CN113699157B - Pd-l1核酸适配体、其筛选方法及应用 - Google Patents

Pd-l1核酸适配体、其筛选方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PD‑L1核酸适配体、其筛选方法及应用。所述PD‑L1核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。所述筛选方法包括：利用慢病毒体系对CHO‑K1细胞进行细胞转染，获得PD‑L1稳定高表达的PD‑L1细胞系，用于靶细胞的正筛选；选取未进行转染的CHO/K1细胞作对照细胞，用于靶细胞的负筛选；利用Cell‑SELEX技术进行PD‑L1核酸适配体的筛选。本发明的PD‑L1核酸适配体能与PD‑L1高表达细胞系特异性结合，同时能够阻断PD‑1与PD‑L1的相互作用，从而拮抗由PD‑1/PD‑L1信号通路介导的免疫抑制作用，具有一定的肿瘤抑制作用。

Description

PD-L1核酸适配体、其筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及一种核酸适配体，尤其涉及一种基于工程化细胞的PD-L1核酸适配体及其筛选方法与应用，例如在肿瘤免疫抑制中的应用，属于肿瘤治疗学技术领域。
背景技术
核酸适配体，也被称为核酸适体、适配子等，是从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲合性和高特异性地与各种靶标结合的单链寡核苷酸。最早是由Szostak和Gold两个小组几乎同时提出。1990年，Ellington和Szostak报道了能结合小分子有机染料的RNA片段，并将其命名为Aptamer。适配体(aptamer)是指利用指数富集的配基系统进化(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，SELEX)技术，从人工合成的寡核苷酸文库中筛选得到的具有亲和性高、特异性强的能够与靶分子特异性结合的短的单链DNA和RNA分子。
免疫疗法已经成为用于肿瘤治疗的一种重要手段，针对免疫检查点分子CTLA-4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen)的单克隆抗体的获批，标志着肿瘤免疫治疗的到来，但是CTLA-4由于其毒副作用，在临床上的应用受到了限制。程序性死亡受体1(Programmed cell death 1)和程序性死亡配体1(Programmed cell death ligand 1)是重要的负性免疫调节因子，是最新发现的另一个具有抑制作用的免疫检查点。T细胞表面PD1受体与肿瘤细胞表面表达的PD-L1配体结合，向细胞内传递调控信号，抑制T细胞活化与增殖，从而介导肿瘤细胞的免疫逃逸及对常规放化疗的抵抗。T细胞表面受体PD1与其配体PD-L1结合后，招募蛋白酪氨酸磷酸酶1(src homology region 2 domain-containingphosphatase-1,SHP-1)和SHP-2，生成一个阻滞信号抑制下游效应PI3K/Akt通路的磷酸化以及mTOR和ERK2的活化，促进CD4+Foxp3-T细胞向CD4+Foxp3+Tregs分化。PD1为Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量50～55kD，PD-L1是由290个氨基酸组成的I类跨膜蛋白，由Cd274基因编码，定位在9号染色体上(9P24.2)。Cd274有7外显子，第一个外显子不编码蛋白，只包括5’UTR(Untranslated Regions)序列。2-4个外显子分别编码信号肽，IgV结构域，IgC结构域。跨膜蛋白由外显子5，6编码，外显子7编码胞内结构域和3’UTR序列。PD-1的胞内段较短，大约由30个氨基酸组成，且具有高度同源性属于免疫球蛋白超家族B7-CD28中的一员，是重要的免疫抑制受体，主要表达于活化的T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞以及间充质干细胞。
