CN114990124B - 膜蛋白靶标cd44的核酸适配体、其筛选方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种膜蛋白靶标CD44的核酸适配体、其筛选方法与应用。所述核酸适配体具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的序列。所述筛选方法包括：以单链DNA序列作为起始筛选文库，与靶标细胞进行结合，并分离出与靶细胞结合的序列，然后进行PCR扩增并制备出单链DNA序列用于下一轮的筛选；同时引入对照细胞进行负筛选；通过反复多轮的筛选，得到所需要的适配体候选序列。本发明筛选出针对膜蛋白靶标CD44的适配体序列，与CD44高表达细胞系的结合，进行循环肿瘤细胞的捕获设计，通过在磁珠表面进行适配体的修饰，从而增加磁珠的生物相容性和对肿瘤细胞的识别能力，使其能够对循环肿瘤细胞进行捕获。

Description

膜蛋白靶标CD44的核酸适配体、其筛选方法与应用
技术领域
本发明涉及一种核酸适配体，具体涉及一种用于循环肿瘤细胞捕获的、基于工程化细胞的膜蛋白靶标CD44高表达细胞系的核酸适配体、其筛选方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
核酸适配体（aptamer）是利用指数富集的配体系统进化（Systematicevolutionof ligand by exponential enrichment，SELEX）技术，从化学合成的寡核苷酸文库中筛选获得的一类短的单链DNA或RNA序列，能够通过折叠形成一个特定的三维结构与靶标结合，通常为25~90个碱基。
CD44（Cluster of Differentiation 44）被认为是多种实体瘤的肿瘤干细胞生物标志物。CD44被证实不仅仅是在单个CTC，同时也在CTC簇上表达，并且CD44与其细胞簇的形成和转移能力有关，CD44介导的肿瘤细胞的聚集不依赖于透明质酸-配体的结合，而是依赖于其细胞间的同源性相互作用。基于此，开发了一些基于CD44生物标志物的分离技术，例如基于CD44抗体以及CD44-透明质酸相互作用的识别系统。Belthier等人构建了基于磁珠和FACS的分离技术，借助CD44抗体进行亲和捕获，实现了对乳腺癌和结直肠癌患者血液中的CTCs的纯化。Li等人制备了多巴胺-透明质酸的微球，利用HeLa细胞为模式细胞进行捕获分离，其捕获效率达到85.94%。Zhao等人通过静电纺丝，制备了透明质酸功能化的聚乙烯醇/聚乙烯亚胺纳米纤维，实现了对HeLa细胞的高效捕获。
循环肿瘤细胞是指从原发或者转移性肿瘤部位脱落，然后随着血液循环系统侵入到人体外周血的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞进入血液后会迁移到身体的其他组织部位从而造成肿瘤的远处转移，通过对循环肿瘤细胞的捕获和检测可以对肿瘤早期诊断和预后进行一定的指导，所以如何从人体血液样本中及早并高效的捕获循环肿瘤细胞已经成为肿瘤诊断、预后方法的一项重要的研究内容。目前多是采用抗体进行捕获，但是成本较高，稳定性不好，所以功能性核酸适配体将提供一种新的辅助工具，用于循环肿瘤细胞的高效捕获。
适配体作为识别配体，具有其独特的优势，例如易功能化调控、易合成等。然而，目前仍未有基于CD44适配体的CTCs检测技术，所以迫切需要开发基于CD44阳性CTCs的检测技术。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基于工程化细胞的膜蛋白靶标CD44高亲和力和高特异性的核酸适配体、其筛选方法及其应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种膜蛋白靶标CD44的核酸适配体，它具有SEQ ID No.1所示的序列。
本发明实施例还提供了另一种膜蛋白靶标CD44的核酸适配体，它具有SEQ IDNo.2所示的序列。
进一步地，所述核酸适配体能够特异性识别并稳定CD44高表达细胞系。
本发明实施例还提供了所述膜蛋白靶标CD44的核酸适配体于制备能够特异性识别和结合膜蛋白靶标CD44，并对循环肿瘤细胞进行捕获的产品中的应用。
相应的，本发明实施例还提供了一种产品，其能够特异性识别和结合膜蛋白靶标CD44，并对循环肿瘤细胞进行捕获，所述产品包括前述的膜蛋白靶标CD44的核酸适配体。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
1）本发明提供了一种膜蛋白靶标CD44的核酸适配体的序列，基于所述CD44适配体与CD44高表达细胞系的特异性结合，可以实现循环肿瘤细胞捕获的目的；
