CN104561246B - 血液中循环癌细胞的检测信号放大的方法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种信号放大检测血液中循环癌细胞的试剂盒和方法、以及人乳腺癌细胞的检测试剂盒，所述信号放大检测血液中循环癌细胞的试剂盒包括有：偶联循环癌细胞上抗原的特异性抗体1的探针A；偶联循环癌细胞上抗原的特异性抗体2的探针B;c）连接探针A和探针B的连接子。该试剂盒基于连接酶激活型探针，通过对CTCs的检测信号放大，可实现对血液中循环癌细胞的高灵敏度和高特异性的检测。

Description

血液中循环癌细胞的检测信号放大的方法与试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体是涉及一种血液中循环癌细胞的检测信号放大的方法与试剂盒。

背景技术

肿瘤转移是导致肿瘤复发和难以根治的重要原因。而肿瘤的微转移（micrometastasis）是指少数具有转移潜能的肿瘤细胞脱离原发灶，转移到血液、淋巴结、骨髓或远处器官中。目前临床的检测手段很难发现这种微转移。相关研究表明，在癌症发展的早期，已有微转移发生。循环癌细胞（circulating tumor cells，CTCs）是自发或因诊疗操作，由实体瘤或转移病灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发或远处转移的重要标志。CTCs的早期检测有助于早期发现肿瘤的微转移、监测术后复发、评估疗效及预后或选择合适的个体化治疗。

目前CTCs检测的主要方法有传统细胞学方法，聚合酶链反应（PCR），流式细胞分选（fluorescence-activated cell scanning/sorting,FACS），免疫磁性分离（magnetic-activated cell separation,MACS），稀有细胞自动检测系统，以及基于表面拉曼增强（SERS）和量子点的新方法。

传统的免疫细胞化学检验方法CTCs是目前公认的标准方法。但由于CTCs在外周血中的数量常小于1/10⁶，如果通过常规的细胞涂片方法，理论上，每份标本将需要制备1000张涂片才可能检测到CTCs。而通过反转录-PCR方法检测癌变组织特异性标志的mRNA来间接确定血液中的CTC的存在。由于实验污染，非常规转录，采血过程中其它来源细胞的污染，以及PCR本身的特点决定该方法的假阳性非常高^[12]。因此在进行检测前对CTCs进行快速有效富集是该技术的关健。目前的细胞富集方法主要有基于流式细胞术和免疫磁性分离技术。流式细胞术筛选细胞的速度为10³-10⁴/秒，CTCs在外周血中的数量稀少，为提高阳性率长需要检测10⁷-10⁸个单个核细胞，这样一次筛选需要几小时，速度慢，试剂消耗也非常大，难以常规应用。而免疫磁性分离的细胞筛选速度可以达到10⁶-10⁷/秒，适合大量细胞的筛选，富集后的细胞可以在一张载玻片上进行免疫细胞化学分析，也可以进行流式检测。此方法比单纯采用RT-PCR或免疫组化法敏感性高10-100倍，从而减少了假阳性和假阴性。荧光显微镜为基础的稀有细胞自动检测系统其主要的特点是能够快速的分析大量的显微镜视野，并将信息以数字模式储存图像，通过坐标系统记录靶细胞在载玻片上的位置，进一步通过普通光学显微镜分析细胞的形态。通过此系统检测外周血单个核细胞中CTCs阳性的灵敏度和特异性都非常高。

CTCs的出现可能发生在肿瘤发生及转移的早期，因此它的检出有可能成为一种比目前常规的肿瘤诊断方法（病理学，影像学和血清学）更早的肿瘤诊断手段。但是由于CTCs在外周血中的数量极少，而且容易与白细胞混淆，目前的检测的方法还很难达到临床的标准。因此急需发展一种能够灵敏，准确，快速的检测CTCs的新方法。

邻近连接技术（proximity ligation assay,PLA）是由瑞典乌普萨拉大学的Landegren U课题组最早发展起来的一项基于核酸的蛋白检测新技术。该方法利用一对邻近探针(proximity probes)对靶分子进行双识别，在连接子的作用下，这对邻近探针通过连接反应形成新的模板序列。这一可扩增的模板序列能以PCR的方式进行放大和检测。两个偶联有寡核苷酸的连接探针通过抗原-抗体反应分别与目标蛋白结合，与连接探针上不同的寡核苷酸序列有互补结构的连接子的加入，使2个探针上的寡核苷酸因为与同一个连接子杂交而形成长的新杂交链。通过连接酶的连接反应，有缺口的杂交链被连接成完整的长链。而此时通过PCR扩增可以简单地实现对目标蛋白X的级联放大检测。