PD1是维持自身耐受性的重要因子，在生理条件下PD1通过T细胞(抗原)受体TCR(Tcell receptor)识别抗原，调节外周组织中T细胞的功能，调控机体对外来或自身抗原的免疫应答反应，防止免疫相关疾病的发生。PD1分子具有两种配体分子，即为PD-L1和PD-L2，但是PD-L2配体的表达比较受限，仅仅在一些造血细胞和抗原呈递细胞中进行表达，如树突状细胞和活化的巨噬细胞；PD-L1(B7-H1)，也称为CD274，由CD274基因编码，是分子量为40kD的细胞表面糖蛋白，属于B7家族。研究发现，PD-L1配体在大多数的组织和细胞中均能够进行大量的表达，例如抗原提呈细胞(antigenpresenting cell,APC)、活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、胎盘滋养层细胞、心脏内皮细胞和胸腺皮质上皮细胞。而并且PD-L1在癌细胞中的表达远高于在正常细胞中的表达，包括非小细胞肺癌、黑色素瘤、胃癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌等，同时也是维持外周耐受的关键参与者。PD-L1对T细胞的抑制作用更强，亲和力更强，对激活T细胞的影响更深远，阻断PD-L1对T细胞的激活作用也更加明显，是主要的抑制性受体。
因此，如何对PD-L1核酸适配体的筛选方法进行优化，寻求一种具有肿瘤抑制功能的PD-L1拮抗性DNA适配体，从而开发一种新的补充疗法，已然成为业界研究人员长期以来一直努力的方向。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种PD-L1核酸适配体，以克服现有技术中的不足。
本发明的另一目的还在于提供一种基于工程化细胞系的PD-L1核酸适配体的筛选方法及应用。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种PD-L1核酸适配体，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明实施例还提供了一种PD-L1核酸适配体的筛选方法，其包括：
利用慢病毒体系对CHO-K1细胞进行细胞转染，获得PD-L1稳定高表达的PD-L1细胞系，用于靶细胞的正筛选；
选取未进行转染的CHO/K1细胞作对照细胞，用于靶细胞的负筛选；
利用Cell-SELEX技术进行PD-L1核酸适配体的筛选。
本发明实施例还提供了前述的PD-L1核酸适配体在制备能够抑制肿瘤细胞生长的产品中的应用。
进一步地，所述产品至少具有能够特异性阻断PD-1与PD-L1的相互作用的功能。
进一步地，所述产品至少具有能够拮抗由PD-1/PD-L1信号通路介导的T细胞的抑制作用的功能。
本发明实施例还提供了一种抑制肿瘤细胞生长的产品，其包含前述的PD-L1核酸适配体。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
1)本发明提供了一种PD-L1核酸适配体的序列，基于所述PD-L1核酸适配体与PD-L1高表达的肿瘤细胞特异性结合，可以实现阻断与肿瘤浸润细胞表达的PD-1的结合，拮抗由PD-1/PD-L1信号通路介导的免疫抑制作用的目的，具有一定的肿瘤生长抑制作用；
2)由于膜蛋白质在提取纯化过程中分子构象和形态会发生变化，故以膜蛋白为靶标进行筛选的核酸适配体很难应于识别整体细胞，直接用高表达膜蛋白的工程化细胞系进行筛选，在筛选的过程中可以保持蛋白的天然构象，进而可以借助与膜蛋白的相互作用，对全细胞进行识别；
