CN108918871A

CN108918871A - 用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法

Info

Publication number: CN108918871A
Application number: CN201810764167.3A
Authority: CN
Inventors: 周娇娇; 陈益定; 陈齐山
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-07-12
Filing date: 2018-07-12
Publication date: 2018-11-30

Abstract

本发明提供一种用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs‑IF:E/M方法，该方法基于阴性筛选结合阳性富集CTCs，巧妙结合物理及免疫磁珠的方法，利用实验室可及的仪器设备，通过梯度离心、流式细胞阴性分选、免疫共聚焦阳性筛选及EMT性状鉴定等三个主要步骤，实现对人外周血循环肿瘤细胞的最大限度捕获分离及EMT生物学分型鉴定。而且，本发明方法可良好对接后续各类CTCs生物学特性的检测，为后续在DNA、RNA等层面进一步分析血CTCs的生物学特质提供平台和可能。

Description

用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法

技术领域

本发明属于医疗检验发明技术领域，具体涉及一种用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，该方法主要用于捕获分离乳腺癌等人外周血中的肿瘤细胞并用于下游分析。

背景技术

乳腺癌是目前中国乃至全球女性发病率最高的癌症，占总癌症死亡高达10％。近年来，我国乳腺癌的发病率和死亡率仍呈逐年增长的趋势。乳腺癌经过外周血至远处复发转移是导致死亡的主因，30-40％的早期乳腺癌患者会发生血行远处转移，而转移后的5年生存率仅20％左右。循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTCs)是指游行于血液循环系统中的肿瘤细胞，是肿瘤转移的关键细胞群。捕获并分离外周血循环肿瘤细胞并通过下游的分子生物学研究其生物学恶性转移相关的生物学特性，是预防及清除乳腺癌等肿瘤远处血行转移和复发的治疗关键。

目前乳腺癌等肿瘤CTCs分离捕获的经典方法主要有两大类：

(一)免疫磁珠捕获法：目前临床上对CTCs开展研究主要采用美国的CellSearch设备，CellSearch是免疫磁珠法的典型代表，该法主要利用包被EpCAM(epithelial celladhesion molecule,上皮细胞黏附分子，一种表达于上皮型肿瘤细胞表面的分子)抗体的免疫磁珠与CTCs表面EpCAM抗原特异反应实现对CTCs的捕获富集。该法在应用初期确实反映了乳腺癌外周血CTCs与病情进展的显著关联，但由于方法原理依靠EpCAM的抗原-抗体反应，只能识别上皮型CTCs，而无法识别外周血中因EMT-MET(epithelial to mesenchymal-mesenchymal to epithelial transition,上皮间质-间质上皮间转化)的动态转化而同样存在的间质型CTCs，尤其是乳腺癌中常见的三阴性乳腺癌亚型间质型CTCs比例可高达80％以上，因而基于EpCAM的免疫磁珠捕获法并不适合乳腺癌等有间质型CTCs存在的肿瘤，而目前的研究认为乳腺癌、肠癌、肺癌等多种肿瘤中均普遍存在间质型CTCs。

(二)物理分离法：主要利用CTCs与外周血其他细胞在密度、大小、电离特性等方面的差异进行分离捕获，常见的有微流控分离法等。物理分离法不受EMT-MET表面标志物的影响，但是由于CTCs和白细胞等外周血有核细胞存在一定范围的物理特征的重叠，物理分离的特异性相对较低。而且微流控的方法通常需要借助各类芯片的设计及加工，这些芯片都局限于个别实验室难以进行普遍开展，且芯片的材料及加工价格昂贵，不同芯片之间捕获效率等差异较大，难以广泛开展，因此临床应用还有待于进一步评估。

本发明“用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法”是基于阴性筛选结合阳性富集以同时特异性分离乳腺癌等肿瘤的上皮型及间质型CTCs，本法基于实验室可及的仪器设备，巧妙地结合了物理和免疫法以捕获分离乳腺癌等人外周血循环肿瘤细胞。优势上能：

1)规避物理微流控分离CTCs在芯片等可及性较差的缺点，本法利用的离心、流式分选仪、共聚焦荧光显微镜等都是实验室较为普遍的仪器，利用本发明方法的步骤可很好地进行CTCs的分离，且以上各项仪器均是国际上较为成熟普遍应用的仪器，仪器的稳定性可很好地保证本发明方法在CTCs细胞分离上结果上的一致性和可重复性；

