CN108671971A - 一种循环肿瘤细胞及团簇阴性分离的微流控装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种循环肿瘤细胞及团簇阴性分离的微流控装置，所述微流控装置由样品存储室和微流控芯片通过热键合组装而成，所述微流控装置直径为60mm，与直径为60mm的细胞培养皿相同，所述微流控装置可以刚好放入培养皿中进行离心，本发明中微坑阵列芯片可对CTCs和CTCs‑Clusters同步捕获，基于该微流控装置可实现了对CTCs和CTCs‑Clusters的同步阴性分离；整个微坑阵列芯片以数字1~64分为64个大区，并对以字母A~P把每个大区分为16个小区，可对每个微坑的精确定位，实现了对富集的CTCs/CTCs‑Clusters的精确定位和单细胞分离纯化，为后续目标细胞进行单细胞分析提供便利。

Description

一种循环肿瘤细胞及团簇阴性分离的微流控装置和方法
技术领域
本发明属于生物与医学检测技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞及团簇阴性分离的微流控装置和方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTCs)是脱落于原发肿瘤部位，经由上皮间质转化后进入血液循环，可在远端部位定位，发生间质上皮转化后增殖形成新的病灶。循环肿瘤细胞团(circulating tumor cell clusters, CTC-clusters)是指多个CTCs同类聚集或与其它种类细胞聚集形成的细胞团。血液中的循环肿瘤细胞和循环肿瘤细胞团簇与癌症转移密切相关，同时对CTCs和CTC-Clusters进行检测有利于实现癌症早期诊断、疗效评估、肿瘤转移机制研究。
临床研究显示，外周血中出现CTC-clusters的肿瘤患者，比只有CTCs的患者的无进展生存期、总生存期都更短。目前，很多的CTCs分离方法利用微流控技术也只能做到对CTCs或CTC-Clusters的分离，很难高效地做到两者同步分离。目前在CTCs鉴定上主要依赖EpCAM和CK等上皮标志物，对EMT转换过程和非上皮来源的CTCs很难鉴定。而且血液中CTC和CTC-Clusters稀少且存在异质性，因此急需发展一种高效的同步实现CTCs和CTC-Clusters的分离方法和对所有CTCs都能较好鉴定的检测方法。
在肿瘤转移机制研究上，理想的分离捕获方法需要保持肿瘤细胞活性并且在单细胞水平上研究肿瘤的机理；在临床应用中，则需要一种能够快速鉴定计数CTCs的低成本的方法。因此,本领域亟待发展一种高效温和的CTCs和CTC-Clusters同步分离检测方法，并能够将分选出的CTCs挑选出来在单细胞水平上研究肿瘤的机理。
发明内容
为了上述问题，本发明提供一种循环肿瘤细胞及团簇阴性分离的微流控装置，所述微流控装置由样品存储室和微流控芯片通过热键合组装而成，所述微流控芯片上设有多个微坑，所述微坑用于存储和甄别定位单个肿瘤细胞或团簇，微流控装置直径小于等于细胞培养皿直径，所述微流控装置可以刚好放入培养皿中进行离心；
进一步地，所述微流控芯片设置在样品存储室内，所述微流控芯片用于对2~6mL全血进行阴性富集，并完成CTCs/CTC-Clusters的甄别、精确定位和后续分离纯化；
进一步地，所述微流控芯片由1~64个微坑阵列形成，每个微坑阵列含有2000个微坑，微坑的大小同时适合物理性地捕获单个肿瘤细胞或团簇，微坑之间呈等边三角形排列，所述微流控芯片的微坑共计12-13万个；