3)在细胞系的筛选中，其对照细胞的选择尤为重要，而工程化细胞进行细胞筛选时，选择未转染的细胞系为对照细胞，对照条件更为严格，更有利于筛选针对相应膜蛋白的核酸适配体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施方案之中利用cell-SELEX方法筛选PD-L1适配体的示意图；
图2a是本发明实施例3中所筛选到的第十二轮富集库以及筛选文库m-Lib与对照细胞CHO-K1的共聚焦成像图；
图2b是本发明实施例3中所筛选到的第十二轮富集库以及筛选文库m-lib与靶细胞PD-L1的共聚焦成像图；
图3a是本发明实施例4中所筛选到的适配体候选序列PL1以及筛选文库m-Lib与靶细胞PD-L1的相互作用的流式验证图；
图3b是本发明实施例4中所筛选到的适配体候选序列PL1以及筛选文库m-lib与对照细胞CHO-K1的相互作用的流式验证图；
图4a是本发明实施例5中所筛选到的适配体PL1以及筛选文库m-Lib与对照细胞CHO-K1相互作用的共聚焦成像图；
图4b是本发明实施例5中所筛选到的适配体PL1以及筛选文库m-Lib与靶细胞PD-L1相互作用的共聚焦成像图；
图5是本发明实施例6中所筛选适配体PL1与靶细胞PD-L1细胞相互作用的亲和力数据图；
图6是本发明实施例7中候选适配体PL1序列特异性竞争PD-1与PD-L1相互作用的数据图；
图7a-图7b是本发明实施例8中所筛选适配体PL1对由PD-1/PD-L1信号通路介导的T细胞抑制的拮抗作用示意图；
图8a-图8b是本发明实施例9中所筛选适配体序列PL1对CT26荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制作用示意图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要致力于筛选到肿瘤抑制功能的PD-L1拮抗性DNA适配体，通过抑制PD-1和其配体PD-L1的结合，从而在一定程度上恢复T细胞的功能，从而开发一种新的补充疗法。
本发明提供了基于工程化细胞系的PD-L1核酸适配体的筛选方法，其包括：构建PD-L1表达质粒和高表达稳定细胞系，以及利用Cell-SELEX技术进行PD-L1核酸适配体的筛选。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例的一个方面提供了一种PD-L1核酸适配体，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具体为：5’-ATACCAGCTTATTCAATTGTAGAGTATAAAAAGAGTGATGATCTTTTGTAGGTTTTTTAGATAGTAAGTGCAATCT-3’。
进一步地，所述PD-L1核酸适配体的两端任选为硫代修饰，能够保留与靶标的结合力。
进一步地，所述PD-L1核酸适配体能够与PD-L1细胞特异性结合。
进一步地，所述PD-L1核酸适配体能够特异性阻断PD-1与PD-L1的相互作用。
进一步地，所述PD-L1核酸适配体能够拮抗由PD-1/PD-L1信号通路介导的T细胞的抑制作用，从而增强免疫系统的免疫能力。
进一步地，所述PD-L1核酸适配体能够对CT26荷瘤小鼠具有一定的肿瘤抑制效果。
本发明的PD-L1核酸适配体能够特异性识别PD-L1蛋白，阻断PD-1/PD-L1的相互作用，从而拮抗由该信号通路介导的免疫抑制作用，从而增强免疫系统的免疫能力，具有一定的肿瘤生长抑制作用。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种用于循环肿瘤细胞捕获的PD-L1高表达细胞系的核酸适配体的筛选方法，可以用于拮抗由PD-1/PD-L1信号通路介导的免役抑制作用，并具有一定的肿瘤生长抑制作用。
