CN101036055B - 循环癌细胞上Her-2/neu蛋白的增加水平的检测以及治疗 - Google Patents
循环癌细胞上Her-2/neu蛋白的增加水平的检测以及治疗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101036055B CN101036055B CN2005800339861A CN200580033986A CN101036055B CN 101036055 B CN101036055 B CN 101036055B CN 2005800339861 A CN2005800339861 A CN 2005800339861A CN 200580033986 A CN200580033986 A CN 200580033986A CN 101036055 B CN101036055 B CN 101036055B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- neu
- cell
- immunoassays
- blood
- cancer cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 157
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 54
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 46
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 56
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 56
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 49
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 claims abstract description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 147
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 54
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 54
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 claims description 25
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 25
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 25
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 15
- 210000003104 cytoplasmic structure Anatomy 0.000 claims description 7
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 claims description 5
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 claims description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 claims 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 6
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 23
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 22
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 19
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 15
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 12
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 7
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- YFTHZRPMJXBUME-UHFFFAOYSA-N tripropylamine Chemical compound CCCN(CCC)CCC YFTHZRPMJXBUME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000028180 Glycophorins Human genes 0.000 description 2
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 102000049320 CD36 Human genes 0.000 description 1
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100025470 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 Human genes 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000914320 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 1
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 1
- 108010066302 Keratin-19 Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000037058 blood plasma level Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000010201 enrichment analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229950008835 neratinib Drugs 0.000 description 1
- ZNHPZUKZSNBOSQ-BQYQJAHWSA-N neratinib Chemical compound C=12C=C(NC\C=C\CN(C)C)C(OCC)=CC2=NC=C(C#N)C=1NC(C=C1Cl)=CC=C1OCC1=CC=CC=N1 ZNHPZUKZSNBOSQ-BQYQJAHWSA-N 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 description 1
- VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N phenylbutazonum Chemical compound O=C1C(CCCC)C(=O)N(C=2C=CC=CC=2)N1C1=CC=CC=C1 VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
- G01N2333/4706—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及循环癌细胞上Her-2/neu蛋白的增加水平的检测以及治疗。具体地说,通过从血液样品中分离癌细胞,然后在所分离的癌细胞上进行灵敏的Her-2/neu免疫测定,来检测血液样品中循环癌细胞上Her-2/neu蛋白的表达。阳性结果表明Her-2/neu在血液样品中癌细胞上的表达。该方法可用于鉴定有望受益于用靶向Her-2/neu的抗癌剂如群司珠单抗(赫赛汀)所进行的治疗的癌症患者。
Description
背景技术
目前只有25%-30%的乳癌患者基于在其原发性肿瘤的活组织检查中发现Her-2/neu(也叫做Her2/neu;HER2;c-erbB-2和erbB2)蛋白或基因的增加水平而接受赫赛汀(HERCEPTIN)治疗。文献数据指出,在原发性肿瘤活组织检查中为Her2/neu阴性结果的相当多数量的妇女(测试的26个中的11个)继续发展为其循环癌细胞上的Her2/neu阳性(Hayes DF等,Int J Oncol21:1111-7;Meng S等,2004Proc Natl Acad Sci USA101:9393-98)。而且,相当多的患有乳癌的妇女不具有容易获得的活组织检查材料以用于测试Her-2-neu的状况。在Hayes等和Meng等的论文中使用的方法繁琐且耗时,需要一种快速的更加方便的检验,特别是可在医生诊所中实施的检验。Hayes等的方法需要流式细胞计数分析,Meng等的方法需要荧光原位杂交(FISH),其比本发明所提到的Her-2/neu蛋白的直接检测(例如通过ECL)更加复杂和耗时。
