wurde die Detektion von Krebszellen aus Vollblut ohne Ficoll-Isolierung von über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen durchgeführt. Dieses Verfahren reduzierte das Risiko des Verlusts an Tumorzellen. Zumindest 40 % mehr Tumorzellen wurden mittels des Vollblutverfahrens im Vergleich zu Isolierungsverfahren der über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen bei Patienten nachgewiesen. Darüber hinaus wurde das Verfahren der Tumorzelldetektion durch Einschränken des Verfahrensschrittes der Isolierung von über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen um 30 min verkürzt. Tumorzellen wurden durch direktes Einfangen von angereicherten Zellen an einem Filter nachgewiesen, gefolgt von Quantifizierung mit Immunhistochemie.
Materialien und Verfahren
Tumorzellenanreicherung. Kernhaltige Zellen in Vollblut werden durch Verdünnen einer Aliquote von Zellen 1:10 mit BSA-Lösung (phosphatgepufferte Salzlösung mit 1 % BSA, 5 mM EDTA, 0,05 % Procline-300, 0,01 % F68, pH 7,4) gezählt. 10 μl der Verdünnung werden mit einem entsprechenden Volumen von Ethidiumbromid/Acridin-Orange-Farbstoff vermischt. Kernhaltige Lebendzellen zeigen sich unter einem Fluoreszenz-Mikroskop als grün gefärbt.
Eine Aliquote von Vollblut, die 10⁸ kernhaltige Zellen enthält, wird in ein Röhrchen gegeben, und DNAse I wird zu einer Endkonzentration von 100 U/ml zugesetzt. Das Blut wird bei 400 g 10 min lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Plasma wird sorgfältig ohne Störung der Grenzfläche entfernt. BSA-Lösung wird zu einem Gesamtvolumen von 45 ml pro Röhrchen zugesetzt, sowie 0,9 ml Saponinlösung (5 % Saponin in PBS mit 0,05 % Natriumazid). Die Zellsuspension wird exakt fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 2,5 ml von 37%igem Formaldehyd werden zugesetzt, das Ganze gut vermischt und 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellsuspension wird bei 250 g 5 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, die Zellen werden in 30 ml der Färbungslösung (0,5 % Saponin in BSA-Lösung) resuspendiert. Anschließend folgt Zentrifugation bei 250 g 5 min lang, Absaugen des Überstands und Resuspension in 10 ml Färbungslösung. Zentrifugation bei 250 g 5 min lang, Überstand wird abgesaugt.
Die Zellen werden in 200 μl Peroxidase-Blockierungsmittel (0,03 % Wasserstoffperoxid, das 0,05 % Natriumazid enthält) 5 min lang bei Raumtemperatur resuspendiert. 5 ml der Färbungslösung werden zugesetzt und das Ganze 5 min lang bei 250 g zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, und die Zellen werden in 600 μl BSA-Lösung resuspendiert. 200 μl FcR-Blockierungsmittel (5 mg/ml Kaninchen-IgG in BSA-Lösung, 0,05 % Procline-300) werden zugesetzt. 200 μl Antikörper (Cam5.2-Anti-Cytokeratin-Antikörper, konjugiert an magnetische Mikropartikel) werden zugesetzt. Bei Raumtemperatur 45 min lang inkubieren. 5 ml Färbungslösung werden zugesetzt, und das Ganze wird bei 250 g 5 min lang zentrifugiert. Überstand wird abgesaugt, die Zellen werden in einer Polymerlösung (Peroxidase-markiertes Polymer, konjugiert an Ziege-Anti-Maus-Ig in Tris-HCl-Puffer, Dako Corp.) resuspendiert und bei Raumtemperatur 30 min lang inkubiert. 5 ml Blockierungslösung werden zugesetzt und bei 250 g 5 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, die Zellen werden in 1 ml entgastem BSA-Puffer resuspendiert.
