CN112126649A - 基于工程化细胞的N-cadherin核酸适配体的筛选及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种N‑cadherin核酸适配体，所述核酸适配体具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。优选的，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供了所述N‑cadherin核酸适配体的筛选方法。因所述N‑cadherin适配体能与N‑cadherin高表达的循环肿瘤细胞特异性结合，因而其可以应用于捕获循环肿瘤细胞。

Description

基于工程化细胞的N-cadherin核酸适配体的筛选及应用
技术领域
本发明涉及一种适配体，具体涉及一种N-cadherin核酸适配体、其筛选方法及其应用，例如在循环肿瘤细胞的分离与鉴定中的应用，属于分子生物学领域。
背景技术
核酸适配体，也被称为核酸适体、适配子等，是从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲合性和高特异性地与各种靶标结合的单链寡核苷酸。最早是由Szostak和Gold两个小组几乎同时提出。1990年，Ellington和Szostak报道了能结合小分子有机染料的RNA片段，并将其命名为Aptamer。适配体(aptamer)是指利用指数富集的配基系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)技术，从人工合成的寡核苷酸文库中筛选得到的具有亲和性高、特异性强的能够与靶分子特异性结合的短的单链DNA和RNA分子。
钙黏蛋白是细胞粘附分子中的一个家族，其中E-cadherin和N-cadherin是与肿瘤转移关系最密切的两种类型。N-cadherin蛋白常见于中胚层组织和神经外胚层，其编码基因位于染色体18q，分子量为120KDa。经典构型是由5个细胞外区、1个跨膜区和1个胞浆区组成，胞浆区的高度保守序列与链蛋白相连组成钙黏蛋白复合体，才能够进行细胞之间的粘附。N-cadherin是一种钙依赖性细胞粘附分子，能够介导细胞与细胞之间的粘附，以及调节细胞迁移和肿瘤的侵袭性，主要在一些高侵袭性的肿瘤细胞中进行表达。N-cadherin主要是通过上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)机制参与肿瘤细胞的远处转移；N-cadherin不仅介导癌细胞间的同质性粘附，而且介导癌细胞与同样表达N-cadherin的成纤维细胞、血管内皮细胞间的异质性粘附。上皮间质转换(EMT，epithelial–mesenchymal transition)，是上皮细胞在一些因素的作用下，失去极性及细胞间紧密连接和黏附连接，获得了浸润性和游走迁移能力，变成具备间充质细胞形态和特性的细胞，并且这种行为是可逆的。在EMT的发生过程中，上皮细胞极性丧失，与周围细胞和基质细胞的接触减少，细胞间的相互作用减少，细胞迁移和运动能力增强，同时细胞表型发生改变，丧失上皮表型，如角蛋白丝，E-cadherin。E-cadherin表达水平下降可以导致细胞的粘附力降低，使细胞获得易于侵袭和转移的特性，E-cadherin表达的丢失已经被认为是EMT最显著的特征。同时细胞获得间充质表型，如Vimentin,N-cadherin等表达升高。目前EMT被看成是导致肿瘤进展的病理过程。在肿瘤的恶性演进过程中，EMT使得肿瘤细胞得以侵袭和转移，还可能使肿瘤细胞逃逸某些因素诱导的凋亡。因此，在肿瘤的研究中，EMT的发生预示肿瘤了恶性进程的发生。
循环肿瘤细胞(CTC)是指从原发瘤体或转移位点脱落进入人体外周血的恶性肿瘤细胞。CTC与癌症转移、治疗效果、癌症复发、用药指导及预后密切相关，因而被作为癌症转移早期诊断和治疗的重要生物标志物。对CTC的研究有望阐明癌症转移、药物敏感及耐药性产生的内在机理，从而实现对癌症病人的个体化有效治疗。然而，CTC在外周血中的极低含量和固有的异质性使高纯度有效捕获CTC面临巨大困难。近十年，不同的检测分离技术被用于分离CTC，如基于亲和分子抗体等的捕获、微流控、尺寸分离、免疫磁珠分离、纳米结构等，这些方法主要依赖单一的生物标志物EpCAM，但是很多CTC在转移过程中会经历EMT转化，使EpCAM的表达丢失或者减少，因此依靠单一抗体EpCAM的技术会减少对异质性CTC的分离。本发明因此而来。
