CN110726838A - 一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及循环肿瘤细胞鉴定技术，尤其涉及一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法，属生物工程技术领域。本发明采用的是利用免疫微球特异性识别白细胞，排除白细胞的干扰，从而负向鉴定出靶标细胞(循环肿瘤细胞)。克服了部分循环肿瘤细胞因其表面特征抗原EpCAM或CK低表达而无法实现有效正向鉴定的缺点，使靶标细胞(循环肿瘤细胞)的检出率更高。该方法利用抗原抗体特异性反应，直接在明场显微镜下观察细胞表面免疫微球的结合情况，此方法可避免传统的循环肿瘤细胞荧光检测方法必须依赖荧光显微镜、检测成本高、染色流程长、信号易淬灭等问题。且操作费用低、装置易实现，为普通明场显微镜的实验室开展循环肿瘤细胞检测提供了可能。

Description

一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法
技术领域
本发明涉及循环肿瘤细胞鉴定技术，尤其涉及一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法，属生物工程技术领域。
背景技术
循环肿瘤细胞是由肿瘤原发灶或转移灶脱落进入血液循环系统的肿瘤细胞。受环境污染、有毒食品和人口老龄化等因素影响，我国正成为癌症的高发区，恶性肿瘤致死正逐渐占据我国成人死因的第一位，我国居民中每年因癌症死亡病例达270万例。恶性肿瘤致命的主要原因是肿瘤细胞获得侵袭能力并由原发灶或转移灶脱落，进入人体血液循环进而侵袭其他脏器实现远端转移。而在外周血中检测脱落的肿瘤细胞是预示肿瘤早期发生和转移最直接和有效的手段，在肿瘤早期临床诊断中具有积极而重要的意义。因此，通过对外周血中循环肿瘤细胞进行捕获和鉴定，可以为癌症的早期诊断和筛查、个体化施药方案的制定、临床放/化疗疗效评价、癌症预后判断以及复发转移检测等提供强大而有力的方法和手段。
循环肿瘤细胞的检测与鉴定首先需要对血液样本中的靶细胞进行富集与分离以提高其检出率，增加检测的灵敏性。但人体外周血中循环肿瘤细胞的数量非常稀少(每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞)，而循环肿瘤细胞分选富集和鉴定将直接影响其后续的检测结果，如循环肿瘤细胞计数、PCR、单细胞测序等。因此，高纯度、高灵敏、快速的循环肿瘤细胞富集鉴定是临床应用中的重点和难点。目前常用的循环肿瘤细胞鉴定方法包括：中国专利公开号：CN105807057A，公开日：2016.07.27，发明名称为：一种捕获和鉴定循环肿瘤细胞同步进行的方法。该文献采用荧光纳米球同时识别循环肿瘤细胞和白细胞能够实现对循环肿瘤细胞的捕获和标记。但仍存在一些问题，例如由于循环肿瘤细胞表面抗原(如EpCAM或CK等)表达的异质性，使用该技术无法检出靶标抗原弱表达的循环肿瘤细胞；中国专利公开号CN105807057A，公开日：2016.06.22，发明名称为：一种外周血循环肿瘤细胞分离鉴定方法。该文献使用膜过滤装置和免疫荧光技术鉴定循环肿瘤细胞，能捕获上皮抗原表达减弱或缺失的肿瘤细胞，但仍存在一些问题，例如使用荧光显微镜，具有信号弱、易淬灭、非特异性吸附干扰等缺点；且鉴定技术操作复杂，鉴定设备昂贵等。
免疫荧光检测技术是最常见的循环肿瘤细胞检测及鉴定技术，可利用荧光显微镜对循环肿瘤细胞进行识别和计数。但该检测技术需要依赖荧光显微镜，具有信号弱、易淬灭、非特异性吸附干扰等缺点；由于循环肿瘤细胞表面抗原(如EpCAM或CK等)表达的异质性，使用该技术无法检出靶标抗原弱表达的循环肿瘤细胞；除此之外，高昂的设备造价和检测费用也限制了其在基础研究和临床检测领域的普及应用。而传统的明场染色方法(如瑞斯-吉姆萨染色)正向鉴定技术非常依赖于人为主观判断，对判读人员的专业经验要求非常高，判读结果存在较大的差异性，检测灵敏度低。因此，基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定技术能够结合免疫识别和明场观测的优势，有效地提高循环肿瘤细胞的检出率和准确度，也突破了原有鉴定技术操作复杂、鉴定设备昂贵的局限，极大地提高了其实际的临床应用。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法，该技术能增加循环肿瘤细胞检测的敏感性和特异性，提高循环肿瘤细胞检出率，操作方便快捷，设备造价低廉。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法，所述鉴定方法按以下步骤进行：
a.将Anti-CD45抗体嫁接到规定粒径大小的有机或无机的已活化的微球表面，经过表面化学处理形成免疫微球，待用，用于免疫识别并标记出白细胞。
