CN116064225A - 一种用于检测循环肿瘤细胞的微流控芯片及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括从下至上层叠设置的芯片基板和芯片盖板，所述芯片基板上设置有至少一个微流控通道，所述微流控通道上连接有生物素修饰的核酸适配体EPCAM、Vimentin、EGFR和CD44。本发明通过对捕集条件进行多靶标优化，在微流控芯片上连接多个生物素修饰的核酸适配体EPCAM、Vimentin、EGFR和CD44，建立高灵敏度和特异性的多靶标纳微流控芯片，从而实现高灵敏度地捕获和分离富集鼻咽癌循环肿瘤细胞。

Description

一种用于检测循环肿瘤细胞的微流控芯片及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及细胞检测技术领域，特别涉及一种微流控芯片及基于微流控芯片检测循环肿瘤细胞的方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)是指由原发灶脱落，侵入血液循环的肿瘤细胞。CTC能逃避机体免疫，在原发或远处脏器驻留，从而形成复发、转移病灶。鼻咽癌循环肿瘤细胞研究主要集中于临床病理回顾性分析。鼻咽癌CTC研究主要基于
Figure BDA0003770844170000011
检测平台，文献报道临床样本CTCs检出率52.6％～92.0％。放疗或术后CTCs明显减少，但部分研究显示疾病分期与CTCs数量可能存在相关性，与CTCs检出率无显著相关性。为了提高CTCs应用价值，与其他标志物如EBV DNA、VCA、MMP-9、COX2等联合诊断和预后评估鼻咽癌研究显示，检测结果众说纷纭。究其原因，临床实践中CTCs检测方法尚未标准化，不同组织来源肿瘤细胞仅70％表达EpCAM等，依赖密度梯度离心、膜过滤法的物理分离和上皮源EpCAM免疫亲和分离计数CTCs。该类方法存在分离效率、纯度低且无法克服CTCs异质性，从而造成假阳性、漏检或CTCs破裂，导致临床应用敏感性、特异性低及诊断预后关联性差，严重影响鼻咽癌诊断治疗的医疗决策。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种微流控芯片及基于微流控芯片检测循环肿瘤细胞的方法，旨在解决现有微流控芯片无法高灵敏度地检测到血液样本中鼻咽癌循环肿瘤细胞的问题。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞的微流控芯片，其中，所述微流控芯片包括从下至上层叠设置的芯片基板和芯片盖板，所述芯片基板上设置有至少一个微流控通道，所述微流控通道上连接有生物素修饰的核酸适配体EPCAM、Vimentin、EGFR和CD44。
所述用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞的微流控芯片，其中，所述核酸适配体EPCAM的核苷酸序列为SIQ ID No.1，所述核酸适配体Vimentin的核苷酸序列为SIQ ID No.2，所述核酸适配体EGFR的核苷酸序列为SIQ ID No.3，所述核酸适配体CD44的核苷酸序列为SIQID No.4。
所述用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞的微流控芯片，其中，所述微流控通道上设置有六棱柱纳米柱阵列结构。
所述用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞的微流控芯片，其中，所述微流控通道经过链霉亲和素修饰。
所述用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞的微流控芯片，其中，所述芯片基板上设置有5个微流控通道。
一种微流控芯片的制备方法，其中，包括步骤：
提供一种芯片基板，所述芯片基板上设置有至少一个微流控通道；