2）本发明利用基因过表达技术，将目标靶蛋白稳定高表达于宿主细胞膜上构建工程化过表达细胞系，并将工程化过表达细胞作为靶细胞进行适配体的筛选，克服了常规SELEX中膜蛋白的纯化问题，尤其是一些不易获得较高纯度和数量的细胞表面蛋白；
3）相较于全细胞筛选采用非等基因细胞进行负筛选，基于工程化细胞的适配体筛选，通过利用模式宿主细胞作为对照细胞，通过灵活设计基于宿主细胞的负筛选过程，可以有效去除非特异性和非靶向的序列的富集，可以作为一种强有力的工具用于分离靶向适配体序列。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行简单的介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅作为本文发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1是本发明一典型实施方式中宿主细胞CHO-K1细胞膜上CD44蛋白表达的流式验证图；
图2是本发明一典型实施方式中转染CD44基因的CHO-K1细胞的CD44蛋白表达的流式验证图；
图3是本发明一实施方案之中利用Cell-SELEX方法进行适配体筛选的流程图；
图4a与图4b是本发明实施例3中所筛选到的适配体候选序列CD24和CD24S以及筛选文库m-Lib与对照细胞CHO-K1和靶细胞CD44的相互作用的流式验证图；
图5a与图5b是本发明实施例3中所筛选到的适配体候选序列CD24和CD24S和靶细胞CD44的结合亲和力测试图；
图6是本发明实施例4中所筛选到的适配体CD24和CD24S以及筛选文库m-Lib与对照细胞CHO-K1和靶细胞CD44相互作用的共聚焦成像图；
图7a和图7b是本发明实施例5中所筛选适配体序列C24S-磁珠分离系统对少量HeLa细胞的灵敏性测试图；
图8a和图8b是本发明实施例6中C24S-磁珠分离系统对临床病人血液样本中CTC的检测图。
具体实施方式
鉴于现有技术的不足，本案发明人经长期研究和实践，提出了本发明的技术方案。即，提供了一种基于工程化细胞的CD44适配体的筛选与应用。
本发明实施例的一个方面提供的一种膜蛋白靶标CD44的核酸适配体具有SEQ IDNo.1所示的序列，具体的，序列表示为：5’-ATACCAGCTTATTCAATTGGGACGCTGAACACTATCATGGGGTGCTATCTCTCTTGGTAGATAGTAAGTGCAATCT-3’。
本发明实施例的另一个方面提供的一种膜蛋白靶标CD44的核酸适配体具有SEQID No.2所示的序列，具体的，序列表示为：5’-GGGACGCTGAACACTATCATGGGGTGCTATCTCTCTTGGT-3’。
在一些实施方案中，所述核酸适配体能够特异性识别并稳定CD44高表达细胞系。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的膜蛋白靶标CD44的核酸适配体的筛选方法，其包括：
（1）利用慢病毒体系构建CD44高表达细胞系；
（2）利用Cell-SELEX技术进行核酸适配体的筛选，CD44高表达细胞系用作靶细胞进行正筛选，同时选取未进行转染的宿主CHO-K1细胞系作对照细胞，用于靶细胞的负筛选；获得所述膜蛋白靶标CD44的核酸适配体。
在一些实施方案中，所述基于工程化细胞的膜蛋白靶标CD44核酸适配体的筛选方法包括：
（1）利用慢病毒体系构建CD44工程化过表达细胞系，用于靶细胞的正筛选；
（2）利用Cell-SELEX技术进行适配体的筛选，同时选取未进行转染的宿主CHO-K1细胞系作对照细胞进行负筛选；
（3）利用流式细胞术、表面等离子体共振技术和共聚焦显微镜对所选取的适配体候选序列进行结合力和特异性的表征。
在一些实施方案中，所述筛选方法包括：将优化设计的CD44核酸适配体序列进行生物素的修饰，然后利用化学的方法修饰到链霉亲和素-磁珠上，然后进行CTC的捕获。
在一些实施方案中，步骤（1）包括：利用三质粒包装系统进行病毒的包装，然后对宿主细胞CHO-K1进行转染，从而获得CD44高表达的细胞系。
在一些实施方案中，步骤（2）包括：利用Cell-SELEX技术进行适配体的筛选，CD44高表达细胞系用作靶细胞进行正筛选，同时选取未处理的宿主细胞CHO-K1作对照细胞，进行负筛选，目的在于提高候选适配体的亲和力和特异性。
在一些实施方案中，步骤（3）具体包括：将步骤（2）所获得的适配体候选序列荧光基团的修饰，然后在4℃条件下与一定数量的细胞进行孵育，洗涤缓冲液清洗后进行流式分析和共聚焦成像分析。其中，筛选库用于做阴性对照。