进一步的，所述微流控芯片大小优选为30mm×30mm，每个微坑直径60μm，深40μm，间距40μm，所述微流控芯片的微坑共计12.3万个；
进一步地，所述微坑阵列以数字1~64分为64个大区；并对以字母A~P把每个大区分为16个小区，满足在6.4X倍镜下可以看到一个完整的以数字命名的区，达到对可疑信号的粗略定位；同时满足在20X倍镜下可看到一个完整的以字母命名的区，达到对可疑信号的精确定位；
进一步地，所述样品存储室由铜钱型围堰构成，铜钱型围堰高为15mm，直径为60mm，中间方孔为下底面大小为30mm×30mm，上底面大小为40mm×40mm的四棱台，所述样品存储室最大容量为18mL；
进一步地，所述热键合材料包括PDMS、玻璃、硅片和高分子聚合物，所述高分子聚合物为PS、PMMA、COC或PC，实验室小试材料优选为PDMS，批量生产大试材料优选为高分子聚合物；
进一步地，所述样品存储室的容量可根据实验需要调整围堰的高和直径，一次分析2~6ml血样，样品存储室容量优选为10-15ml；
进一步地，所述微流控装置通过低速离心后，每个微坑同时满足对单个肿瘤细胞和肿瘤细胞团簇的高效物理捕获，微坑直径优选为50-100μm，深优选为40-60μm，间距优选为40-60μm；
进一步的，所述微流控装置直径为60mm，与直径为60mm的细胞培养皿相同；
进一步地，一种循环肿瘤细胞及团簇阴性分离方法，所述方法用于外周血中，所述方法包括以下步骤：
（1）微流控装置表面处理：用10%山羊血清与3%牛血清白蛋白混合溶液注入溶液存储室封闭1h以避免细胞的非特异性；
（2）阴性富集肿瘤细胞：首先，血液样品稀释后低速离心弃上层血清和血小板，待用；其次，将前一步处理的样品密度梯度离心后，吸取中间的有核细胞层；再次，将前一步处理的样品与CD45和CD15抗体标记的免疫磁珠共同孵育后，通过磁力架除去白细胞，得肿瘤细胞富集样品；最后，将前一步处理的样品与APC-CD45抗体和荧光葡萄糖类似物2-NBDG共同孵育，使白细胞和肿瘤细胞各标记上不同荧光；
（3）微流控芯片细胞捕获：将通过阴性富集后的样品，注入该装置的样品存储室后，通过低速离心，样品中的细胞可被底层的微坑捕获；
（4）肿瘤细胞甄别及精确定位：用荧光显微镜6.4X倍镜下统计每个阵列内2-NBDG+信号，20X倍镜下确定2-NBDG+且APC-CD45- 信号的准确位置；
（5）分离纯化：在明场下，找到甄别及精确定位后的微坑，用毛细针对循环肿瘤细胞或团簇进行个纯化分离，挑选后，在明场和荧光场下进行再次确认；
进一步地，在步骤（2）中，依据肿瘤细胞的Warburg效应，利用荧光葡萄糖类似物2-NBDG荧光标记肿瘤细胞，使用2-NBDG得最佳浓度根据肿瘤细胞类型不同而不同，优选浓度为400-600μM，37℃孵育20min；
在步骤（3）中，低速离心，利用微坑进行物理性地捕获细胞，离心速度优选为800-1000r/min，时间优选为5-3min；
本发明的有益效果如下：
1）：微坑阵列芯片可对CTCs和CTCs-Clusters同步捕获，基于该微流控装置可实现了对CTCs和CTCs-Clusters的同步阴性分离；
2）：整个微坑阵列芯片以数字1~64分为64个大区，并对以字母A~P把每个大区分为16个小区，可对每个微坑的精确定位，实现了对富集的CTCs/CTCs-Clusters的精确定位和单细胞分离纯化，为后续目标细胞进行单细胞分析提供便利；
3）：本发明灵敏度高，操作简单，成本低，通量大，能够耗时短的同步分离循环肿瘤细胞及团簇。
附图说明
图1为本发明所述微流控装置实物及尺寸标示图；
图2为本发明实施例1中微流控装置对单个循环肿瘤细胞甄别及精确定位示意图；