Her2/neu和赫赛汀治疗:在来自患乳癌妇女的大约25%的活组织检查样品中观察到了Her2/neu癌基因的过量表达并且Her2/neu癌基因的过量表达与不良预后有关。群司珠单抗(Trastuzumab)(赫赛汀)是人源化的单克隆抗体,其抗Her2/neu受体的胞外结构域(ECD)和抑制过量表达该受体的人乳癌细胞的增殖(见Esteve FJ2004,The Oncologist9(附刊3):第4-9页,最近综述)。乳癌细胞上Her-2/neu的蛋白质表达可容易地达到每个细胞500,000个分子或更多的水平,如Her-2/neu过量表达的称为SK-BR-3的人乳癌细胞系的情况。目前Her2/neu的检验依靠检验患者活组织检查的组织切片的蛋白质过量表达或基因扩增。在那些具有基因扩增或蛋白质的至少2+免疫染色的妇女中,用单个试剂群司珠单抗或用与诸如紫杉醇等化学治疗剂组合的群司珠单抗已经证明有显著应答。能靶向Her-2/neu的其它试剂正在开发中且具有与本发明的赫赛汀相似的适用性。这些试剂包括但不限于:正由Genentech开发的OMNITARG(pertuzumab);正由GlaxoSmithKline开发的GW-572016(Xia等,2004,Oncogene23:646-653);正由Pfizer开发的CP-654577(Barbacci等,2003,Cancer Res63:4450-4459);正由Wyeth开发的HKI-272(Rabindran等,2004,Cancer Res2004,64:3958-65)。在其特异性中包括Her-2/neu的其它抗癌剂描述在Janmaat和Giaccone,2003(The Oncologist8:576-86)中。除了乳癌之外,Her-2/neu在包括卵巢癌等其它癌细胞中也是过量表达的。
ECL:电化学发光是一种使用设计成电化学刺激时发光的标记的过程(关于ECL的综述见Yang等,1994,Biotechnology12:193-194;也可见Blackburn等,1991,Clin Chem37:1534-1539)。这些标记与合适的装置(如由BioVeris开发的)一起供检测诸如蛋白质、mRNA和DNA等各种生物分子的具有高度灵敏度的方法之用。Martin等(2003,美国专利号6,524,865)描述了基于ECL的酶免疫测定;然而没有描述检测血液中循环癌细胞上的蛋白质如Her-2/neu的应用。
ECL和整个真核细胞
使用整个真核细胞的ECL方法已由Chinn等公开(美国专利6,300,143B1)。然而Chinn等的方法是用于测量细胞表面抗体的结合亲和力而不是测定细胞表面上受体分子的相对数量。且Chinn的方法起始于大量细胞(167,000细胞每ml)的纯化细胞群,与首先从全血中发现的不纯混合物中分离数量可以是很少(典型地为1至200细胞每ml;Hayes等,2002)的所选细胞群相反。
Her-2/neu或相关分子的测定:
目前美国食品和药品管理局(FDA)批准的筛选用赫赛汀(群司珠单抗)治疗的患者的测定是:(1)Her-2/neu蛋白过量表达的免疫组织化学法(DAKO的HERCEPTEST)和(2)用于Her-2/neu基因扩增的FISH(荧光原位杂交)测定(VYSIS的PATHVISION试剂盒)。这些检验已显示了患者对于赫赛汀的应答和受益的预见性(Fornier M等,2002.HER2testing and correlation with efficacy of trastuzumab therapy.Oncology16:1340-58)。然而,这两种测定都具有以下四个限制:
1)这些测定需要活组织检查样品组织。不是所有的患者都有这样存档的容易获得的用于检测的材料。在这种情况下,唯一的选择是获得肿瘤活组织检查样品。血液样品的测定会更加方便、容易实施,且具有更快提供答案的潜力。
2)非常普遍的是,首次诊断乳癌时采集的活组织检查样品在数年后当患者疾病复发时才使用。因此,使用测试旧组织材料的测定,能在作出关于是否用赫赛汀治疗患者的临床决定之前在可能为许多年的时间点上确定患者关于Her-2/neu的肿瘤状况。文献数据提出在原发性肿瘤活组织检查中具有Her2/neu阴性结果的相当多数量的妇女(26个测试中的11个)继续发展为其循环癌细胞上的Her2/neu阳性(Hayes DF等,Int JOncol21:1111-7;Meng S等,2004Proc Natl Acad Sci USA101:9393-98),因此是用赫赛汀治疗的候选者。关于来自血液样品的循环乳癌细胞的Her-2/neu状况的测定,会提供其目前Her-2/neu状况的更加实用且快速的测定。
3)由于这些测定中评分的主观性,地方实验室与中央实验室对于两种类型的测定最近已显示出显著量的相异,在一些地方实验室发现可产生高达25%的假阳性率(Fomier等,2002)。使用更加常见的免疫组织化学测定,相对于FISH估计有14%~17%的假阴性率(Seidman等,2001,J Clin Oncol19:2587-95;Fornier等,2002)。使用免疫组织化学产生的14%~17%的假阴性率显示了在美国每年有数千名这样的妇女将补充为赫赛汀治疗的候选者。
4)最后,这些方法是缓慢的,需要(a)待从采集位置的存储处重新获得的组织块,(b)待切割的切片,(c)大量的处理和其次很经常性的,(d)耗时和受训人员的主观性评分。这些手工分析是不方便的,其一般用于通过免疫组织化学法显示细胞染色的程度或用于显示对样品进行评分所需的阳性FISH位置的数量。对于治疗医生来说,希望提供更迅速反馈的更快测定。此外,FISH是很昂贵的且不能普遍地获得(Fornier等,2002)。
Koski,1998(美国专利5,783,404)描述了乳癌细胞和乳癌组织中Her-2/neu蛋白的免疫组织化学测定,其使用能识别Her-2/neu蛋白特定部分的变性表位的单克隆抗体。然而这些测定是在纯的乳癌细胞群或如在乳癌组织中很高百分比的乳癌细胞的环境中进行的。Koski没有解决在复杂基质中如血液中检测少量的表达Her-2/neu的乳癌细胞的问题。
Slamon等,1990(美国专利4,968,603)描述了扩增Her-2/neu基因的测定和在筛选患者中的用途。没有提供检测Her-2/neu蛋白的测定的实施例。而且,该专利没有解决在复杂基质中如血液中检测少量的表达Her-2/neu的乳癌细胞的问题。用针对Her-2/neu蛋白的单克隆抗体如赫赛汀治疗乳癌患者的鉴定患者的应用没有指示。
Carney等,1995(美国专利5,401,638)描述了人血清或血浆的免疫测定,以检测由人neu基因产物胞外结构域(ECD)组成的全长Her-2/neu蛋白的截短形式构成的neu相关蛋白p100。Carney的该项专利没有解决特别是在复杂混合物如全血中的细胞相关的或全长的Her-2/neu蛋白的检测。基于Carney的商业上的测定(来自ONCOGENE)具有的灵敏度(1.5ng截短的Her-2/neu每ml血清)太低,以至于不能用于检测潜在少量的Her-2/neu蛋白(pg含量),该潜在少量的Her-2/neu蛋白能根据本发明得以检测且是检测所要求的。正如本发明中的测定对于细胞相关Her-2/neu是非常有利的,因为患者活组织检查组织的免疫组织化学已经证明了细胞相关表达对响应赫赛汀治疗的预见力。Burstein等(2003,J ClinOncol21:2889-2895)的最近报告显示了针对截短的p100蛋白(HER2ECD)的血清测定的有限有效性。Burstein等报道“HER2ECD的基线水平或治疗引起的HER2ECD减少均未预测出一个周期后针对群司珠单抗的临床应答”。在用赫赛汀治疗的乳癌患者的研究中,Cobleigh等(1999,J Clin Oncol9:2639)达成了一个相似的结论,即在血清ECD水平和赫赛汀应答状况之间没有可证明的显著关联。
Carney等,1997(美国专利5,604,107)描述了在细胞溶解物中检测全长p185Her-2/neu蛋白的免疫测定;然而基于Carney的商业上的ELISA测定具有的灵敏度的数量级太低,以至于不能用于检测此处描述的申请所要求的少量Her-2/neu蛋白(pg含量)。如上所述,用于定量Her-2/neu蛋白的该测定的灵敏度被报道为每ml血清为1.5ng截短的Her-2/neu;推测在更加复杂的混合物如全血中将更差。而且,Carney等没有解决使用全血的Her-2/neu测定。代替的是在血液的血浆成分而不是细胞相关成分中检测称为p100的截短的Her-2/neu的水平。上面讨论了优选如该发明中测量细胞相关全长蛋白质的测定而不是测量截短的蛋白质的血浆水平的测定的基本原理。Carney等也没有指出使用整个细胞而是使用细胞溶解物。
Hudziak等,1998(美国专利5,720,937)要求保护通过将哺乳动物体内的细胞暴露于单克隆抗体以确定Her-2/neu蛋白的过量表达的体内测定。然而,没有描述体外测定肿瘤细胞的方法。
血液中循环癌细胞的分离:
Terstappen等,2002(美国专利6,365,362)描述了使用具有针对上皮细胞粘附分子(EpCAM)的抗体的免疫磁珠从患者血液样品中分离乳癌细胞。Terstappen的测定结合了免疫磁性富集与流式细胞计数分析和免疫细胞计数分析。然而,流式细胞计数和免疫细胞计数是不方便且耗时的技术。
因此,在医学实践中需要一种快速且方便的测定,其灵敏度足以使用全血样品来鉴定以下患有乳癌的妇女,她们具有在循环乳癌细胞上的Her-2/neu蛋白的过量表达,且因此有望受益于诸如群司珠单抗等Her-2/neu靶向治疗。
发明内容
本发明提供一种检测血液样品中循环癌细胞上的Her-2/neu蛋白的表达的方法,该方法包括从所述血液样品中分离所述癌细胞,然后对分离的所述癌细胞实施能检测癌细胞相关Her-2/neu的免疫测定,其中阳性免疫测定结果表明所述癌细胞上Her-2/neu的存在。本发明的测定具有以下限定的灵敏度:a)每毫升血液样品中能以0.1皮克~20皮克的Her-2/neu水平检测癌细胞相关Her-2/neu;或b)能从以每毫升血液少于或等于100个SK-BR-3细胞的浓度掺入血液中时的SK-BR-3乳癌细胞检测Her-2/neu。
本发明提供一种鉴定有望受益于用靶向Her-2/neu的抗癌剂所进行的治疗的癌症患者的方法,该方法包括上述的检测方法。当用于鉴定这样的患者时,从患者中抽取含有癌细胞的血液样品。本发明提供一种治疗如此鉴定的癌症患者的方法,该方法包括给患者施用Her-2/neu靶向抗癌剂。
附图说明
图1:通过ECL免疫测定检测重组Her-2/neu(4pg/孔、16pg/孔和64pg/孔)。