综上所述，本发明提供的筛选方法包括：设计单链DNA序列作为起始筛选文库，然后与靶标细胞进行结合，并分离出与靶细胞结合的序列，然后进行PCR扩增并制备出单链DNA序列用于下一轮的筛选；并且，在筛选的过程中，引入对照细胞进行负筛选，从而降低与靶标结合力弱或者是非特异性结合的序列的富集；最后，通过反复多轮的筛选，得到所需要的适配体候选序列，并进行进一步的表征。
由于细胞膜上负载有多种表面分子，以细胞为靶标，所筛选的适配体可能会靶向识别非目标蛋白。为了实现特定目标蛋白的适配体筛选，利用基因过表达技术，将目标靶蛋白稳定高表达于宿主细胞膜上构建工程化过表达细胞系，并将工程化过表达细胞作为靶细胞进行适配体的筛选，克服了常规SELEX中膜蛋白的纯化问题，尤其是一些不易获得较高纯度和数量的细胞表面蛋白。
相较于全细胞筛选采用非等基因细胞进行负筛选，基于工程化细胞的适配体筛选，通过利用模式宿主细胞作为对照细胞，通过灵活设计基于宿主细胞的负筛选过程，可以有效去除非特异性和非靶向的序列的富集。该技术的提出，可以作为一种强有力的工具用于分离靶向适配体序列。
本发明实施例的另一个方面还提供了所述膜蛋白靶标CD44的核酸适配体于制备能够特异性识别和结合膜蛋白靶标CD44，并对循环肿瘤细胞（CTCs）进行捕获的产品中的应用。
进一步地，所述应用具体包括：将所述膜蛋白靶标CD44的核酸适配体进行生物素的修饰，利用化学的方法修饰到链霉亲和素-磁纳米颗粒上，实现肿瘤干细胞特性的循环肿瘤细胞的捕获。
本发明提供的所述膜蛋白靶标CD44的核酸适配体的序列，基于所述CD44适配体与CD44高表达细胞系的特异性结合，可以实现循环肿瘤细胞捕获的目的。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种基于CD44适配体-纳米磁珠的CTC分离与鉴定方法用于CTC的亲和捕获。
相应的，本发明实施例还提供了一种产品，其能够特异性识别和结合膜蛋白靶标CD44，并对循环肿瘤细胞进行捕获，所述产品包括前述的膜蛋白靶标CD44的核酸适配体。
综上，本发明利用Cell-SELEX方法筛选出针对膜蛋白靶标CD44的核酸适配体序列，并利用所述CD44适配体与CD44高表达细胞系的结合，从而进行循环肿瘤细胞的捕获设计。所述的设计主要包括：通过在磁珠表面进行所筛选到的适配体的修饰，从而增加磁珠的生物相容性和对肿瘤细胞的识别能力，使其能够对循环肿瘤细胞进行捕获。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
该基于工程化细胞系进行CD44核酸适配体的筛选方法具体如下：
a）质粒构建：利用正向引物FP2（5’-ACCGAATTCATGGACAAGTT-3’）和反向引物RP2（5’-TTAGGATCCTTACACCCCA-3’），对人CD44表达基因进行 PCR 扩增，从而获得大量的CD44序列；分别EcoR I和BamH I对扩增的目的片段慢病毒载体pLVX-IRES-Puro于37℃进行切割过夜；将酶切后、CD44目的片段与载体pLVX（1：10摩尔比）进行连接，分别将各组分混合后，置于16℃连接10 h；采用热激法，将构建质粒转化到DH5α感受态细胞中，进行测序，从而确保CD44目的片段成功插入到慢病毒载体的相应酶切位点。
b）细胞转染：将步骤a所获得的含有目的序列的载体命名为CD44-pLVX。利用慢病毒载体介导的三质粒系统构建CD44高表达细胞系。待293T细胞融合度达到70%~80%时，将CD44-pLVX（12 µg）、Pspax2（8 µg）和pMD2.G（2 µg）分别加入到离心管A中，然后添加200 µLOpti-MEM 后静置；同时将转染试剂 Lipo 2000 置于含有Opti-MEM的离心管B中，静置5min，将离心管AB混合后静置20 min。然后，将293T细胞的培养基替换成Opti-MEM，加入转染复合物进行病毒包装。分别在包装4 h和24 h时，更换完全培养基。48 h时，收集病毒上清，2000 g离心10 min；然后4℃下82700 g离心120 min，完全培养基重悬病毒沉淀，保存于-80℃。
将CHO-K1细胞接种于60 mm培养皿，使用 F12K 培养基培养至细胞融合度为60%进行假病毒颗粒的转染。将假病毒颗粒与Opti-MEM 培养基按照1：1比例（v/v）进行混合，然后加入助转染试剂聚凝胺（10 µg/mL），混合后加入到CHO-K1细胞中，12 h后更换成完全培养基。48 h后，进行连续两周的抗性筛选，采用6 µg/mL的嘌呤霉素维持两周的抗性筛选，其中成功转染CD44基因的CHO-K1细胞具有嘌呤霉素抗性基因，能够在嘌呤霉素环境下生存。