本发明的一种基于工程化细胞的PD-L1核酸适配体的筛选方法，其包括：
利用慢病毒体系对CHO-K1细胞进行细胞转染，获得PD-L1稳定高表达的PD-L1细胞系，用于靶细胞的正筛选；
选取未进行转染的CHO/K1细胞作对照细胞，用于靶细胞的负筛选；
利用Cell-SELEX技术进行PD-L1核酸适配体的筛选。
在一些优选实施例中，所述的筛选方法包括：利用载有PD-L1表达基因的三质粒包装系统进行非复制性病毒的包装，然后用包装的病毒对CHO-K1细胞进行转染，从而获得PD-L1稳定高表达的PD-L1细胞系，用于靶细胞的正筛选。
在一些更为优选实施例之中，一种基于工程化细胞的膜蛋白靶标PD-L1核酸适配体的筛选与应用，所述靶标的核酸适配体的筛选包括：
(1)利用Cell-SELEX技术进行适配体的筛选，选择稳定高表达PD-L1蛋白的细胞系为靶细胞进行正筛选，同时选取未进行转染的CHO-K1细胞系作对照细胞进行负筛选；
(2)利用流式细胞术对筛选进程进行监测，选择富集效果较好的筛选文库进行测序分析，从而选择可能的适配体候选序列；
(3)利用流式细胞术和共聚焦显微镜对所选取的适配体候选序列进行结合力和特异性的表征。
其中，步骤(1)包括：利用三质粒包装系统进行非复制性病毒的包装，然后用包装的病毒对的CHO-K1细胞进行转染，从而获得PD-L1高表达的细胞系，用于靶细胞的正筛选。
进一步地，步骤(2)包括：利用Cell-SELEX技术进行适配体的筛选，PD-L1高表达细胞系用作靶细胞进行正筛选，同时选取未感染的细胞系CHO-K1作对照细胞，进行负筛选，目的在于降低与靶标结合力弱或者非特异性结合的序列的富集，从而筛选到高亲和力和高特异性的适配体序列。
进一步地，步骤(3)具体包括：将步骤(2)所获得的适配体候选序列以及筛选库进行荧光基团的修饰，然后在4℃条件下与一定量的细胞进行孵育，洗涤缓冲液清洗三遍后进行流式分析和共聚焦成像分析。其中，筛选库用于做阴性对照。
更进一步地，所述的筛选方法包括：设计并合成包含40个随机碱基序列的单链DNA核酸文库作为起始筛选库，然后与靶细胞进行孵育后分离与靶细胞结合的序列，经PCR扩增后，制备单链DNA序列用作下一轮的筛选库；通过反复多轮的筛选，选择富集效果较好次级筛选库进行测序分析，并对测序的序列进行二级结构模拟，选择可能的适配体候选序列，然后进行进一步的亲和力和特异性的表征。
本发明一优选实施例中提供了一种基于基于工程化细胞系的DNA核酸适配体的筛选技术，其包括：
构建人PD-L1蛋白的表达质粒，并将利用慢病毒体系将表达质粒转染到CHO-K1细胞中进行表达，获得PD-L1稳定高表达细胞系，即PD-L1细胞。然后将PD-L1细胞作为靶细胞、CHO-K1细胞作为阴性对照细胞，利用Cell-SELEX技术进行DNA核酸适配体的筛选。
本发明研究人员发现，与PD-L1特异性结合的核酸适配体，核苷酸序列为SEQ IDNO：1。
在PD-L1核酸适配体的两端分别进行3个碱基的硫代修饰，可以提高适配体在含血清的PBS缓冲溶液中的稳定性。
经修饰后的PD-L1核酸适配体序列，能够保留其与PD-L1的结合能力，同时能够与鼠源细胞上表达的PD-L1蛋白进行结合，从而阻断PD-1/PD-L1之间的相互作用，发挥抗肿瘤生长抑制作用。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的PD-L1核酸适配体在制备能够抑制肿瘤细胞生长的产品中的应用。
进一步地，所述产品至少具有能够特异性阻断PD-1与PD-L1的相互作用的功能。
进一步地，所述产品至少具有能够拮抗由PD-1/PD-L1信号通路介导的T细胞的抑制作用的功能。