图2:从SK-BR-3人乳癌细胞提取物(每孔10、30和100个细胞溶解物材料)中检测Her-2/neu。所用的细胞溶解试剂是Sigma Lysis Buffer。
图3:从SK-BR-3人乳癌细胞提取物(每孔10、30和100个细胞溶解物材料)中检测Her-2/neu。所用的细胞溶解试剂是Pierce Lysis Buffer。
图4:比较SK-BR-3乳癌细胞(Her-2/neu过量表达的阳性对照)中与MDA-MB-468乳癌细胞(Her-2/neu过量表达呈阴性)的溶解物中Her-2/neu免疫测定检测的ECL信号。对于每一个细胞系,使用来自10、30和100个细胞/孔的溶解物材料。
图5:比较以0.9、3和10个细胞/孔的溶解物材料使用的来自SK-BR-3乳癌细胞(Her-2/neu过量表达的阳性对照)与以0.9、3、10和100个细胞/孔的溶解物材料使用的来自MDA-MB-468乳癌细胞(Her-2/neu过量表达呈阴性)的溶解物中Her-2/neu免疫测定检测的ECL信号。
图6:对于以1、3和10个SK-BR-3细胞/孔的溶解物材料使用的来自SK-BR-3乳癌细胞(Her-2/neu过量表达的阳性对照)的溶解物中Her-2/neu免疫测定检测,未受到PBMC溶解物(100至10,000个细胞/孔)的干扰。
具体实施方式
如这里使用的过渡性术语“包括”是开放式的。使用该术语的权利要求可以含有该权利要求中那些列举要素之外的额外要素。因此,例如,该权利要求可理解为也包括没有在此明确列举的其它步骤的方法,只要列举的要素或其等价要素是存在的。
本发明提供灵敏的足以定量血液样品中循环乳癌细胞上的Her-2/neu蛋白的水平的方法,并提供鉴定那些有望受益于使用赫赛汀或别的靶向Her-2/neu的试剂进行的治疗的患乳癌妇女的方法。一种方便、高灵敏性且快速的通过检验血液样品来鉴定将受益于赫赛汀治疗的额外患者的方法,在乳癌治疗领域中是一个重要的进步。如下所述,一种用于检测循环乳癌细胞表面上Her-2/neu蛋白的快速且高度灵敏的免疫学测定如使用电化学发光(ECL)检测是实施上述方法的优选方法。
本发明是基于用于从血液中分离循环癌细胞过程的高度特异性和某些基于免疫学的测定如ECL的高度灵敏性的组合。优选的且有利的是,将免疫磁珠用于本发明的两个方面,因而起到新的双重功能的作用:将免疫磁珠用于从血液中分离和纯化循环癌细胞,然后将不同的珠或这些相同的珠用作实施ECL的支持相,从而允许磁体捕获它们且将目标抗原与标记的抗体(例如钌标签标记的抗体)集中在一起。
在本发明的检测方法的实施方案中,上述a)中的灵敏度水平为1皮克~20皮克、1皮克~10皮克或者1皮克~5皮克的Her-2/neu每毫升血液样品。在本发明的检测方法的另一个实施方案中,上述b)中的灵敏度水平为能从以每毫升血液少于或等于10个SK-BR-3细胞的浓度掺入血液中时的SK-BR-3乳癌细胞检测Her-2/neu。在更进一步的实施方案中,上述b)中的灵敏度水平为能从以每毫升血液少于或等于3个SK-BR-3细胞,甚至每毫升血液少于或等于1个SK-BR-3细胞的浓度掺入血液中时的SK-BR-3乳癌细胞检测Her-2/neu。
从患有癌症特别是乳癌的患者中获取血液样品(通常为约8ml~20ml)。详细步骤包括以下:
1.除去红细胞
2.可选的阴性选择以进一步去除正常白细胞。优选的实施方案包括该步骤。
3.阳性选择循环癌细胞
4.由循环癌细胞检测和定量Her-2/neu蛋白
1.除去红细胞。
可获得多种除去红细胞的方法,包括但不限于基于密度的分离(如将血液直接收集到BECTON DICKINSON BD Vacutainer CPT管中,随后离心)和商业上的溶解缓冲液如PURESCRIPT RBC溶解缓冲液(GENTRA,Minneapolis)、FACS溶解溶液(BDIS)、IMMUNOLYSE(COULTER)、OPTILYSE B(IMMUNOTECH)和ACK溶解缓冲液(BIOSOURCE,Rockville,MD)。
一个优选的方法使用具有抗凝剂(EDTA或柠檬酸盐)的BDVacutainer CPT管。这些管含有恰当离心(1,100×g10分钟,甩平桶型转子(swing-out bucket rotor))后使得可除去红细胞和嗜中性粒细胞的物质。离心后,管底含有红细胞(红血球)和嗜中性粒细胞的细胞沉淀。在该细胞沉淀上面是凝胶层,在该凝胶层上面是肿瘤细胞、淋巴细胞和单核细胞(作为血浆底部的一个条带)。然后可将肿瘤细胞、淋巴细胞和单核细胞容易地从凝胶层上面的顶部收集。该方法是优选的,因为其不仅可以除去红细胞而且还可以除去嗜中性粒细胞。
2.阴性选择以进一步去除正常白细胞。
本发明的一个优选实施方案使用阴性选择步骤以分离肿瘤细胞。阴性选择使得可进一步去除白细胞特别是淋巴细胞和单核细胞。该步骤包括使用对两种白细胞抗原特别是共同的白细胞抗原CD45和对红细胞抗原如血型糖蛋白A具有双特异性的抗体。一种商业上可获得的具有这样双特异性抗体的混合物可获自STEMCELL TECHNOLOGIES(Rosettesep目录第15127号和第15167号)。该混合物包括针对血型糖蛋白A和人的造血细胞上多种细胞表面抗原(CD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD66b)的双重特异性抗体。在血液采集之前,将一种或多种这些双特异性抗体加入到BD Vacutainer CPT管中。在优选的实施方案中,使用针对多于一个的白细胞相关CD分子的双特异性抗体的混合物。当将血液导入CPT vacutainer管时,双特异性抗体则形成免疫玫瑰花结,每一个免疫玫瑰花结由白细胞加许多红细胞组成。这些免疫玫瑰花结具有近似红细胞的密度,且当离心后,发现在红细胞沉淀中,因此进而从细胞沉淀和凝胶层上面发现的肿瘤细胞级分中除去白细胞。收集血浆中具有肿瘤细胞的级分以进一步处理。
3.阳性选择循环癌细胞。
分离循环癌细胞的优选方法使用免疫磁珠。分离循环癌细胞的其它方法包括过滤(Vona G等,2000,Am J Pathol.2000 156:57-63)。在一个优选的实施方案中,免疫磁珠具有针对癌细胞表面上选择性发现的抗原(如上皮细胞粘附分子(EpCAM)、细胞角蛋白如细胞角蛋白-19)的抗体,特别是针对细胞角蛋白和其它表面标记的抗体混合物。也可使用具有针对Her2/neu的抗体的免疫磁珠。免疫磁珠可以具有各种大小(50微米~小于200nm),包括具有针对EpCAM(其为商业上可获得的)或针对Her2/neu的抗体的DYNAL珠(>1.5微米~约50微米)。在一个优选的实施方案中,使用纳米颗粒珠,因为其使得可更快且更有效地将肿瘤细胞和珠结合。在本发明的一个实施方案中,将EasySepTM人EpCAM阳性选择混合物和EasySepTM磁性纳米颗粒(STEMCELL TECHNOLOGIES)加入到来自先前步骤的血浆中具有肿瘤细胞的级分中。然后用磁体从剩余物质中分离肿瘤细胞,并用水溶液清洗肿瘤细胞。然后纯化的肿瘤细胞可备下个步骤中检测抗原之用。
4.由循环癌细胞检测和定量Her-2/neu蛋白。
然后可以通过使用与检测分子连接的针对Her-2/neu的单克隆抗体(mAb)如赫赛汀或mAb191924(R&D systems目录号为MAB1129)或多克隆抗体(例如山羊多克隆抗体R&D systems目录号为AF1129)来完成Her-2/neu的检测。在电化学发光(ECL)的情况下,检测分子是钌。在公共领域中有丰富的文献提供了用于将钌连接于抗体(例如Lee等,AmJ Trop Med Hyg2001,65:1-9),随后在含有三丙胺的溶液中进行磁珠上抗原的ECL检测的非常有用的方法。通过电势的应用,激发钌标记而发光,使用ECL检测仪器(如ORIGEN分析仪或可商购的仪器像来自BIOVERIS公司(Gaithersburg,MD)的M-Series384)检测所述光。
根据本发明使用的免疫测定可以是针对Her-2/neu的多克隆或单克隆抗体。优选单克隆抗体是人源化的小鼠单克隆抗体,例如群司珠单抗。群司珠单抗对于本发明的免疫测定和治疗方法是优选的。
为了检测Her-2/neu,各种针对Her-2/neu的单克隆和多克隆抗体和包括针对胞外结构域和胞质结构域的抗体可商购自如R&D Systems(Minneapolis,MN Biosource(Camarillo,CA)和BD Biosciences,SanDiego,CA)等来源。兔多克隆抗体也可获自LABVISION公司(Fremont.CA;如neu Ab-21)和获自UPSTATE CELL SIGNALING SOLUTIONS(Lake Placid,NY;如目录号06-562)。针对Her-2/neu胞外结构域的山羊多克隆抗体可获自R&D systems(目录号AF1129)。针对全长重组Her-2/neu的山羊多克隆抗体可获自EXALPHA BIOLOGICS(Rosedale,MA;目录号M100P)。预计这些针对全长Her-2/neu的多克隆抗体将能与Her-2/neu的胞外和胞质结构域结合而不是胞外结构域特异性的。可获得的单克隆抗体针对胞外结构域(例如R&D Systems目录号MAB1129)和胞质结构域(例如LABVISION neuAB-8),包括针对C-末端肽(例如LABVISION neuAB-15)。在Hudziak等(1997,美国专利5,677,171)中也公开了针对Her-2/neu的单克隆抗体。一个改进的实施方案使用赫赛汀,因与该抗体结合是最能够预测作为患者的治疗手段的赫赛汀的结合。另一个有利的实施方案使用兔多克隆抗体或结合于Her-2/neu蛋白上的许多表位的抗体混合物而使得具有更高的灵敏度。
在本发明的一个实施方案中,免疫测定在完整的癌细胞上进行,并使用选择性结合于Her-2/neu胞外结构域的抗体。作为一种选择,在免疫测定前可将分离的癌细胞溶解,并在细胞溶解物上进行免疫测定。在这种情况下,免疫测定可使用选择性结合于Her-2/neu的胞外结构域或胞质结构域的抗体。在本发明的一个更具体的实施方案中,免疫测定使用一种或两种选择性结合于Her-2/neu胞质结构域的抗体。