c）工程化细胞系中CD44表达水平检测：利用流式技术考察转染前后CHO-K1细胞上的 CD44 蛋白的表达水平，从而确认是否成功构建工程化稳定高表达CD44蛋白的细胞系。首先将转染前后的CHO-K1细胞分散于PBS溶液中（2×105个/管），然后分别加入FITC-CD44抗体和FITC-IgG2b同型对照，避光孵育30 min，PBS清洗三次后，流式上样分析，并将CD44稳定过表达细胞命名为CD44细胞其中，流式分析结果如图1和图2所示，图1示出了宿主细胞CHO-K1细胞膜上CD44蛋白表达的流式验证图，图2示出了流式考察候转染人CD44表达基因后的CHO-K1细胞的CD44蛋白表达水平。
实施例2
基于Cell-SELEX技术，以CD44和CHO-K1细胞分别进行正负筛选，其中，CHO-K1作阴性对照，用于降低非特异性结合CD44序列的富集，具体的筛选流程如图3所示。量取100 µL经95℃热变性处理的ssDNA初始文库（m-Lib，100 µM）分散到900 µL结合缓冲液中。待CD44细胞融合度达90%时，用洗涤缓冲液清洗三次，加入m-Lib于冰上孵育60 min，使初始库与CD44细胞进行结合。在进行第3轮筛选时，首先将筛选库与CHO-K1共孵育，进行负筛选；然后再与CD44细胞共孵育，进行正筛选，从而提高适配体的结合特异性。具体操作如下：将定量的m-Lib热处理后，与接种于60 mm培养皿的CHO-K1（融合度 90%）进行冰上孵育30 min，收集未结合的序列与CD44细胞孵育，从而进行正筛选，然后收集与CD44细胞结合的序列。
孵育后，用洗涤缓冲液清洗三次后，加入1 mL H2O，然后用细胞刮刀收集细胞，进行95℃热变性处理，使结合序列与CD44细胞分离。通过离心，收集本轮富集库。将分离的结合序列，利用m-P1和biotin-mP2进行大批量PCR扩增。收集PCR产物，利用碱变性法制备ssDNA库，用作下一轮的筛选库。
实施例3
在筛选8轮后进行高通量测序，根据序列分析结果，选择其候选序列，即C24。为了提高适配体的亲和力以及降低使用成本，通常引入适配体SELEX后优化策略。通过对引物序列进行裁短优化，设计了一条裁短序列，即C24S。同时合成FAM荧光基团修饰的初始文库（FAM-m-Lib）和候选序列（FAM-C24和FAM-C24S），然后利用流式和共聚焦成像技术考察候选序列对CD44细胞的结合力作用。
将融合度90%的CD44和CHO-K1细胞用PBS进行清洗，消化后计数，然后200 µL结合缓冲液重悬细胞（2×105个/管），然后分别加入终浓度为250 nM的FAM-m-Lib和FAM-aptamer，冰上避光孵育50 min，加入洗涤缓冲液（700 µL），1000 rpm离心清洗三次，重悬于200 µL洗涤缓冲液，进行流式分析。图4a示出了考察候选序列C24和C24S与对照细胞CHO-K1的相互结合作用，图4b示出了流式考察候选序列C24、C24S与CD44细胞的结合作用。
同时，采用流式技术，考察候选序列与CD44细胞的结合亲和力：将消化处理的CD44 细胞重悬于200 µL结合缓冲液中（2×105个/管），然后分别加入FAM-m-Lib（250 nM）和不同浓度的FAM-aptamer（5~500 nM），冰上避光孵育50 min，离心清洗后，流式上样分析。通过非线性拟合方式，对荧光强度与适配体浓度的相关性进行拟合，根据公式计算其平衡解离常数，即F-F0=Bmax X/(Kd+X)，其中F和F0分别代表不同浓度FAM-aptamer和FAM-m-Lib处理后的CD44细胞的平均荧光强度，X代表FAM-aptamer的浓度。图5a和5b分别示出了候选序列C24和C24S与CD44细胞的结合亲和力参数。
实施例4
以CD44细胞为阳性细胞，CHO-K1细胞系为对照细胞，利用共聚焦显微镜成像技术考察了所筛选到的序列对筛选所选用的细胞间的相互作用。别将CD44和CHO-K1细胞接种于35 mm共聚焦皿中，置于培养箱中培养24 h；PBS清洗后，分别加入500 µL结合缓冲液稀释的FAM-m-Lib和FAM-aptamer（250 nM）避光孵育。30 min后，加入Hoechst 33342（10 µg/mL）染色20 min，清洗后进行荧光成像。图6为共聚焦成像考察候选适配体C24和C24S与CHO-K1和CD44细胞的结合作用。
实施例5
