CN111088323A - 筛选跨膜靶蛋白适配体的细胞selex方法及跨膜靶蛋白适配体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种筛选跨膜靶蛋白适配体的GAIN‑LOSS细胞SELEX方法及跨膜靶蛋白适配体及其应用,该方法包括以下步骤:S1.采用具有跨膜靶蛋白的表达的初始细胞系构建所述跨膜靶蛋白过表达的GAIN正选细胞系和所述跨膜靶蛋白敲除的LOSS反选细胞系;S2.将所述GAIN正选细胞系作为目标靶分子,将所述LOSS反选细胞系作为消减靶分子进行GAIN‑LOSS细胞SELEX筛选。该方法能够有效地在活细胞状态下针对各种跨膜靶蛋白筛选出具有高特异性和亲和力的活性适配体。
Description
技术领域
本公开涉及一种筛选跨膜靶蛋白适配体的GAIN-LOSS细胞SELEX方法及跨膜靶蛋白适配体及其应用。
背景技术
核酸适体(Nucleic acid aptamers)是采用指数富集配体的系统进化技术(SELEX)从随机单链核酸库中筛选出的能与不同靶分子高特异性、高亲和力结合的单链DNA或RNA。核酸适体通过特定的空间构象,与靶分子相互作用而发生特异性结合,与抗原-抗体结合的原理相似且与靶分子的亲和力可与抗原-抗体相当。核酸适体可以通过人工体外筛选和合成,具有快速获得、易于制备及稳定性可控的优势。此外,不论是细胞、动物及临床试验中,迄今均未发现核酸适体具有明显的毒性和免疫原性。因此,核酸适体被认为是可与抗体相媲美的分子,在疾病的诊断和治疗方面极具应用前景。2004年12月,第一个获得美国FDA批准上市的核酸适体药物Macugen是一种能特异性结合并阻断VEGF165功能的核酸适体,它能抑制VEGF信号转导通路,可有效抑制新生血管的生成,主要用于治疗老年性视网膜黄斑营养不良等。
通过指数富集配体的系统进化技术(SELEX)能够筛选出对应大多数靶蛋白的适体。然而,越来越多的证据表明,针对纯化的膜蛋白筛选出来的适体在细胞状态下失去识别靶蛋白的能力。
细胞SELEX(cell-SELEX)是将整个细胞作为靶标筛选特异性核酸适体的技术。通常是将相应细胞系被用作靶标,以获得可将靶细胞从其他细胞中区分开的核酸适体。但是,采用细胞SELEX技术筛选出来的适体对蛋白质是非特异性的,即细胞系中任何高表达水平的蛋白质都可能是适体的靶分子。
因此,有必要开发一种创新的细胞SELEX方法,以筛选出能够特异性识别并结合细胞中指定跨膜靶蛋白的适配体。
发明内容
本公开的目的是提供一种筛选跨膜靶蛋白适配体的GAIN-LOSS细胞SELEX方法及跨膜靶蛋白适配体及其应用,该方法能够有效地针对各种跨膜靶蛋白筛选出具有高特异性和亲和力的活性适配体。
为了实现上述目的,本公开第一方面:提供一种筛选跨膜靶蛋白适配体的GAIN-LOSS细胞SELEX方法,该方法包括以下步骤:
S1.采用具有跨膜靶蛋白的表达的初始细胞系构建所述跨膜靶蛋白过表达的GAIN正选细胞系和所述跨膜靶蛋白敲除的LOSS反选细胞系;
S2.将所述GAIN正选细胞系作为目标靶分子,将所述LOSS反选细胞系作为消减靶分子进行GAIN-LOSS细胞SELEX筛选。
可选地,步骤S1中,所述GAIN正选细胞系的所述跨膜靶蛋白的表达量与所述初始细胞系的所述跨膜靶蛋白的表达量的比值为(20~100):1,所述LOSS反选细胞系的所述跨膜靶蛋白的表达量为0。
可选地,步骤S1中,所述GAIN正选细胞系通过将跨膜靶蛋白基因转导到所述初始细胞系进行构建;
所述LOSS反选细胞系通过CRISPR-Cas9基因组编辑将所述初始细胞系的跨膜靶蛋白基因敲除的方式进行构建。
可选地,步骤S2中,所述GAIN-LOSS细胞SELEX筛选包括以下步骤:
S201.将所述GAIN正选细胞系与随机ssDNA文库混合进行阳性孵育,去除未与所述GAIN正选细胞系结合的ssDNA,得到正向筛选的适配体文库;
S202.将所述LOSS反选细胞系与所述正向筛选的核酸适体文库混合进行阴性孵育,收集未与所述LOSS反选细胞系结合的ssDNA,得到反向筛选的适配体文库;
S203.PCR扩增所述反向筛选的适配体文库,并制备ssDNA候选物文库;
S204.将所述ssDNA候选物文库代替所述随机ssDNA文库返回步骤S201并循环进行步骤S201至S203的操作。
可选地,步骤S201中,所述随机ssDNA文库为:
5'-保守区-(n)x-保守区-3';
其中保守区为18~21个核苷酸,x为20~70的整数,n各自独立地为A、T、C或G。
可选地,步骤S204中,步骤S201至S203的循环次数为4~30轮。