本发明的免疫测定比任何先前开发的针对Her-2/neu的免疫测定更为迅速且具有明显更高的灵敏度。本发明的免疫测定能检测非癌症人类志愿者中每ml血液加入的100个或更少SK-BR-3乳癌细胞的Her-2/neu表达。本发明的免疫测定能以每毫升血液样品中20皮克或更少Her-2/neu的水平检测癌细胞相关Her-2/neu。
除了电化学发光之外,能产生本发明所需的高灵敏度的其它免疫测定包括,但不限于:
a)如Liu Y等,2003(J Food Protection66:512-7)描述的化学发光。
b)如YuH等,2000(Biosens Bioelectron14:829-40)描述的荧光发生化学发光(FCL)。
c)荧光偏振免疫测定(见Howanitz JH,1988Arch Pathol Lab Med112:775-9)。
d)时间分辨荧光免疫测定(Butcher H等,2003,J Immunol Methods272:247-56;Soukka等,2001,Clin Chem47:1269-78;Howanitz JH,1988Arch Pathol Lab Med112:775-9)。
在一个优选的实施方案中,估计了测定中使用的乳癌细胞的相对量。这使得可获得每个细胞的总Her-2/neu蛋白的比率,并能与具有每个细胞高、中和低水平Her-2/neu蛋白的乳癌细胞的对照标准进行比较。这是优选的实施方案,因其排除了其中有许多具有低水平Her-2/neu蛋白表达的循环乳癌细胞的假阳性情况,其可能给出模拟从少量具有高水平表达的乳癌细胞获得的信号。在该实施方案中,可使用各种方法来估计相对细胞数量,所述方法包括流式细胞计数分析、总DNA或DNA相关抗原如溶解细胞的组蛋白(每个二倍体细胞有6pg DNA)的定量和浊度或吸光度测定。
由于其灵敏度,用于鉴定有望受益于用靶向Her-2/neu的抗癌剂所进行的治疗的患者的本发明方法,可有效地应用于先前通过Her-2/neu组织测试已测定(例如通过免疫组织化学或FISH分析)肿瘤活组织检查组织为Her-2/neu表达阴性的患者。
通过参考以下实施例将更好地理解本发明,该实施例举例说明但不限制这里描述的本发明。
实施例
实施例1
患有转移性乳癌的患者来到诊所,将血液样品(8mL至40mL)直接抽取到BD Vacutainer CPT管中,所述BD Vacutainer CPT管含有诸如柠檬酸盐等抗凝剂以及所加入的阴性选择产物:含有针对红细胞抗原及针对白细胞表面抗原的双特异性抗体的ROSETTESEP(来自STEMCELLTECHNOLOGIES)。将所述物质在1500RCF(相对离心力)至1800RCF离心20分钟。除去凝胶层上面的细胞层。加入EasySepTM人EpCAM阳性选择混合物和EasySepTM磁性纳米颗粒(StemCell Technologies),用磁场分离和清洗肿瘤细胞。将针对Her-2/neu的钌标记的多克隆抗体随同三丙胺溶液一起加入到粘附于已结合到电极的磁珠的肿瘤细胞中。在本领域中描述了钌标记抗体的常规方法,如在Lee等,Am J Trop Med Hyg2001,65:1-9中。施加电流并使用如商购的(BIOVERIS Corporation)ECL检测装置来检测电化学发光(ECL)。在这些仪器中将光电倍增管(PMT)恰好置于工作电极之上以有效地捕获光。在工作电极下面,将磁体放在捕获用目标抗原包被的珠的适当位置。信号与发现的结合在循环肿瘤细胞表面上的Her-2/neu的量成比例。
实施例2
提供与实施例1中使用的相同的方法,不同之处在于使用针对Her-2/Neu的单克隆抗体而不是多克隆抗体进行检测。
实施例3
提供与实施例1~2中使用的相同的方法,不同之处在于在加入连接于磁珠的针对Her-2/neu的抗体之前溶解所分离的乳癌细胞。溶解可用本领域中描述的许多细胞溶解试剂实现,所述细胞溶解试剂例如但不限于Lysis Buffer A[1%NP-40、20mM Tris(pH8.0)、137mM NaCl、10%甘油、2mM EDTA、1mM原钒酸钠、10μg/mL抑肽酶、10Ug/mL亮肽素]和RIPA缓冲液(Papetti和Herman,2001,Am J Pathology159:165-178)。在该夹心式ECL(见Yang等,1994,for an illustration of a‘sandwich’immunoassay using ECL)中,使用两套针对Her-2/neu的抗体:一种抗体是生物素酰化的且粘附于链抗生物素蛋白包被的磁珠,而第二种抗体是钌标记的。
实施例4
提供与实施例1~3使用的相同的方法,不同之处在于患者具有先前基于原发性肿瘤分析为Her-2/neu阴性的结果或者不具有容易获得用于分析的肿瘤组织。
实施例5
提供实施例1~4中使用的方法,在分析中使用额外的定量乳癌细胞的相对数量的步骤。根据DNA含量(每二倍体核有6pg DNA)定量细胞的ELISA(www.gentra.com/calcularing.asp)已由Friis等描述了(2003;APMIS111:658-68),但缺少本发明所需的灵敏度。使用高度灵敏的免疫测定例如通过使用ECL和用于定量Her-2/neu的类似仪器,实现了检测本发明所要求的少量细胞所需的更高灵敏度测定。
为了通过ECL定量细胞,首先溶解细胞(例如用溶解缓冲液,例如但不限于上面详述的Lysis Buffer A),然后加入两种不同的针对双链DNA的抗体(例如可获自STATENS SERUM INSTITUT(哥本哈根,丹麦)的小鼠单克隆抗体HYB33-01;可获自CHEMICON(Temecula,CA,USA)的小鼠单克隆抗体MAB3032;来自ALPHA DIAGNOSTICSINTERNATIONAL(San Antonio,TX,USA)的小鼠单克隆抗体(目录号DNA11-M));一种已用钌进行标记(本领域描述了钌标记抗体的常规方法,如Lee等,Am J Trop Med Hyg2001,65:1-9),另一种用生物素进行标记以粘附于链抗生物素蛋白包被的磁珠。用三丙胺溶液和借助使用磁场结合于电极的磁珠通过ECL实现抗原[该情况下dsDNA(双链DNA)]的定量。施加电流并使用如商购的(BIOVERIS公司)的ECL检测装置检测电化学发光(ECL)。在这些仪器中将光电倍增管(PMT)恰好置于工作电极之上以有效地捕获光。信号与dsDNA的量成比例,因此与细胞数量成比例。然后这使得可获得每细胞数量中Her-2/neu的比率。该比率而不是每ml血液中肿瘤细胞相关Her-2/neu的绝对数量,在本发明中对于测定患者针对赫赛汀治疗的灵敏度是有利的。
实施例6
实施例1~5中显示为Her-2/neu水平高于对照样品的患者,被认为是具有对Her-2/neu呈阳性的肿瘤细胞,然后用包括针对Her2/neu的单克隆抗体如赫赛汀的疗法治疗。优选的治疗包括以90分钟输注施用4mg/kg的初始负荷剂量,每周以30分钟输注2mg/kg的维持剂量。
实施例7
在该实施例中,纯化的重组Her-2/neu(胞外结构域)用作一种标准以使用电化学发光检测夹心式免疫测定的灵敏度。
制备四种不同的PBS测定缓冲液:
·测定缓冲液1:PBS(磷酸缓冲盐水)中含0.5%吐温-20和0.5%牛血清白蛋白(BSA)
·测定缓冲液2:PBS中含1.0%吐温-20和0.5%BSA
·测定缓冲液3:PBS中含0.5%吐温-20和1.0%BSA
·测定缓冲液4:PBS中含1.0%吐温-20和1.0%BSA
Her-2/neu标准(重组Her-2/neu胞外结构域)获自DakoCytomation(Carpinteria,CA93013USA;Product EL541)。山羊抗人Her-2/neu多克隆抗体以生物素酰化和非生物素酰化两种形式(目录号分别为BAF1129和AF1129)获自R&D Systems,Inc.(Minneapolis,MN55413USA),单克隆抗体MAB1129(R&D Systems目录号为191924)也是一样。多克隆抗体AF1129和单克隆抗体MAB1129按如下进行钌标记(“TAG标记”):
·在DMSO中制备1.5μg/μl钌标记(BV-TAG-NHS Ester,目录号为110034;BioVeris公司,Gaithersburg,MD,USA)。
·对于500μl单克隆抗体(蛋白质浓度为1mg/ml),加入18.8μlBV-TAG-NHS,对于200μl多克隆抗体(蛋白质浓度为0.5mg/ml),加入3.8μl BV-TAG-NHS。在每一种情况下,将溶液孵育一小时,并通过加入20μl2M甘氨酸停止反应。
·每一反应混合物中未偶联的BV-TAG-NHS Ester用PD-10凝胶过滤柱除去,所述凝胶过滤柱用PBS(包含0.08%叠氮化钠)预先平衡,所述包含0.08%叠氮化钠的PBS也用于洗脱。对于每一抗体,通过蛋白质测定法测定每一级分中的蛋白质浓度,具有高蛋白质含量的级分用于随后的实施例中。
在本实施例和随后的实施例中,钌标记的多克隆抗体AF1129和生物素酰化的多克隆抗体BAF1129此后称为“TAG-pAb”和“Biotin-pAb”。本实施例中钌标记的单克隆抗体MAB1129此后称为“TAG-mAb”。
电化学发光测定按如下进行:
·按顺序将25μl/孔的Her-2/neu标准,然后50μl/孔的TAG-Ab和Biotin-Ab混合物(例如各浓度为1μg/ml;稀释到4种PBS测定缓冲液中)加入到96孔U型底聚丙烯板的孔中,并在室温持续摇动孵育(例如2小时)。
·将25μl中的10μg磁性链抗生物素蛋白珠(例如Dynabeads M-280Streptavidin,目录号为110028,BioVeris,Corporation,Gaithersburg,MD)加入到每个孔中,并持续摇动孵育(例如30分钟)。
将·PBS测定缓冲液加入到每个孔中以使最终体积为每孔250μl。本测定中分析物(重组Her-2/neu胞外结构域)的含量为每孔16pg至1600pg不等。也包括没有分析物的对照孔。所有条件以至少双份重复孔进行测试。然后使用M8M-Analyzer(目录号为310800,BioVeris,Corporation,Gaithersburg,MD)分析96孔板的电化学发光。