图3为本发明实施例2中对模拟血样利用微流控装置捕获循环肿瘤细胞团簇示意图；
图4为本发明实施例3中微流控装置对甄别及精确定位后的肿瘤细胞团簇进行分离纯化示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。下面为本发明的举出最佳实施例：
如图1-图4所示，本发明提供一种循环肿瘤细胞及团簇阴性分离的微流控装置和方法，所述方法能同时高效地分离CTCs和CTC-Clusters，并能对目标CTCs或CTC-Clusters进行单个分离纯化进行后续单细胞分析。
本发明中微坑阵列芯片可对CTCs和CTCs-Clusters的同步捕获，基于该微流控装置可实现了对CTCs和CTCs-Clusters的同步阴性分离。整个微坑阵列芯片以数字1~64分为64个大区，并对以字母A~P把每个大区分为16个小区，可对每个微坑的精确定位，实现了对富集的CTCs/CTCs-Clusters的精确定位和单细胞分离纯化，为后续目标细胞进行单细胞分析提供便利。
本发明所述微流控装置装置包括微孔阵列芯片和样品存储室，两者通过热键合组装而成，并且该装置大小与Corning细胞培养皿60mm（430166）相同，可以刚好放入培养皿中进行离心。所述装置的样品存储室由“铜钱型”的PDMS围堰构成。围堰高15mm，直径60mm，中间方孔为下底面大小为30mm×30mm，上底面大小为40mm×40mm的四棱台。整个样品存储室的容量可达18mL，超大的存储容量完全可以满足仅用一个这样的微流控芯片装置，即可对2~6mL全血进行阴性富集后在该装置上完成CTCs/CTC-Clusters的甄别及精确定位和后续分离纯化。所述装置的微孔阵列芯片大小为30mm×30mm，是由12.3万个微坑组成。每个微坑直径60μm，深40μm，间距40μm，微坑之间呈等边三角形排列。同时，为了便于对分离的肿瘤细胞进行精确定位和挑选，对微坑阵列进行分区域：以数字1~64把整个微坑阵列芯片分为64个大区；并对以字母A~P把每个大区分为16个小区。这样的微阵列尺寸和分区设计，可以满足在6.4X倍镜下刚好可以看到一个完整的以数字命名的大阵列，达到对可疑信号的粗略定位，如（55G区）有可疑信号；同时可以满足在20X倍镜下刚好可以看到一个完整的以字母命名的小阵列，达到对可疑信号的精确定位，如（55G区，第13排，第2列）达到对每个微坑都有一个准确的位置确定。所述装置的微孔阵列芯片的微坑直径优选为50-80μm，深优选为40-50μm，既能满足捕获单个肿瘤细胞，又能满足捕获肿瘤细胞团簇。述热键合材料包括PDMS、玻璃、硅片和高分子聚合物，所述高分子聚合物为PS、PMMA、COC或PC，实验室小试材料优选为PDMS，批量生产大试材料优选为高分子聚合物。
一种外周血中循环肿瘤细胞及团簇的同步快速分离方法，包括如下步骤：
（1）微流控装置表面处理：如权力要求1所述分离装置，用10%山羊血清与3%牛血清白蛋白混合溶液注入溶液存储室封闭1h以避免细胞的非特异性。
（2）阴性富集肿瘤细胞：首先，癌症患者血样稀释后低速离心弃上层血清和血小板，待用；其次，将前一步处理的样品密度梯度离心后，吸取中间的有核细胞层；再次，将前一步处理的样品与CD45和CD15抗体标记的免疫磁珠共同孵育后，通过磁力架除去白细胞，得肿瘤细胞富集样品。最后，将前一步处理的样品与APC-CD45抗体和荧光葡萄糖类似物2-NBDG共同孵育，使白细胞和肿瘤细胞各标记上不同荧光。
（3）微流控芯片细胞捕获：将通过阴性富集后的样品，注入该装置的样品存储室后，通过低速离心，样品中的细胞可被底层的微坑捕获。