进一步地，所述产品至少具有能够激活并增强受抑制的肿瘤浸润效应T细胞的活性，从而抑制肿瘤的生长的功能。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种抑制肿瘤细胞生长的产品，其包含前述的PD-L1核酸适配体。
本发明利用所筛选到的PD-L1核酸适配体进行CT26荷瘤小鼠的肿瘤生长的抑制性效应研究，包括：
(1)对所筛选到的PD-L1核酸适配体进行修饰，以提高其血清稳定性。
(2)探究该PD-L1核酸适配体序列是否能够阻断PD-1/PD-L1之间的相互作用。
(3)探究该PD-L1核酸适配体序列是否能够拮抗由PD-1/PD-L1信号通路介导的T细胞抑制作用。
(4)探究该PD-L1核酸适配体序列对CT26荷瘤小鼠的肿瘤的生长抑制作用。
其中步骤(1)包括：将所筛选到的PD-L1序列两端的三个碱基进行硫代修饰，然后将一定量的修饰后的PD-L1核酸适配体序列置于含有10％胎牛血清的PBS溶液中，分别在0，6，12，24和48h利用超滤法测定溶液中适配体的含量。
其中步骤(2)包括：将100μL PD-L1蛋白(2μg/mL)置于96孔板，4℃放置过夜。PBS清洗3次后，用1％BSA溶液进行封闭2h，清洗后加入Fc标记的重组人PD-1蛋白(2μg/mL)，孵育1h。PBS清洗3次后，加入biotin修饰的适配体PL1序列在4℃孵育50min(终浓度分别为0、0.5、1、5、10和20μM)。PBS清洗后，加入绿色荧光修饰的抗PD-1的抗体检测孔板中PD-1重组蛋白的量。同时，利用辣根过氧化物酶修饰的牛血清白蛋白进行孔板中PL1序列的定量。
其中步骤(3)包括：取20mL健康人外周血，利用人外周血淋巴细胞提取试剂盒，分离出淋巴细胞，然后利用荧光修饰的抗CD4抗体与细胞进行孵育，清洗后利用流式分选仪进行CD4阳性T细胞的分选。将抗人CD3和CD28的抗体置于96孔板，其工作浓度为1μg/mL，并于4℃放置过夜。PBS清洗后，每个孔加入1×105个CD4阳性T细胞，然后分别加入100μL PD-L1蛋白(2μg/mL)。同时，在不同的处理组中分别加入抗人PD-L1抗体，同型对照，PD-L1适配体和随机链。
其中步骤(4)包括：首先检测所筛选到的适配体序列PD-L1是否能够与鼠源CT26细胞相互作用。将所筛选到的适配体进行绿色荧光修饰后，与2×105个CT26细胞在4℃环境下孵育50min后，离心清洗去除未结合序列，然后将细胞进行流式分析。在肿瘤生长抑制研究中，选择4-6周雌性Balb/c鼠，然后在皮下接种CT26肿瘤细胞，待种瘤至5mm时，设置5个不同的处理组，其中包括对照PBS组，人PD-L1抑制剂，同型对照，适配体和随机序列组，同时给予给药处理，给药间隔为48h，并记录小鼠的体重和肿瘤大小。
经以上研究得知，本发明获得的所述的筛选到的PD-L1核酸适配体序列可用抑制CT26荷瘤小鼠的肿瘤生长。
藉由上述技术方案，本发明提供的一种PD-L1核酸适配体的序列，基于所述PD-L1核酸适配体与PD-L1高表达的肿瘤细胞特异性结合，可以实现阻断与肿瘤浸润细胞表达的PD-1的结合，拮抗由PD-1/PD-L1信号通路介导的免疫抑制作用的目的，具有一定的肿瘤生长抑制作用。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，实施例中的试验方法均按照常规条件进行。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，NewYork，1987andperiodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，AcademicPress，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULARBIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。