发明内容
本发明提供一种N-cadherin核酸适配体，用于解决现有技术中CTC的分离问题，所述核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
优选的，所述N-cadherin核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选的技术方案中，所述核酸适配体的两端任选为荧光分子、生物素基团修饰。
本发明的另一目的在于提供一种用于捕获循环肿瘤细胞的捕获试剂，其特征在于，所述捕获试剂包含所述的N-cadherin核酸适配体和药学上可接受的载体。
本发明的另一目的在于提供一种N-cadherin核酸适配体的筛选方法，其包括：
利用慢病毒体系对CHO/K1细胞进行细胞转染，获得N-cadherin稳定表达的N-cadherin细胞系，用于靶细胞的正筛选；
选取未进行转染的CHO/K1细胞系作对照细胞，用于靶细胞的负筛选；
利用Cell-SELEX技术进行N-cadherin核酸适配体的筛选。
本发明的又一目的在于提供一种循环肿瘤细胞的捕获方法，其包括：
使循环肿瘤细胞与所述的N-cadherin核酸适配体接触，其中所述N-cadherin核酸适配体的一端设置标识部分；
使所述N-cadherin核酸适配体与N-cadherin稳定表达的循环肿瘤细胞特异性结合而捕获循环肿瘤细胞。
优选的技术方案中，所述方法具体包括：
对磁珠表面进行硅烷化修饰，然后利用甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱和甲基丙烯酸以及交联剂BACy在磁珠表面修饰抗粘附水凝胶层；以及
利用所述抗粘附水凝胶层将所述N-Cadherin适配体序列修饰到磁珠上。
优选的技术方案中，所述方法具体包括：通过水热合成法合成Fe3O4磁性纳米颗粒，在其表面进行硅烷化修饰，然后利用带有功能基团的抗粘附分子甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)和甲基丙烯酸(MAA)以及含双硫键的交联剂(BACy)在其表面修饰上抗粘附水凝胶层。
优选的技术方案中，所述方法具体包括：利用化学缩合的方法在MAA的羧基官能团上修饰上N-Cadherin适配体序列。
本发明的又一目的在于提供一种所述的N-cadherin核酸适配体在在制备能够特异性识别和/或捕捉循环肿瘤细胞的产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明提供了一种N-cadherin核酸适配体的序列，基于所述N-cadherin核酸适配体与N-cadherin高表达的循环肿瘤细胞的特异性结合，可以实现循环肿瘤细胞捕获的目的。
2)由于膜蛋白质在提取纯化过程中分子构象和形态会发生变化，故以膜蛋白为靶标进行筛选的核酸适配体很难应于识别整体细胞，直接用高表达膜蛋白的工程化细胞系进行筛选，在筛选的过程中可以保持蛋白的天然构象，进而可以借助与膜蛋白的相互作用，对全细胞进行识别。
3)在细胞系的筛选中，其对照细胞的选择尤为重要，而工程化细胞进行细胞筛选时，选择未转染的细胞系为对照细胞，对照条件更为严格，更有利于筛选针对相应膜蛋白的核酸适配体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中转染后的CHO/K1细胞N-cadherin表达的流式验证图；
图2是本发明实施例中未转染的CHO/K1细胞N-cadherin表达的流式验证图；
图3是本发明实施例中利用Cell-SELEX方法进行适配体筛选的流程图；
图4为本发明实施例中所筛选到的第十二轮富集库以及筛选文库m-lib与对照细胞CHO/K1的共聚焦成像图；