Durch Platzieren in ein magnetisches Feld und zweimaliges Spülen der Säule mit 2 ml entgaster BSA-Lösung wird eine MiniMACS-Säule (Miltenyi Biotech GmbH) vorbereitet. 1 ml Zellsuspension wird in die Säule geladen, die negative Fraktion eingesammelt (sofern erwünscht). Das Röhrchen wird mit zusätzlicher BSA-Lösung (1 ml) gespült und auf die Säule geladen. Nachdem die Säule nicht mehr tropft, werden 2 ml entgaste BSA-Lösung in die Säule geladen, um die nicht-spezifisch gebundenen Zellen abzuwaschen.
Eine Filterhalterung (Poretics) und ein 2-μm-Polycarbonatfilter (Poretics) werden vorbereitet, um die Zellen aufzunehmen. Die zwei Teile der Halterung werden festgeschraubt, und 5 ml BSA-Puffer wird durch das Filter gepresst, um es zu befeuchten und es auf Undichtigkeit zu überprüfen. Die Filterhalterung wird auf die Spritze geschraubt und in ein modifiziertes, konisches 50-ml-Röhrchen platziert. Die Mini-MACS-Säule, die die gebundenen Zellen enthält, wird auf die Spritze platziert. Der Komplex wird in eine Zentrifuge gegeben. 2 ml entgaster BSA-Lösung werden in die Säule geladen. 5 min lang wird bei 1.250 g zentrifugiert. Die Säule wird verworfen, und das Filter wird mit zusätzlichen 10 ml BSA-Lösung gewaschen. Das Filter und die Filterhalterung werden aus dem Komplex entfernt.
180 μl AEC-Puffer (3-Amino-9-ethylcarbazol in N,N-9(DMF) und Acetatpuffer, pH 5,0, der Wasserstoffperoxid, Enhancer, Stabilisatoren und anti-mikrobielles Reagens enthält) werden entlang einer Wand der Halterung geladen. 5 min lang wird bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zentrifugation mit 10 ml BSA-Puffer wird wie zuvor ein Waschschritt durchgeführt.
Ein Tropfen des Einbettungsmittels (wasserbasiertes Einbettungsmittel, Dako) wird auf einen zellfreien Objektträger platziert. Das Filter wird auf das Einbettungsmedium platziert, und ein weiterer Tropfen wird zuoberst zugesetzt. Ein Deckglas wird daraufgesetzt und Luftbläschen werden entfernt. Der Objektträger wird unter einem Normallichtmikroskop mit 10facher Vergrößerung untersucht. Die Tumorzellen färben sich hellrot, und normale periphere Blutzellen bleiben transparent.
Resultate
Es wurden Tests zur Detektion von Krebszellen in neunzehn Blutproben von sechzehn Brustkrebspatientinnen mit Stadium-IV-Erkrankungen durchgeführt. Unter diesen Patientinnen gab es fünfzehn periphere Blutproben und vier Leukophorese-Proben. Die Empfindlichkeit von Tumorzelldetektion in den Patientenproben erreicht 1 Tumorzelle in 10⁸ PBMC oder 1 Tumorzelle in 10-20 ml Vollblut. In keiner der acht gesunden Personen wurden Tumorzellen nachgewiesen. Tumorzellen wurden in 79 % der Patientenproben nachgewiesen. Der Bereich an Krebszellen, die in Patienten nachgewiesen wurden, die eine Erkrankung in Stadium IV aufwiesen und bereits intensiver Chemotheraphie unterzogen worden waren, reichte von 0,5 bis 80 Tumorzellen in 10 ml Blut oder von 1 bis 60 Tumorzellen in 10⁸ kernhaltigen Zellen. Für ein Filtereinfangverfahren zur Tumorzelldetektion wurde gezeigt, dass es wirksamen und konstanten Tumorzellfang gewährleistete.