可选地,步骤S201中,所述阳性孵育的条件为:温度为4~37℃,时间为1~2h;
步骤S202中,所述阴性孵育的条件为:温度为4~37℃,时间为1~2h;
随着循环次数的增加,所述阳性孵育的时间逐渐缩短,所述阴性孵育的时间逐渐增长。
可选地,该方法还包括:
对GAIN-LOSS细胞SELEX筛选后得到的适配体候选物进行跨膜靶蛋白特异性和/或跨膜靶蛋白亲和力的测定。
本公开第二方面:提供由本公开第一方面所述的方法筛选得到的跨膜靶蛋白适配体。
本公开第三方面:提供本公开第二方面所述的跨膜靶蛋白适配体在制备疾病诊断和/或治疗药物中的应用。
通过上述技术方案,本公开采用具有一定跨膜靶蛋白表达量的初始细胞系构建GAIN正选细胞系和LOSS反选细胞系,并进一步进行GAIN-LOSS细胞SELEX筛选,能够针对特定的需要靶向的跨膜蛋白筛选得到具有高特异性和亲和力的活性适配体,在靶向治疗方面具有重要的意义。采用本公开的方法筛选得到的适配体可用于制备各种疾病的诊断和/或治疗药物,具有广阔的应用前景。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本公开,但并不构成对本公开的限制。在附图中:
图1是为实施例中对GAIN正选细胞系和LOSS反选细胞系的验证结果;其中,a为具有IRES-ZsGreen1质粒的MDA-MB-231细胞系的FACS分析图,FL1代表GFP通道,FL2代表自动荧光控制;b为MDA-MB-231细胞系中的PD-L1的mRNA表达水平的实时PCR分析图,M代表分子量标记,loss代表靶蛋白敲除的细胞系,WT代表野生型,gain代表靶蛋白过表达的细胞系;c为MDA-MB-231细胞系中的PD-L1表达水平的Western印迹分析图,loss代表靶蛋白敲除的细胞系,WT代表野生型,gain代表靶蛋白过表达的细胞系;d为靶蛋白敲除的细胞系中PD-L1的基因组测序,WT代表野生型;e为细胞膜上PD-L1表达水平的流式细胞术分析图,由左往右的曲线依次为PD-L1敲除的细胞系、对照细胞系和PD-L1过表达的细胞系;f为PD-L1蛋白定位的荧光共聚焦分析,gain代表靶蛋白过表达的细胞系,WT代表野生型,loss代表靶蛋白敲除的细胞系。
图2是GAIN-LOSS细胞SELEX筛选的流程示意图。
图3是实施例中采用流式细胞术测定的不同筛选轮数的ssDNA文库与靶细胞的结合力结果,从左至右依次为第0轮(即筛选前)、第6轮和第10轮。
图4是实施例中筛选得到的代表性适配体候选物的表征结果,a为适配体候选物与细胞上PD-L1的结合和定位,Aptamer1代表适配体候选物1,Aptamer3代表适配体候选物3,Aptamer18代表适配体候选物18;b为适配体候选物与靶细胞结合的解离常数曲线。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开,并不用于限制本公开。
本公开第一方面:提供一种筛选跨膜靶蛋白适配体的GAIN-LOSS细胞SELEX方法,该方法包括以下步骤:
S1.采用具有跨膜靶蛋白的表达的初始细胞系构建所述跨膜靶蛋白过表达的GAIN正选细胞系和所述跨膜靶蛋白敲除的LOSS反选细胞系;
S2.将所述GAIN正选细胞系作为目标靶分子,将所述LOSS反选细胞系作为消减靶分子进行GAIN-LOSS细胞SELEX筛选。
本公开采用具有一定跨膜靶蛋白表达量的初始细胞系构建GAIN正选细胞系和LOSS反选细胞系,并进一步进行GAIN-LOSS细胞SELEX筛选,能够针对特定的需要靶向的跨膜蛋白筛选得到具有高特异性和亲和力的活性适配体,在靶向治疗方面具有重要的意义。
根据本公开,步骤S1中,所述初始细胞系中,所述跨膜靶蛋白的表达量没有特殊的限制。
根据本公开,步骤S1中,所述GAIN正选细胞系为将所述初始细胞系进行跨膜靶蛋白过表达所得到的细胞系。进一步地,所述GAIN正选细胞系的所述跨膜靶蛋白的表达量与所述初始细胞系的所述跨膜靶蛋白的表达量的比值可以为(20~100):1。所述LOSS反选细胞系为将所述初始细胞系进行跨膜靶蛋白敲除所得到的细胞系,即,所述LOSS反选细胞系的所述跨膜靶蛋白的表达量为0。
根据本公开,步骤S1中,所述GAIN正选细胞系可以通过本领域技术人员熟知的方法构建。例如,所述GAIN正选细胞系可以通过将跨膜靶蛋白基因转导到所述初始细胞系进行构建。