图5为本发明实施例中所筛选到的第十二轮富集库以及筛选文库m-lib与靶细胞N-cadherin的共聚焦成像图；
图6为本发明实施例中所筛选到的适配体候选序列NC-3S以及筛选文库m-lib与靶细胞N-cadherin的相互作用的流式验证图；
图7为本发明实施例中所筛选到的适配体候选序列NC-3S以及筛选文库m-lib与对照细胞CHO/K1的相互作用的流式验证图；
图8是本发明实施例中所筛选到的适配体NC-3S以及筛选文库m-Lib与对照细胞CHO/K1相互作用的共聚焦成像图；
图9是本发明实施例中所筛选到的适配体NC-3S以及筛选文库m-Lib与靶细胞N-cadherin相互作用的共聚焦成像图；
图10是本发明实施例中所筛选适配体序列对HeLa细胞的捕获效率；
图11是本发明实施例中HeLa细胞与不同修饰后的磁珠作用后的细胞荧光图。
具体实施方式
通过应连同所附图式一起阅读的以下具体实施方式将更完整地理解本发明。本文中揭示本发明的详细实施例；然而，应理解，所揭示的实施例仅具本发明的示范性，本发明可以各种形式来体现。因此，本文中所揭示的特定功能细节不应解释为具有限制性，而是仅解释为权利要求书的基础且解释为用于教示所属领域的技术人员在事实上任何适当详细实施例中以不同方式采用本发明的代表性基础。
本发明提供一种用于循环肿瘤细胞捕获的N-cadherin高表达细胞系的核酸适配体的筛选方法，可以用于基于纳米磁珠的CTC分离与鉴定。本发明人经长期研究发现，N-cadherin受体在癌细胞经历EMT后会高表达，因此这个分离技术将N-cadherin适配体修饰在磁珠等标识部分表面，用于CTC捕获。
本发明基于工程化细胞的膜蛋白靶标N-cadherin适配体的筛选包括：
(1)利用慢病毒体系进行高效率的细胞转染，并获得N-cadherin稳定高表达的细胞系，用于靶细胞的正筛选；
(2)利用Cell-SELEX技术进行适配体的筛选，同时选取未进行转染的CHO/K1细胞系作对照细胞进行负筛选；
(3)利用流式细胞术和共聚焦显微镜对所选取的适配体候选序列进行结合力和特异性的表征。
其中，步骤(1)包括：利用三质粒包装系统进行非复制性病毒的包装，然后用包装的病毒对所选取的待感染的CHO/K1细胞进行转染，从而获得N-cadherin高表达的细胞系，用于靶细胞的正筛选。
步骤(2)包括：利用Cell-SELEX技术进行适配体的筛选，N-cadherin高表达细胞系用作靶细胞进行正筛选，同时选取未感染的细胞系CHO/K1作对照细胞，进行负筛选，目的在于降低与靶标结合力弱或者非特异性结合的序列的富集，从而筛选到高亲和力和高特异性的适配体序列。
步骤(3)具体包括：将步骤(2)所获得的适配体候选序列以及筛选库进行荧光基团的修饰，然后在4℃条件下与一定数量的细胞进行孵育，洗涤缓冲液清洗三遍后进行流式分析和共聚焦成像分析。其中，筛选库用于做阴性对照。
本发明利用磁珠修饰适配体进行循环肿瘤细胞的捕获，包括：
1)对磁珠进行水凝胶层的修饰。
2)将N-cadherin适配体序列利用化学的方法修饰到磁珠上，然后进行循环肿瘤细胞的捕获。
其中步骤(1)包括：通过水热合成法合成100nm左右的Fe3O4磁性纳米颗粒，在其表面进行硅烷化修饰，然后利用带有功能基团的抗粘附分子甲基丙稀酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)和甲基丙烯酸(MAA)以及含双硫键的交联剂(BACy)在其表面修饰上抗粘附水凝胶层。
步骤2)包括：步骤(1)中修饰了抗粘附水凝胶层的磁珠，通过化学缩合的方法在MAA的羧基官能团上修饰上N-cadherin适配体序列。该磁珠可以高效捕获EMT转化后高表达N-cadherin的CTC，减少异质性CTC的丢失。其具体的制备方法如下：将修饰了水凝胶层的磁珠分散于具有活化羧基的偶联试剂EDC和NHS的PBS溶液中，常温反应20-90min后，PBS清洗，然后加入0.00005-0.0001w/v％的链霉亲和素，常温过夜反应，清洗后加入生物素修饰的N-cadherin适配体。避光保存于4℃冰箱中备用。
本发明获得的所述的筛选到的适配体序列可用于CTC的捕获。
本发明实施例提供了一种基于工程化细胞系的DNA核酸适配体的筛选方法，其包括：