b.将经过预固定的癌症病患外周血样通入微流控芯片，完成循环肿瘤细胞的预富集，待用。
c.将经a步骤得到的免疫微球通入已完成循环肿瘤细胞预富集的微流通道，常温下孵育2小时，使免疫微球与白细胞上的CD45抗原发生特异性结合。并用PBS缓冲液将未与白细胞发生免疫反应的多余微球以及红细胞冲洗出微流控芯片。
d.最后通过普通明场显微镜进行镜检，根据免疫微球在不同细胞表面的结合情况负向鉴定出循环肿瘤细胞，即与免疫微球发生特异性结合的细胞可判断为白细胞，未与免疫微球结合的细胞可判断为循环肿瘤细胞。
所述的微球的粒径范围为100nm至5um。
所述的微球的材质为四氧化三铁(Fe3O4)或二氧化硅(SiO2)或二氧化钛(TiO2)中的一种。
与现有方法相比，本发明的有益效果和优点在于：
1、本发明采用的是利用免疫微球特异性识别白细胞，排除血样中占绝大部分数量的白细胞的干扰，从而负向鉴定出靶标细胞(循环肿瘤细胞)的方法，克服了部分循环肿瘤细胞因其表面特征抗原EpCAM或CK低表达而无法实现有效正向鉴定的缺点，使靶标细胞(循环肿瘤细胞)的检出率更高。
2、本发明采用明场鉴定的方法，利用抗原抗体特异性反应，直接在明场显微镜下观察细胞表面免疫微球的结合情况，与免疫微球发生特异性结合的细胞可判断为白细胞，从而负向鉴定出未与免疫微球结合的细胞即为循环肿瘤细胞。此方法可避免传统的循环肿瘤细胞荧光检测方法必须依赖荧光显微镜、检测成本高、染色流程长、信号易淬灭等问题。
附图说明
图1为本发明的基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法流程图。
图2为经鉴定流程后微流芯片内细胞示意图。
图3为实施例1中的实验结果图，即对免疫磁球(IMPs)具有不同免疫吸附性能的Jurkat T细胞和MCF-7细胞的明场照片。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明进行详细说明。
图2中：1-微流芯片入口，2-修饰过Anti-CD45抗体的微球，3-白细胞，4-循环肿瘤细胞，5-红细胞，6-微流芯片通道，7-微流芯片出口。
见附图，一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法，所述鉴定方法按以下步骤进行：
a.将Anti-CD45抗体嫁接到规定粒径大小的有机或无机的已活化的微球表面，经过表面化学处理形成免疫微球2，待用，用于免疫识别并标记出白细胞3。其中微球的大小是根据白细胞3的大小而确定，从而确保白细胞3表面能反应足够多的免疫微球2。
b.将经过多聚甲醛溶液(PFA)预固定的癌症病患外周血样从微流芯片入口1通入微流控芯片，经过微流芯片内部沟道的拦截，完成循环肿瘤细胞的预富集，待用。
c.将a步骤得到的免疫微球2以固定流速从微流芯片入口1通入已完成循环肿瘤细胞预富集的微流通道6，常温下孵育2小时，使免疫微球与白细胞上的CD45抗原发生特异性结合。孵育结束后用PBS缓冲液将未与白细胞发生免疫反应的多余微球以及红细胞5从微流芯片出口7冲洗出芯片。
d.最后通过普通明场显微镜进行镜检，根据免疫微球在不同细胞表面的结合情况负向鉴定出循环肿瘤细胞，即与免疫微球发生特异性结合的细胞可判断为白细胞5，未与免疫微球结合的细胞可判断为循环肿瘤细胞4。
所述的微球的粒径范围为100nm至5um。
所述的微球的材质为四氧化三铁(Fe3O4)或二氧化硅(SiO2)或二氧化钛(TiO2)中的一种。
具体实施例
按上述鉴定方法。
实施例1
a.将Anti-CD45抗体通过表面化学处理嫁接到粒径100nm的四氧化三铁(Fe3O4)微球表面：室温下，取400μL PBS缓冲液，80μLFe3O4微球溶液进行混合，再依次加入3mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，1.5μg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，待该体系反应30min，完成微球的活化。在上述活化体系中加入4μgAnti-CD45抗体后，在摇床中反应4h，完成对微球的抗体修饰。
b.室温下，分别取100μL JurkatT细胞(人外周血白血病T细胞，CD45阳性表达)样本和MCF-7细胞(人乳腺癌细胞，CD45阴性表达)样本，分别加入1000μL 0.4％多聚甲醛(PFA)溶液对两种细胞样本进行20min的预固定，将预固定后的细胞样本以100μL/min的流速分别通入2个内设台阶沟道的微流控芯片，完成循环肿瘤细胞的预富集。
c.将a中所得的免疫微球溶液以100μL/min的流速分别通入步骤b所得的微流控芯片中，常温下静置孵育2h。再以50μL/min的流速向上述2个微流控芯片中分别通入200μLPBS溶液，将未与细胞发生抗原抗体反应的多余的微球及红细胞等非目标细胞冲出芯片。