进一步地,所述GAIN正选细胞系可以通过如下步骤进行构建:将所述跨膜靶蛋白的基因整合到表达载体上,得到过表达载体;然后,将所述过表达载体转染至所述初始细胞系,一定时间后,收集阳性转染的细胞,得到所述GAIN正选细胞系。其中,所述表达载体可以为质粒、腺病毒、慢病毒或逆转录病毒。所述转染可以为电转染、脂质体转染或磷酸钙转染。
根据本公开,步骤S1中,所述LOSS反选细胞系也可以通过本领域的常规方法构建。例如,所述LOSS反选细胞系可以通过CRISPR-Cas9基因组编辑将所述初始细胞系的跨膜靶蛋白基因敲除的方式进行构建。CRISPR-Cas9基因组编辑技术的原理和操作步骤为本领域技术人员所熟知,例如可以参考文献(Bauer,D.E.,M.C.Canver and S.H.Orkin(2015)."Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9."JVis Exp(95):e52118.)中的方法进行操作,本公开不再赘述。
根据本公开,步骤S2中,所述GAIN-LOSS细胞SELEX筛选的含义和流程为本领域技术人员所熟知。在本公开的一种具体实施方式中,参考图2,所述GAIN-LOSS细胞SELEX筛选可以包括以下步骤:
S201.将所述GAIN正选细胞系与随机ssDNA文库混合进行阳性孵育,去除未与所述GAIN正选细胞系结合的ssDNA,得到正向筛选的适配体文库;
S202.将所述LOSS反选细胞系与所述正向筛选的核酸适体文库混合进行阴性孵育,收集未与所述LOSS反选细胞系结合的ssDNA,得到反向筛选的适配体文库;
S203.PCR扩增所述反向筛选的适配体文库,并制备ssDNA候选物文库;
S204.将所述ssDNA候选物文库代替所述随机ssDNA文库返回步骤S201并循环进行步骤S201至S203的操作。
进一步地,步骤S201中,所述随机ssDNA文库的来源没有特殊的限制,可以合成得到,也可以商购得到。所述随机ssDNA文库可以包括两端的保守区和中间的随机序列区,即表示为:
5'-保守区-(n)x-保守区-3';其中保守区通常为18~21个核苷酸,是PCR扩增文库时的引物结合区,随机序列区x可以为20~70的整数,x个n中的每一个n各自独立地为A、T、C或G。
此外,在筛选中还需相应的引物用于扩增ssDNA,所述引物包括正向引物和反向引物,
所述正向引物可以为:5'-FITC-atccagagtgacgcagca-3'(SEQ ID NO.1);
反向引物可以为:5'-biotin-actaagccaccgtgtcca-3'(SEQ ID NO.2)。
在与所述GAIN正选细胞系混合前,可以先对所述随机ssDNA文库进行预处理,例如可以将所述随机ssDNA文库溶解在结合缓冲液中,并在95℃下进行变性处理5~10min,随即在0℃下进行冷却处理10~20min,然后再进行步骤S201的操作。
进一步地,步骤S201中,所述阳性孵育的条件可以为:温度为4~37℃,时间为1~2h。步骤S202中,所述阴性孵育的条件可以为:温度可以为4~37℃,时间为1~2h。步骤S203中,所述PCR扩增的条件可以为常规的,例如可以包括:变性、退火和延伸。
为了达到理想的筛选效果,步骤S204中,步骤S201至S203的循环次数可以为4~30轮,直到所得ssDNA候选物文库与GAIN正选细胞系的结合力达到饱和即可终止筛选。此外,随着循环次数的增加,所述阳性孵育的时间可以逐渐缩短,所述阴性孵育的时间可以逐渐增长。
根据本公开,通过GAIN-LOSS细胞SELEX筛选后,可以得到所述跨膜靶蛋白的适配体候选物,接着,可对该候选物进行分析,从而得到经验证的具有跨膜靶蛋白特异性和/或跨膜靶蛋白亲和力的跨膜靶蛋白适配体。因此,该方法还可以包括:对GAIN-LOSS细胞SELEX筛选后得到的适配体候选物进行跨膜靶蛋白特异性和/或跨膜靶蛋白亲和力的测定。所述跨膜靶蛋白特异性和/或跨膜靶蛋白亲和力的测定方法可以为本领域常规的,本公开不再赘述。
本公开第二方面:提供由本公开第一方面所述的方法筛选得到的跨膜靶蛋白适配体。
本公开第三方面:提供本公开第二方面所述的跨膜靶蛋白适配体在制备疾病诊断和/或治疗药物中的应用。
以下通过以PD-L1作为跨膜靶蛋白的实施例对本公开进行进一步地详细说明。PD-L1参与控制T细胞活化,靶向和阻断PD-L1对T细胞的抑制作用能够增强患者的抗肿瘤免疫应答,是一种重要的免疫治疗方法。因此,在以下实施例中,使用PD-L1和三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系MDA-MB-231来说明本公开的方法。
实施例