对所述微流控通道进行刻蚀处理，在所述微流控通道内形成六棱柱纳米柱阵列结构；
在所述微流控通道上连接生物素修饰的核酸适配体EPCAM、Vimentin、EGFR和CD44后，再在所述芯片基板上盖上芯片盖板，制得所述微流控芯片。
一种微流控芯片的应用，其中，将所述微流控芯片用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞。
有益效果：本发明提供的微流控芯片通过连接多个生物素修饰的核酸适配体EPCAM、Vimentin、EGFR和CD44，建立高灵敏度和特异性的多靶标纳微流控芯片，实现高灵敏度地捕获和分离富集鼻咽癌循环肿瘤细胞。
附图说明
图1为本发明一种微流控芯片结构示意图。
图2为本发明一种微流控芯片的制备方法原理图。
图3为本发明流式细胞术验证适配体单元对肿瘤细胞的识别结果图。
图4为本发明微流控芯片基底结合适配体的捕获效率考察结果图。
图5为本发明微流控体系的上样流速优化结果图。
图6为本发明鼻咽癌患者循环肿瘤细胞的荧光视野图像。
图7为模拟样本分选后亮场视野与荧光视野下的图像。
图8为微流控芯片系统与市售产品的分选效率比较图。
具体实施方式
本发明提供一种微流控芯片及基于微流控芯片检测循环肿瘤细胞的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
大量研究已证实，参与血液扩散的循环肿瘤癌症细胞能够发生上皮-间质转化(EMT)。发生转化CTCs上皮标志物(如EpCAM)表达下调，间质型标志物(波形蛋白Vimentin、N-钙粘蛋白)表达上调，因此，血液中存在至少两种亚型的CTCs。有研究表明，CTCs的EMT程度与其肿瘤转移能力呈正相关，与预后情况呈负相关，具有间质特性的CTCs可能会具有更强的侵袭性和转移性。仅依靠物理分离和单一上皮标志物的免疫捕获技术，识别效率低、难修饰、难以无损释放等缺陷，严重制约了CTCs检测的临床引用、EMT化CTCs临床检测方法发展及EMT化CTCs在肿瘤转移机制中作用的研究。不能高效、灵敏、特异性地检测具有转移、成瘤活性的不同CTCs亚群，可能造成诊疗的偏差。因此，基于高特异性、敏感度的捕获技术亟待开发。
基于此，本发明提供了一种用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞的微流控芯片，其中，所述微流控芯片包括从下至上层叠设置的芯片基板10和芯片盖板20，所述芯片基板10上设置有至少一个微流控通道11，所述微流控通道11上连接有生物素修饰的核酸适配体EPCAM、Vimentin、EGFR和CD44。
在本发明中，所述核酸适配体EPCAM的核苷酸序列为SIQ ID No.1，具体为：CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG，其3‘端连接生物素Biotin-C6 spacer；
所述核酸适配体Vimentin的核苷酸序列为SIQ ID No.2，具体为：CACGCATAGCCTTTGCTCCTCGTCTGGAACGTCGCAGCTTTAGTTCTGGGCCTATGCGTG，其5‘端连接生物素Biotin-C6spacer；
所述核酸适配体EGFR的核苷酸序列为SIQ ID No.3，具体为：TACCAGTGCGATGCTCAGTGCCGTTTCTTCTCTTTCGCTTTTTTTGCTTTTGAGCATGCTGACGCATTCGGTTGAC，其5‘端连接生物素Biotin-C6 spacer；
所述核酸适配体CD44的核苷酸序列为SIQ ID No.4，具体为：GGGATGGATCCAAGCTTACTGGCATCTGGATTTGCGCGTGCCAGAATAAAGAGTATAACGTGTGAATGGGAAGCTTCGATAGGAATTCGG，其5‘端连接生物素Biotin-C6 spacer。
本发明通过对捕集条件进行多靶标优化，在微流控芯片上连接多个生物素修饰的核酸适配体EPCAM、Vimentin、EGFR和CD44，建立高灵敏度和特异性的多靶标纳微流控芯片，从而实现高灵敏度地捕获和分离富集鼻咽癌循环肿瘤细胞。
