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Hintergrund
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Eines
der größten Probleme,
mit denen ein praktizierender Onkologe zu kämpfen hat, ist die Metastase
von malignen Tumorzellen von der primären Stelle zu vielfachen, entfernten
Stellen. In den meisten Fällen von
Krebs sind es die metastatischen Läsionen, die den Patienten töten. Während Chirurgie
oft gegen einen primären
Tumor wirksam ist, kann sie nicht das gesamte maligne Gewebe entfernen,
wenn der Tumor bereits metastasiert hat. Beispielsweise entwickelt
ein Drittel der Patientinnen mit operablem Brusttumor Metastasen nach
der primären
Therapie. Adjuvans-Therapie
kann diese Prognose verbessern, erfordert jedoch die Identifikation
von Hochrisiko-Patientinnen. Den primären Tumor durch seine Größe und das
Stadium von Knötchen unter
den Achseln zu bewerten, ist für
diesen Zweck nicht ausreichend.
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Knochen
und Knochenmark sind häufige
Stellen von Metastasen, doch radiologische und szintographische
Verfahren können
Einbindung von Knochen nur nachweisen, wenn bereits Zerstörung von
Knochenmatrix eingetreten ist. Die Gegenwart von epithelialen Tumorzellen
im Knochenmark korreliert im Allgemeinen mit herkömmlichen
Risikofaktoren, wie z.B. Größe und histologischer
Grad des primären
Karzinoms, entfernte Metastase und Einbindung von Lymphknoten. Klinische
Folgeuntersuchungen zeigten eine signifikant erhöhte Rückfallsrate unter jenen Patienten,
die epitheliale Tumorzellen im Knochenmark zum Zeitpunkt des primären chirurgischen
Eingriffs aufwiesen.
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Es
gibt demnach Bedarf an Verfahren, die die Detektion von verbreiteten
Tumorzellen zu einem Zeitpunkt ermöglichen, zu dem sie sich noch
nicht zu unheilbaren Makrometastasen entwickelt haben. Solch eine Diagnose
könnte
hilfreich sein zur Festlegung der Prognose, zur Entscheidung, ob
eine bestimmte Therapie indiziert ist, und zur Bereitstellung eines
Mittels, um die Wirksamkeit der Therapie zu überwachen. Solch eine Diagnose
kann mit der im Vergleich zu normalen Knochen- und Blutzellen unterschiedlichen
Morphologie von Tumorzellen arbeiten. Tumorspezifische Antigene
an der Zelloberfläche
können
nachgewiesen werden. Wenn die Tumorzelle eine andere Entwicklungslinie
aufweist als blutbildende Zellen, beispielsweise Epithelkarzinome,
so können
gewebespezifische Marker verwendet werden, um die Tumorzellen zu
identifizieren.
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Verfahren
zur Detektion von Krebszellen, die sich ausgehend von kleinen lokalisierten
primären
Tumoren in Knochenmark, peripheres Blut und sekundäre Lymphorgane
verbreiten; wurden bereits beschrieben. Morphologische Analysen
können
durch Cytospin-Präparate
von Knochenmark-Abstrichen, Zellproben von peripherem Blut oder
Lymphknoten durchgeführt
werden, gefolgt von May-Grunwald-Giemsa-Färbung
und Untersuchung durch Lichtmikrosopie (Molino et al. (1991)). Alternativ
dazu können
Cytospin-Präparate
oder Abstriche von Zellen ebenfalls mit tumorspezifischen oder gewebespezifischen
Antikörpern
gefärbt
werden. Diese Verfahren weisen den Nachteil von äußerst geringer Empfindlichkeit
auf und sind zeit- und arbeitsaufwendig. Bis zu 100 zu untersuchende
Objektträger
können
erforderlich sein, um die Gegenwart einer einzelnen Tumorzelle nachzuweisen.
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Verbreitete
Tumorzellen wurden auch durch die Verwendung von Umkehr-Transkriptase und
Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) nachgewiesen. PCR kann verwendet
werden, um mRNA von Prostata-spezifischem Antigen (PSA) oder Cytokeratin-19-mRNA
zu amplifizieren. Diese Verfahren haben mehrere Nachteile, insbesondere
in Bezug auf geringe Empfindlichkeit und falsche positive Resultate.
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Es
wurde gezeigt, dass Brustkarzinomzellen aus einer Blutprobe des
peripheren Bluts durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)
identifiziert oder isoliert werden können (Gross et al. (1995)).
Der hohe technologische Aufwand, der für FACS erforderlich ist, stellt
jedoch für
die routinemäßige Verwendung
zur medizinischen Diagnose ein Hindernis dar. FACS-Analyse oder
-Sortierung ist ein zeitaufwendiges und kostspieliges Verfahren.
Durchflusszytometrie hat den zusätzlichen Nachteil,
dass es schwierig ist, große
Mengen an Zellen oder Mehrfachproben zugleich zu sortieren oder
zu analysieren.
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Auch
ein alternativer Ansatz zur Zellsortierung wurde bereits beschrieben,
wobei magnetische Mikropartikel, gebunden an Antikörper, verwendet
werden, um auf spezifische Zelltypen zu selektieren. Shpall et al. (1991)
beschreiben ein Verfahren und eine Vorrichtung zur immunmagnetischen
Reinigung von Brustkrebszellen aus Knochenmarkzellproben zur autologen
Transplantation bei Karzinompatientinnen, die hochdosierte Chemotherapie
erhalten.
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Ein
verbessertes magnetisches Sortierungsverfahren, in dem Tumorzellen
aus peripherem Blut oder anderen Gewebequellen getrennt werden könnten und
das ermöglicht,
Mehrfachproben im Labor zu untersuchen, würde für den Bereich der onkologischen
Diagnostik zahlreiche Vorteile bereitstellen.
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Relevante
Literatur
-
Detektion
von verbreiteten Tumorzellen durch Morphologie an Cytospin-Präparaten
oder Blutabstrichen wird in Molino et al., Cancer 67, 1033 (1991),
beschrieben. Die Verwendung desselben Verfahrens in Verbindung mit
Antikörperfärbung für gewebe- oder tumorspezifische
Antigene wird in Redding et al., The Lancet 3, 1271 (1983); Schlimok
et al., P.N.A.S. 84, 8672 (1987); Moul et al., Urology 43, 68 (1994);
Menard et al., Br. J. Cancer (1994); Osborne et al., Cancer Res.
51, 2706 (1991); Cote et al., J. Clin. Oncol. 9, 1749 (1991); Bretton
et al., The Prostate 25, 108 (1994); und Oberneder et al., Urol.
Res. 22, 3 (1994), beschrieben.
-
Die
Verwendung von Umkehr-Transkriptase und Polymerasekettenreaktion
zur Detektion von Expression von tumor- oder gewebespezifischen
Genen aus Proben von peripherem Blut, Knochenmark oder Lymphknoten
wird in Seiden et al., J. Clin. Oncol. 12, 2634 (1994); Katz et
al., Urology 43, 765 (1994); Schoenfeld et al., Cancer Res. 54,
2986 (1994); und Datta et al., J. Clin. Oncol. 12, 475 (1994), beschrieben.
-
Detektion
und Trennung von Tumorzellen aus peripherem Blut durch Durchflusszytometrie
wird in Gross et al., P.N.A.S. 92, 537 (1995), beschrieben. Verfahren,
die immunomagnetische Trennungen verwenden, werden in Shpall et
al., Bone Marrow Transplantation 7, 145 (1991); Kemmer et al., J.
Immunol. Methods 147, 197 (1992); und Griwatz et al., Suppl. J.
Exp. Clin. Cancer Res. 13, Nr. 3 (Abstract) (1994), beschrieben.
-
Korrelationen
zwischen der Gegenwart von verbreiteten Tumorzellen in blutbildenden
Organen und herkömmlichen
Risikofaktoren werden in Schlimok et al., Eur. J. Cancer 27, 1461
(1991); Huvos et al., Ann. Surg. 173, 44 (1971); International (Ludwig)
breast cancer study group, Lancet 335, 1565 (1990); und DeMascarel
et al., Br. J. Cancer 66, 523 (1992), beschrieben.
-
Magnetische
Hochgradienten-Zellsortierung wird in Miltenyi et al., Cytometry
11, 231-238 (1990),
beschrieben. Molday beschreibt in
US
4.452.773 die Herstellung von magnetischen Eisen-Dextran-Mikrokügelchen
und stellt eine Zusammenfassung bereit, die die verschiedenen Mittel
zur Herstellung von Partikeln beschreibt, die zur Anbindung an biologische
Materialien geeignet sind. Eine Beschreibung von polymeren Beschichtungen
für magnetische
Partikel, die bei HGMS verwendet werden, sind in
DE 3720844 (Miltenyi) und in Miltenyi
et al.,
US 5.385.707 ,
zu finden. Verfahren zur Herstellung von superparamagnetischen Partikeln
werden im US-Patent Nr. 4.770.183 beschrieben.