邻近连接技术的最大优点在于它结合了实时定量PCR的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异性。邻近连接技术将对蛋白质的检测转变成为对扩增DNA的检测，因此具有极高的检测灵敏度，而且邻近连接反应的苛刻条件（双探针必须同时结合到目标蛋白，且相互间距离足够贴近时,邻位连接反应才能够发生）使得PLA技术与一般的ELISA,免疫PCR或其它蛋白检测方法相比，具有更高的特异性。该技术自首次报道后发展迅速，现已经广泛应用到蛋白质定量分析及蛋白质-核酸相互作用研究等研究中，并初步形成了商品化检测试剂盒。可以直接分析复杂生物样品中的微量蛋白质。

本发明通过构建了一种新型的连接酶激活型探针来检测血液中CTCs。这种方法利用一对亲和探针对CTCs上特异抗原进行双识别，在连接酶的作用下发生接近连接，继而产生可通过PCR扩增而得到的检测信号，从而将对CTCs上特异抗原的检测转变成为对DNA的检测，实现对血液中CTCs放大检测。

针对现有肿瘤细胞及循环癌细胞检测中存在的上述矛盾，本发明所要解决的技术问题之一是提供一种连接酶激活型探针来检测血液中CTCs的方法。这种方法利用一对亲和探针对CTCs上特异抗原进行双识别，在连接酶的作用下发生接近连接，继而产生可通过PCR扩增而得到的检测信号，从而将对CTCs上特异抗原的检测转变成为对DNA的检测，实现对血液中CTCs分析。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种血液中循环癌细胞的检测信号放大的试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。

一种信号放大检测血液中循环癌细胞的试剂盒，包括有：

c）偶联循环癌细胞上抗原的特异性抗体1的探针A；

d）偶联循环癌细胞上抗原的特异性抗体2的探针B;

c）连接探针A和探针B的连接子。

本发明的另一目的是提供一种人乳腺癌细胞的检测信号放大试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。

一种人乳腺癌细胞的检测信号放大试剂盒，包括有：

a）偶联抗体Trastuzumab抗体的探针A，所述探针A的碱基组成如SEQ ID NO.1所示,

b)偶联单链抗体Anti-HER2-scFv的探针B,所述探针B的碱基组成如SEQ ID NO.2所示，

c）碱基组成如SEQ ID NO.2所示的连接子。

在其中一个实施例中，还包括有连接酶。

本发明的另一目的是提供一种一种人乳腺癌检测试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。

一种人乳腺癌检测试剂盒，包括有：

a）偶联抗体Trastuzumab抗体的探针A，所述探针A的碱基组成如SEQ ID NO.1所示,

b)偶联单链抗体Anti-HER2-scFv的探针B,所述探针B的碱基组成如SEQ ID NO.2所示，

c）碱基组成如SEQ ID NO.2所示的连接子；

D）碱基组成如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物。

本发明的另一目的是提供一一种血液中循环癌细胞的检测信号放大的方法，它具有定量、快速、简便、准确地检测肿瘤细胞及定量细胞表面特异受体密度的优点。

实现该目的的技术方案如下。

一种血液中循环癌细胞的检测信号放大的方法，包括以下步骤：

（1）将探针A偶联有血液中循环癌细胞上的抗原的特异性抗体1，

（2）将探针B偶联血液中循环癌细胞上的抗原的特异性抗体2，所述特异性抗体2与特异性抗体1不相同；

（3）将血液中循环癌细胞与步骤（1）中的所述探针A和步骤（1）中的所述探针B孵化，所述探针A和所述探针B分别通过抗原抗体结合，结合到细胞上；

（4）加入连接子，探针A与探针B互补杂交；

（5）加入连接酶，所述探针A与探针B因接近连接而形成新的完整的长链。

本发明设计了一种连接酶激活型探针放大CTCs检测信号的方法。连接酶激活型探针检测CTCs的最大优点在于它同时具备了实时定量PCR的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异性。它将对细胞的抗原的检测转变为对能进行指数扩增的DNA的检测，因此具有极高的检测灵敏度，而邻近连接反应的苛刻条件（双探针必须同时结合到靶标抗原上，且相互间距离足够贴近时，连接反应才能够发生）使得这种方法具有比普通PCR方法更高的特异性。