实施例1
本实施例中利用Cell-SELEX技术对工程化PD-L1细胞系进行DNA核酸适配体的筛选，其具体方法如下：
1)利用PCR技术，对含有PD-L1基因片段的质粒进行基因扩增，经纯化后，将扩增的片段进行酶切，同时将pLVX-IRES-Pruo载体进行酶切，并将酶切后的片段进行凝胶电泳，确定酶切片段正确后将目的序列与酶切后的载体进行连接，然后进行测序，从而验证是否将PD-L1基因片段连接到载体的特定酶切位点。
2)将步骤1)中获得的含有目的片段的载体和pSPAX2和Pmd2.G三质粒系统进行CHO-K1细胞的转染。具体方法包括：分别将三质粒系统和OPTI-MEM培养基混匀；然后将5μLLipo 2000和150μL OPTI-MEM混匀后静置5min，然后与三质粒系统进行混合后静置20min；将包装好的质粒加入到293T细胞中，3-4h后将培养基更换成完全培养基，24h后再次更换培养基，待48h后收集病毒。
3)将步骤2)中所收集到的病毒加入到融合度为70-90％的CHO-K1细胞中进行转染，同时加入浓度为6μg/ml的转染增强试剂聚凝胺，转染12h后，换成生长培养基；24h后，加入浓度为2μg/mL的嘌呤霉素进行阳性筛选。由于载体本身具有嘌呤霉素抗性，所以未转入目的基因载体的细胞将会被嘌呤霉素杀死，然后进行1周左右嘌呤霉素的筛选，可获得稳定表达PD-L1基因的细胞系。
实施例2
将稳定高表达PD-L1细胞作为靶细胞进行正筛选，未进行转染处理的CHO-K1细胞作为对照细胞进行负筛选，其中具体的筛选方法包括：首先将合成的含有40个随机碱基序列的筛选文库m-Lib(10nmol)分散于筛选缓冲液中，然后置于95℃水浴中变性5min，然后立即置于10min备用。将培养在100×20mm，融合度为90％左右的PD-L1细胞用洗涤缓冲液清洗后，与筛选文库在4℃条件下进行孵育60min，然后用洗涤缓冲液进行清洗从而去除与靶细胞不结合的核酸序列。用细胞刮片将细胞刮下后，置于95℃水浴中变性10min后离心，并收集所得序列，用作于本轮的筛选库。然后，对所得的筛选库进行PCR扩增，并利用碱变性方法制备单链，用于下一轮的筛选。在筛选过程中，引入未经转染处理的CHO-K1细胞进行负筛选，从而降低筛选库与靶细胞的非特异性结合；同时，不断提高筛选压力，包括减少靶细胞的数量和筛选库的容量，以及增加对照细胞量，来提高筛选序列的亲和力。图1为具体的筛选方法示意图。
实施例3
以PD-L1细胞为靶细胞，CHO-K1细胞为阴性对照细胞，利用共聚焦显微镜成像技术对筛选文库的富集效果进行验证，将培养48h而且生长状态良好的PD-L1和CHO-K1细胞利用胰酶消化，加入新鲜的培养液将细胞吹打均匀并进行计数细胞，调整细胞悬液密度至105/mL。然后将0.5mL的上述细胞悬液接种至共聚焦成像皿中，培养48h后，用PBS对细胞进行清洗2-3次，从而去除死细胞。对于所选取的对照细胞和阳性细胞，分别进行荧光修饰m-Lib和筛选库进行处理，4℃条件下进行孵育50min，然后用500μl洗涤缓冲液进行清洗，多聚甲醛固定15min后进行共聚焦成像。图2a是本实施例中所筛选到的第十二轮富集库以及筛选文库m-Lib与对照细胞CHO-K1的共聚焦成像图，图2b是本实施例中所筛选到的第十二轮富集库以及筛选文库m-lib与靶细胞PD-L1的共聚焦成像图，图2a和图2b的共聚焦成像结果表明，相对于m-lib处理组，第十轮的筛选库与阳性PD-L1细胞有较强的结合。
实施例4