构建N-cadherin表达质粒和高表达稳定细胞系，同时包含基于Cell-SELEX技术进行DNA核酸适配体的筛选。
一种基于纳米磁珠的CTC分离与鉴定方法，包括粒径100nm左右的磁珠，包裹在磁珠表面25nm左右厚度的硅层，在硅层中包覆一定的荧光染料，将抗黏附分子连接在硅层表面以及与所述抗粘附分子连接的N-cadherin适配体序列用于CTC的亲和捕获。
本发明研究人员发现，与CTC特异性结合的核酸适配体，核苷酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，优选为后者。
在核酸适配体的两端，可以进行基团修饰，所述修饰的基团可以是选自硫代、氨代、氟代、甲氧基、荧生物素修饰。本发明的一个实施例中，提供了在所述的核心的核酸适配体的一端进行生物素修饰后得到的经修饰的核酸适配体分子，将修饰后的适配体连接到载体后，能够与CTC特异性结合。
可以对所述的核酸适配体的碱基进行修饰，如光分子、修饰，得到碱基修饰后的核酸适配体分子，优选地，对所述碱基进行生物素修饰。本发明的一优选实施例中，将所述核酸适配体一端进行荧光素分子的修饰，得到所述的核酸适配体与靶细胞作用，从而检测核酸适配体序列的亲和力和特异性。
本发明所述的载体也可以是造影剂粒子(如纳米铁、包裹了造影剂的纳米粒等)，将所述适配体偶联到造影剂粒子上，作为CTC靶向分子，用于CTC的靶向显影，将适配体偶联到造影粒子上的方法，本发明技术人员可以根据现已有的制剂技术进行。或者，本发明所述的载体还可以是染色分子(如辣根过氧化物酶)，作为CTC靶向分子，用于CTC的组化染色等等。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
除非另外具体陈述，否则术语“包含(include、includes、including)”、“具有(have、has或having)”的使用通常应理解为开放式的且不具限制性。
除非另外具体陈述，否则本文中单数的使用包含复数(且反之亦然)。此外，除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式“一(a、an)”及“所述(the)”包含复数形式。另外，在术语“约”的使用在量值之前之处，除非另外具体陈述，否则本发明教示还包括特定量值本身。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
实施例1
该基于工程化细胞系进行N-cadherin适配体的筛选方法具体如下：
a)利用基因扩增的方法，将含有人源N-cadherin基因序列的载体进行扩增，从而获得大量的N-cadherin序列，并进行凝胶电泳，确认所扩增的序列正确无误后进行切胶纯化；然后将纯化后的基因序列进行酶切，同时将pLVX-IRES-Pruo载体进行酶切，并将酶切后的片段进行电泳，确定酶切片段正确后将目的序列与酶切后的载体进行过夜连接，然后将连接好的质粒进行克隆转化后，进行测序，从而验证所连接的含有目的序列的质粒知否正确，是否将目的序列正确连接到目的载体的相应位点。
b)将步骤a所获得的含有目的序列的载体命名为N-Cadherin-pLVX-IRES-Pruo，然后按照质量比为4：3：2的N-Cadherin-pLVX-IRES-Pruo、pSPAX2和Pmd2.G三质粒系统进行慢病毒体系的包装。具体方法如下：分别将三质粒系统和OPTI-MEM培养基混匀后备用；然后将5-10ul lipo 2000和150ul OPTI-MEM混匀后静置5-10min，然后与三质粒系统进行混合后静置20-30min；将包装好的质粒加入到293T细胞中，3-4h后将培养基更换成完全培养基，24h后再次更换培养基，待48h后收集病毒。
c)包括：将步骤b中所收集到的病毒加入到融合度为70-90％的CHO/K1细胞中进行转染，同时加入浓度为4-6ug/ml的转染增强试剂polybrene，转染12h后，换成生长培养基；24h后，加入浓度为1-3ug/ml的嘌呤霉素进行筛选，未成功转入含有目的基因载体的细胞将会被嘌呤霉素杀死，从而连续进行1周左右嘌呤霉素的筛选，可获得稳定转染N-cadherin细胞系。