慢病毒系统的辅助质粒(pLP1,pLP2和pLP/VSVG)和慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1购自Youbio公司。Human PD-L1/B7-H1/CD274Gene ORF cDNA克隆表达质粒购自Sino Bio公司。通过PCR,使用一对引物(F:ccgctcgaggccaccatgaggatatttgctgtc(SEQ IDNO.3);R:aaggaaaaaagcggccgcttacgtctcctccaaatg(SEQ ID NO.4))从人PD-L1/B7-H1/CD274Gene ORF cDNA表达质粒克隆PD-L1基因。通过标准分子克隆构建pLVX-PD-L1-IRES-ZsGreen1质粒。慢病毒载体pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro(sgRNA:tcccaaggacctatatg(SEQ ID NO.5))购自Applied Biological Materials(ABM)公司。通过HiPrue Plasmid EF Micro试剂盒制备所有质粒,并通过Nanodrop检查质粒的质量以确保A260/A280为1.8~2.0。
构建具有PD-L1过表达的TNBC细胞系GAINMDA-MB-231:
HEK 293T细胞和MDA-MB-231细胞(来自ATCC)在补充有10%胎牛血清(FBS)和100单位/mL青霉素-链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM,Gibco)中培养。在100mm培养皿中,将四种质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pLVX-PD-L1-IRES-ZsGreen1混合并一起转染的HEK 293T细胞中。转染后48小时,以3000rpm/10分钟收集293T培养物上清液,得到慢病毒。将200μl慢病毒与106个MDA-MB-231细胞共培养用于转染,转染后48小时观察到ZsGreen荧光信号。4天后,将MDA-MB-231细胞重悬于500μl分选缓冲液(含有1%FBS的PBS)中,以达到每mL分选缓冲液约106个细胞的终浓度。数据采集后,在Bio-rad S3e细胞分选仪上使用100μm喷嘴分选并收集具有高ZsGreen信号的细胞,得到GAIN正选细胞系。图1a为根据ZsGreen强度收集的转导的MDA-MB-231细胞系,由图1b可见,PD-L1的mRNA转录显着增加,由图1c可见,PD-L1蛋白过度表达。GAIN正选细胞系的PD-L1表达量与初始MDA-MB-231细胞系的PD-L1表达量的比值为30:1。
构建具有PD-L1敲除的TNBC细胞系LOSSMDA-MB-231:
按照与构建GAIN正选细胞系相同的方法制备慢病毒。将200μl慢病毒与106个MDA-MB-231细胞共培养用于感染。3天后,用含有3μg/ml嘌呤霉素的完全DMEM对感染MDA-MB-231细胞的培养基进行换液。7天后,将剩余的细胞稀释入具有不同细胞密度的三个100mm培养皿(每个培养皿分别为300、3000或30000个细胞)。15天后,在最低细胞密度培养皿中观察到清晰分布的克隆体。用200μL枪头挑取24个克隆体并转移到的96孔板中用于细胞扩增。通过蛋白质印迹测定每个克隆体的PD-L1表达水平,得到LOSS反选细胞系。图1b可见,LOSS反选细胞系中PD-L1的mRNA水平很低。由图1d可见,通过测序确认,LOSS反选细胞系中PD-L1基因产生移码突变。由由图1e和图1f可见,PD-L1蛋白被消耗。LOSS反选细胞系的PD-L1表达量为0。
GAIN-LOSSGAIN-LOSS细胞SELEX筛选:
合成随机ssDNA文库:
5'-atccagagtgacgcagca-(n)25-tggacacggtggcttagt-3'(SEQ ID NO.6),每一个n各自独立地为A、T、C或G;
正向引物:5'-FITC-atccagagtgacgcagca-3'(SEQ ID NO.7);
反向引物:5'-biotin-actaagccaccgtgtcca-3'(SEQ ID NO.8)。
通过HPLC纯化。