2)本发明方法在阴性筛选步骤上利用梯度离心富集含CTCs的单核细胞层后进一步用流式细胞仪最大程度地精确地去除人外周血中的免疫细胞，该两步骤逐层递进，梯度离心可以最大限度富集含CTCs的细胞群，但是鉴于CTCs在外周血中含量极少，且与单核细胞在大小、密度等物理特性上重叠明显，进一步利用外周血单核细胞上共同特征性表达的CD45分子以流式细胞仪进行阴性筛选，剔除单核细胞以最大限度地保留CTCs；

3)本发明方法中巧妙地利用免疫荧光的步骤同时涵盖了上皮型及间质型CTCs的表面标志物，利用此步骤可最大限度地富集包含上皮型及间质型在内的CTCs，而不是像传统的CellSearch只包含上皮型的CTCs，尤其适用于广泛存在肿瘤细胞EMT-MET转化及间质型CTCs的癌种，通过此法同时可准确地鉴定和区分上皮型和间质型的CTCs，以此基础上可分别进一步分析上皮型、间质型CTCs的生物特征的异同点。

因此，本发明“用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法”通过阴性筛选和阳性富集，可以大限度地富集包括上皮及间质型在内的外周血CTCs，并能准确鉴定该亚型的CTCs以利于后续的生物学研究。本发明“用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法”，该方法应视为一个整体，每个步骤及其组合的整体形成了完整的捕获分离系统，该整体的捕获分离系统国内外尚无报道。

发明内容

针对目前乳腺癌等肿瘤CTCs分离捕获的经典方法存在的不足，主要包括：以CellSearch为代表的免疫磁珠捕获法只能捕获上皮型CTCs因而疏漏了大量存在的间质型CTCs，而使捕获的CTCs结果不准确；以微流控等为代表的物理分离法很难规避CTCs与外周血有核细胞在一定范围内物理特征的重叠，同时又局限于芯片等制作工艺复杂造价昂贵的困难。本发明提供一种用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，该方法基于阴性筛选结合阳性富集CTCs，巧妙结合物理及免疫磁珠的方法，利用实验室可及的仪器设备，通过梯度离心、流式细胞阴性分选、免疫共聚焦阳性筛选及EMT性状鉴定等三个主要步骤，实现对人外周血循环肿瘤细胞的最大限度捕获分离及EMT生物学分型鉴定。而且，本发明方法可良好对接后续各类CTCs生物学特性的检测，为后续在DNA、RNA等层面进一步分析血CTCs的生物学特质提供平台和可能。

本发明的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，包括如下步骤：

1)采用梯度离心法富集含有CTCs的单核细胞层；

2)分离CTCs的富集层进行进一步的流式阴性筛选以去除血细胞；

3)采用免疫荧光染色阳性筛选并鉴定包含上皮型、间质型在内的各型CTCs。

上述技术方案中，步骤1)的方法具体为：抽取新鲜人外周血于抗凝收集管中，加入PBS溶液进行混匀稀释，将稀释好的外周血连续缓慢注入预先装有Ficoll-Pague淋巴细胞分选液的离心管中，轻放入离心机中，以1040x g,20℃条件进行不间断水平离心15分钟，离心后标本明显分层，由上至下分别为：血浆层，白膜状的包含CTCs的单核细胞层，分离层，底层为红色的红细胞及粒细胞沉淀层，用枪头吸弃血浆层，吸取白膜状的包含CTCs的单核细胞层至新的离心管中，加入PBS溶液，混匀后放入离心机中，以400x g,20℃条件进行不间断水平离心10分钟，吸弃上清留下底层的细胞沉淀，加入ACK红细胞裂解液裂解5分钟后再加入PBS溶液，放入离心机中，以400x g,20℃条件进行不间断水平离心10分钟，离心后弃上清，用PBS溶液重悬细胞沉淀，得到富含CTCs的单核细胞层重悬液，冰上保存。