d)将获得细胞系进行N-cadherin表达的验证，采用流式分析的方法，分别用未转染的CHO/K1细胞和转染后的细胞在4℃条件下与IgG、anti-N-cadherin抗体进行孵育30min，然后用PBS清洗3次后加入相应的FITC修饰的二抗，4℃孵育20min后清洗，然后进行流式分析，有流式结果可知，转然后的细胞相对于未转染的细胞，N-cadherin具有较强的表达，并将该细胞命名为N-cadherin细胞。其中，流式分析结果如图1和图2所示。
实施例2
以N-cadherin细胞为阳性细胞，未转染的CHO/K1细胞为对照细胞进行适配体的筛选。具体的筛选方法如下：首先将设计的筛选文库m-lib 10nmol溶于500ul灭菌水中，然后进行95℃变性5min，然后立即置于冰上10min。用洗涤缓冲液对融合度在90％的N-cadherin细胞进行清洗三次，然后将细胞与筛选文库在4℃条件下进行孵育60min后，用洗涤缓冲液进行清洗，洗涤在4℃条件下进行，每次清洗3min，清洗三次。最后，用1ml灭菌水用细胞刮刀将细胞刮下来，并转移至离心管中，经过95℃处理10min后，进行离心，收集上清即为本轮筛选所得到的富集文库。然后，将所筛选到的序列进行PCR扩增，并制备ssDNA用于下一轮的筛选，反复进行，直至得到富集效果好的筛选文库。在筛选的进程中，引入未转染的CHO/K1细胞进行负筛选，并且逐渐减少阳性细胞的使用量，增加对照细胞的数量，并且逐渐增加洗涤时间和洗涤次数，从而降低非特异性结合以及与靶标结合较弱的序列的富集，得到与靶标具有高亲和力和高特异性的适配体序列。图3为具体的筛选方法流程。
实施例3
以N-cadherin细胞为阳性细胞，CHO/K1细胞系为对照细胞，进行筛选效果的验证。分别考察了所得到的第12轮的筛选库和筛选库m-lib对细胞的亲和作用。将状态良好的细胞消化后，取一定数量的细胞种在共聚焦专用培养皿中。24h后，将生长状态良好的N-cadherin和CHO/K1细胞用PBS清洗三次。然后分别将500nM m-lib和荧光修饰的第十二轮的筛选库和阳性细胞和对照细胞系在4℃条件下进行孵育50min，然后用700ul洗涤缓冲液清洗三次，然后进行共聚焦显微镜成像。图4和图5的共聚焦结果表明在筛选至12轮时，与靶细胞结合力较强的序列的富集效果较好。
实施例4
对12轮所得到的筛选文库进行克隆转化后，进行测序。并根据所筛选到的序列的二级结构选择最有可能的适配体候选序列。然后以N-cadherin细胞为阳性细胞，CHO/K1细胞系为对照细胞，利用流式技术考察了所筛选到的序列对细胞的亲和作用。将已培养两天而且生长状态良好的N-cadherin和CHO/K1细胞利用0.25％的胰酶消化，然后弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液并将细胞吹打均匀后进行细胞计数，调整细胞悬液至4X 105/ml。将0.5ml细胞悬液在1000rpm条件下离心5min去除培养基，然后加入100ul 2X结合缓冲液以及100ul 500nM的荧光修饰的筛选序列，4℃条件下进行孵育50min，然后用700ul洗涤缓冲液进行离心清洗，并加入350ul洗涤缓冲液进行流式上样分析，图6和图7的流式结果表明所筛选到的适配体序列与构建的细胞之间的相互作用。
实施例5
以N-cadherin细胞为阳性细胞，CHO/K1细胞系为对照细胞，利用共聚焦显微镜成像技术考察了所筛选到的序列对筛选所选用的细胞间的相互作用。将已培养两天而且生长状态良好的N-cadherin和CHO/K1细胞利用0.25％的胰酶消化，然后弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液将细胞吹打均匀并进行计数细胞，调整细胞悬液密度至105/ml。然后0.5ml的上述细胞悬液接种到共聚焦成像专用培养皿中，培养48h后，用PBS对细胞进行清洗2-3次，从而去除死细胞。对于所选取的对照细胞和阳性细胞，分别进行荧光修饰m-lib和适配体序列NC-3S进行处理，4℃条件下进行孵育50min，然后用500ul洗涤缓冲液进行清洗，然后用多聚甲醛进行固定15min后进行共聚焦成像。图8和图9的共聚焦成像结果表明，相对于m-lib处理组，所筛选到的适配体序列与阳性细胞有较强的结合。