结果显示,使用具有TAG-pAb和Biotin-pAb的夹心式免疫测定,使用所有四种不同的测定缓冲液可检测到所有测试的重组Her-2/neu胞外结构域的水平(16Pg/孔、160Pg/孔和1600Pg/孔),且高于基线(表1)。使用具有TAG-mAb和Biotin-pAb的夹心式免疫测定也可检测到重组Her-2/neu胞外结构域(表2)。
表1.通过使用钌标记的多克隆(TAG-pAb)和生物素酰化的多克隆抗体(Biotin-pAb)的免疫测定进行重组Her-2/neu的电化学发光(ECL)检测。
*平均ECL信号高于来自没有抗原的对照孔的平均信号。
表2.通过使用钌标记的单克隆(TAG-mAb)和生物素酰化的多克隆抗体(Biotin-pAb)的免疫测定进行重组Her-2/neu的电化学发光(ECL)检测。
*平均ECL信号高于来自没有抗原的对照孔的平均信号。
**信号不高于来自没有抗原的对照孔的平均信号。
实施例8
使用如实施例7中所使用的方法,不同之处在于:
·在本实施例整个过程中使用的PBS测定缓冲液是PBS测定缓冲液1。
·仅使用的钌标记的抗体是Tag-pAb。加入的Tag-pAb的浓度是在50μl中的2μg/ml而不是1μg/ml。
·重组Her-2/neu(胞外结构域)的量为4pg/ml至64pg/ml不等。
结果显示,清楚地检测到所有测试的重组Her-2/neu胞外结构域的水平(4Pg/孔、16Pg/孔和64Pg/孔)且高于基线(见图1)。
实施例9
方法为实施例8中使用的方法,不同之处在于:
·重组Her-2/neu(胞外结构域)的量为16Pg/孔至4096Pg/孔不等。
检测Her-2/neu的能力是在存在或缺少0.02μl/孔的细胞溶解缓冲液中测试的。在分离的孔中测试Pierce Lysis Buffer[M-ExtractionReagent(产品号为78501,获自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL)]和Sigma Lysis Buffer[Sigma CelLyticTM-M(Sigma产品号为C2978,Sigma-Aldrich,Inc.,St.Louis,MO63103)]。
结果提供在表3中。可检测到该实验中所有含量(包括最低含量16Pg/孔)的Her-2/neu且高于基线(表3)。该结果是在存在或缺少各细胞溶解缓冲液(Pierce Lysis Buffer或Sigma Lysis Buffer)中观察到的。
表3.ECL免疫测定检测重组Her-2/neu
实施例10
免疫测定方法如同实施例8使用的免疫测定方法一样,不同之处在于:
·分析了来自SK-BR-3乳癌细胞的细胞提取物。
按照ATCC推荐的条件使SK-BR-3细胞(来自ATCC,Manassas,VA)在6孔组织培养板中生长,用PBS清洗两次,使用血细胞计数器对等分试样进行计数。使用Pierce Lysis Buffer或Sigma Lysis Buffer进行SK-BR-3细胞的溶解。这两种溶解缓冲液描述于上面的实施例9中。为了溶解SK-BR-3细胞,每1百万个细胞加入200μl溶解缓冲液。按照各制造商的推荐进行细胞溶解,在除去细胞碎片之前附加5分钟的剧烈涡旋。通过在Eppendorf离心机(型号为5415C)中以14,000rpm离心30分钟从细胞溶解物中除去细胞碎片。每孔溶解物上清液的量因从10至1000个SK-BR-3细胞中提取的量而异,使用实施例7中描述的采用PBS测定缓冲液1的免疫测定分析Her-2/neu。
该实验的结果提供在表4中。从本实验的SK-BR-3细胞的溶解物中包括使用本实验中最低量SK-BR-3溶解物的那些孔(每孔加入10个细胞的溶解物;表4)中可检测到Her-2/neu且高于基线。无论使用何种细胞溶解缓冲液(Pierce Lysis Buffer或Sigma Lysis Buffer),均观察到该结果。图2和3为对于每孔测试的SK-BR-3细胞的三个最低量的溶解物(每孔10、30和100个SK-BR-3细胞),分别使用Sigma Lysis Buffer和PierceLysis Buffer的图示结果,表明了使用该免疫测定利用细胞进行的Her-2/neu检测呈线性。
表4.在SK-BR-3乳癌细胞溶解物中ECL免疫测定检测Her-2/neu
实施例11
在本实验中,免疫测定方法如同实施例10中使用的免疫测定方法一样,不同之处在于检测使用Sigma Lysis Buffer从以下细胞获得的溶解物:
·SK-BR-3人乳癌细胞(Her-2/neu的高表达;Goebel SU等,2002,Cancer Res62:3702-10);制备见实施例10。该SK-BR-3细胞系是对于乳癌表达Her-2/neu蛋白的合适的阳性对照。
·MDA-MB-468人乳癌是对于Her-2/neu的过量表达的合适的阴性对照乳癌细胞系(Goebel SU等,2002,Cancer Res62:3702-10)。对于MDA-MB-468细胞如同实施例10中对于SK-BR-3细胞一样进行细胞培养和使用Sigma Cell Lysis Buffer的细胞溶解。
本实验的结果提供在图4中。来自SK-BR-3细胞的溶解物(Her-2/neu过量表达的阳性对照)在Her-2/neu免疫测定中比来自MDA-MB-468细胞的溶解物(对于Her-2/neu过量表达呈阴性)给出高得多的信号,显示了Her-2/neu检测结果的特异性(图4)。
实施例12
在该实验中,免疫测定方法如同实施例11中使用的免疫测定方法一样,不同之处在于:50μl中加入的Tag-pAb和Biotin-pAb的浓度各自都为0.5μg/ml而不是1μg/ml。同样,就Her-2/neu的表达来说,将来自SK-BR-3细胞的细胞溶解物与来自MDA-MB-468细胞的细胞溶解物进行比较。本实验的结果提供在图5中。来自SK-BR-3细胞的溶解物(Her-2/neu过量表达的阳性对照)在Her-2/neu免疫测定中比来自MDA-MB-468细胞的溶解物(对于Her-2/neu过量表达呈阴性)给出高得多的信号,显示了Her-2/neu检测结果的特异性(图5)。同样,从每孔少至0.9个SK-BR-3细胞的溶解物材料中可检测到Her-2/neu;这给出了高于背景的ECL信号,也高于来自100个MDA-MB-468细胞的溶解物材料的信号(图5)。
实施例13
在本实验中,免疫测定方法如同实施例12中使用的免疫测定方法一样,不同之处在于使用Sigma Lysis Buffer获得另外的细胞溶解物(小鼠外周血单核细胞,PBMC)。PBMC由淋巴细胞和单核细胞组成,且可以在导致循环乳癌细胞从血液中分离乳癌的起始步骤中共同纯化。
将4ml小鼠血液采集到4ml的BECTON DICKINSON BD VacutainerCPT管中,在Jouan CR412离心机中以3000rpm离心30分钟。在凝胶之上的细胞级分中收集PBMC并用PBS清洗4次。从4ml血液中总共收集到1百万个PBMC。如同对于SK-BR-3细胞一样进行细胞溶解。通过在Eppendorf离心机(型号为5415C)中以14,000rpm离心30分钟从细胞溶解物中除去细胞碎片。然后将上清液用于本实验的分析。
通过将以下物质加入到每个孔中来制备用于测试的样品:
·12.5μl中来自1~10个SK-BR-3细胞的细胞溶解物。
·同样,在12.5μl中来自100~10,000个PBMC或对照PBS测定缓冲液1的细胞溶解物。
·每孔加入含有Tag-pAb和Biotin-pAb(各抗体为50μl中0.5μg/ml)的50μl溶液,并将96孔板在室温持续摇动孵育2小时。
·将25μl中10μg磁性链抗生物素蛋白珠(例如Dynabeads M-280Streptavidin,目录号为110028,BioVeris,Corporation,Gaithersburg,MD)加入到每个孔中并持续摇动孵育30分钟。
·将PBS测定缓冲液-1加入到每个孔中使最终体积为250μl每孔。所有条件在至少三个重复孔中测试。然后使用M8M-Series分析仪(目录号为310800,BioVeris,Corporation,Gaithersburg,MD)分析96孔板的电化学发光。
本实验的结果提供在表5和表6及图6中。从100、1000和10,000个PBMC中无法检测到Her-2/neu(表5)。相反,从使用的甚至最小量的SK-BR-3乳癌细胞溶解物(每孔来自1个SK-BR-3细胞的溶解物;见表6)中可检测到Her-2/neu。而且,来自100、1000和甚至10,000个PBMC的细胞溶解物的添加不会干扰乳癌细胞中Her-2/neu的检测(表6和图6)。在导致循环乳癌细胞从血液中分离乳癌的起始步骤中可共同纯化的PBMC,具有无法检测到的Her-2/neu表达,而且也不会干扰SK-BR-3细胞上Her-2/neu的检测。
表5.在大量(例如10,000)PBMC上用ECL免疫测定进行检测时未检测到Her-2/neu。
PBMC溶解物的量(细胞/孔) | 平均ECL信号(高于背景) |
0 | 0 |
100 | 阴性* |
1000 | 阴性 |
10,000 | 阴性 |
*阴性:ECL信号略低于背景水平。
表6.在存在或缺少PBMC溶解物的情况下在SK-BR-3乳癌细胞溶解物中进行Her-2/neu的ECL免疫测定检测。
NT:未测试。
Claims (15)
1.一种检测血液样品中循环癌细胞上Her-2/neu蛋白的表达的方法,该方法包括从所述血液样品中分离所述癌细胞,溶解所分离的癌细胞以获得细胞溶解物,然后在所述细胞溶解物上进行能检测癌细胞相关Her-2/neu的免疫测定,其中阳性免疫测定结果表明所述癌细胞上存在Her-2/neu;
其中通过将所述血液与能选择性结合于所述癌细胞的免疫磁珠接触而分离所述癌细胞;
其中所述免疫测定使用电化学发光检测技术;
其中所述免疫测定使用两种选择性结合于Her-2/neu的抗体;
且其中所述免疫测定具有下述限定的灵敏度:
a)能以每毫升所述血液样品0.1皮克~20皮克的Her-2/neu的水平检测癌细胞相关Her-2/neu;或