步骤2)具体为：取步骤1)中得到的富含CTCs的单核细胞层重悬液，稀释后进行细胞计数，按1×10⁶cells加入80-100μl的PE-Cy^TM5Mouse Anti-Human CD45抗体中，室温20℃避光、静置孵育40分钟，调试好流式细胞仪，488nm激光于675-20通道收集荧光，先将同型对照重悬液置入流式仪中，按FSC/SSC参数剔除左下角明显较小的细胞碎片及红细胞门，余下的细胞群按照同型对照荧光强弱进行画门，以同型对照设定CD45阴性的细胞群，而后将实验组重悬液轻度涡旋后，置入流式细胞仪，按FSC/SSC参数剔除左下角明显较小的细胞碎片及红细胞门，选取同型对照所示的CD45阴性门内的细胞进行回收，收集PE-Cy5CD45阴性的细胞群于收集管中。

所述的同型对照重悬液可以采用下述方法获得：取骤1)中得到的富含CTCs的单核细胞层重悬液，用PBS溶液稀释后细胞计数，按1×10⁶cells加入80-100μl的PE-Cy^TM5MouseIgG1κIsotype Control同型对照抗体中，室温20℃避光、静置孵育40分钟。

所述的收集管应用于收集前先加入1ml的胎牛血清加1ml的PBS溶液的稀释液，震荡仪上涡旋收集管至液泡覆盖整个管壁，弃去稀释液，用PBS溶液润洗洗涤后，加入无菌的PBS溶液2ml用于收集流式筛选的细胞。

步骤3)具体为：用步骤2)中分离所得到的富集的CD45阴性的CTCs细胞悬液，置于离心机中，配平后以400x g,4℃条件进行不间断水平离心5分钟，吸弃上清，并用滤纸吸干管口，用无菌PBS重悬后吸至已经预备好的甩片离心夹中，将带有重悬液的离心夹置入甩片机中，以1000rpm,4℃甩片5分钟，取出离心夹中载玻片，免疫组化笔圈定甩片后细胞所在的孔径范围，在所圈定的范围内滴入100-200μl的4％多聚甲醛覆盖整个圈定范围，进行固定15分钟，用滤纸从边缘吸弃多聚甲醛后，再在圈定范围内滴入PBS溶液100-200μl，使得滴入的PBS溶液覆盖整个圈定范围，孵育10分钟，用滤纸从边缘吸弃PBS溶液，进行该滴入PBS溶液-孵育-吸弃过程3次，之后，在上述圈定范围内滴入0.4％的TritonX-100溶液100-200μl破膜，使得滴入的TritonX-100溶液覆盖整个细胞所在范围，孵育15分钟，用滤纸从边缘吸弃TritonX-100溶液后，再在圈定范围内滴入含有1％BSA封闭溶液100-200μl，20℃室温下孵育60分钟，用滤纸从边缘吸弃封闭溶液后，在圈定范围上滴入配置的一抗溶液，4℃过夜，用滤纸从边缘吸弃一抗溶液，再在圈定范围内滴入PBS溶液100-200μl，使得滴入的PBS溶液覆盖整个细胞所在范围，孵育5分钟，用滤纸从边缘吸弃PBS溶液，进行该滴入PBS溶液-孵育-吸弃过程共3次，之后，在圈定范围内滴入二抗溶液100-200μl着色，使得滴入的二抗溶液覆盖整个细胞所在范围，20℃避光、静置孵育120分钟，再在圈定范围内滴入PBS溶液100-200μl，使得滴入的PBS溶液覆盖整个细胞所在范围，孵育5分钟后，用滤纸从边缘吸弃PBS溶液后，进行该滴入PBS溶液-孵育-吸弃过程3次，之后，在圈定范围内滴入4’6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride细胞核着色及封片结合液避光、静置4℃固定10分钟，最终用盖玻片盖住染色好的细胞上方，于Confocol共聚焦免疫荧光显微镜下观察或置于4℃避光保存。

其中，所述的一抗溶液的成分为：包括1)上皮型抗体：EpCAM，E-cadherin，CK8,CK18,CK19；和2)间质型抗体：Vimentin,Fibronectin,N-Cadherin。还可以包括HER2或ALDH1a1或CD44分别用于对CTCs分子分型相关标志物HER2(erb-b2receptor tyrosinekinase 2)、干细胞相关标志物ALDH1(aldehyde dehydrogenase 1)、CD44进行鉴定。