d.通过普通明场显微镜对上述2个玻璃芯片进行明场观察和鉴定。
实施例1镜检结果
实验结果如图3所示，其中图3(a)中细胞为CD45阳性表达的Jurkat T细胞，其周围特异性吸附很多修饰有Anti-CD45抗体的免疫微球，图3(b)中细胞为CD45阴性表达的MCF-7乳腺癌细胞，其周围仅非特异性吸附极少的免疫微球，对比图3(a)和(b)，可以负向鉴定出图3(b)中表面几乎不吸附磁性微球的细胞为乳腺癌细胞。
实施例2
a.将Anti-CD45抗体通过表面化学处理嫁接到粒径5um的二氧化硅(SiO2)微球表面：室温下，取400μL PBS缓冲液，80μL SiO2微球溶液进行混合，再依次加入3mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，1.5μg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，待该体系反应30min，完成微球的活化；在上述活化体系中加入4μgAnti-CD45抗体后，在摇床中反应4h，完成对微球的抗体修饰。
b.室温下，取100μL血液样本，加入1000μL 0.4％多聚甲醛(PFA)溶液对血液样本中的细胞进行20min的预固定；将预固定后的血样以100μL/min的流速通入内设台阶沟道的微流控芯片。
c.将a中所得的免疫微球溶液以100μL/min的流速分别通入步骤b所得的微流控芯片中，常温下静置孵育2h；以50μL/min的流速向上述玻璃芯片中通入200μL PBS溶液，将未与白细胞发生抗原抗体反应的多余的微球及红细胞等非目标细胞冲出芯片。
d.通过普通明场显微镜进行明场观察和鉴定。
实施例2镜检结果：白细胞周围特异性吸附很多修饰有Anti-CD45抗体的二氧化硅免疫微球，循环肿瘤细胞其周围仅非特异性吸附极少的免疫微球表面几乎不吸附磁性微球的细胞为循环肿瘤细胞。
实施例3
a.将Anti-CD45抗体通过表面化学处理嫁接到粒径1um的二氧化钛(TiO2)微球表面：室温下，取400μL PBS缓冲液，80μL TiO2微球溶液进行混合，再依次加入3mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，1.5μg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，待该体系反应30min，完成微球的活化；在上述活化体系中加入4μgAnti-CD45抗体后，在摇床中反应4h，完成对微球的抗体修饰。
b.室温下，取100μL血液样本，加入1000μL 0.4％多聚甲醛(PFA)溶液对血液样本中的细胞进行20min的预固定；将预固定后的血样以100μL/min的流速通入内设台阶沟道的微流控芯片。
c.将a中所得的免疫微球溶液以100μL/min的流速分别通入步骤b所得的微流控芯片中，常温下静置孵育2h；以50μL/min的流速向上述微流控芯片中通入200μLPBS溶液，将未与白细胞发生抗原抗体反应的多余的微球及红细胞等非目标细胞冲出芯片。
d.通过普通明场显微镜进行明场观察和鉴定。
实施例3镜检结果：白细胞周围特异性吸附很多修饰有Anti-CD45抗体的二氧化钛免疫微球，循环肿瘤细胞其周围仅非特异性吸附极少的免疫微球表面几乎不吸附磁性微球的细胞为循环肿瘤细胞。

Claims (3)

1.一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法，其特征在于：所述鉴定方法按以下步骤进行：
a.将Anti-CD45抗体嫁接到规定粒径大小的有机或无机的已活化的微球表面，经过表面化学处理形成免疫微球，待用，用于免疫识别并标记出白细胞；
b.将经过预固定的癌症病患外周血样通入微流控芯片，完成循环肿瘤细胞的预富集，待用；
c.将经a步骤得到的免疫微球通入已完成循环肿瘤细胞预富集的微流通道，常温下孵育2小时，使免疫微球与白细胞上的CD45抗原发生特异性结合；并用PBS缓冲液将未与白细胞发生免疫反应的多余微球以及红细胞冲洗出微流控芯片；
d.最后通过普通明场显微镜进行镜检，根据免疫微球在不同细胞表面的结合情况负向鉴定出循环肿瘤细胞，即与免疫微球发生特异性结合的细胞可判断为白细胞，未与免疫微球结合的细胞可判断为循环肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法，其特征在于：微球的粒径范围为100nm至5um。
3.根据权利要求1所述的基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法，其特征在于：微球的材质为四氧化三铁(Fe3O4)或二氧化硅(SiO2)或二氧化钛(TiO2)中的一种。
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