b)能从以每毫升血液1~100个SK-BR-3细胞的浓度掺入血液中时的SK-BR-3乳癌细胞检测Her-2/neu。
2.如权利要求1所述的方法,其中a)中的所述灵敏度水平是每毫升所述血液样品1皮克~20皮克的Her-2/neu。
3.如权利要求2所述的方法,其中a)中的所述灵敏度水平是每毫升所述血液样品1皮克~10皮克的Her-2/neu。
4.如权利要求3所述的方法,其中a)中的所述灵敏度水平是每毫升所述血液样品1皮克~5皮克的Her-2/neu。
5.如权利要求1所述的方法,其中b)中的所述灵敏度水平是每毫升血液少于或等于10个SK-BR-3细胞。
6.如权利要求5所述的方法,其中b)中的所述灵敏度水平是每毫升血液少于或等于3个SK-BR-3细胞。
7.如权利要求6所述的方法,其中b)中的所述灵敏度水平是每毫升血液1个SK-BR-3细胞。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述免疫测定利用选择性结合于Her-2/neu胞外结构域的抗体。
9.如权利要求1所述的方法,其中所述免疫测定使用一种或两种选择性结合于Her-2/neu胞质结构域的抗体。
10.如权利要求9所述的方法,其中所述免疫测定使用两种选择性结合于Her-2/neu胞质结构域的抗体。
11.如权利要求1所述的方法,其中所述免疫测定使用针对Her-2/neu的多克隆抗体。
12.如权利要求1所述的方法,其中所述免疫测定使用针对Her-2/neu的单克隆抗体。
13.权利要求12所述的方法,其中所述单克隆抗体是人源化的小鼠单克隆抗体。
14.如权利要求13所述的方法,其中所述单克隆抗体是群司珠单抗。
15.如权利要求1所述的方法,其中所述免疫磁珠选择性结合于上皮癌细胞。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61633204P | 2004-10-06 | 2004-10-06 | |
US60/616,332 | 2004-10-06 | ||
PCT/US2005/035894 WO2006041959A2 (en) | 2004-10-06 | 2005-10-06 | Detection of elevated levels of her-2/neu protein on circulating cancer cells and treatment |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101036055A CN101036055A (zh) | 2007-09-12 |
CN101036055B true CN101036055B (zh) | 2011-06-29 |
Family
ID=36148887
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2005800339861A Expired - Fee Related CN101036055B (zh) | 2004-10-06 | 2005-10-06 | 循环癌细胞上Her-2/neu蛋白的增加水平的检测以及治疗 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20080261243A1 (zh) |
EP (1) | EP1797431B1 (zh) |
JP (1) | JP4798801B2 (zh) |
CN (1) | CN101036055B (zh) |
AT (1) | ATE497165T1 (zh) |
CA (1) | CA2582713A1 (zh) |
DE (1) | DE602005026143D1 (zh) |
HK (1) | HK1103439A1 (zh) |
MX (1) | MX2007004079A (zh) |
WO (1) | WO2006041959A2 (zh) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102005034628B4 (de) * | 2005-07-19 | 2007-08-23 | Epigenomics Ag | Verfahren zur Untersuchung von Cytosin-Methylierungen in DNA |
EP1803822A1 (en) * | 2005-12-30 | 2007-07-04 | Adnagen AG | Method for the individual characterization of therapeutic target molecules and use thereof |
CA2646497A1 (en) * | 2006-04-18 | 2007-10-25 | Wellstat Biologics Corporation | Detection of circulating endothelial cells |
EP2008107A4 (en) * | 2006-04-18 | 2009-12-23 | Wellstat Biologics Corp | DETECTION OF STEROID RECEPTORS IN CIRCULATIVE CANCER CELLS AND TREATMENT |
WO2007121465A2 (en) * | 2006-04-18 | 2007-10-25 | Wellstat Biologics Corporation | Detection of proteins from circulating neoplastic cells |
US20080200342A1 (en) * | 2007-02-15 | 2008-08-21 | Rao Rupa S | Device, Array, And Methods For Disease Detection And Analysis |
WO2008130910A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Wellstat Biologics Corporation | Detection her-2/neu protein from non-isolated circulating cancer cells and treatment |
KR100972618B1 (ko) * | 2007-10-19 | 2010-07-27 | 국립암센터 | 허셉틴을 이용한 유방암 진단 키트, 조성물 및 이들을이용하여 허셉틴 민감성 her2 과발현 세포를 검출하는방법 |
JP5040597B2 (ja) * | 2007-11-06 | 2012-10-03 | 日本電気株式会社 | 評価システム、評価方法および評価プログラム |
EP2133433A1 (en) * | 2008-06-09 | 2009-12-16 | Centre Georges François Leclerc | A method for predicting responsiveness to a treatment with an anti-HER2 antibody |
MX2011004467A (es) | 2008-10-31 | 2011-07-28 | Biogen Idec Inc | Moleculas de objetivo light y usos de las mismas. |
WO2010070117A1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-06-24 | Universite Libre De Bruxelles | Treatment method by the administration of anti-her2 targeted active compounds to patients with early breast cancer and her2-negative primary tumor |
CN101880650B (zh) * | 2009-05-04 | 2013-01-16 | 卢焕梅 | 一种从外周血中快速提取循环的非血缘性有核细胞的组合物和试剂盒及其应用 |
EP3306321A1 (en) * | 2010-07-07 | 2018-04-11 | The Regents of The University of Michigan | Diagnosis and treatment of breast cancer |
FR2976294B1 (fr) | 2011-06-10 | 2018-02-16 | Universite De Nice Sophia Antipolis | Methode de prediction de la reponse a un traitement avec un agent bloquant her2 |
CN102830228B (zh) * | 2011-06-15 | 2015-01-21 | 格诺思博生物科技(上海)有限公司 | 定量分析循环肿瘤细胞的试剂及试剂盒 |
CN104122394A (zh) * | 2013-04-23 | 2014-10-29 | 北京豪迈生物工程有限公司 | 人表皮生长因子受体2(Her-2)定量测定试剂盒及其检测方法 |
CN104561246B (zh) * | 2013-10-18 | 2018-06-15 | 深圳先进技术研究院 | 血液中循环癌细胞的检测信号放大的方法与试剂盒 |
CN104568923A (zh) * | 2014-12-01 | 2015-04-29 | 浙江省肿瘤医院 | 电化学发光检测外周血循环肿瘤细胞抗原的方法及试剂盒 |
CN104458710B (zh) * | 2014-12-09 | 2017-11-14 | 山东省海盟生化科技有限公司 | 肿瘤早期高通量电化学发光检测方法的构建 |