所述的二抗溶液包括Donkey anti-Goat IgG-Alexa Fluor 488和Donkey anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 647。

有益效果：

本发明“用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法”是基于阴性筛选结合阳性富集以同时特异性分离乳腺癌等肿瘤的上皮型及间质型CTCs，本法基于实验室可及的仪器设备，巧妙地结合了物理和免疫法以捕获分离乳腺癌等人外周血循环肿瘤细胞。有益效果主要包括：

1)能有效分离和准确收集人外周血中稀有的循环肿瘤细胞：经过前期实验认证，本发明negFACs-IF:E/M方法具有较好的有效性和可重复性，前期我们已经在乳腺癌细胞系及100例左右乳腺癌真实病人的外周血中进行检测，发现本发明能很好地分离捕获外周血中稀有的包括上皮型和间质型在内的循环肿瘤细胞(附图2)，用乳腺癌细胞系掺入健康人血样中获得negFACs-IF:E/M方法对上皮型肿瘤细胞和间质型肿瘤细胞的回收率均可以在90％以上(附图3)。通过DNA层面验证negFACs-IF:E/M方法分离的细胞确为掺入的肿瘤细胞而无混杂其他细胞(附图4)。通过RNA层面验证negFACs-IF:E/M方法分离的上皮型和间质型表达的循环肿瘤细胞在RNA层面确为分别上皮型和间质型基因高表达(附图5)。

2)能同时有效鉴定上皮型和间质型CTCs：本发明negFACs-IF:E/M方法的亮点之一就在于通过整套实验方法流程，可以在成功分离包含上皮型和间质型的CTCs的基础上，同时可以有效地对上皮型、间质型的CTCs进行鉴定，这一优势一方面能准确地提供我们外周血中CTCs总个数，同时亦能清晰地提供我们上皮型和间质型CTCs各占的个数和比例，两者间的动态变化可以密切地检测CTCs中EMT转化的状态，而我们已知EMT状态的转化对肿瘤远处转移的意义非常重大。

3)本发明所利用的仪器设备实验室可及，方法具有开展的普遍使用性：本发明negFACs-IF:E/M方法的另一个优势在于各大主要步骤所涉及的仪器设备实验室的可及性非常好，本发明是方法上的创新发明，但是开展本方法并不受仪器设备的限制，所用仪器设备均是国际上非常成熟稳定的仪器设备，对方法的开展提供稳定的硬件保障，使得数据的稳定性更为可靠，为发明后期转让及普遍开展提供很大的可能性，而不受限于硬件设备的加工设计局限和昂贵的特定设计耗材费用。

4)本发明下游对接检测分析灵活，为进一步开展CTCs相关分子学特性研究提供可能：本发明negFACs-IF:E/M方法较为灵活，在下游富集分离CTCs后，可以在染色之后对接其他各类CTCs生物学检测，例如DNA、RNA表达谱检测、FISH探针检测等，为进一步分析血CTCs的生物学特质提供平台和可能。

附图说明

图1：本发明用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法实验原理及技术路线图。图2：negFACs-IF:E/M方法很好地分离捕获外周血中稀有的包括上皮型和间质型在内的循环肿瘤细胞(BCa-86925为一名乳腺癌患者其代号)。

图3：negFACs-IF:E/M方法对上皮型和间质型肿瘤细胞均有较好的回收率(平均90％值以上)。图中的MCF-7为典型的上皮型肿瘤细胞系，MDA-MB-231为典型的间质型肿瘤细胞系，将上述两种细胞系分别以20个、40个掺入健康人外周血中，经由negFACs-IF:E/M方法可有效回收上皮型和间质型肿瘤细胞。

图4：通过DNA层面验证negFACs-IF:E/M方法分离的细胞确为掺入的肿瘤细胞而无混杂其他细胞。BT-549细胞系和SK-BR-3细胞系均含有TP53不同位点上的突变。将上述两种细胞系分别掺入健康人外周血样中(不含有TP53突变的血样)中，经由negFACs-IF:E/M方法分离掺入的肿瘤细胞系后测序发现，分离的CTCs细胞含有TP53突变，且无其他非突变的混杂信号，在DNA层面验证了negFACs-IF:E/M方法分离肿瘤细胞的精确性。