对所筛选到的富集核酸文库进行测序，并对所得到的序列进行同源性比对和二级结构的预测，并根据其二级结构，选择可能的适配体序列，即候选适配体序列。然后对所选择的序列进行合成并修饰绿色荧光基团，然后将0.25nmol的候选适配体序列分别与2×105PD-L1和CHO-K1细胞在4℃条件下孵育50min，离心清洗三次后进行流式分析，选取15000个细胞进行其荧光强度的统计。同时，选择化学合成的绿色荧光基团修饰的随机文库作阴性对照。图3a是本实施例中所筛选到的适配体候选序列PL1以及筛选文库m-Lib与靶细胞PD-L1的相互作用的流式验证图，图3b是本实施例中所筛选到的适配体候选序列PL1以及筛选文库m-lib与对照细胞CHO-K1的相互作用的流式验证图，结果表明，相对于随机序列，所筛选到的候选适配体序列能够与靶细胞具有较强的相互作用，并且与对照细胞无明显的相互作用。
实施例5
以PD-L1细胞为阳性细胞，CHO-K1细胞系为对照细胞，利用共聚焦显微镜成像技术考察候选适配体序列与靶细胞和对照细胞之间的相互作用。将已培养两天而且生长状态良好的PD-L1和CHO-K1细胞利用胰酶消化，加入新鲜的培养液将细胞吹打均匀并进行计数细胞，调整细胞悬液密度至105/mL。然后将0.5mL的上述细胞悬液接种至共聚焦成像皿中，培养48h后，用PBS对细胞进行清洗2-3次，从而去除死细胞。对于所选取的对照细胞和阳性细胞，分别进行荧光修饰m-Lib和适配体序列进行处理，4℃条件下进行孵育50min，然后用500μL洗涤缓冲液进行清洗，多聚甲醛固定15min后进行共聚焦成像。图4a是本实施例中所筛选到的适配体PL1以及筛选文库m-Lib与对照细胞CHO-K1相互作用的共聚焦成像图，图4b是本实施例中所筛选到的适配体PL1以及筛选文库m-Lib与靶细胞PD-L1相互作用的共聚焦成像图，图4a和图4b的共聚焦成像结果表明，相对于m-Lib处理组，所筛选到的适配体序列与阳性细胞有较强的结合。
实施例6
以PD-L1细胞为靶细胞，利用流式细胞术技术考察所筛选到的适配体序列与靶细胞作用的的亲和力。分别配置荧光修饰的适配体浓度为0、2.5、5、10、25、37.5、50、100、150、200和250nM。然后将培养48h，生长状态良好的PD-L1细胞用胰酶消化后加入新鲜的培养液，吹打均匀后进行计数，调整细胞悬液至4×105/mL。将0.5mL细胞悬液于1000rpm离心5min去除培养基，然后加入100μL 2×结合缓冲液以及100μL不同浓度梯度的荧光修饰的适配体序列，4℃条件下进行孵育50min，然后用700μL洗涤缓冲液进行离心清洗，并加入350μL洗涤缓冲液进行流式分析，每个浓度重复2-4次。选择其细胞荧光强度对其适配体浓度进行非线性拟合，得到所述适配体与靶细胞间相互作用的亲和力，其适配体序列及其平衡解离常数如图5所示。
实施例7
利用竞争法考察所筛选到的候选适配体序列是否能够阻断PD-1/PD-L1之间的相互作用。将100μLPD-L1蛋白(2μg/mL)置于96孔板，4℃放置过夜。PBS清洗3次后，用1％BSA溶液封闭2h，清洗后加入Fc标记的重组人PD-1蛋白(2μg/mL)，孵育1h。PBS清洗3次后，加入biotin修饰的适配体PL1序列在4℃孵育50min(终浓度分别为0、0.5、1、5、10和20μM)。PBS清洗后，分别检测孔板中PD-1蛋白和PD-L1适配体的量。其中，对于PD-1蛋白的检测，通过加入绿色荧光修饰的抗PD-1的抗体，然后用酶标仪测定每个样品孔中的荧光强度，从而检测孔板中PD-1重组蛋白。同时，对于PL1核酸适配体的检测，借助于生物素-链霉亲和素之间的相互作用，利用辣根过氧化物酶修饰的链霉亲和素结合生物素，然后清洗之后加入辣根过氧化物酶的反应底物TMB进行显色，然后用酶标仪测定样品孔中的样品在450nm处的光吸收值，从而对样品孔中的PD-L1序列进行定量。图6是竞争法测定候选适配体阻断PD-1/PD-L1相互作用的结果，该结果表明所筛选的候选适配体序列能够特异性阻断PD-1/PD-L1之间的相互作用。
实施例8