（4）肿瘤细胞甄别及精确定位：用荧光显微镜（Olympus IX71 microscope, witha scientific CMOS）6.4X倍镜下统计每个阵列内2-NBDG+信号，20X倍镜下确定2-NBDG+且APC-CD45- 信号的准确位置。
（5）分离纯化：在明场下，找到甄别及精确定位后的微坑，用毛细针对循环肿瘤细胞或团簇进行单个纯化分离。挑选后，在明场和荧光场下进行再次确认。
在步骤（2）中，所述癌症患者血样可以是结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌等癌症患者的外周血样品。
在步骤（2）中，依据肿瘤细胞的Warburg效应，利用荧光葡萄糖类似物2-NBDG荧光标记肿瘤细胞，使用2-NBDG得最佳浓度根据肿瘤细胞类型不同而不同，优选浓度为400-600μM，37℃孵育20min。
在步骤（3）中，低速离心，利用微坑进行物理性地捕获细胞，离心速度优选为800-1000r/min，时间优选为5-3min。
在图1中，整个装置由样品存储室（“铜钱型”的PDMS围堰）和微坑阵列芯片两者通过热键合组装而成。其中图1中A为微坑阵列芯片的明场显微镜视野图，整个芯片大小为30mm×30mm，由1~64个数字标记的阵列构成，包含12万个微坑。其中图1中B为数字55标记的阵列的放大图，字母A~P把该阵列又分为16个小阵列。其中图1中C为微坑尺寸标示图,每个微坑直径60μm，深40μm，间距40μm，微坑之间呈等边三角形排列。其中图1中D为微流控装置实物图，整个装置大小与Corning细胞培养皿60mm（430166）相同，高约为15mm，直径约为60mm。中间“铜钱型”的PDMS围堰下底面大小为30mm×30mm，上底面大小为40mm×40mm，高为15mm。整个样品存储室的容量可达18mL。
实施例1：利用微流控装置对单个循环肿瘤细胞分离甄别及精确定位
（1）分离装置前处理：对于所述分离装置，其结构如图1所示。用10%山羊血清与3%牛血清白蛋白混合溶液注入溶液存储室封闭1h以避免细胞的非特异性。
（2）阴性富集肿瘤细胞：首先，取4ml癌症患者血样稀释后低速离心弃上层血清和血小板，待用；其次，将前一步处理的样品密度梯度离心后，吸取中间的有核细胞层；再次，将前一步处理的样品与CD45和CD15抗体标记的免疫磁珠共同孵育后，通过磁力架除去白细胞，得肿瘤细胞富集样品。最后，将前一步处理的样品与APC-CD45抗体和荧光葡萄糖类似物2-NBDG共同孵育，使白细胞和肿瘤细胞各标记上不同荧光。
（3）微流控芯片细胞捕获：将通过阴性富集后的样品，注入该装置的样品存储室后，通过低速离心，样品中的细胞可被底层的微坑捕获。
（4）肿瘤细胞甄别及精确定位：用荧光显微镜（Olympus IX71 microscope, witha scientific CMOS）6.4X倍镜下统计每个阵列内2-NBDG+信号，20X倍镜下确定2-NBDG+且APC-CD45- 信号的准确位置。
图2中A为6.4X倍镜下，数字20标记的阵列的荧光场显微镜视野图，可粗略定位(20，G)中有一个2-NBDG阳性的肿瘤细胞信号。其中图2中B为20X倍镜下，20G标记的阵列的明场和荧光场显微镜视野图，可精确定位肿瘤细胞信号在(20，G，13列，2排)微坑。其中图2中C为更高倍镜下，(20，G，13列，2排)微坑的明场和荧光场显微镜视野图：图2中C1为明场视野图，清楚可见肿瘤细胞明显大于血细胞；图2中C2为激发光波长为488nm的荧光场视野图，可见肿瘤细胞高摄取2-NBDG呈现绿色荧光；图2中C3为激发光波长为635nm的荧光场视野图，可见白细胞被APC-CD45抗体结合呈现红色荧光，而肿瘤细胞无红色荧光。整个过程在微流控装置上实现了对单个循环肿瘤细胞精确定位及甄别。