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Verfahren
werden zur Identifikation von verbreiteten, nicht blutbildenden
Tumorzellen aus einer Probe blutbildender Zellen, wie z.B. aus Knochenmark,
Lymphe oder peripherem Blut, bereitgestellt. Die Tumorzellen werden
magnetisch mit Antikörper
markiert, die auf gewebespezifische Antigene gerichtet sind. Das
Markieren für
zytoplasmatische Antigene erfolgt durch ein Verfahren der Permeabilisierung
und Fixierung der Zellen. Magnetisches Sortieren wird verwendet,
um die markierten Tumorzellen von den normalen Zellen der blutbildenden
Probe zu trennen. Die an Tumorzellen angereicherte Zellfraktion
ist als eine Quelle von DNA, RNA und exprimierten Proteinen zur
weiteren Charakterisierung des metastatischen Zellphänotyps und
zur Quantifizierung und Charakterisierung der Anzahl an Tumorzellen,
die sich vom primären
Tumor ausgehend verbreitet haben, nützlich.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die 1A bis 1D zeigen
die Charakterisierung von menschlicher epithelialer Antigen- (HEA-) und
Cytokeratin-8/18-Expression während
der magnetischen Anreicherung von experimentell zugesetzten Brustkarzinomzellen
aus einer Probe von an Leukozyten reichen, über Dichtegradient separierten
weißen
Blutzellen.
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Die 2A bis 2C zeigen
die Charakterisierung von CD45- und Cytokeratin-8/18-Expression während der
magnetischen Anreicherung von Tumorzellen aus einer Fraktion von
an Leukozyten reichen, über Dichtegradient
separierten weißen
Blutzellen aus peripherem Blut von einer Brustkrebspatientin mit
entfernten Metastasen oder aus Kontrollproben.
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BESCHREIBUNG
SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Es
werden Verfahren bereitgestellt, die magnetische Sortierung verwenden,
um die Gegenwart von seltenen verbreiteten Tumorzellen aus Proben
von blutbildenden Zellen zu identifizieren. Die Tumorzellen sind im
Allgemeinen von der Stelle des primären Tumors entfernt, und ihre
Gegenwart in den Proben von blutbildenden Zellen eines Patienten
kann Hinweise auf das metastatische Potenzial des Tumors geben.
Die Zellprobe kann mit einem permeabilisierenden Mittel und Fixierungsmittel
behandelt werden, um zytoplasmatische Proteine nachzuweisen. Antikörper, die
auf Tumorantigene gerichtet sind, oder Abstammungs-spezifische Antigene
werden verwendet, um die Tumorzellen magnetisch zu markieren. Die
markierten Zellen werden von unmarkierten, blutbildenden Zellen
durch magnetische Trennung getrennt. Die Fraktion von an Tumorzellen angereicherten
Zellen ist zur Quantifizierung der Tumorzellen und als eine Quelle
von Tumorzellen zur weiteren Charakterisierung nützlich.
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Antigene,
die Marker für
bestimmte Zelltypen sind, können
Proteine, Kohlenhydrate, Lipide oder andere komplexe Biomoleküle sein.
In manchen Typen von Tumoren wurden spezifische Antigene identifiziert, die
an den malignen Zellen in erhöhten
Konzentrationen exprimiert werden. Dennoch ist es häufiger,
Tumorzellen zu finden, die keine charakteristischen Antigene aufweisen.
In zahlreichen Fällen
haben die Tumorzellen zahlreiche phänotypische Marker mit dem Zelltyp
gemeinsam, von dem sie abstammen. Beispielsweise exprimieren Karzinome
Antigene, die für
Epithelzellen typisch sind, Lymphome solche, die für Lymphozyten
typisch sind, usw. Solche Antigene können auch an Zellen von anderen
Abstammungen exprimiert werden oder können in nachweisbaren Konzentrationen
auch nur bei Zellen mit einer bestimmten Abstammung gefunden werden,
z.B. ein gewöhnliches
Leukozyten-Antigen,
Epithelmembranantigen usw. Die Letztgenannten werden auch als "gewebespezifische" Antigene bezeichnet.
Haben sich Tumorzellen bereits aus ihrem Ursprungsgewebe verbreitet,
so können
die Tumorzellen die einzigen Zellen dieser Abstammung sein, die
in einer Population von Zellen einer anderen Abstammung vorhanden
sind. Beispielsweise metastasieren von Epithel abstammende Karzinome
zum Knochenmark, das aus blutbildenden Zellen besteht. Diese Expression
von gewebespezifischen Antigenen kann dann eine Grundlage für Trennung
und Detektion der Tumorzellen sein.
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Die
Verbreitung von Tumorzellen durch das blutbildende System ist medizinisch
gesehen als ein früher Hinweis
auf Metastasenbildung von großer
Bedeutung. Blutbildende Zellen stammen in Bezug auf ihre Entwicklung
von einer gemeinsamen embryonalen Quelle ab und haben ein gemeinsames
antigenes Profil für
gewebespezifische Antigene gemeinsam. Quellen für Proben von blutbildenden
Zellen umfassen Blut und Fraktion davon, insbesondere Präparate von über Dichtegradient
separierten weißen
Blutzellen, Aphorese- oder Leukophorese-Proben; Lymphe und Lymphknoten;
und Knochenmark. Die Bezeichnung "blutbildende Zellen" sollte sich auf die normalen Zellpopulationen
beziehen, die in Blut, Knochenmark, Lymphe usw. zu finden sind, und
umfassen Lymphozyten, z.B. B-Zellen, T-Zellen und natürliche Killerzellen,
Knochenmarkzellen, z.B. Makrophagen, Monozyten, polymorphonukleare
Zellen, Megakaryozyten, Basophile, Eosinophile, Neutrophile; usw.;
Erythroidzellen, z.B.
-
Retikulozyten,
Plättchen
und Erythrozyten; dendritische Zellen; und die Vorläufer davon.
Stroma- und Fibroblastenzellen, die in Knochenmark zu finden sind,
sind auch umfasst. Die Bezeichnung "Probe blutbildender Zellen", insbesondere unter
Verweis auf Patientenproben, sollen geringe Anzahlen an verbreiteten
Tumorzellen umfassen, die vorhanden sein können.
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Gewebespezifische
Antigene, die zur Trennung von Tumorzellen aus blutbildenden Zellen
geeignet sind, werden als antigene Moleküle identifiziert, die in einer
nachweisbaren Konzentration in den Target-Tumorzellen und in einer
nicht nachweisbaren Konzentration in normalen, blutbildenden Zellen,
die nachstehend als "Trennungsmarker" bezeichnet werden,
vorhanden sind. Die Mehrheit der Trennungsmarker sind Proteine, obwohl
tumorspezifische Mucine und Kohlenhydrate auch Verwendung finden.
Im Allgemeinen ist der Unterschied der Expressionsniveaus zwischen
Tumorzellen und blutbildenden Zellen zumindest ein 50faches, basierend
auf Proteinquantifizierung, und noch häufiger beträgt der Unterschied zumindest
etwa ein 500faches oder mehr.
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Trennungsmarker
können
Zelloberflächenantigene
sein oder können
im Zytoplasma der Tumorzelle angeordnet sein. Geeignete Marker umfassen
Cytokeratine, insbesondere Cytokeratin 8, 18 und 19, als einen Marker
für Karzinome,
die von Epithel abstammen, z.B. Adenokarzinome, die eine primäre Tumorstelle
in der Brust, in den Ovarien, im Endometrium, in der Zervix, im
Dickdarm, in der Lunge, im Pankreas, in der Speiseröhre, Prostata,
im Dünndarm,
Rektum, Uterus oder Bauch aufweisen können, oder Schuppenzellkarzinome, die
eine primäre
Stelle in den Lungen, in der Mundhöhle, Zunge, im Kehlkopf, in
der Speiseröhre,
Haut, Blase, Zervix, in dem Augenlid, in der Bindehaut, Vagina usw.
aufweisen können.
Epithelmembranantigen (EMA), menschliches embryonales Antigen (HEA-125),
menschliche Milchfetttröpfchen,
MBr1, MBr8, Ber-EP4, 17-1A, C26 und T16 sind ebenfalls als Marker
für Karzinome
nützlich.
Desmin und muskelspezifisches Actin sind Trennungsmarker für Muskelsarkome.
Alkalische Plazenta-Phosphatase, menschliches β-Choriongonadotropin und α-Fetoprotein
sind Marker für
trophoblastische Tumoren und Keimzellen tumoren. Prostata-spezifisches
Antigen ist ein Marker für
Prostata-Karzinome, karzinoembryonales Antigen für Kolon-Adenokarzinome, HMB-45
ist ein Marker für
Melanome. Chromagranin-A und Synptophysin sind Marker für neuroendokrine
und neuroektodermale Tumoren. Andere Antigene, die auf eine gewebespezifische
Weise exprimiert werden, können
auch Verwendung als Trennungsmarker verwenden. Im Allgemeinen schließt der blutbildende
Ursprung von Leukämien
und Lymphomen ihre Trennung durch die vorliegenden Verfahren aus,
unter Ausnahme von Tumoren, die ein tumorspezifisches Antigen aufweisen,
z.B. spezifische Idiotypen an B-Zell- oder T-Zelllymphomen usw.
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Eine
Probe von blutbildenden Zellen wird einem Patienten entnommen, der
unter dem Verdacht steht, an einem Tumor mit möglicher Verbreitung in das
Blut oder die Lymphe erkrankt zu sein. Bevorzugte Stellen für die primäre Tumorstelle
sind die drainierenden Lymphknoten und Lymphgefäße, Blut und Knochenmark. Proben
können
aus Apherese-Patienten, die behandelt werden, um blutbildende Progenitorzellen
zu mobilisieren, entnommen werden. Blutproben umfassen üblicherweise
etwa 5 bis 100 ml Vollblut und können
mit Antikoagulanzien, z.B. Heparin, EDTA, Citrat, Säurecitratdextrose
oder Citratphosphatdextrose, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt
behandelt werden. Blutproben können
weiter fraktioniert werden, um an Fraktion von über Dichtegradient separierten
weißen
Blutzellen angereichert zu werden. Knochenmarkaspirationen können an
der Iliumkrone, am Sternum usw. durchgeführt und mit Antikoagulanzien
behandelt werden. Die Probe kann Behandlungen wie z.B. Verdünnung in
gepuffertem Medium, Konzentration, Filtration oder anderen groben
Behandlungen unterzogen werden, die keine spezifische Trennung umfassen.