图5：通过RNA层面验证negFACs-IF:E/M方法分离的上皮型和间质型表达的循环肿瘤细胞在RNA层面确为分别上皮型和间质型基因高表达。图a和b中用negFACs-IF:E/M方法分离的事先掺入健康人血样中的上皮型MCF-7细胞系和间质型MDA-MB-231，随机各选取3个细胞进行单细胞层面的RNA表达水平检测，经过qPCR鉴定后发现，negFACs-IF:E/M法富集所得的上皮型MCF-7肿瘤细胞确高表达上皮型基因，富集的间质型MDA-MB-231肿瘤细胞确高表达间质型基因，两者均不表达免疫血细胞CD45的标志物。(CDH1:cadherin1,EPCAM:epithelial cell adhesion molecule,KRT8/18/19:CK8/18/19,FN1:fibronectin1,VIM:vimentin,CDH2:cadherin2)。

具体实施方式

本发明的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法主要包含三大部分：

1)梯度离心法富集含有CTCs的单核细胞层；

3)免疫荧光染色阳性筛选并鉴定包含上皮型、间质型在内的各型CTCs。

以下对本发明方法做详细说明：

1)梯度离心法富集含有CTCs的单核细胞层：抽取新鲜(4℃保存2h内)人外周血4ml于抗凝收集管中，加入4ml的PBS溶液进行混匀稀释，预先在15ml离心管中注入4ml的Ficoll-Paque淋巴细胞分选液，将稀释好的外周血(4ml外周血+4ml PBS)连续缓慢注入预先装有4ml的Ficoll-Pague淋巴细胞分选液的离心管中，此时4ml的Ficoll-Pague淋巴细胞分选液在下层，8ml的外周血稀释液在上层。避免剧烈摇晃已经配置好的梯度离心标本，配平后轻轻地放入离心机中，以1040x g,20℃条件进行不间断水平离心15分钟。离心后小心取出梯度离心标本，这时梯度离心标本已经明显分层，由上至下分别为：相对透明的血浆层，白膜状的包含CTCs的单核细胞层，相对透明的分离层，底层为红色的红细胞及粒细胞沉淀层。用枪头小心吸弃血浆层至白膜层上方，小心吸取富含CTCs和单核细胞的整层白膜层至新的离心管中，在新的离心管中加入PBS溶液至10ml，轻轻混匀避免剧烈震荡后，配平后轻轻地放入离心机中，以400x g,20℃条件进行不间断水平离心10分钟，吸弃上清留下底层的细胞沉淀。而后加入ACK红细胞裂解液至5ml裂解5分钟。而后再加入PBS溶液至10ml，配平后轻轻地放入离心机中，以400x g,20℃条件进行不间断水平离心10分钟。离心后弃上清，用600μl的PBS溶液重悬细胞沉淀，冰上保存。

2)分离CTCs的富集层进行进一步的流式阴性筛选以去除血细胞：用步骤1)中所分离最后得到的富含CTCs的单核细胞层重悬液中，取少许重悬液(<5ul)稀释后进行细胞计数后，按1×10^6cells加入80-100μl的PE-Cy^TM5Mouse Anti-Human CD45抗体(Clone HI30,BDPharmingen,USA)，室温20℃避光、静置孵育40分钟。在步骤1)中条件我们会额外抽取1-1.5ml的新鲜外周血作为对照，处理方法同步骤1)，到步骤2)时，用150-200μl的PBS溶液重悬后细胞计数，按1×10^6cells加入80-100μl的PE-Cy^TM5Mouse IgG1κIsotype Control同型对照抗体(Clone MOPC-21,BD Pharmingen,USA)，室温20℃避光、静置孵育40分钟。调试好流式细胞仪(BD FACSAria ^TMⅡ)，488nm激光于675-20通道收集荧光，细胞轻度涡旋后，先将同型对照重悬液置入流式仪中，按FSC/SSC参数剔除左下角明显较小的细胞碎片及红细胞门，余下的细胞群按照同型对照荧光强弱进行画门，以同型对照设定CD45阴性的细胞群。而后将实验组重悬液轻度涡旋后，置入流式细胞仪，按FSC/SSC参数剔除左下角明显较小的细胞碎片及红细胞门，选取同型对照所示的CD45阴性门内的细胞进行回收，收集PE-Cy5CD45阴性的细胞群于收集管中。此处的收集管为低吸附的流式收集管，应用于收集前先加入1ml的胎牛血清加1ml的PBS溶液的稀释液，震荡仪上涡旋收集管至液泡覆盖整个管壁，弃去稀释液，用PBS溶液润洗洗涤后，加入无菌的PBS溶液2ml用于收集流式筛选的细胞。