首先制备功能化CD44适配体的磁纳米颗粒：将10 µL链霉亲和素-磁珠（SA-MNPs，1mg/mL）分散于1 mL PBS 缓冲液中，然后加入生物素修饰的适配体序列（biotin-C24S，10 µM）反应过夜，将适配体连接于磁纳米颗粒表面，磁分离清洗三次后，重悬于PBS中，保存于4℃备用（命名为C24S-MNPs）。为了检测该适配体-磁珠分离系统的捕获灵敏性，通过将少量模式细胞HeLa（10、20、50、100和200个）分散于PBS和白细胞体系中，模拟血液样本中的CTCs，用于考察适配体-磁珠对少量细胞的捕获灵敏性。
白细胞抽提：EDTA抗凝管收集健康志愿者的新鲜外周血，加入等体积Hank’s溶液进行稀释，然后转移至Histopaque-1077分离液的离心管中，400 g离心30 min后，收集单个核细胞层（WBCs），然后重悬于PBS中备用。
将消化处理后的HeLa细胞加入DiO染料进行细胞膜染色，30 min后离心清洗并计数。然后将预染的不同数量的HeLa细胞分别分散于500 µL PBS或白细胞混悬液中，然后加入C24S-MNPs，于37℃培养箱中孵育30 min。利用磁分离进行清洗后，重悬于PBS溶液中，通过荧光成像，对捕获的HeLa细胞进行计数，从而计算捕获效率。图7a为C24S-MNPs对分散于PBS中的少量HeLa细胞的捕获灵敏性分析结果，图7b为C24S-MNPs对分散于WBCs中的少量HeLa细胞的捕获灵敏性分析结果。
实施例6
病人外周血液样本来源于苏州大学第二附属医院，采用Histopaque-1077试剂分离WBCs。将制备的C24S-MNPs与分离的白细胞置于培养箱中共孵育。30 min后磁分离清洗三次，4% PFA固定1 h，清洗后用2% BSA封闭1 h。然后加入Alexa Fluor 488-anti-CD45和Alexa Fluor 555-anti-pan CytoKeratin（PanCK）和Hochest 33342（10 µg/mL）进行染色，PBS清洗后，进行共聚焦成像分析。将PanCK+/CD45-/hochest33342+的细胞定义为CTCs，PanCK-/CD45+/hochest33342+的细胞为WBCs。图8a为适配体-磁纳米颗粒（C24S-MNPs）捕获CTCs示意图，图8b为C24S-MNPs分离病人外周血液样本中CTCs的免疫荧光成像分析。
综上所述，藉由本发明的上述技术方案，本发明构筑了具有良好细胞相容性的功能化适配体的纳米磁珠，该磁珠具有较高的细胞捕获特异性和灵敏度，以及鉴定能力，同时制备方法简单，可大量制备。
此外，本案发明人还参照以上实施例的方式，以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验，并同样构建了表达不同目的蛋白的高表达细胞系，该构建细胞系的方法具有很好的适用性。
需要说明的是，在本文中，在一般情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的步骤、过程、方法或者实验设备中还存在另外的相同要素。
应当理解，以上所述实例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 膜蛋白靶标CD44核酸适配体、其筛选方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ataccagctt attcaattgg gacgctgaac actatcatgg ggtgctatct ctcttggtag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
gggacgctga acactatcat ggggtgctat ctctcttggt 40

Claims (4)

1.一种膜蛋白靶标CD44的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体的序列如SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述膜蛋白靶标CD44的核酸适配体在制备能够特异性识别和结合膜蛋白靶标CD44，并对循环肿瘤细胞进行捕获的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括：
将所述膜蛋白靶标CD44的核酸适配体进行生物素的修饰，利用化学的方法修饰到链霉亲和素-磁纳米颗粒上，实现肿瘤干细胞特性的循环肿瘤细胞的捕获。
4.一种产品，其能够特异性识别和结合膜蛋白靶标CD44，并对循环肿瘤细胞进行捕获，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的膜蛋白靶标CD44的核酸适配体。
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