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Geeignete
Proben weisen etwa 106, üblicherweise zumindest etwa
107 und vorzugsweise 108,
kernhaltige Zellen auf. Detektion von Tumorzellen kann erreicht
werden, wenn die Tumorzellen zumindest etwa 1 Zelle pro 107 blutbildenden Zellen umfasst.
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Ein
Präparat
aus kernhaltigen Zellen kann aus der Probe unter Verwendung eines
Verfahrens hergestellt werden, dass kernhaltige Zellen von Erythrozyten
trennen kann. Die Verwendung von Ficoll-Paque-Dichtegradienten oder
Schlämmung
für solche
Trennungen ist in der Literatur gut dokumentiert. Alternativ dazu können die
Blutzellen in einer Lösung
resuspendiert werden, die Erythrozyten selektiv lysiert, z.B. Ammoniumchloridkalium;
Ammoniumoxalat; usw., oder Vollblut kann verwendet werden. Die Zellen
können
auch in einer Lösung
von Saponin resuspendiert werden, das mit Membrancholesterin und
anderen nicht-konjugierten β-Hydroxysterolen
Komplexe bildet, was zur Bildung von Poren in der Zellmebran führt. Alle
Zellen werden permeabilisiert, und die Erythrozyten setzen Hämoglobin
frei. Die Erythrozyten-Ghosts
werden dann durch Zentrifugation von kernhaltigen Zellen getrennt.
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Die
Probe von blutbildenden Zellen wird selektiv an Tumorzellen angereichert.
Reagenzien, die Tumor-Trennungsmarker spezifisch binden, wie zuvor
beschrieben wurde, werden an kolloidale superparamagnetische Partikel
gebunden. Besonders nützliche
Reagenzien sind Antikörper,
die für
die Tumor-Trennungsmarker spezifisch sind. Ganze Antikörper können verwendet
werden oder Fragmente, z.B. Fab, F(ab')2, Leicht- oder
Schwerkettenfragmente usw. Solche Trennungsantikörper können polyklonal oder monoklonal
sein und sind im Allgemeinen im Handel erhältlich oder können alternativ
dazu mittels Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, leicht hergestellt
werden. Antikörper,
die zur Verwendung ausgewählt
werden, weisen ein geringes Niveau an nicht-spezifischer Färbung von
blutbildenden Zellen auf und haben normalerweise eine Affinität von zumindest
etwa 100 μM
für das
Antigen.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung werden die Trennungsantikörper an ein magnetisches Reagens
wie z.B. ein superparamagnetisches Mikropartikel (Mikropartikel)
gebunden. Molday (
US 4.452.773 )
beschreibt die Herstellung von magnetischen Eisen-Dextran-Mikropartikeln
und stellt eine Zusammenfassung bereit, die die verschiedenen Mittel
zur Herstellung von Partikeln beschreibt, die zur Anbindung an biologische Materialien
geeignet sind. Eine Beschreibung von polymeren Beschichtungen für magnetische
Partikel, die in magnetischer Hochgradienten-Zellsortierung (HGMS)
verwendet werden, ist in
DE 3720844 (Miltenyi)
und
US 5.385.707 zu
finden. Verfahren zur Herstellung von superparamagnetischen Partikeln
werden im US-Patent Nr.
4.770.183 beschrieben. Die Mikropartikel weisen üblicherweise einen Durchmesser
von weniger als etwa 100 nm und üblicherweise
einen Durchmesser von mehr als etwa 10 nm auf. Das exakte Verfahren
zur Bindung ist für
die praktische Durchführung
der Erfindung nicht maßgeblich,
und zahlreiche Alternativen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Direkte Bindung bindet die Trennungsantikörper an die Partikel. Indirekte Bindung
kann durch mehrere Verfahren erreicht werden. Die Antikörper können an
ein Mitglied eines Hochaffinitäts-Bindungssystems,
z.B. Biotin, gebunden sein, und die Partikel können an das andere Mitglied,
z.B. Avidin, gebunden sein. Auch können Antikörper zweiter Stufe verwendet
werden, die speziesspezifische Epitope der Antikörper, z.B. Anti-Maus-Ig, Anti-Ratten-Ig
usw., erkennen. Indirekte Bindungsverfahren ermöglichen die Verwendung einer
einzelnen, magnetisch gebundenen Einheit, z.B. Antikörper, Avidin
usw., mit einer Vielzahl von Trennungsantikörpern.
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Ein
bevorzugtes Verfahren verwendet Hapten-spezifische Antikörper zweiter
Stufe, gebunden an die magnetischen Partikel, wie in der gleichzeitig
anhängigen
Patentanmeldung Nr. 08/52.112 beschrieben wird. Die Hapten-spezifischen
Antikörper
weisen üblicherweise
eine Affinität
von zumindest etwa 100 μM
für das Hapten
auf. Die Antikörper
werden an das geeignete Hapten konjugiert. Geeignete Hapten umfassen
Digoxin, Digoxigenin, FITC, Dinitrophenyl, Nitrophenyl usw. Verfahren
zur Konjugation des Haptens an Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt.
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Wenn
dies auch für
die praktische Durchführung
der vorliegenden Verfahren nicht erforderlich ist, kann es nützlich sein,
die Zellen während
der anfänglichen
Färbung
mit Immunzytochemie-Reagenzien zu behandeln. Solche Reagenzien sind
häufig
markierte Antikörper,
die zur Identifikation von Tumorzellen im angereicherten Zellpräparat verwendet
werden, hierin Analyse-Antikörper.
Diese können
enzymkonjugierte Antikörper,
z.B. Meerrettichperoxidase, Phosphatase usw., haptenierte Antikörper, z.B.
Biotikonjugate, Digoxigeninkonjugate usw., oder mit einem Fluorochrom
konjugierte Antikörper,
z.B. Phycoerythrin, FITC, Rhodamin, Texas-Rot, Allophycocyanin usw.,
umfassen. Die Analyse-Antikörper
können
Spezifität
für jedes
beliebige der zuvor beschriebenen Tumorantigene aufweisen oder können für Marker
spezifisch sein, die an blutbildenden Zellen exprimiert werden.
Reagenzien können
auch Blockie rungsmittel umfassen, die nicht-spezifische Markierung
reduzieren, z.B. Fc-Rezeptor-Blockierungsmittel,
Peroxidase-Blockierungsmittel usw. Markierung kann aus praktischen
Gründen
dasselbe indirekte Bindungssystem verwenden wie die magnetischen
Partikel. Beispielsweise kann eine Mischung aus Digoxigenin-gebundenen
Antikörpern
in Kombination mit Anti-Digoxigenin-Antikörper, gebunden an magnetische
Partikel, verwendet werden, gefolgt von Markieren mit einem fluorochromkonjugierten
Antikörper,
der gegen den Anti-Hapten-Antikörper
gerichtet ist. Praktischerweise ist ein nicht-magnetischer, Fluorochrom-konjugierter
Antikörper,
der für
einen Blutbildungszellmarker wie z.B. CD45 usw. spezifisch ist,
in die Markierung eingebunden und wird so zur Analyse nach der Trennung
verwendet.
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Die
Analyse-Antikörper
können
verwendet werden, um die Zellzusammensetzung mittels eines geeigneten
Verfahrens, z.B. durch Mikroskopie, Durchflusszytoemtrie usw., zu
beobachten, nachdem die Trennungsschritte durchgeführt wurden.
In einer Ausführungsform
der Erfindung werden die Zellen direkt an einem Mikroskop-Objektträger oder
einem Filter, z.B. einem Polycarbonatfilter, zur Immunzytochemie-Analyse eingefangen.
Das direkte Einfangen ist von Vorteil, da es durch die Verarbeitungsschritte
einen erhöhten
Zellverlust gibt.
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Wie
zuvor beschrieben können
Trennungsmarker an der Zelloberfläche oder im Zytoplasma, einschließlich der
Nuklearmembran, der Tumorzellen gefunden werden. Ist der Trennungsmarker
im Zytoplasma angeordnet, so ist es erforderlich, die Zellen zu
permeabilisieren und zu fixieren, bevor sie an die Trennungsantikörper gebunden
werden. Es wurde erkannt, dass es von Vorteil ist, die Zellen vor
der Fixation zu permeabilisieren. Die Zellen werden in Färbungsmedium
resuspendiert, das jedes beliebige Medium sein kann, das die Morphologie
der Zellen aufrechterhält.
Verschiedene Medien sind im Handel erhältlich und können gemäß der Beschaffenheit
der Zellen verwendet werden, einschließlich Dulbecco's Modified Eagle
Medium (DMEM), Hank's
Balanced Salt Solution (HBSS), Dulbecco's phosphatgepufferte Salzlösung (DPBS),
RPMI, Iscove's Medium,
PBS mit 5 ml EDTA usw. Ein bevorzugtes Medium ist phosphatgepufferte
Salzlösung.