将上述随机ssDNA文库溶解在结合缓冲液中,在95℃下变性5min并在冰上冷却10min后,在100mm培养皿中与GAIN正选细胞系混合进行阳性孵育,在4℃下培养2h。除去上清液,用洗涤缓冲液洗涤细胞并转移至500μL水中,在95℃加热10min收集得到细胞结合的DNA。将该细胞结合的DNA用作模板,用FAM标记的正向引物和生物素标记的反向引物通过PCR制备进化的DNA库(95℃,30秒,58℃,30秒,72℃,30秒,72℃,5分钟,6~14个循环)。然后通过链霉抗生物素蛋白包被的琼脂糖珠(GE Healthcare)将dsDNA产物与PCR溶液分离。在用0.2M NaOH处理后,将FAM标记的ssDNA与另一条链分离,脱盐并冻干用于下一轮筛选。从第三轮开始,首先将上一轮得到的ssDNA文库与60mm培养皿中的LOSS反选细胞系混合进行阴性孵育,在4℃下培养1h。然后收集未结合的ssDNA并将其应用于GAIN正选细胞系。随着选择轮数的增加,阳性孵育时间从2h缩短至1h,洗涤时间也延长为2~3倍;同时,阴性孵育时间从1h逐渐增加到2h。循环10轮后,将从富集最后一轮的ssDNA文库进行PCR扩增,然后使用Illumina MiSeq(Sangon Biotech公司)进行高通量测序。
筛选过程中采用流式细胞术检测筛选文库的富集情况:
将跨膜靶蛋白和对照细胞离心并洗涤,然后重悬于结合缓冲液(3×105个细胞/100μL)中。将50μL细胞移液到不同的流式细胞仪管中。将50μLssDNA加入到每个试管中。具有10%FBS的未筛选的DNA文库用作阴性对照库。将混合物在冰上孵育30分钟。将细胞洗涤两次并重悬于200μL结合缓冲液中。检测跨膜靶蛋白和对照细胞的FAM荧光强度。由图3可见,在第6轮筛选后得到的候选物文库具有较高的跨膜靶蛋白亲和力。
所得到的代表性适配体候选物的序列见表1。
表1
测定适配体候选物的跨膜靶蛋白特异性:
用N-末端FAM修饰合成50个代表性适配体候选物和1个作为阴性对照的随机序列(RS)。使用流式细胞术结合测定法测定1μM的每种适配体/RS对MDA-MB-231细胞和肝细胞/PBMC的特异性,结果见图4a。当与MDA-MB-231结合时,适配体候选物显示出比对肝细胞/PBMC更高的荧光强度。
测定适配体候选物的在体外对MDA-MB-231的亲和力:
使用适配体候选物和具有不同浓度的RS(0.1nM,5nM,10nM,50nM,100nM和500nM),通过流式细胞术结合测定法来测定。根据每种浓度下的荧光强度绘制结合曲线,并计算解离常数(Kd),结果见图4b,可见适配体候选物显示出对跨膜靶蛋白具有高的结合亲和力(纳摩尔水平)。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式,但是,本公开并不限于上述实施方式中的具体细节,在本公开的技术构思范围内,可以对本公开的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本公开的思想,其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 北京和理咨询有限公司
<120> 筛选跨膜靶蛋白适配体的细胞SELEX方法及跨膜靶蛋白适配体及其应用
<130> 11441HLZX
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccagagtg acgcagca 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actaagccac cgtgtcca 18
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgctcgagg ccaccatgag gatatttgct gtc 33
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaggaaaaaa gcggccgctt acgtctcctc caaatg 36
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcccaaggac ctatatg 17
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(43)
<223> n各自独立地为A、T、C或G
<400> 6
atccagagtg acgcagcann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntggacac ggtggcttag 60
t 61