CN106932583A (zh) * | 2015-12-29 | 2017-07-07 | 北京大成生物工程有限公司 | 人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒及其制备方法与应用 |
CN106226374B (zh) * | 2016-08-18 | 2018-10-16 | 中南大学 | 一种人类表皮生长因子受体-2浓度的检测方法 |
CN106319069B (zh) * | 2016-09-28 | 2020-02-14 | 河南乾坤科技有限公司 | 一种精确测定病源细胞的试剂盒及其应用 |
CN111257310B (zh) * | 2020-03-10 | 2023-05-02 | 莆田学院附属医院(莆田市第二医院) | 一种用于癌细胞识别的电致化学发光传感器的制备方法 |
CN117074692B (zh) * | 2023-08-15 | 2024-04-09 | 复旦大学附属华山医院 | 一种关于脑脊液中肿瘤细胞her2抗原表达生物信息的识别方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000052474A1 (en) * | 1999-03-01 | 2000-09-08 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Electrochemiluminescent assays for eukaryotic cells |
WO2003065042A1 (en) * | 2001-02-16 | 2003-08-07 | Immunivest Corporation | Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells |
WO2004008099A8 (en) * | 2002-07-15 | 2005-02-17 | Genentech Inc | METHODS FOR IDENTIFYING TUMORS THAT ARE RESPONSIVE TO TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6451225B1 (en) * | 1986-04-30 | 2002-09-17 | Igen International, Inc. | Electrochemiluminescent reaction utilizing amine-derived reductant |
US5401638A (en) * | 1986-06-04 | 1995-03-28 | Oncogene Science, Inc. | Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans |
US4968603A (en) * | 1986-12-31 | 1990-11-06 | The Regents Of The University Of California | Determination of status in neoplastic disease |
JP3040121B2 (ja) * | 1988-01-12 | 2000-05-08 | ジェネンテク,インコーポレイテッド | 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法 |
US5720937A (en) * | 1988-01-12 | 1998-02-24 | Genentech, Inc. | In vivo tumor detection assay |
US6448091B1 (en) * | 1988-11-03 | 2002-09-10 | Igen International, Inc. | Method and apparatus for improved luminescence assays using particle concentration chemiluminescence detection |
US5801005A (en) * | 1993-03-17 | 1998-09-01 | University Of Washington | Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated |
US6884357B2 (en) * | 1995-02-21 | 2005-04-26 | Iqbal Waheed Siddiqi | Apparatus and method for processing magnetic particles |
US5783404A (en) * | 1995-04-13 | 1998-07-21 | Amgen Inc. | Methods and compositions for determining HER-2/neu expression using monoclonal antibodies |
JP3784072B2 (ja) * | 1995-06-07 | 2006-06-07 | イゲン,インコーポレイテッド | 電気化学発光酵素イムノアッセイ |
US6117985A (en) * | 1995-06-16 | 2000-09-12 | Stemcell Technologies Inc. | Antibody compositions for preparing enriched cell preparations |
US6190870B1 (en) * | 1995-08-28 | 2001-02-20 | Amcell Corporation | Efficient enrichment and detection of disseminated tumor cells |
US6297062B1 (en) * | 1996-03-07 | 2001-10-02 | Bio-Magnetics Ltd. | Separation by magnetic particles |
US6890426B2 (en) * | 1996-06-07 | 2005-05-10 | Immunivest Corporation | Magnetic separation apparatus and methods |
US20020172987A1 (en) * | 1998-02-12 | 2002-11-21 | Terstappen Leon W.M.M. | Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells |
JP2002503814A (ja) * | 1998-02-12 | 2002-02-05 | イムニベスト・コーポレイション | 循環ガン細胞の迅速かつ効率的な単離のための方法および試薬 |
AU2876900A (en) * | 1999-02-10 | 2000-08-29 | Cell Works Inc. | Class characterization of circulating cancer cells isolated from body fluids andmethods of use |
US6969615B2 (en) * | 1999-07-26 | 2005-11-29 | 20/20 Genesystems, Inc. | Methods, devices, arrays and kits for detecting and analyzing biomolecules |
EP1231944A2 (en) * | 1999-11-15 | 2002-08-21 | University Of Southern California | Targeted delivery of therapeutic and diagnostic moieties |
US7537938B2 (en) * | 2000-04-28 | 2009-05-26 | Monogram Biosciences, Inc. | Biomarker detection in circulating cells |
JP3313107B2 (ja) * | 2001-03-22 | 2002-08-12 | バイエル コーポレイション | ヒトの生物学的流体中のneu関連タンパク質の検出及び定量 |
AU2002334989A1 (en) * | 2001-10-11 | 2003-04-22 | Aviva Biosciences Corporation | Methods, compositions, and automated systems for separating rare cells from fluid samples |
GB0512429D0 (en) * | 2005-06-17 | 2005-07-27 | Smithkline Beecham Corp | Novel compound |
EP1816477A1 (en) * | 2006-02-06 | 2007-08-08 | F. Hoffmann-la Roche AG | The use of natriuretic peptides and placenta growth factor levels for risk stratification of individuals elected for cardiac stress testing |
WO2007121465A2 (en) * | 2006-04-18 | 2007-10-25 | Wellstat Biologics Corporation | Detection of proteins from circulating neoplastic cells |