Permeabilisierende Mittel sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt
und umfassen milde Detergenzien, wie z.B. Triton X-100, NP-40, Saponin
usw. Ein bevorzugtes Permeabilisierungsmittel ist Saponin in einer
Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 0,5 %.
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Eine
Lösung
von Fixierungsmittel wird dann zur Zellsuspension zugesetzt. Verschiedene
Fixativa sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, einschließlich Formaldehyd,
Paraformaldehyd, Formaldehyd/Aceton, Methanol/Aceton usw. Formaldehyd,
das in einer Endkonzentration von etwa 1 bis 2 % verwendet wird,
wurde als ein gutes Vernetzungs-Fixierungsmittel erkannt. Ist Saponin
das Permeabilisierungsmittel, so wird es in allen darauf folgenden
Inkubations- und Waschschritten zur intrazellulären Antikörper-Markierung in einer Konzentration
von etwa 0,1 bis 2 % eingebunden.
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Die
Trennungsantikörper
werden zur Suspension von blutbildenden Zellen zugesetzt und über eine ausreichende
Zeitspanne hinweg inkubiert, um die verfügbaren Antigene zu binden.
Die Inkubation erfolgt üblicherweise
zumindest etwa 2 Minuten lang und üblicherweise weniger als etwa
60 Minuten. Es ist wünschenswert, über eine
ausreichende Konzentration von Antikörpern im Reaktionsgemisch zu
verfügen,
sodass die Wirksamkeit der magnetischen Trennung nicht durch einen
Mangel an Antikörper
eingeschränkt
wird. Die geeignete Konzentration wird durch Titration bestimmt.
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Wird
ein magnetisch gebundener Antikörper
zweiter Stufe verwendet, so kann die Zellsuspension gewaschen und
in Medium wie zuvor beschreiben vor der Inkubation mit den Antikörpern zweiter
Stufe resuspendiert werden. Alternativ dazu kann der Antikörper zweiter
Stufe direkt zum Reaktionsgemisch zugesetzt werden. Werden direkt
gebundene Trennungsantikörper
verwendet, so kann die Zellsuspension direkt im nächsten Schritt
verwendet oder gewaschen und in Medium resuspendiert werden.
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Die
Zellsuspension wird auf eine Trennungsvorrichtung aufgetragen. Beispiele
für magnetische
Trennungsvorrichtungen sind in WO 90/07380, PCT/US96/00953 und
EP 438.520 beschrieben. In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird durch die Verwendung einer magnetischen Hochgradienten-Matrix
von dicht gepackten ferromag netischen Kügelchen anstelle der Matrix
nach dem Stand der Technik aus Stahlwolle, Drähten usw. eine Verbesserung
bereitgestellt. Die Kügelchen
weisen üblicherweise
einen Durchmesser von zumindest etwa 200 μm und nicht mehr als etwa 1.000 μm, noch üblicher
von zumindest etwa 250 μm
und nicht mehr als etwa 300 μm,
auf. Für
optimale Leistung wird bevorzugt, dass die Zusammensetzung von Kügelchen im
Allgemeinen bezüglich
der Größe homogen
ist und üblicherweise
um nicht mehr als 15 % von der mittleren Größe variiert. Die Kügelchen
bestehen aus einem ferromagnetischen Material (z.B. Eisen, Stahl
usw.), die mit einer undurchlässigen
Beschichtung beschichtet sein können,
um den Kontakt von Zellen mit Metall zu vermeiden. Unter undurchlässiger Beschichtung
wird eine polymere Beschichtung verstanden, die wesentlich weniger
als 30 Gew.-% Wasser enthält,
die das Durchdringen von Ionen nicht zulässt und die auf dem Kügelchen als
ein Resultat von passiver Auftragung, Vernetzung oder Polymerisation
eines relativ hydrophoben Polymers oder Co-Polymers gebildet ist.
Geeignete Polymere umfassen Polystyrole, Polyacrylamide, Polyetherurethane,
Polysulfone, fluorierte oder chlorierte Polymere wie z.B. Polyvinylchlorid,
Polyethylene und Polypropylene, Polycarbonate und Polyester usw.
Die Matrix der Kügelchen
sollte eine angemessene Oberfläche
aufweisen, um ausreichende Magnetfeldgradienten in der Trennungsvorrichtung
zu schaffen, um wirksames Zurückhalten von
magnetisch markierten Zellen zu ermöglichen. Das für eine bestimmte
Trennung erforderliche Volumen kann empirisch bestimmt werden und
variiert mit der Zellgröße, der
Antigendichte an der Zelloberfläche,
der Antikörperaffinität usw. Die
Durchflussgeschwindigkeit wird durch die Größe der Säule bestimmt, erfordert jedoch
im Allgemeinen eine Kanüle
oder ein Ventil, um den Durchfluss zu regulieren.
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Die
markierten Zellen werden in der magnetischen Trennungsvorrichtung
in Gegenwart eines magnetischen Feldes, bei üblicherweise zumindest etwa
100 mT, noch üblicher
zumindest etwa 500 mT, üblicherweise
nicht mehr als etwa 2 T, noch üblicher
nicht mehr als etwa 1 T, zurückgehalten.
Die Quelle des magnetischen Feldes kann ein Permanentmagnet oder
ein Elektromagnet sein. Nach der anfänglichen Bindung kann die Vorrichtung
mit jedem geeigneten physiologischen Puffer gewaschen werden, um
ungebundene Zellen zu entfernen.
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Die
ungebundenen Zellen, die im Eluat enthalten sind, werden gesammelt,
wenn das Eluat durch die Säule
wandert. Die gebundenen Zellen, die die Tumorzellen enthalten, werden
durch Aufheben des magnetischen Feldes und Eluieren in einem geeigneten
Puffer freigesetzt. Die Zellen können
in jedem geeigneten Medium gesammelt werden. Verschiedene Medien
sind im Handel erhältlich
und können
gemäß der Natur
der Zellen verwendet werden, einschließlich dMEM, HBSS, dPBS, RPMI,
PBS-EDTA, PBS, Iscove's Medium usw., häufig ergänzt mit
fötalem
Kälberserum,
BSA, HSA usw.
-
In
zahlreichen Fällen
stellt ein einfacher Trennungsschritt ausreichend Anreicherung von
Tumorzellen bereit. Die tatsächliche
Wirksamkeit hängt
von den bestimmten Trennungsmarkern und Antikörpern, die verwendet werden,
sowie von den Konzentrationen an Tumorzellen in der Probe ab. Beispielsweise
werden in kontrollierten Versuchen unter Verwendung von Cytokeratin
als ein Marker für
Karzinomzellen zumindest etwa 25 %, noch üblicher zumindest etwa 50 %,
der Tumorzellen wiedergewonnen.
-
Ist
größere Reinheit
erwünscht,
können
zusätzliche
Trennungsschritte durchgeführt
werden. Die eluierte magnetische Fraktion kann über eine zweite magnetische
Säule geführt werden,
um die Anzahl an nicht-spezifisch gebundenen Zellen zu reduzieren.
Höhere
Reinheit von Tumorzellen wird auch durch die Durchführung von
zwei Anreicherungsschritten, unter Verwendung von zwei verschiedenen,
tumorspezifischen Trennungsmarkern, erzielt. Alternativ dazu kann
eine Multiparameter-Trennung durchgeführt werden, durch Abreichern
von blutbildenden Zellen aus der Probe. Geeignete Marker zur Abreicherung
sind Antigene, die an blutbildenden Zellen umfassend exprimiert
werden und an den Target-Tumorzellen nicht vorhanden sind, z.B.
CD45 usw. Der Abreicherungsschritt kann zuerst durchgeführt werden,
woraufhin ein Anreicherungsschritt folgt. Die Abreicherung wird
im Wesentlichen wie für
die Anreicherung beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass
die nicht-magnetische Fraktion gesammelt wird. Die Anreicherung
wird dann an der an Leukozyten abgereicherten Fraktion durchgeführt.
-
Muss
der Anreicherungsschritt zuerst durchgeführt werden, dann ist ein zusätzlicher
Schritt nach der Anreicherung erforderlich, um die magnetische Markierung
von den angereicherten Zellen zu entfernen. Dies kann durch jedes
beliebige, geeignete Verfahren erfolgen. Beispielsweise kann die
angereicherte Zellpopulation mit einer Lösung von Dextranase inkubiert
werden, worin die Dextranase in einer ausreichenden Konzentration
vorhanden ist, um im Wesentlichen alle Mikropartikel von den markierten
Zellen zu entfernen. Üblicherweise
ist die Reaktion nach zumindest etwa 15 Minuten abgeschlossen. Der
Abreicherungsschritt kann dann wie zuvor beschrieben mit den Dextranase-behandelten
Zellen durchgeführt
werden. Ein anderes Verfahren zur Entfernung der magnetischen Markierung
verwendet 3-(2-Pyridyldithio)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester
(SPDP) als einen Dithiothreit(DTT-) spaltbaren Linker.
-
Alternativ
dazu kann der Anreicherungsschritt zuerst durchgeführt und
der Abreicherungsschritt so modifiziert werden, dass große magnetische
Kügelchen
anstelle der Mikropartikel verwendet werden. Die Verwendung solcher
magnetischen Kügelchen
wurde bereits früher
beschrieben, und die Reagenzien sind im Handel erhältlich.