In den in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Versuchen begannen die Verfahren mit Isolierung von über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen als erstem Schritt. Um zu untersuchen, ob dieser Schritt für den Verlust an kernhaltigen Zellen verantwortlich war, die sowohl WBC- als auch Tumorzellen umfassen, wurden die kernhaltigen Zellen sowohl im Vollblut als auch in über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen, isoliert aus dem Vollblut, mit einem Hämacytometer unter einem Fluoreszenz-Mikroskop nach Färbung mit Ethidiumbromid/Acridin-Orange gezählt. Die Resultate zeigten, dass in einem Isolationsschritt der über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen bis zu etwa 3 % der gesamten kernhaltigen Zellen verloren gehen konnten, wie in Tabelle 3 gezeigt ist. Ein Vergleich mit Tumorzelldetektion im Vollblut und in den über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen wurde durchgeführt. Das Ergebnis zeigte, dass zumindest 40 % mehr Tumorzellen mit dem Voll blutverfahren nachgewiesen wurden als mit dem Isolierungsverfahren der über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen, wie in Tabelle 4 gezeigt wird. Das gesamte Verfahren von Tumorzelldetektion wurde durch Ausschluss dieses Schrittes um 30 min verkürzt.
Ein Filter-Einfangverfahren verwendete eine Polycarbonatmembran, um Tumorzellen durch Filtration mit Vakuum oder Zentrifugation zurückzuhalten. Drei Filter mit verschiedenen Porengrößen (0,1, 0,4 und 1,0 μm) wurden getestet. Das Resultat zeigte, dass alle drei Porengrößen beim Zurückhalten von Tumorzellen unter Verwendung von Vakuumfiltration gleich wirksam waren. Doch das Filter mit 1,0 μm Porengröße hatte die beste Durchflussrate: Um die Frage des oberen Zelllimits abzuklären; wurden getrennte Filtrationen für 10⁴, 10⁵, 10⁶ und 10⁷ Zellen durchgeführt. In diesen Versuchen wurde erkannt, dass 10⁶ Zellen wirksam vakuumfiltriert werden konnten; die Filtrationsgeschwindigkeit bei 10⁷ Zellen sank sehr weit ab. Tabelle 3 Kernhaltige Zellen in über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen und Vollblut
Tabelle 4. Krebszellen, nachgewiesen in Vollblut und über Dichtegradient separierten weißen Blutzellen (WBC 10⁷)

Beachte: Die Zahlen in Klammern sind die tatsächlichen Anzahlen, die für jede Probe nachgewiesen wurden. Die Zahlenmittel von Tumorzelldetektion für jeden Patienten sind links von den Klammern angegeben.

Blutproben von Brustkrebspatientinnen wurden zur Tumorzelldetektion getestet. Unter ihnen waren Vollblutproben, Leukophorese-Proben und Knochenmark-Proben, Die medizinischen Informationen zu allen Patienten sind in Tabelle 5 angegeben. Die Empfindlichkeit von Tumorzelldetektion in den Patientenproben erreichte 1 Tumorzelle unter 10⁸ PBMC oder 1 Tumorzelle in 10-20 ml Vollblut. Tumorzellen wurden in keiner der acht gesunden Personen und in 79 % der Patientenproben nachgewiesen. Der Bereich von Krebszellen, die in jenen Patienten nachgewiesen wurde, die intensiver Chemotherapie unterzogen worden waren, reichte von 0,5 bis 80 Tumorzellen in 10 ml Blut oder von 1 bis 60 Tumorzellen in 10⁸ kernhaltigen Zellen (Tabelle 6). Tabelle 5 Medizinische Informationen zu Brustkrebspatientinnen
Tabelle 9 Tumorzelldetektion in peripherem Blut von normalen Personen und Brustkrebspatientinnen

* Buffy = über Dichtegradient separierte weißte Blutzellen

Tumorzelldetektion in Leukophorese-Proben von Brustkrebspatientinnen
Tumorzelldetektion im Knochenmark von Brustkrebspatientinnen
Die obigen Daten zeigen einen Karzinomzell-Detektionstest, der Krebszellen in peripherem Blut und Knochenmark isolieren und visualisieren kann. Die Empfindlichkeit des Tests erreicht 1 Krebszelle auf 10⁸ kernhaltige Zellen von peripherem Blut. Die mittlere Wiedergewinnung von Krebszellen liegt bei etwa 75 %, und der Test ist konstant und reproduzierbar.