实施例2：外周血中循环肿瘤细胞团簇的快速分离
（1）分离装置前处理：对于所述分离装置用10%山羊血清与3%牛血清白蛋白混合溶液注入溶液存储室封闭1h以避免细胞的非特异性。
（2）模拟含肿瘤细胞团簇的癌症患者血样的制备：抗凝管采集健康志愿者外周血样本4ml，用毛细管挑选若干LOVO细胞系的肿瘤细胞团块掺入血液中模拟癌症患者血样。
（3）阴性富集肿瘤细胞团簇：首先，样品稀释后低速离心弃上层血清和血小板，待用；其次，将前一步处理的样品密度梯度离心后，吸取中间的有核细胞层；再次，将前一步处理的样品与CD45和CD15抗体标记的免疫磁珠共同孵育后，通过磁力架除去白细胞，得肿瘤细胞富集样品。最后，将前一步处理的样品与APC-CD45抗体和荧光葡萄糖类似物2-NBDG共同孵育，使白细胞和肿瘤细胞各标记上不同荧光。
（4）肿瘤细胞团簇捕获：将通过阴性富集后的样品，注入该装置的样品存储室后，通过低速离心，样品中的细胞团簇可被底层的微坑捕获。
（5）甄别及精确定位：用荧光显微镜（Olympus IX71 microscope, with ascientific CMOS）6.4X倍镜下统计每个阵列内2-NBDG+信号，20X倍镜下确定2-NBDG+且APC-CD45- 信号的准确位置。
图3中A为明场显微镜视野图，从细胞形态上便可清楚辨别肿瘤细胞团簇及血细胞（白细胞、红细胞）。其中图3中B为激发光波长为488nm的荧光场视野图，可见肿瘤细胞团簇高摄取2-NBDG呈现绿色荧光。其中图3中C为激发光波长为635nm的荧光场视野图，可见白细胞被APC-CD45抗体结合呈现红色荧光，而肿瘤细胞无红色荧光。
实施例3：对甄别及精确定位后的肿瘤细胞团簇进行单个分离纯化
（1）外周血中肿瘤细胞团簇的快速分离（步骤同实施例2）。
（2）分离纯化：在明场下，找到甄别及精确定位后的微坑，用毛细针对循环肿瘤细胞团簇进行个纯化分离。挑选后，在明场和荧光场下进行再次确认。
图4中A为20X倍镜下，21E标记的阵列的明场显微镜视野图，可精确定位肿瘤细胞团簇在(21，E，6列，6排)微坑。其中图4中B为毛细针挑选后，20X倍镜下，21E标记的阵列的明场显微镜视野图，可见(21，E，6列，6排)微坑里肿瘤细胞团簇已经被分离。其中图4中C为未挑选前高倍镜下对(21，E，6列，6排)微坑的明场和荧光场甄别示意图：图4中C1为明场视野图，从细胞形态上便可清楚辨别肿瘤细胞团簇及血细胞（白细胞、红细胞）；图4中C2为激发光波长为488nm的荧光场视野图，可见肿瘤细胞团簇高摄取2-NBDG呈现绿色荧光；图4中C3为激发光波长为635nm的荧光场视野图，可见白细胞被APC-CD45抗体结合呈现红色荧光，而肿瘤细胞团簇无红色荧光。
以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种循环肿瘤细胞及团簇阴性分离的微流控装置，其特征在于，所述微流控装置由样品存储室和微流控芯片通过热键合组装而成，所述微流控芯片上设有多个微坑，所述微坑用于存储和甄别定位单个肿瘤细胞或团簇，微流控装置直径小于等于细胞培养皿直径，所述微流控装置可放入培养皿中进行离心。
2.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述微流控芯片设置在样品存储室内，所述微流控芯片用于对2-6mL全血进行阴性富集，并完成CTCs/CTC-Clusters的甄别、精确定位和后续分离纯化。