Die angereicherte Zellpopulation wird mit hochmagnetischen Polymerkügelchen
von etwa 1 bis 10 μm
Durchmesser, die an die Abreicherungs-Antikörpermischung konjugiert sind,
inkubiert. Das Zellgemisch wird dann sehr nahe an ein magnetisches
Feld platziert. Im Wesentlichen alle Zellen, die an die Polymerkügelchen
gebunden sind, sind innerhalb von etwa 1 Minute und nicht mehr als
etwa 5 Minuten an den Magneten gebunden. Die ungebundenen Zellen
können
dekantiert und verwendet werden.
-
Ein
einziger Trennungsschritt stellt im Allgemeinen eine ausreichende
Anreicherung von Tumorzellen dar, um Quantifizierung durch mikroskopische
oder zytometrische Analyse durchführen zu können. Die Tumorzellen in der
angereicherten Fraktion können
durch Morphologie, Immunhistochemie, Färbung mit Fluorochromkonjugierten
Antikörpern,
die zwischen Tumorzellen und blutbildenden Zellen unterscheiden,
und anderen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt
sind, quantifiziert werden. Eine Gegenfärbung, die für blutbildende
Zellen spezifisch ist, kann aus praktischen Gründen ebenfalls eingebunden
werden. Eine Kontrollprobe, die künstlich mit definierten Anzahlen
an Tumorzellen versehen ist, kann als eine Kontrolle verwendet werden,
um den Prozentsatz der Rückgewinnung
von Tumorzellen zu berechnen. Diese Information kann verwendet werden,
um die Anzahl an Tumorzellen in der ursprünglichen Patientenprobe zu
bestimmen.
-
Die
Tumorzellen können
weiter bezüglich
ihres Phänotyps
durch PCR, ELISA, FISH, In-situ-FISH, kompetitive Hybridisierung,
Fluoreszenzmarkierung ganzer Chromosomen, Immunhistochemie usw.
charakterisiert werden. Die Expression einer Anzahl an Proteinen,
die mit Malignität
assoziiert sind, ist von Interesse, umfassend Onkogene, z.B. sis,
src, yes, fgr, lck, abl, erbB, neu, fms, ras, mos, myc, myb, p53,
fos, jun, rel usw.; Wirkstoffresistenzproteine, z.B. DHFR, p-Glykoprotein
usw.; Metastasefaktoren, z.B. Metalloproteasen, Integrine, Angiogenesefaktoren,
Kathepsin B usw.; und andere Charakteristika, die auf das Wachstum,
das metastatische Potenzial und die Wirkstoffresistenz von Tumorzellen
hinweisen. Der Status des Zellzyklus und der DNA-Gehalt der Tumorzellen
sind auch von Interesse.
-
Verfahren,
die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwenden, sind von Interesse:
DNA oder RNA wird aus der Zellprobe isoliert, und PCR wird verwendet,
um eine Region der RNA oder DNA durch die Verwendung von spezifischen
Primern zu amplifizieren. Das Amplifikationsprodukt wird dann auf
die Gegenwart von spezifischen Allelen analysiert. Die Analyse kann
das Amplifikationsprodukt gemäß der Größe fraktionieren,
um Fragmentlänge-Polymorphismen
zu bestimmen, oder kann Hybridisierung verwenden, um die Abwesenheit oder
Gegenwart einer spezifischen Sequenz zu bestimmen. Ein Prä-Amplifikationsschritt
(PEP) mit spezifischen oder nichtspezifischen Primern kann verwendet
werden. Bulk-PCR, worin DNA oder RNA aus einer Anzahl an Zellen
in einer einzigen Reaktion amplifiziert wird, kann verwendet werden,
um die Gegenwart von chromosomalen Translokationen, Onkogenexpression
usw. nachzuweisen. Isolierte einzelne Zellen können auch durch PCR amplifiziert
werden, üblicherweise
in Kombination mit einem Prä-Amplifikationsschritt.
-
Amplifikation
von DNA ermöglicht
die Detektion von Genamplifikation, chromosomalen Translokationen,
Genmutationen in Kodierregionen oder Regulationssequenzen, chromosomale
Aneuploidien, viraler DNA, RFLPs usw. Amplifikation von RNA ermöglicht die
Bestimmung der Expression von Genen wie z.B. Onkogenen, Tumorexpressionsgenen,
Zyklinen, Kinasen, Regulations-DNA-Bindungsproteinen, Wachstumsfaktoren,
Rezeptoren, viralen Proteinen, Adhäsionsmolekülen, Inhibitoren usw. und die
Detektion von Allel-Varianten von exprimierten Genen. FISH ermöglicht die
Detektion von Genamplifikation, chromosomalen Translokationen, Genmutationen,
chromosomalen Aneuploidien, viraler DNA usw.
-
Um
den Anforderungen eines klinischen Labors nachzukommen, kann ein
Testset mit den Reagenzien und der Vorrichtung bereitgestellt werden,
die erforderlich sind, um die vorliegende Erfindung durchzuführen. Solch
ein Set kann Hapten-konjugierte spezifische Separationsmarker-Antikörper, z.B.
Anti-Cytokeratin, Anti-EMA usw.; Anti-Hapten-Antikörper konjugiert
an superparamagnetische Partikel; spezifische Trennungsmarker-Antikörper, die
direkt and superparamagnetische Partikel konjugiert sind, und Säule(n),
die zur Selektion geeignet ist/sind, insbesondere Säulen, die
mit ferromagnetischen Kügelchen
vorgepackt sind, enthalten. Komponenten können auch superparamagnetisch
gebundene Leukozyten-spezifische Antikörper, z.B. Anti-CD45 usw., umfassen.
Aus praktischen Gründen
können
Puffer für
Erythrozytenlyse, Zellfixation und Permeabilisierung, Zellfärbung und
-sammlung usw. eingebunden werden. Während einzelne Säulen verwendet
werden können,
wird erwartet, dass Mehrfachsäulen
gleichzeitig laufen gelassen werden, und eine Vorrichtung für automatisierte
oder manuelle Verfahren kann für
solch einen Zweck bereitgestellt werden.
-
Die
folgenden Beispiele sind als Veranschaulichung bereitgestellt und
dienen in keiner Weise der Einschränkung.
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VERSUCHSTEIL
-
Beispiel 1
-
Immunomagnetische
Trennung von Brustkrebszellen aus künstlichen Gemischen von Blutzellen
und Brustkrebszellen durch magnetische Hochgradienten-Zellsortie rung
unter Verwendung eines Anti-Cytokeratin-8/18-Antikörpers, der
chemisch an kolloidale superparamagnetische Mikropartikel gebunden
ist.
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Material und Verfahren
-
Zellprobenherstellung.
An Leukozyten reiche, über
Dichtegradient separierte weiße
Blutzellen wurde aus mit Antikoagulans behandeltem peripherem Blut
eines gesunden Donors durch Zentrifugation bei 400 × g hergestellt.
Vier Proben zu je 5 ml über
Dichtegradient separierte weiße
Blutzellen wurden mit 30.000, 3.000, 300 und 0 Zellen der Mamma-Karzinomzelllinie
SK-BR-3 vermischt.
-
Erythrozytenlyse
und Permeabilisierung von kernhaltigen Zellen. Die Zellen wurden
in phosphatgepufferter Salzlösung
(PBS) und 0,1 % Saponin (Erythrozytenlyse/Cytokeratin-demaskierende
Lösung)
5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert.
-
Fixierung.
Die Zellen wurden in PBS, 0,05 % Saponin und 2 % Formaldehyd 30
min lang bei Raumtemperatur fixiert und einmal in PBS mit 0,5 %
BSA und 0,5 % Saponin (PBS/BSA/Saponinpufter) gewaschen.
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Magnetisches
Markieren von Cytokeratin-8/18-exprimierenden Zellen. Die Zellen
wurden mit Anti-Cytokeratin-8/18-mAb, konjugiert an kolloidale superparamagnetische
Mikrokügelchen,
in PBS/BSA/Saponin-Puffer 35 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert
(Moll et al., Cell 31, 11 (1982)). Anschließend wurden an PE konjugierte
Anti-Cytokeratin-8/18-mAb und biotinylierte HEA-125-mAb zugesetzt,
und die Zellen wurden weitere 10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Zellen wurden in PBS/BSA/Saponin-Puffer gewaschen und mit CD45-FITC
und Streptavidin-CyChrom 10 min lang bei Raumtemperatur in PBS/BSA/Saponin-Puffer gefärbt.
-
Positive
Selektion von Cytokeratin-8/18-exprimierenden Zellen durch magnetische
Hochgradienten-Zellsortierung (HGMS). Magnetisch markierte, Cytokeratin-8/18-exprimierende Zellen
wurden durch zwei aufeinander folgende positive Selektionen an MiniMACS-Säulen angereichert
(magnetisierbare Stahlkugel-Matrix, Miltenyi Bio tec GmbH, Bergisch
Gladbach), die in einen MiniMACS-Permanentmagneten insertiert waren.
-
Durchflusszytometrische
Analyse. Um die Wirksamkeit der magnetischen Anreicherung von Cytokeratin-8/18-exprimierenden
SK-BR-3-Zellen zu bewerten, wurden Aliquoten von nicht-getrennten
Zellen, magnetische und nicht-magnetische Zellfraktionen mittels
Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACSscan (Becton Dickinson)
analysiert. Daten von 5.000-17.000 Zellen wurden gesammelt und unter
Verwendung von FACSscan Research Software (Becton Dickinson) oder
CellQuest (Becton Dickinson) analysiert. Die Resultate sind in Tabelle
1 gezeigt.