3)免疫荧光染色阳性筛选并鉴定包含上皮型、间质型在内的各型CTCs：用步骤2)中分离所得到的富集的CD45阴性的CTCs细胞悬液，置于离心机中，配平后以400x g,4℃条件进行不间断水平离心5分钟，注意动作轻柔避免剧烈震荡。轻轻吸弃上清，并用滤纸吸干管口，用500μl的无菌PBS重悬后吸至已经预备好的甩片离心夹中，注意滤纸和甩片孔径的大小匹配，缓缓对着甩片孔注入重悬液，小心轻放将带有重悬液的离心夹置入甩片机(Cytospin4,Thermo scientific)中，注意先行配平，而后以1000rpm,4℃甩片5分钟。取出离心夹中载玻片，免疫组化笔圈定甩片后细胞所在的孔径范围，进行后续免疫荧光染色步骤。在免疫组化笔圈定的圈内细胞所在的范围内滴入一滴100-200μl的4％多聚甲醛(配置方法：40g多聚甲醛溶于800mlPBS溶液，加热60-80℃，滴加NaOH 2ml至澄清，冷却后加PBS溶液至1000ml)进行固定15分钟，要求多聚甲醛液覆盖整个细胞所在范围。用滤纸在免疫组画笔圈定的边缘吸弃多聚甲醛后，再在圈定的细胞所在范围内滴入PBS溶液100-200μl，使得滴入的PBS溶液覆盖整个细胞所在范围，孵育10分钟后，用滤纸在免疫组画笔圈定的边缘吸弃PBS溶液后，再在圈定的细胞所在范围内滴入PBS溶液100-200μl，如此重复滴入-孵育-吸弃共3次。最终吸弃PBS溶液后，在圈定的细胞所在范围内滴入0.4％的TritonX-100溶液(配置方法：40ul TritonX-100用10ml PBS溶液配置)100-200μl破膜，使得滴入的TritonX-100溶液覆盖整个细胞所在范围，孵育15分钟。用滤纸在免疫组画笔圈定的边缘吸弃TritonX-100溶液后，再在圈定的细胞所在范围内滴入含有1％BSA封闭溶液(配置方法：0.1g BSA粉加入至10ml PBS，再加入50ul Tween-20配置溶液)100-200μl，20℃室温下孵育60分钟。用滤纸在免疫组画笔圈定的边缘吸弃封闭溶液后，在细胞所在范围上滴入配置的一抗溶液，4℃过夜。这里所采用的一抗溶液为本发明所特有的抗体组合，经过大量前期实验验证：包括1)上皮型抗体：EpCAM(epithelial cell adhesion molecule,5μg/ml,R&D,USA)稀释比例1:100，E-cadherin(cadherin 1,5μg/ml,R&D,USA)稀释比例1:100，CK8(keratin 8,SantaCruz,USA)稀释比例1:200,CK18(keratin18,Santa Cruz,USA)稀释比例1:200,CK19(keratin19,Santa Cruz,USA)稀释比例1:200；2)间质型抗体：Vimentin(Cell Signaling,USA)稀释比例1:150,Fibronectin(Abcam,USA)稀释比例1:150,N-Cadherin(AntibodyRevolution,USA)稀释比例1:150；此外如需对CTCs分子分型相关标志物HER2(erb-b2receptor tyrosine kinase 2)、干细胞相关标志物ALDH1(aldehyde dehydrogenase1)、CD44等进行鉴定，可增加组合相关抗体：HER2(20μg/ml,Aviva Systems Biology,USA),ALDH1a1(Cell Signaling,USA)稀释比例1:400,CD44(R&D,USA)稀释比例1:50。一抗溶液孵育4°过夜后，用滤纸在免疫组画笔圈定的边缘吸弃一抗溶液，再在圈定的细胞所在范围内滴入PBS溶液100-200μl，使得滴入的PBS溶液覆盖整个细胞所在范围，孵育5分钟后，用滤纸在免疫组画笔圈定的边缘吸弃PBS溶液后，再在圈定的细胞所在范围内滴入PBS溶液100-200μl，如此重复滴入-孵育-吸弃共3次。最终吸弃PBS溶液后，在圈定的细胞所在范围内滴入二抗溶液100-200μl着色，使得滴入的二抗溶液覆盖整个细胞所在范围，20℃避光、静置孵育120分钟。这里所采用的二抗溶液为本发明所特有的抗体组合，契合本步骤中的一抗抗体种属及反应原性，经过大量前期实验验证：包括Donkey anti-Goat IgG-Alexa Fluor488(Abcam,USA)稀释比例1:800,Donkey anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 647(Abcam,USA)稀释比例1:800。二抗孵育120分钟后，再在圈定的细胞所在范围内滴入PBS溶液100-200μl，使得滴入的PBS溶液覆盖整个细胞所在范围，孵育5分钟后，用滤纸在免疫组画笔圈定的边缘吸弃PBS溶液后，再在圈定的细胞所在范围内滴入PBS溶液100-200μl，如此重复滴入-孵育-吸弃共3次。最终吸弃PBS溶液后，在圈定的细胞所在范围内滴入4’6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride细胞核着色及封片结合液(DAPI；Sigma-Aldrich,MO,USA)避光、静置4℃固定10分钟。最终用盖玻片盖住染色好细胞的上方，周围一圈用固定剂固定住盖玻片以免滑动。于Confocol共聚焦免疫荧光显微镜下观察或置于4℃避光保存。