3.根据权利要求2所述的微流控装置，其特征在于，所述微流控芯片由1-64个微坑阵列形成，每个微坑阵列含有2000个微坑，微坑的大小同时适合物理性地捕获单个肿瘤细胞或团簇，微坑之间呈等边三角形排列，所述微流控芯片的微坑共计12-13万个。
4.根据权利要求3所述的微流控装置，其特征在于，所述微坑阵列以数字1~64分为64个大区；并对以字母A~P把每个大区分为16个小区，满足在6.4X倍镜下可以看到一个完整的以数字命名的区，达到对可疑信号的粗略定位；同时满足在20X倍镜下可看到一个完整的以字母命名的区，达到对可疑信号的精确定位。
5.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述样品存储室由铜钱型围堰构成，铜钱型围堰的中间方孔为四棱台。
6.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述热键合材料包括PDMS、玻璃、硅片和高分子聚合物，所述高分子聚合物为PS、PMMA、COC或PC，实验室小试材料优选为PDMS，批量生产大试材料优选为高分子聚合物。
7.根据权利要求5所述的微流控装置，其特征在于，所述样品存储室的容量能够根据实验需要调整围堰的高和直径，一次分析2-6ml血样，所述样品存储室容量最大容量为18ML，所述样品存储室容量优选为10-15ml。
8.根据权利要求4所述的微流控装置，其特征在于，所述微流控装置通过低速离心后，每个微坑同时满足对单个肿瘤细胞和肿瘤细胞团簇的高效物理捕获，微坑直径优选为50-100μm，深优选为40-60μm，间距优选为40-60μm。
9.一种循环肿瘤细胞及团簇阴性分离方法，所述方法用于外周血中，所述方法基于上述权利要求1-8之一所述的微流控装置，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）微流控装置表面处理：用10%山羊血清与3%牛血清白蛋白混合溶液注入溶液存储室封闭1h以避免细胞的非特异性；
（2）阴性富集肿瘤细胞：首先，血液样品稀释后低速离心弃上层血清和血小板，待用；其次，将前一步处理的样品密度梯度离心后，吸取中间的有核细胞层；再次，将前一步处理的样品与CD45和CD15抗体标记的免疫磁珠共同孵育后，通过磁力架除去白细胞，得肿瘤细胞富集样品；最后，将前一步处理的样品与APC-CD45抗体和荧光葡萄糖类似物2-NBDG共同孵育，使白细胞和肿瘤细胞各标记上不同荧光；
（3）微流控芯片细胞捕获：将通过阴性富集后的样品，注入该装置的样品存储室后，通过低速离心，样品中的细胞可被底层的微坑捕获；
（4）肿瘤细胞甄别及精确定位：用荧光显微镜6.4X倍镜下统计每个阵列内2-NBDG+信号，20X倍镜下确定2-NBDG+且APC-CD45- 信号的准确位置；
（5）分离纯化：在明场下，找到甄别及精确定位后的微坑，用毛细针对循环肿瘤细胞或团簇进行个纯化分离，挑选后，在明场和荧光场下进行再次确认。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，依据肿瘤细胞的Warburg效应，利用荧光葡萄糖类似物2-NBDG荧光标记肿瘤细胞，使用2-NBDG得最佳浓度根据肿瘤细胞类型不同而不同，优选浓度为400-600μM，37℃孵育20min；
在步骤（3）中，低速离心，利用微坑进行物理性地捕获细胞，离心速度优选为800-1000r/min，时间优选为5-3min。
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