-
-
Die 1A(i) bis 1D(i) zeigen
HEA-125-Cychrom- gegenüber
Cytokeratin-8/18-PE-Färbung von
Zellen aus an Leukozyten reichen über Dichtegradient separierten
weißen
Blutzellen, die etwa 108 Leukozyten, vermischt
mit 30.000 (1A(i)), 3.000 (1B(i)), 300 (1C(i))
und 0 (1D(i)) Zellen der Mamma-Karzinomzelllinie
SK-BR-3, enthalten. Die Häufigkeiten
von Krebszellen im Zählfenster
(R1) sind angegeben. Die 1A(ii) bis 1D(ii) zeigen HEA-125-Cychrom- gegenüber Cytokeratin-8/18-PE-Färbung derselben
Zellproben nach magnetischer Anreicherung von Cytokeratin-8/18-exprimierenden
SK-BR-3-Zellen. Die Häufigkeiten von
Krebszellen in den Zählfenstern
(R1) sind angegeben. Die 1A(iii) bis 1D(iii) zeigen
die Lichtstreuungs-Eigenschaften der angereicherten, Cytokeratin-8/18-exprimierenden
SK-BR-3-Zellen, die in den 1A(ii) bis 1D(ii) gemessen wurden (Blende R1).
-
Beispiel 2
-
Immunomagnetische
Anreicherung von Tumorzellen aus peripherem Blut von Brustkrebspatientinnen (M1-Patienten)
durch magnetische Hochgradienten-Zellsortierung unter Verwendung
eines Anti-Cytokeratin-8/18-Antikörpers, der chemisch an kolloidale
superparamagnetische Mikropartikel gebunden ist.
-
Material und Verfahren
-
Zellprobentrennung.
Leukozyten-reiche, über
Dichtegradient separierte weiße
Blutzellen wurden aus 30-40 ml frisch abgenommenem, mit Antikoagulans
behandeltem peripherem Blut von Brustkrebspatientinnen mit weit
voneinander entfernten Metastasen hergestellt. Blut wurde auf ein
sauberes konisches 50-ml-Röhrchen übertragen,
und phosphatgepufferte Salzlösung
(PBS) wurde zu einem Endvolumen von 50 ml zugesetzt. Die Proben
wurden bei 400 × g
35 min lang (ohne Bremse) zentrifugiert. Die obere Plasmaschicht
wurde verworfen, und die Leukozyten-Schicht (etwa 5 ml) wurde auf
ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen übertragen.
5-ml-Proben von über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen von normalen Donoren wurden als negative Kontrollen verwendet.
2,8 × 104 Zellen der Brustkarzinom-Zelllinie BT474
wurden zu 5 ml über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen von einem gesunden Donor als eine positive Kontrolle
zugesetzt. Erythrozytenlyse, Permeabilisierung von kernhaltigen
Zellen und Fixierung wurden wie für Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
-
Magnetisches
Markieren von Cytokeratin-8/18-exprimierenden Zellen. Die Zellen
wurden mit Anti-Cytokeratin-8/18-mAb, konjugiert an kolloidale superparamagnetische
Mikroperlen, in PBS/BSA-Saponin-Puffer 35-45 min lang bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend
wurden an PE konjugierte Anti-Cytokeratin-8/18-mAb und biotinylierte
Anti-NEA-125-mAb oder biotinylierte CD45-mAb zugesetzt, und die
Zellen wurden in PBS/BSA/Saponin-Puffer gewaschen und mit Streptavidin-CyChrom
(und CD45-FITC, sofern die Zellen mit biotinylierten Anti-HEA-125-mAb
gefärbt
waren) 10-15 min
lang bei Raumtemperatur in PBS/BSA/Saponin-Puffer gefärbt.
-
Positive
Selektion von Cytokeratin-8/18-exprimierenden Zellen durch magnetische
Hochgradienten-Zellsortierung (HGMS). Magnetisch markierte, Cytokeratin-8/18-exprimierende Zellen
wurden durch zwei aufeinander folgende positive Selektionen an MiniMACS-Säulen (magnetisierbare
Stahlkugel-Matrix, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach), die
in einen MiniMACS-Permanentmagneten insertiert waren, angereichert.
-
Durchflusszytometrische
Analyse. Um die Wirksamkeit der magnetischen Anreicherung von Cytokeratin-8/18-exprimierenden
Zellen zu bewerten, wurden Aliquoten von nicht-getrennten Zellen
und von magnetischen und nicht-magnetischen Zellfraktionen mittels
Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACSscan (Becton Dickinson)
analysiert. Daten von 5.000-17.000 Zellen wurden gesammelt und unter
Verwendung von FACSscan Research Software (Becton Dickinson) oder
CellQuest (Becton Dickinson) analysiert.
-
Resultate
-
Die
Analyse von Patient 1 ist in den 2B(i) und 2B(ii) gezeigt. Die 2A(i) bis 2C(i) zeigen CD45-Cychrom- gegenüber Cytokeratin-8/18-PE-Färbung von
Zellen aus an Leukozyten reichen, über Dichtegradient separierten
weißen
Blutzellen eines gesunden Donors (2A(i)),
von Zellen aus an Leukozyten reichen, über Dichtegradient separierten
weißen
Blutzellen einer Brustkrebspatientin mit weit voneinander entfernten
Metastasen (2B(i)) und von Zellen
aus an Leukozyten reichen, über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen eines gesunden Donors, vermischt mit Zellen aus einer
Mamma-Karzinomzelllinie BT474 (2C(i)).
28.000 BT474-Zellen wurden mit über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen, die etwa 1,5 × 108 Leukozyten enthielten, vermischt. Die Häufigkeiten
von Krebszellen in den Zählfenstern
(R1) sind angegeben. Die 2A(ii) bis 2D(ii) zeigen CD45-Cychrom- gegenüber Cytokeratin-8/18-PE-Färbung derselben Zellproben
nach magnetischer Anreicherung von Cytokeratin-8/18-exprimierenden
Krebszellen. Die Häufigkeiten
von Krebszellen in den Zählfenstern
(R1) sind angegeben.
-
Cytokeratin-8/18-exprimierende
Tumorzellen wurden zu einer Häufigkeit
von 11,7 % (2B(ii)) angereichert. Etwa 3.110
Cytokeratin-8/18-exprimierende Krebszellen wurden aus 38 ml Blut
(2,56 × 108 Leukozyten) angereichert. Dies entspricht
einer Häufigkeit
von 1,21 × 10–5.
-
Die
Resultate von einem gesunden Donor sind in den 2A(i) und 2A(ii) gezeigt. Keine Cytokeratin-8/18-exprimierende
Zelle wurde aus den 5 ml der Zellprobe der über Dichtegradient separierten
weißen Blutzellen
(1,54 × 108 Leukozyten) des normalen gesunden Donors
1 angereichert. Eine Cytokeratin-8/18-exprimierende Zelle wurde
aus den 5 ml Probe der über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen (1,54 × 108 Leukozyten) des gesunden Donors 2 angereichert.
-
Cytokeratin-8/18-exprimierende
Tumorzellen aus Patient 2 wurden bei einer Häufigkeit von 12,5 % angereichert,
was sich auf etwa 10.800 Cytokeratin-8/18-exprimierende Krebszellen angereichert
aus 30 ml Blut (1,92 × 108 Leukozyten) belief. Dies entspricht einer
ursprünglichen
Proben-Tumorzellenhäufigkeit
von 5,63 × 10–5.
Den Lichtstreuungseigenschaften zufolge sind die Brustkrebszellen
größer als
Lymphozyten und sogar als Monozyten. Färbung des Epithelzell-spezifischen
Oberflächenantigens
HEA-125 zeigte eine beträchtliche Heterogenität im Expressionsniveau
an den Tumorzellen.
-
Patient
3 wurde zum Zeitpunkt der Durchführung
der Versuchsreihe Bestrahlungstherapie unterzogen. Cytokeratin-8/18-exprimierende
Tumorzellen wurden durch das Trennungsverfahren zu einer Häufigkeit
von 0,51 % angereichert. Etwa 68 Cytokeratin-8/18-exprimierende
Krebszellen wurden aus 30 ml Blut (5,68 × 107 Leukozyten)
angereichert. Dies entspricht einer Häufigkeit in der ursprünglichen
Probe von 1 Tumorzelle pro 8,4 × 105 Leukozyten.
-
Die
Daten in Tabelle 2 fassen die Resultate von Tumorzellanreicherung
der Zellen von Brustkrebspatientinnen zusammen. Tabelle
2
- * CK-8/18* bezeichnet Zellen, die positiv
für Cytokeratin
8/18 durch zytoplasmatisches Färben
sind.
-
Beispiel 3
-
Vergleichende
immunomagnetische Isolierung von Brustkrebszellen aus künstlichen
Gemischen von Blutzellen und Brustkrebszellen durch magnetische
Hochgradienten-Zellsortierung
unter Verwendung von entweder Anti-Cytokeratin-8/18-mAb oder HEA-125-mAb,
chemisch gebunden an kolloidale superparamagnetische Mikropartikel.
-
Material und Verfahren
-
1. Zellproben-Herstellung
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An
Leukozyten reiche, über
Dichtegradient separierte weiße
Blutzellen wurden aus mit Antikoagulans behandeltem, peripherem
Blut eines gesunden Donors durch Zentrifugation bei 400 × g hergestellt.