具体来讲，如图2所示，本发明还提供了一种微流控芯片的制备方法，其包括步骤：
提供一种芯片基板，所述芯片基板上设置有至少一个微流控通道；
对所述微流控通道进行刻蚀处理，在所述微流控通道内形成六棱柱纳米柱阵列结构；
将链霉亲和素加入PBS溶液配制成1mg/mL储备液，使用前，用PBS稀释成10μg/mL，移取100μL滴加至微流控通道，孵育1h后滴加PBS清洗后再进行干燥，得到活化后的微流控通道；
在所述活化后的微流控通道上连接生物素修饰的核酸适配体EPCAM、Vimentin、EGFR和CD44后，再在所述芯片基板上盖上芯片盖板，制得所述微流控芯片。
下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
实施例1
适配体对肿瘤细胞的识别验证
为了提高微流控体系的捕获效率，研究选用多靶标适配体组合。利用5，端FAM修饰的适配体EPCAM、Vimentin、EGFR及CD44对SUNE1(鼻咽癌细胞)和健康志愿者PBMC(外周血单核细胞)进行识别能力验证，见图2.3。SUNE1在不加生物识别单元时荧光信号102，当分别加入FAM-EPCAM、FAM-Vimentin、FAM-EGFR和FAM-CD44后，其因荧光强度增大比例FAM-EPCAM≥FAM-EGFR＞FAM-Vimentin＞FAM-CD44，4种生物识别单元混合后可显著提高适配体组合对SUNE1的选择捕获能力。将健康志愿者PBMC不加4种生物识别单元与加入4种生物单元混合后，流式细胞检测结果如图3所示，从图3可以看出，虽然健康志愿者PBMC虽有增强，但仍小于肿瘤细胞空白组的荧光强度，表明适配体生物单元可识别捕获肿瘤细胞。
实施例2
微纳米结构的微流控芯片基底结合适配体的捕获效率
选取EPCAM(+)的细胞MCF-7和A549、EPCAM(-)的细胞Hela和Jurkat设计了4组试验分别为：Flat w/o Biotin(A)、Flat w/Biotin(B)、Structure w/o Biotin(C)及Sturucture w/Biotin(D)，以EPCAM适配体修饰进行比较研究，结果如图4所示。A：将适配体捕获前的细胞MCF-7、A549、Hela及Jurkat，加至普通的玻片上静置1h，PBS清洗3次，显微镜下计数吸附的细胞，可知不同细胞未经适配体捕获其吸附率在6.33％～10.87％。B：将生物修饰的适配体捕获后的细胞，加至链霉亲和素修饰的普通玻片上，静置后清洗镜检，其捕获率相比A组并未发生显著变化。C：未修饰的细胞加至纳微流控芯片基底，其捕获效率相比普通玻片提高了4倍，表明纳微流控基底利用其特殊的六棱柱纳米结构实现了肿瘤细胞的拦截，而白细胞拦截效率低。D：纳微芯片基底经过链霉亲和素修饰后，对肿瘤细胞的捕获效率相比未修饰结构进一步提高了2倍，表明适配体联合纳微结构可显著提高细胞的捕获效率。
实施例3
微流控条件优化
肿瘤细胞流经微流控通道的流速影响着细胞的捕获效率，确定最佳的流速有助于提高稀有细胞的捕获效率，以EPCAM为因此本研究考察了0.2～2.0mL/hr的肿瘤细胞捕获效率，结果如图5所示。对于EpCAM+的細胞MCF-7和A549，细胞的捕获效率随流速升高出现先升高后降低的变化，表明该集基材对EPCAM+细胞有反应；对EPCAM-的細胞HeLa和Jurkat，其细胞捕获效率随流速变化没有显著改变。根据本研究采用的捕获靶标为EPCAM、Vimentin及EGFR，流速对提高多靶标生物识别单元捕获肿瘤细胞的效率有调控作用，用过优化其最佳流速为0.5mL/hr。
实施例4
循环肿瘤细胞荧光免疫检测
将SUNE1细胞与Jurkat细胞混合后制备成模拟样本和临床患者的PBMC上机分选后，免疫荧光染色，镜检见图6和图7。从亮场镜下可初步判断细胞直径相对大一些的为SUNE1。荧光抗体染色后检测结果可见Jurkat细胞的CD45(555nm)表达主要在细胞膜上，SUNE1的PCK(488nm)和Vimentin(647nm)表达包括细胞膜和胞浆。