Der Tumorzell-Detektionstest wurde bei Brustkrebspatientinnen eingesetzt. Es wurden Tests zur Detektion von Krebszellen abstammend von vierzig Krebspatientinnen mit Erkrankungen im Stadium II-IV durchgeführt. Unter ihnen waren 26 Proben peripheres Blut, 12 waren Leukophorese und zwei waren Knochenmark. Die Empfindlichkeit von Tumorzelldetektion in Patientenproben betrug 1 Tumorzelle in 10-20 ml Vollblut. In keiner der 16 gesunden Personen wurden Tumorzellen gefunden. Tumorzellen wurden in 80 % der Patientenproben nachgewiesen. Der Bereich von nachgewiesenen Krebszellen erstreckte sich von 1 bis 600 Tumorzellen in 10⁸ kernhaltigen Zellen. Es wurde eine Korrelation zwischen der Häufigkeit von Tumorzellen und dem Erkrankungsstadium und dem Patientenalter erkannt.
Aus den obigen Resultaten geht eindeutig hervor, dass die vorliegende Erfindung ein einfaches, rasches Verfahren zum Trennen verbreiteter Tumorzellen aus blutbildenden Zellen bereitstellt. Die Fraktion von Zellen, die an Tumorzellen angereichert ist, stellt ein nützliches Mittel zur Quantifizierung von Tumorzellen und zur weiteren Zell-Phänotypisierung dar. Die einfache Vorgehensweise und die Fähigkeit, die Anzahl und Größe der Proben um ein Vielfaches zu steigern, stellen bedeutende Vorteile gegenüber Verfahren nach dem Stand der Technik dar.

Claims

Verfahren zur Trennung und Detektion von verbreiteten Tumorzellen aus einer Vollblutprobe, umfassend: Zusetzen magnetisch gebundener Antikörper, die für ein oder mehrere Antigene spezifisch sind, die von den Tumorzellen exprimiert werden und in blutbildenden Zellen fehlen, zur Vollblutprobe; Durchführen der Zellsuspension durch eine ferromagnetische Matrix in Gegenwart eines magnetischen Feldes, um Zellen in der Probe, die gebundene Antikörper daran gebunden aufweisen, magnetisch zu immobilisieren; Abwaschen ungebundener Zellen von der Matrix; und Entfernen des magnetischen Feldes und Eluieren gebundener Zellen von der Matrix unter Verwendung eines Filtereinfangverfahrens; um eine angereicherte Zellprobe bereitzustellen, die Tumorzellen zur Detektion davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin gebundene Zellen an einem Polycarbonatfilter oder einem Objektträger eingefangen werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Tumorzellen Karzinomzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die primäre Stelle des Karzinoms aus der aus Brust, Ovarien, Endometrium, Zervix, Kolon, Magen und Lungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das von den Tumorzellen exprimierte Antigen aus der aus Cytokeratin, Epithelmembranantigen (EMA), menschlichem Embryonalantigen (HEA-125), menschlichen Milchfetttröpfchen, MBr1, MBr8, Ber-EP4, 17-1A, C26 und T16 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Detektion das Analysieren der angereicherten Zellpopulation auf die Gegenwart von Tumorzellen durch Immunzytochemie umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Filtereinfangverfahren das Zurückhalten von Tumorzellen durch Filtration mit Vakuum oder Zentrifugation umfasst.