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atccagagtg acgcagca 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actaagccac cgtgtcca 18
<210> 9
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atccagagtg acgcagcagc aggagaatgc agatcccagg ttgtggacac ggtggcttag 60
t 61
<210> 10
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atccagagtg acgcagcatc ccaggagaaa gcagatcccc agatggacac ggtggcttag 60
t 61
<210> 11
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atccagagtg acgcagcaag attagaatgc agataatacc atgtggacac ggtggcttag 60
t 61
Claims (10)
1.一种筛选跨膜靶蛋白适配体的GAIN-LOSS细胞SELEX方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
S1.采用具有跨膜靶蛋白的表达的初始细胞系构建所述跨膜靶蛋白过表达的GAIN正选细胞系和所述跨膜靶蛋白敲除的LOSS反选细胞系;
S2.将所述GAIN正选细胞系作为目标靶分子,将所述LOSS反选细胞系作为消减靶分子进行GAIN-LOSS细胞SELEX筛选。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤S1中,所述GAIN正选细胞系的所述跨膜靶蛋白的表达量与所述初始细胞系的所述跨膜靶蛋白的表达量的比值为(20~100):1,所述LOSS反选细胞系的所述跨膜靶蛋白的表达量为0。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤S1中,所述GAIN正选细胞系通过将跨膜靶蛋白基因转导到所述初始细胞系进行构建;
所述LOSS反选细胞系通过CRISPR-Cas9基因组编辑将所述初始细胞系的跨膜靶蛋白基因敲除的方式进行构建。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤S2中,所述GAIN-LOSS细胞SELEX筛选包括以下步骤:
S201.将所述GAIN正选细胞系与随机ssDNA文库混合进行阳性孵育,去除未与所述GAIN正选细胞系结合的ssDNA,得到正向筛选的适配体文库;
S202.将所述LOSS反选细胞系与所述正向筛选的核酸适体文库混合进行阴性孵育,收集未与所述LOSS反选细胞系结合的ssDNA,得到反向筛选的适配体文库;
S203.PCR扩增所述反向筛选的适配体文库,并制备ssDNA候选物文库;
S204.将所述ssDNA候选物文库代替所述随机ssDNA文库返回步骤S201并循环进行步骤S201至S203的操作。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,步骤S201中,所述随机ssDNA文库为:
5'-保守区-(n)x-保守区-3';
其中保守区为18~21个核苷酸,x为20~70的整数,n各自独立地为A、T、C或G。
6.根据权利要求4所述的方法,其中,步骤S204中,步骤S201至S203的循环次数为4~30轮。
7.根据权利要求4~6中任意一项所述的方法,其中,步骤S201中,所述阳性孵育的条件为:温度为4~37℃,时间为1~2h;
步骤S202中,所述阴性孵育的条件为:温度为4~37℃,时间为1~2h;
随着循环次数的增加,所述阳性孵育的时间逐渐缩短,所述阴性孵育的时间逐渐增长。
8.根据权利要求1所述的方法,其中,该方法还包括:
对GAIN-LOSS细胞SELEX筛选后得到的适配体候选物进行跨膜靶蛋白特异性和/或跨膜靶蛋白亲和力的测定。
9.由权利要求1~8中任意一项所述的方法筛选得到的跨膜靶蛋白适配体。
10.权利要求9所述的跨膜靶蛋白适配体在制备疾病诊断和/或治疗药物中的应用。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200501 |
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