实施例6
以N-cadherin细胞为靶细胞，利用流式细胞术技术考察所筛选到的适配体序列与靶细胞间相互作用的的亲和力。分别配置荧光修饰的适配体浓度为0、2.5、5、10、25、37.5、50、100、150、200和250nM。然后将已经培养48h并生长状态良好的N-cadherin细胞利用0.25％的胰酶消化，然后弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液并将细胞吹打均匀后进行细胞计数，调整细胞悬液至4X105/ml。将0.5ml细胞悬液在1000rpm条件下离心5min去除培养基，然后加入100ul 2X结合缓冲液以及100ul不同浓度梯度的荧光修饰的适配体序列，4℃条件下进行孵育50min，然后用700ul洗涤缓冲液进行离心清洗，并加入350ul洗涤缓冲液进行流式分析其细胞的平均荧光强度，并重复2-4次。选择其细胞应该给你强度的平均值对其适配体浓度进行非线性拟合，得到所述适配体与靶细胞间相互作用的亲和力，其适配体序列及其平衡解离常数如表1所示。
表1适配体序列及其平衡解离常数
Figure BDA0002106181510000121
实施例7
以N-cadherin细胞为阳性细胞，CHO/K1细胞系为对照细胞，利用流式技术考察了所筛选到的序列对不同细胞之间的特异性作用。将已培养两天而且生长状态良好的N-cadherin、CHO/K1、293T、Ca Ski、H460、Hep G2、KB、K562、GIST 882、Hela和MCF-7细胞利用0.25％的胰酶消化，然后弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液并将细胞吹打均匀后进行细胞计数，调整细胞悬液至4X105/ml。将0.5ml细胞悬液在1000rpm条件下离心5min去除培养基，然后加入100ul 2X结合缓冲液以及100ul 500nM的荧光修饰的不同轮数的筛选库，4℃条件下进行孵育50min，然后用700ul洗涤缓冲液进行离心清洗，并加入350ul洗涤缓冲液进行流式分析。结果如表2所示，表明所筛选到的序列与构建的阳性细胞系具有较强的特异性作用。
表2核酸适配体序列与构建的阳性细胞系的特异性作用
Figure BDA0002106181510000122
Figure BDA0002106181510000131
实施例8
通过水热合成法合成100nm左右的Fe3O4磁性纳米颗粒，在其表面进行硅烷化修饰，然后利用带有功能基团的抗粘附分子甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)和甲基丙烯酸(MAA)以及含双硫键的交联剂(BACy)在其表面修饰上抗粘附水凝胶层。
将修饰了抗粘附水凝胶层的磁珠分散于具有活化羧基的偶联试剂EDC和NHS的PBS溶液中，常温反应20-90min后，PBS清洗，然后加入0.00005-0.0001w/v％的链霉亲和素，常温过夜反应，清洗后加入生物素修饰的N-Cadherin适配体，避光保存于4℃冰箱中备用。
以N-Cadherin阳性的海拉细胞株Hela为模型细胞，考察了不同修饰的磁珠对癌细胞的捕获行为。将培养48h而且生长状态良好的Hela细胞利用0.25％的胰酶消化，然后弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液将细胞吹打均匀并进行细胞计数，调整细胞悬液至105/ml。将已不同修饰后的纳米磁珠与1ml上述的细胞悬液，在细胞培养箱中孵育20min后，用PBS清洗3-5次然后进行计数。图10和图11为不同修饰后的磁珠对Hela细胞的捕获行为以及与磁珠作用后的细胞荧光图。实验结果表明，不修饰抗粘附分子的磁珠对癌细胞有一定的粘附行为，而SBMA形成的水凝胶层包覆后的磁珠具有很好的抗粘附性能，适配体序列修饰的纳米磁珠对癌细胞有很好的选择性和较高的捕获效率。同时，该磁珠具有良好的生物相容性，可以保持细胞的活性。