Zwei Proben von 5 ml über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen wurden mit 20.000 Zellen der Mamma-Karzinomzelllinie
BT474 vermischt. Erythrozytenlyse, Permeabilisierung und Fixierung
wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
-
Magnetische
Markierung. Die Zellen wurden entweder mit Anti-Cytokeratin-8/18-mAb, konjugiert an kolloidale
superparamagnetische Mikroperlen, oder HEA-125-mAb, konjugiert an kolloidale superparamagnetische
Mikroperlen, in PBS/BSA/Saponin-Puffer 45 Minuten lang bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend wurden
an PE konjugierte Anti-Cytokeratin-8/18-mAb und biotinylierte HEA- 125-mAb zugesetzt,
und die Zellen wurden weitere 15 Minuten lang bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Zellen wurden in PBS/BSA/Saponin-Puffer gewaschen
und mit CD45-FITC und Streptavidin-CyChrom 15 Minuten lang bei Raumtemperatur
in PBS/BSA/Saponin-Puffer gefärbt.
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Positive
Selektion von Cytokeratin-8/18-exprimierenden Zellen durch magnetische
Hochgradienten-Zellsortierung (HGMS). Magnetisch markierte, Cytokeratin-8/18-exprimierende Zellen
wurden durch zwei aufeinander folgende positive Selektionen an MiniMACS-Säulen, die
in einen MiniMACS-Permanentmagneten insertiert waren, angereichert.
-
Durchflusszytometrische
Analyse. Um die Wirksamkeit der magnetischen Anreicherung von BT474-Zellen
zu bewerten, wurden Aliquoten von nicht-getrennten Zellen und von
magnetischen und nicht-magnetischen Zellfraktionen mittels Durchflusszytometrie
unter Verwendung eines FACSscan (Becton Dickinson) analysiert. Daten
von 5.000-17.000 Zellen wurden gesammelt und unter Verwendung von
FACSscan Research Software (Becton Dickinson) oder CellQuest (Becton
Dickinson) analysiert.
-
Resultate:
-
BT474-Zellen,
die unter Verwendung von Anti-Cytokeratin-Antikörpern isoliert worden waren,
wurden zu einer Häufigkeit
von 7,05 % angereichert. Etwa 4.200 BT474-Zellen wurden aus 5 ml über Dichtegradient separierten
weißen
Blutzellen (5,26 × 107 Leukozyten) mit einer Rückgewinnungsrate von 21 % angereichert. Ein
Hintergrund-Niveau von einer "positiven
Zelle" wurde in
der Kontrolltrennung von 5 ml über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen ohne zugesetzte Krebszellen detektiert.
-
Durch
Anti-HEA-125-Antikörper
isolierte BT474-Zellen wurden zu einer Häufigkeit von 26,03 % angereichert.
Etwa 3.890 BT474-Zellen wurden aus 5 ml über Dichtegradient separierten
weißen
Blutzellen (8,68 × 107 Leukozyten) mit einer Rückgewinnungsrate von 19,5 %
angereichert. Keine "positiven
Zellen" wurden in der
Kontroll trennung von 5 ml über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen ohne zugesetzte Krebszellen nachgewiesen.
-
Das
Verfahren wurde mit zwei verschiedenen Proben von 0,3 ml über Dichtegradient
separierten weißen
Blutzellen, vermischt mit 50.000 Zellen der Mamma-Karzinomzelllinien
BT474 und SK-BR-3 wiederholt, doch es wurden weder Permeabilisierung
noch Fixierung durchgeführt.
Die Lebendzellen wurden mit HEA-125-mAb, konjugiert an kolloidale
superparamagnetische Mikroperlen, in PBS/BSA 20 min lang bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend
wurden HEA-125-FITC zugesetzt, und die Zellen wurden weitere 10 min
lang bei Raumtemperatur inkubiert.
-
Lebensfähige SK-BR-3-Zellen
wurden von einer Häufigkeit
von 4,73 % in der Ausgangspopulation auf eine Häufigkeit von 81,84 % angereichert.
Etwa 20.800 SK-BR-3-Zellen
wurden aus 0,3 ml über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen (6,18 × 106 Leukozyten) bei einer Rückgewinnungsrate von 42 % rückgewonnen.
Lebensfähige
BT474-Zellen wurden von einer Häufigkeit
von 5,28 % auf eine Häufigkeit
von 81,39 % angereichert. Etwa 22.000 SK-BR-3-Zellen wurden aus
0,3 ml über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen (7,45 × 106 Leukozyten) gewonnen, was eine Rückgewinnungsrate
von 44 % ergab.
-
Beispiel 4
-
Es
wurde die Detektion von Krebszellen aus Vollblut ohne Ficoll-Isolierung
von über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen durchgeführt.
Dieses Verfahren reduzierte das Risiko des Verlusts an Tumorzellen. Zumindest
40 % mehr Tumorzellen wurden mittels des Vollblutverfahrens im Vergleich
zu Isolierungsverfahren der über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen bei Patienten nachgewiesen. Darüber hinaus wurde das Verfahren
der Tumorzelldetektion durch Einschränken des Verfahrensschrittes
der Isolierung von über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen um 30 min verkürzt.
Tumorzellen wurden durch direktes Einfangen von angereicherten Zellen
an einem Filter nachgewiesen, gefolgt von Quantifizierung mit Immunhistochemie.
-
Materialien und Verfahren
-
Tumorzellenanreicherung.
Kernhaltige Zellen in Vollblut werden durch Verdünnen einer Aliquote von Zellen
1:10 mit BSA-Lösung
(phosphatgepufferte Salzlösung
mit 1 % BSA, 5 mM EDTA, 0,05 % Procline-300, 0,01 % F68, pH 7,4)
gezählt.
10 μl der
Verdünnung
werden mit einem entsprechenden Volumen von Ethidiumbromid/Acridin-Orange-Farbstoff
vermischt. Kernhaltige Lebendzellen zeigen sich unter einem Fluoreszenz-Mikroskop
als grün
gefärbt.
-
Eine
Aliquote von Vollblut, die 108 kernhaltige
Zellen enthält,
wird in ein Röhrchen
gegeben, und DNAse I wird zu einer Endkonzentration von 100 U/ml
zugesetzt. Das Blut wird bei 400 g 10 min lang bei Raumtemperatur
zentrifugiert. Das Plasma wird sorgfältig ohne Störung der
Grenzfläche
entfernt. BSA-Lösung
wird zu einem Gesamtvolumen von 45 ml pro Röhrchen zugesetzt, sowie 0,9
ml Saponinlösung
(5 % Saponin in PBS mit 0,05 % Natriumazid). Die Zellsuspension
wird exakt fünf
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 2,5 ml von 37%igem Formaldehyd
werden zugesetzt, das Ganze gut vermischt und 30 min lang bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Zellsuspension wird bei 250 g 5 min lang zentrifugiert.
Der Überstand
wird abgesaugt, die Zellen werden in 30 ml der Färbungslösung (0,5 % Saponin in BSA-Lösung) resuspendiert.
Anschließend
folgt Zentrifugation bei 250 g 5 min lang, Absaugen des Überstands
und Resuspension in 10 ml Färbungslösung. Zentrifugation
bei 250 g 5 min lang, Überstand
wird abgesaugt.
-
Die
Zellen werden in 200 μl
Peroxidase-Blockierungsmittel (0,03 % Wasserstoffperoxid, das 0,05
% Natriumazid enthält)
5 min lang bei Raumtemperatur resuspendiert. 5 ml der Färbungslösung werden
zugesetzt und das Ganze 5 min lang bei 250 g zentrifugiert. Der Überstand
wird abgesaugt, und die Zellen werden in 600 μl BSA-Lösung
resuspendiert. 200 μl
FcR-Blockierungsmittel (5 mg/ml Kaninchen-IgG in BSA-Lösung, 0,05
% Procline-300) werden zugesetzt. 200 μl Antikörper (Cam5.2-Anti-Cytokeratin-Antikörper, konjugiert
an magnetische Mikropartikel) werden zugesetzt. Bei Raumtemperatur
45 min lang inkubieren. 5 ml Färbungslösung werden
zugesetzt, und das Ganze wird bei 250 g 5 min lang zentrifugiert. Überstand
wird abgesaugt, die Zellen werden in einer Polymerlösung (Peroxidase-markiertes
Polymer, konjugiert an Ziege-Anti-Maus-Ig in Tris-HCl-Puffer, Dako
Corp.) resuspendiert und bei Raumtemperatur 30 min lang inkubiert.
5 ml Blockierungslösung
werden zugesetzt und bei 250 g 5 min lang zentrifugiert. Der Überstand
wird abgesaugt, die Zellen werden in 1 ml entgastem BSA-Puffer resuspendiert.
-
Durch
Platzieren in ein magnetisches Feld und zweimaliges Spülen der
Säule mit
2 ml entgaster BSA-Lösung
wird eine MiniMACS-Säule
(Miltenyi Biotech GmbH) vorbereitet. 1 ml Zellsuspension wird in
die Säule
geladen, die negative Fraktion eingesammelt (sofern erwünscht).
Das Röhrchen
wird mit zusätzlicher BSA-Lösung (1
ml) gespült
und auf die Säule
geladen. Nachdem die Säule
nicht mehr tropft, werden 2 ml entgaste BSA-Lösung in die Säule geladen,
um die nicht-spezifisch gebundenen Zellen abzuwaschen.