抽取20mL健康人外周血，利用人外周血单个核细胞分离液提取其中的淋巴细胞，分离的细胞用PBS清洗后，加入绿色荧光修饰的抗人CD4抗体在4℃孵育30min，离心清洗后用PBS进行分散，然后用流式分选仪进行分选，收集CD4阳性细胞进行培养。然后利用人T细胞激活增值试剂盒进行T细胞的激活和扩增。将100μL抗人CD3和CD28抗体(1μg/mL)置于96孔板中过夜，清洗后，每孔加入激活后的CD4阳性细胞，并给予人重组PD-L1蛋白进行处理，然后设置5个不同的处理组，分别加入抗PD-L1抗体，同型对照，PBS，抗PD-L1适配体和随机。其中，未进行处理的样品孔做空白对照，未进行PD-L1蛋白处理的组作为激活组(阳性对照组)，仅有PD-L1蛋白处理的组设为抑制组。不同处理组的细胞培养48h后，利用人IFNγ检测试剂盒检测不同处理组培养液中的IFN-γ含量；同时，利用WST-1试剂盒检测不同处理组的细胞增值情况。图7a和图7b为候选适配体PL1序列拮抗T细胞抑制的结果，加入适配体后，T细胞的增值变强，IFN-γ的表达量增加，表明该适配体能够拮抗由PD-1/PD-L1信号通路介导的T细胞的抑制。
实施例9
将4-6周，雌性Balb/c小鼠进行皮下CT26肿瘤细胞的接种，待肿瘤大小至5mm左右时，将小鼠碎金分成5组，每个处理组给予不同的处理，分别为PD-L1抑制剂(1.2mg/kg)，同型对照(1.2mg/kg)，PBS，抗PD-L1适配体(1.2mg/kg)和随机序列(1.2mg/kg)。每个处理组进行皮下给药处理，时间间隔为48h。每次给药前，记录小鼠的体重和肿瘤的大小，其中肿瘤的体积计算为：V＝1/2×a×b2,其中V代表肿瘤体积，a代表种瘤的长度，b代表种瘤的宽度。图8a和图8b分别是不同组别小鼠的体重和肿瘤大小的统计图，该结果表明，该适配体序列具有一定的生物安全性，并能够抑制CT26种瘤的生长。
综上所述，本发明提供的一种PD-L1核酸适配体的序列，基于所述PD-L1核酸适配体与PD-L1高表达的肿瘤细胞特异性结合，可以实现阻断与肿瘤浸润细胞表达的PD-1的结合，拮抗由PD-1/PD-L1信号通路介导的免疫抑制作用的目的，具有一定的肿瘤生长抑制作用。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。
Figure BDA0002499366940000131
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序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> PD-L1核酸适配体、其筛选方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ataccagctt attcaattgt agagtataaa aagagtgatg atcttttgta ggttttttag 60
atagtaagtg caatct 76

Claims (5)

1.一种PD-L1核酸适配体，其特征在于，所述PD-L1核酸适配体的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的PD-L1核酸适配体，其特征在于：所述PD-L1核酸适配体的两端任选为硫代修饰。
3.根据权利要求1所述的PD-L1核酸适配体，其特征在于：所述PD-L1核酸适配体能够与PD-L1高表达细胞系特异性结合。
4.权利要求1-3中任一项所述的PD-L1核酸适配体在制备能够抑制CT26肿瘤细胞生长的产品中的应用。
5.一种抑制CT26肿瘤细胞生长的产品，其特征在于包含权利要求1-3中任一项所述的PD-L1核酸适配体。
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