CA2646497A1 (en) * | 2006-04-18 | 2007-10-25 | Wellstat Biologics Corporation | Detection of circulating endothelial cells |
EP2008107A4 (en) * | 2006-04-18 | 2009-12-23 | Wellstat Biologics Corp | DETECTION OF STEROID RECEPTORS IN CIRCULATIVE CANCER CELLS AND TREATMENT |
-
2005
- 2005-10-06 JP JP2007535785A patent/JP4798801B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-10-06 CA CA002582713A patent/CA2582713A1/en not_active Abandoned
- 2005-10-06 EP EP05807568A patent/EP1797431B1/en not_active Not-in-force
- 2005-10-06 CN CN2005800339861A patent/CN101036055B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-10-06 US US11/575,811 patent/US20080261243A1/en not_active Abandoned
- 2005-10-06 DE DE602005026143T patent/DE602005026143D1/de active Active
- 2005-10-06 WO PCT/US2005/035894 patent/WO2006041959A2/en active Application Filing
- 2005-10-06 AT AT05807568T patent/ATE497165T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-10-06 MX MX2007004079A patent/MX2007004079A/es active IP Right Grant
-
2007
- 2007-07-16 HK HK07107590.2A patent/HK1103439A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-02-18 US US12/708,159 patent/US20110070598A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000052474A1 (en) * | 1999-03-01 | 2000-09-08 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Electrochemiluminescent assays for eukaryotic cells |
WO2003065042A1 (en) * | 2001-02-16 | 2003-08-07 | Immunivest Corporation | Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells |
WO2004008099A8 (en) * | 2002-07-15 | 2005-02-17 | Genentech Inc | METHODS FOR IDENTIFYING TUMORS THAT ARE RESPONSIVE TO TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
BASELGA.Is circulating NER-2 more than just a tumor marker.《 CLINICAL CANCER RESEARCH》.2001,第7卷2605-2607. * |
COOK ET AL.Clinical Utility of Serum HER-2/neu testing on the Bayer Immunol (R) automated system in breast cancer.《 ANTICANCER RESEARCH》.2001,第21卷1465-1470. * |
FORUS ET AL.Sensitive fluorescent in situ hybridisation method for the characterisation of breast cancer cells in bone marrow aspirates.《 J. CLIN. PATHOL.: MOL. PATHOL.》.1999,第52卷68-74. * |
LIPTON ET AL.Elevated serum HER-2/neu level predicts decreased response to hormone therapy in metastatic breast cancer.《J. OF CLINICAL ONCOLOGY》.2002,第20卷1467-1472. * |
STEARNS ET AL.Circulating tumor markers in breast cancer: accepted utilities and novel prospects.《BREAST CANCER RESEARCH AND TREATMENT》.1998,第52卷239-259. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20110070598A1 (en) | 2011-03-24 |
WO2006041959A8 (en) | 2008-01-31 |
CA2582713A1 (en) | 2006-04-20 |
WO2006041959A2 (en) | 2006-04-20 |
JP4798801B2 (ja) | 2011-10-19 |
EP1797431B1 (en) | 2011-01-26 |
EP1797431A4 (en) | 2008-07-09 |
WO2006041959A3 (en) | 2006-06-15 |
MX2007004079A (es) | 2007-06-15 |
DE602005026143D1 (de) | 2011-03-10 |
CN101036055A (zh) | 2007-09-12 |
ATE497165T1 (de) | 2011-02-15 |
EP1797431A2 (en) | 2007-06-20 |
US20080261243A1 (en) | 2008-10-23 |
JP2008517253A (ja) | 2008-05-22 |
HK1103439A1 (en) | 2007-12-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101036055B (zh) | 循环癌细胞上Her-2/neu蛋白的增加水平的检测以及治疗 | |
JP5025724B2 (ja) | 循環腫瘍性細胞からのタンパク質の検出 | |
KR101716555B1 (ko) | 포유동물 대상체에서 5t4-양성 순환 종양 세포를 검출하는 방법 및 5t4-양성 암을 진단하는 방법 | |
US20140113310A9 (en) | Cancer detection markers | |
CN101663584A (zh) | 未分离的循环癌细胞的Her-2/neu蛋白的检测和治疗 | |
EP2833149B1 (en) | Method for detecting degree of malignancy of circulating tumor cell unit, and kit for same | |
CN112501173B (zh) | 一种gpc1 dna适配体及其应用 | |
US20210231659A1 (en) | Detection and isolation of myeloid-derived suppressor cell subpopulations | |
KR101704828B1 (ko) | 체액 내 세포밖 소포체의 단백질 또는 유전자 분석을 통한 염증성 질환 진단 방법 | |
AU2018243850B2 (en) | Methods of using giant cell nucleic acid characterization in cancer screening, diagnostics, treatment and recurrence | |
EP2551673B1 (en) | Methods for the detection of cancer infiltration of the central nervous system | |
Innaro et al. | Minimal residual disease assessment of papillary thyroid carcinoma through circulating tumor cell‐based cytology | |
WO2013003898A1 (en) | Method for detection of cancer in a patient | |
US20070248999A1 (en) | Method for Determining the Concentration of Vital Epithelial Tumor Cells in a Body Fluid |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110629 Termination date: 20121006 |