-
Eine
Filterhalterung (Poretics) und ein 2-μm-Polycarbonatfilter (Poretics)
werden vorbereitet, um die Zellen aufzunehmen. Die zwei Teile der
Halterung werden festgeschraubt, und 5 ml BSA-Puffer wird durch
das Filter gepresst, um es zu befeuchten und es auf Undichtigkeit
zu überprüfen. Die
Filterhalterung wird auf die Spritze geschraubt und in ein modifiziertes,
konisches 50-ml-Röhrchen
platziert. Die Mini-MACS-Säule, die
die gebundenen Zellen enthält,
wird auf die Spritze platziert. Der Komplex wird in eine Zentrifuge
gegeben. 2 ml entgaster BSA-Lösung
werden in die Säule
geladen. 5 min lang wird bei 1.250 g zentrifugiert. Die Säule wird verworfen,
und das Filter wird mit zusätzlichen
10 ml BSA-Lösung
gewaschen. Das Filter und die Filterhalterung werden aus dem Komplex
entfernt.
-
180 μl AEC-Puffer
(3-Amino-9-ethylcarbazol in N,N-9(DMF) und Acetatpuffer, pH 5,0,
der Wasserstoffperoxid, Enhancer, Stabilisatoren und anti-mikrobielles
Reagens enthält)
werden entlang einer Wand der Halterung geladen. 5 min lang wird
bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zentrifugation mit 10 ml BSA-Puffer
wird wie zuvor ein Waschschritt durchgeführt.
-
Ein
Tropfen des Einbettungsmittels (wasserbasiertes Einbettungsmittel,
Dako) wird auf einen zellfreien Objektträger platziert. Das Filter wird
auf das Einbettungsmedium platziert, und ein weiterer Tropfen wird
zuoberst zugesetzt. Ein Deckglas wird daraufgesetzt und Luftbläschen werden
entfernt. Der Objektträger
wird unter einem Normallichtmikroskop mit 10facher Vergrößerung untersucht.
Die Tumorzellen färben
sich hellrot, und normale periphere Blutzellen bleiben transparent.
-
Resultate
-
Es
wurden Tests zur Detektion von Krebszellen in neunzehn Blutproben
von sechzehn Brustkrebspatientinnen mit Stadium-IV-Erkrankungen
durchgeführt.
Unter diesen Patientinnen gab es fünfzehn periphere Blutproben
und vier Leukophorese-Proben.
Die Empfindlichkeit von Tumorzelldetektion in den Patientenproben
erreicht 1 Tumorzelle in 108 PBMC oder 1
Tumorzelle in 10-20 ml Vollblut. In keiner der acht gesunden Personen
wurden Tumorzellen nachgewiesen. Tumorzellen wurden in 79 % der
Patientenproben nachgewiesen. Der Bereich an Krebszellen, die in
Patienten nachgewiesen wurden, die eine Erkrankung in Stadium IV aufwiesen
und bereits intensiver Chemotheraphie unterzogen worden waren, reichte
von 0,5 bis 80 Tumorzellen in 10 ml Blut oder von 1 bis 60 Tumorzellen
in 108 kernhaltigen Zellen. Für ein Filtereinfangverfahren
zur Tumorzelldetektion wurde gezeigt, dass es wirksamen und konstanten
Tumorzellfang gewährleistete.
-
In
den in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Versuchen begannen die
Verfahren mit Isolierung von über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen als erstem Schritt. Um zu untersuchen, ob dieser Schritt
für den
Verlust an kernhaltigen Zellen verantwortlich war, die sowohl WBC-
als auch Tumorzellen umfassen, wurden die kernhaltigen Zellen sowohl
im Vollblut als auch in über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen, isoliert aus dem Vollblut, mit einem Hämacytometer
unter einem Fluoreszenz-Mikroskop nach Färbung mit Ethidiumbromid/Acridin-Orange
gezählt.
Die Resultate zeigten, dass in einem Isolationsschritt der über Dichtegradient
separierten weißen
Blutzellen bis zu etwa 3 % der gesamten kernhaltigen Zellen verloren
gehen konnten, wie in Tabelle 3 gezeigt ist. Ein Vergleich mit Tumorzelldetektion
im Vollblut und in den über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen wurde durchgeführt.
Das Ergebnis zeigte, dass zumindest 40 % mehr Tumorzellen mit dem
Voll blutverfahren nachgewiesen wurden als mit dem Isolierungsverfahren
der über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen, wie in Tabelle 4 gezeigt wird. Das gesamte Verfahren
von Tumorzelldetektion wurde durch Ausschluss dieses Schrittes um
30 min verkürzt.
-
Ein
Filter-Einfangverfahren verwendete eine Polycarbonatmembran, um
Tumorzellen durch Filtration mit Vakuum oder Zentrifugation zurückzuhalten.
Drei Filter mit verschiedenen Porengrößen (0,1, 0,4 und 1,0 μm) wurden
getestet. Das Resultat zeigte, dass alle drei Porengrößen beim
Zurückhalten
von Tumorzellen unter Verwendung von Vakuumfiltration gleich wirksam
waren. Doch das Filter mit 1,0 μm
Porengröße hatte
die beste Durchflussrate: Um die Frage des oberen Zelllimits abzuklären; wurden
getrennte Filtrationen für
10
4, 10
5, 10
6 und 10
7 Zellen
durchgeführt.
In diesen Versuchen wurde erkannt, dass 10
6 Zellen
wirksam vakuumfiltriert werden konnten; die Filtrationsgeschwindigkeit
bei 10
7 Zellen sank sehr weit ab. Tabelle
3 Kernhaltige
Zellen in über
Dichtegradient separierten weißen
Blutzellen und Vollblut
Tabelle
4. Krebszellen, nachgewiesen in Vollblut und über Dichtegradient separierten
weißen
Blutzellen (WBC 10
7)
- Beachte: Die Zahlen in Klammern sind die
tatsächlichen
Anzahlen, die für
jede Probe nachgewiesen wurden. Die Zahlenmittel von Tumorzelldetektion
für jeden
Patienten sind links von den Klammern angegeben.
-
Blutproben
von Brustkrebspatientinnen wurden zur Tumorzelldetektion getestet.
Unter ihnen waren Vollblutproben, Leukophorese-Proben und Knochenmark-Proben,
Die medizinischen Informationen zu allen Patienten sind in Tabelle
5 angegeben. Die Empfindlichkeit von Tumorzelldetektion in den Patientenproben
erreichte 1 Tumorzelle unter 10
8 PBMC oder
1 Tumorzelle in 10-20 ml Vollblut. Tumorzellen wurden in keiner
der acht gesunden Personen und in 79 % der Patientenproben nachgewiesen.
Der Bereich von Krebszellen, die in jenen Patienten nachgewiesen
wurde, die intensiver Chemotherapie unterzogen worden waren, reichte
von 0,5 bis 80 Tumorzellen in 10 ml Blut oder von 1 bis 60 Tumorzellen
in 10
8 kernhaltigen Zellen (Tabelle 6). Tabelle
5 Medizinische
Informationen zu Brustkrebspatientinnen
Tabelle
9 Tumorzelldetektion
in peripherem Blut von normalen Personen und Brustkrebspatientinnen
- *
Buffy = über
Dichtegradient separierte weißte
Blutzellen
-
Tumorzelldetektion
in Leukophorese-Proben von Brustkrebspatientinnen
-
Tumorzelldetektion
im Knochenmark von Brustkrebspatientinnen
-
Die
obigen Daten zeigen einen Karzinomzell-Detektionstest, der Krebszellen
in peripherem Blut und Knochenmark isolieren und visualisieren kann.
Die Empfindlichkeit des Tests erreicht 1 Krebszelle auf 108 kernhaltige Zellen von peripherem Blut.
Die mittlere Wiedergewinnung von Krebszellen liegt bei etwa 75 %, und
der Test ist konstant und reproduzierbar.
-
Der
Tumorzell-Detektionstest wurde bei Brustkrebspatientinnen eingesetzt.
Es wurden Tests zur Detektion von Krebszellen abstammend von vierzig
Krebspatientinnen mit Erkrankungen im Stadium II-IV durchgeführt. Unter
ihnen waren 26 Proben peripheres Blut, 12 waren Leukophorese und
zwei waren Knochenmark. Die Empfindlichkeit von Tumorzelldetektion
in Patientenproben betrug 1 Tumorzelle in 10-20 ml Vollblut. In
keiner der 16 gesunden Personen wurden Tumorzellen gefunden. Tumorzellen
wurden in 80 % der Patientenproben nachgewiesen. Der Bereich von
nachgewiesenen Krebszellen erstreckte sich von 1 bis 600 Tumorzellen in
108 kernhaltigen Zellen. Es wurde eine Korrelation
zwischen der Häufigkeit
von Tumorzellen und dem Erkrankungsstadium und dem Patientenalter
erkannt.
-
Aus
den obigen Resultaten geht eindeutig hervor, dass die vorliegende
Erfindung ein einfaches, rasches Verfahren zum Trennen verbreiteter
Tumorzellen aus blutbildenden Zellen bereitstellt. Die Fraktion
von Zellen, die an Tumorzellen angereichert ist, stellt ein nützliches
Mittel zur Quantifizierung von Tumorzellen und zur weiteren Zell-Phänotypisierung
dar. Die einfache Vorgehensweise und die Fähigkeit, die Anzahl und Größe der Proben
um ein Vielfaches zu steigern, stellen bedeutende Vorteile gegenüber Verfahren
nach dem Stand der Technik dar.