综上所述，藉由本发明的上述技术方案，本发明构筑了具有良好细胞相容性的纳米磁珠，该磁珠具有较高的细胞捕获特异性和灵敏度，以及鉴定能力，同时制备方法简单，可大量制备。
此外，本案发明人还参照实施例1的方式，以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验，并同样构建了表达不同目的蛋白的高表达细胞系，该构建细胞系的方法具有很好的适用性。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。
Figure BDA0002106181510000151
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所；北京三三万生科技有限公司
<120> 基于工程化细胞的N-cadherin核酸适配体的筛选及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ataccagctt attcaattga gtaagagtgc actatgtttt agctagggtt ccctccggag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
ttgcactatg ttttagctag ggttccctcc ggagatagta agtgcaa 47

Claims (12)

1.一种N-cadherin核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的N-cadherin核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的N-cadherin核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的两端任选为荧光分子、生物素基团修饰。
4.一种用于捕获循环肿瘤细胞的捕获试剂，其特征在于，所述捕获试剂包含权利要求1至3中任一所述的N-cadherin核酸适配体。
5.如权利要求4所述的捕获试剂，其特征在于，所述捕获试剂还包括固相载体，所述N-cadherin核酸适配体被连接在固相载体上。
6.如权利要求5所述的捕获试剂，其特征在于，所述固相载体包括磁珠。
7.一种N-cadherin核酸适配体的筛选方法，其特征在于包括：
利用慢病毒体系对CHO/K1细胞进行细胞转染，获得N-cadherin稳定表达的N-cadherin细胞系，用于靶细胞的正筛选；
选取未进行转染的CHO/K1细胞系作对照细胞，用于靶细胞的负筛选；
利用Cell-SELEX技术进行N-cadherin核酸适配体的筛选。
8.一种循环肿瘤细胞的捕获方法，其特征在于，所述方法包括：
使循环肿瘤细胞与权利要求1～3中任一所述的N-cadherin核酸适配体接触，其中所述N-cadherin核酸适配体的两端设置标识部分；以及
使所述N-cadherin核酸适配体与N-cadherin稳定表达的循环肿瘤细胞特异性结合而捕获循环肿瘤细胞。
9.根据权利要求8所述的捕获方法，其特征在于具体包括：
对磁珠表面进行硅烷化修饰，然后利用甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱和甲基丙烯酸以及交联剂BACy在磁珠表面修饰抗粘附水凝胶层；以及
利用所述抗粘附水凝胶层将所述N-Cadherin适配体序列修饰到磁珠上。
10.根据权利要求9所述的捕获方法，其特征在于具体包括：将表面修饰有抗粘附水凝胶层的磁珠分散于包含EDC和NHS的PBS溶液中，常温反应后再加入链霉亲和素进行反应，之后与生物素修饰的所述N-cadherin适配体反应。
11.根据权利要求9或10所述的捕获方法，其特征在于：所述磁珠包括通过水热合成法合成的Fe3O4磁性纳米颗粒。
12.权利要求1至3中任一所述的N-cadherin核酸适配体在制备能够特异性识别和/或捕捉循环肿瘤细胞的产品中的应用。
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