实施例5
临床样本检测
对临床上收集的5例鼻咽癌患者和2例颅底肿瘤患者进行CTC检测。5例患者临床分期III～IV期，均存在淋巴结转移，EBV DNA载量在5.01*10^2～8.08*10^4copies。7例样本中检测出的CTC分别为17、44、81、89、100、20和40个/4mL，检出率100％，相比市售CTC100平台，相同样本的CTC个数提高了5倍，为下游的CTC进一步分析奠定了基础，如图8所示。通过文献及COSMIC癌症中体细胞突变目录检索鼻咽癌遗传突变和频率结果显示，突变频率依次为TP53(42％)、PIK3CA(10％)、EGFR(3％)。将上述7例样本进行CTC挑选，每例样本成功挑选的3～5颗CTC，进行EGFR和PIK3CA突变检测，结果显示均为阴性。
综上所述，鼻咽癌患者中80％以上存在EGFR表达上调，尤其是非角化型鼻咽癌组织中表达率达90％以上，且EGFR高表达与鼻咽癌不良预后有关。鼻咽癌属于鼻咽部的上皮组织恶性肿瘤，因此存在EPCAM表达，EPCAM是免疫介导的主要CTC捕获靶标之一。鼻咽癌是高度侵袭转移性癌种，存在EMT转化，间质型的标志物如Vimentin可通过降低组织间的粘连，促进肿瘤细胞脱落，侵犯基底层释放入血。为了提高稀有细胞CTC的捕获效率，本发明利多靶标适配体识别单元联合纳微流控芯片体系通过流式细胞术验证多靶标的识别、纳微流结构与适配体双重作用显著提高捕获效率6倍、确定了最佳流速及模拟样本中回收率可达75％以上。将优化好的微流控体系用于7例临床样本检测，CTC检出率100％，检出细胞是市售产品的5倍，进一步实现了单细胞采集及CTC上EGFR和PIK3CA突变检测。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括从下至上层叠设置的芯片基板和芯片盖板，所述芯片基板上设置有至少一个微流控通道，所述微流控通道上连接有生物素修饰的核酸适配体EPCAM、Vimentin、EGFR和CD44。
2.根据权利要求1所述用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞的微流控芯片，其特征在于，所述核酸适配体EPCAM的核苷酸序列为SIQ ID No.1，所述核酸适配体Vimentin的核苷酸序列为SIQ ID No.2，所述核酸适配体EGFR的核苷酸序列为SIQ ID No.3，所述核酸适配体CD44的核苷酸序列为SIQ ID No.4。
3.根据权利要求1所述用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞的微流控芯片，其特征在于，所述微流控通道上设置有六棱柱纳米柱阵列结构。
4.根据权利要求1所述用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞的微流控芯片，其特征在于，所述微流控通道经过链霉亲和素修饰。
5.根据权利要求1所述用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞的微流控芯片，其特征在于，所述芯片基板上设置有5个微流控通道。
6.一种如权利要求1所述微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括步骤：
提供一种芯片基板，所述芯片基板上设置有至少一个微流控通道；
对所述微流控通道进行刻蚀处理，在所述微流控通道内形成六棱柱纳米柱阵列结构；
在所述微流控通道上连接生物素修饰的核酸适配体EPCAM、Vimentin、EGFR和CD44后，再在所述芯片基板上盖上芯片盖板，制得所述微流控芯片。
7.一种如权利要求1-5任一所述微流控芯片的应用，其特征在于，将所述微流控芯片用于检测鼻咽癌循环肿瘤细胞。
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