Confocol共聚焦免疫荧光显微镜转至405(细胞核显色所在通道)，488(上皮型抗体显色所在通道)，647(间质型抗体显色所在通道)分别进行观察，观察计数时先将镜下的玻片移至细胞所在最左上角，而后按照由上及下，由左及右的顺序全覆盖进行镜下细胞观察，所观察到的细胞进行扫描记录存档。

由步骤2)所得的富集的CD45阴性的CTCs细胞悬液，经过离心机甩片后亦可进行免疫组化鉴定分子分型ER、HER2相关表面标志物，免疫组化的抗体经过本发明的前期实验筛选后选用ER(Ventana,USA)or HER2(Ventana,USA)。免疫组化操作步骤采用商品化试剂盒(UltraSensitive S-P,Maxim,China)。

Claims

1.一种用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)采用梯度离心法富集含有CTCs的单核细胞层；

2.如权利要求1所述的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，步骤1)的方法具体为：抽取新鲜人外周血于抗凝收集管中，加入PBS溶液进行混匀稀释，将稀释好的外周血连续缓慢注入预先装有Ficoll-Pague淋巴细胞分选液的离心管中，轻放入离心机中，以1040x g,20℃条件进行不间断水平离心15分钟，离心后标本明显分层，由上至下分别为：血浆层，白膜状的包含CTCs的单核细胞层，分离层，底层为红色的红细胞及粒细胞沉淀层，用枪头吸弃血浆层，吸取白膜状的包含CTCs的单核细胞层至新的离心管中，加入PBS溶液，混匀后放入离心机中，以400x g,20℃条件进行不间断水平离心10分钟，吸弃上清留下底层的细胞沉淀，加入ACK红细胞裂解液裂解5分钟后再加入PBS溶液，放入离心机中，以400x g,20℃条件进行不间断水平离心10分钟，离心后弃上清，用PBS溶液重悬细胞沉淀，得到富含CTCs的单核细胞层重悬液，冰上保存。

3.如权利要求1所述的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，所述的步骤2)具体为：取步骤1)中得到的富含CTCs的单核细胞层重悬液，稀释后进行细胞计数，按1×10⁶cells加入80-100μl的PE-Cy^TM5Mouse Anti-Human CD45抗体中，室温20℃避光、静置孵育40分钟，调试好流式细胞仪，488nm激光于675-20通道收集荧光，先将同型对照重悬液置入流式仪中，按FSC/SSC参数剔除左下角明显较小的细胞碎片及红细胞门，余下的细胞群按照同型对照荧光强弱进行画门，以同型对照设定CD45阴性的细胞群，而后将实验组重悬液轻度涡旋后，置入流式细胞仪，按FSC/SSC参数剔除左下角明显较小的细胞碎片及红细胞门，选取同型对照所示的CD45阴性门内的细胞进行回收，收集PE-Cy5 CD45阴性的细胞群于收集管中。

4.如权利要求3所述的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，所述的同型对照重悬液为：取骤1)中得到的富含CTCs的单核细胞层重悬液，用PBS溶液稀释后细胞计数，按1×10⁶cells加入80-100μl的PE-Cy^TM5 Mouse IgG1 κIsotypeControl同型对照抗体中，室温20℃避光、静置孵育40分钟。

5.如权利要求3所述的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，所述的收集管应用于收集前先加入1ml的胎牛血清加1ml的PBS溶液的稀释液，震荡仪上涡旋收集管至液泡覆盖整个管壁，弃去稀释液，用PBS溶液润洗洗涤后，加入无菌的PBS溶液2ml用于收集流式筛选的细胞。

6.如权利要求1所述的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，所述的步骤3)具体为：用步骤2)中分离所得到的富集的CD45阴性的CTCs细胞悬液，置于离心机中，配平后以400x g,4℃条件进行不间断水平离心5分钟，吸弃上清，并用滤纸吸干管口，用无菌PBS重悬后吸至已经预备好的甩片离心夹中，将带有重悬液的离心夹置入甩片机中，以1000rpm,4℃甩片5分钟，取出离心夹中载玻片，免疫组化笔圈定甩片后细胞所在的孔径范围，在所圈定的范围内滴入100-200μl的4％多聚甲醛覆盖整个圈定范围，进行固定15分钟，用滤纸从边缘吸弃多聚甲醛后，再在圈定范围内滴入PBS溶液100-200μl，使得滴入的PBS溶液覆盖整个圈定范围，孵育10分钟，用滤纸从边缘吸弃PBS溶液，进行该滴入PBS溶液-孵育-吸弃过程3次，之后，在上述圈定范围内滴入0.4％的TritonX-100溶液100-200μl破膜，使得滴入的TritonX-100溶液覆盖整个细胞所在范围，孵育15分钟，用滤纸从边缘吸弃TritonX-100溶液后，再在圈定范围内滴入含有1％BSA封闭溶液100-200μl，20℃室温下孵育60分钟，用滤纸从边缘吸弃封闭溶液后，在圈定范围上滴入配置的一抗溶液，4℃过夜，用滤纸从边缘吸弃一抗溶液，再在圈定范围内滴入PBS溶液100-200μl，使得滴入的PBS溶液覆盖整个细胞所在范围，孵育5分钟，用滤纸从边缘吸弃PBS溶液，进行该滴入PBS溶液-孵育-吸弃过程共3次，之后，在圈定范围内滴入二抗溶液100-200μl着色，使得滴入的二抗溶液覆盖整个细胞所在范围，20℃避光、静置孵育120分钟，再在圈定范围内滴入PBS溶液100-200μl，使得滴入的PBS溶液覆盖整个细胞所在范围，孵育5分钟后，用滤纸从边缘吸弃PBS溶液后，进行该滴入PBS溶液-孵育-吸弃过程3次，之后，在圈定范围内滴入4’6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride细胞核着色及封片结合液避光、静置4℃固定10分钟，最终用盖玻片盖住染色好的细胞上方，于Confocol共聚焦免疫荧光显微镜下观察或置于4℃避光保存。

7.如权利要求6所述的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，所述的一抗溶液的成分为：包括1)上皮型抗体：EpCAM，E-cadherin，CK8,CK18,CK19；和2)间质型抗体：Vimentin,Fibronectin,N-Cadherin。

8.如权利要求7所述的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，所述的一抗溶液还包括HER2或ALDH1a1或CD44分别用于对CTCs分子分型相关标志物HER2(erb-b2 receptor tyrosine kinase 2)、干细胞相关标志物ALDH1(aldehydedehydrogenase 1)、CD44进行鉴定。

9.如权利要求6所述的用于外周血循环肿瘤细胞捕获的negFACs-IF:E/M方法，其特征在于，所述的二抗溶液包括Donkey anti-Goat IgG-Alexa Fluor 488和Donkey anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 647。