附图说明

图1为本发明液中循环癌细胞的检测信号放大的原理图。

具体实施方式

针对目前CTCs检测方法中存在的不足，本发明建立新型的CTCs检测方法方法以提高血液中的CTCs检测的灵敏度和准确度。本发明主要是针对现有CTCs的PCR检测技术中存在的不足进行创新和改进，设计一种连接酶激活型纳米探针以同时提高CTCs检测的灵敏度和准确度。在这种探针的制备及随后的CTCs检测方法中将主要解决以下二个技术问题：

（1）这种连接酶激活型探针的设计原理、制备方法与技术；

（2）提高这种方法检测CTCs的灵敏度和准确性。

为此，本发明的主要研究包括：

（1）连接酶激活型探针的设计

连接酶激活型探针检测CTCs的原理如图1所示：首先选择能CTCs特异抗原X、Y。而特异抗原X、Y分别有2种不同的抗体a，b，c，d与之相对应。在这四种抗体a，b，c，d上分别偶联不同寡核苷酸序列就形成4种特异的探针。抗体a，b能与CTCs上的特异抗原X结合，而抗体c，d能与CTCs上的特异抗原Y结合。将探针加入到包含有CTCs的溶液中后，4种探针将特异地结合到细胞的抗原上，同时部分探针因为交叉反应或非特异吸附到细胞表面的抗体也将结合到细胞上。随后两种连接子被加入，结合在同一抗原上的探针对因为相互接近而在连接子的作用下，形成一条有缺口的杂交链。连接酶加入后，杂交链被连接而形成新的完整的长链，而交叉反应或非特异吸附到细胞表面的抗体上的核酸序列则无法被连接；此时再加入PCR引物，DNA聚合酶等，新形成的长链e和f就能得到指数扩增；最后通过对扩增产物的检测实现对CTC的特异检测。

（2）连接酶激活型探针的制备

由于这种方法检测CTCs的原理实质上还是基于CTCs表面所携带的特异抗原。所以我们首先要针对CTCs的表面的特异抗原来筛选出合适的抗体。

连接酶激活型探针的制备主要涉及将特异的核酸片段偶联到特异抗原的的抗体上。为了保证抗体的活性，只能采取相对温和的方式将两者偶联起来。而目前常规的方法一般都是通过生物素-链酶亲和素的方式将两者偶联起来。但是这种方式比较繁琐，需要分别在核酸片段和抗体上先修饰上生物素，然后通过链酶亲和素的介导才能连接起来。而且很难保证连接的准确度和效率。在本发明中，我们与引入点击化学的概念，利用点击化学中点击反应产率高，副产物无害，反应有很强的立体选择性的优点通过叠氮化物-炔基的点击反应将核酸片段和抗体连接起来。

我们先通过化学方法将在核酸片段上偶联上叠氮化物，然后采用类似的方法在抗体上偶联上炔基化化物。这样，常温下核酸片段和抗体在中性的磷酸缓冲液中就可以非常特异地结合到一起。由于叠氮化物-炔基的加成反应是生物体本身所不具备的反应，所以这种反应的特异性非常强。几乎不存在非特异连接。

（3）基于连接酶激活型探针的特异抗原检测

在进行细胞分析前，为了检验方法的可行性，需要先验证连接酶激活型探针对抗原检测的可行性。两种偶联有寡核苷酸的连接探针加入到包含抗原的溶液中，探针通过抗原-抗体反应分别结合到目标蛋白上。而与连接探针上不同的寡核苷酸序列有互补结构的连接子的加入，使2个不同探针上的寡核苷酸游离的5′端和3′端因为邻近效应而与同一个连接子杂交形成新的长杂交链。此时加入连接酶，通过连接酶的连接反应，有缺口的杂交链被连接成完整的DNA链。这条DNA链的出现意味着我们已经成功地将抗原-抗体反应的信号转变为DNA链的形成。这时再加入PCR扩增引物，荧光染料或者荧光探针和聚合酶，使用荧光定量PCR仪，通过变温循环，就可以通过荧光定量PCR方法实现对特异抗原的检测。

（4）基于连接酶激活型探针的肿瘤细胞株检测

在连接酶激活型探针实现对特异抗原检测的基础上，我们将进一步通过对实验室培养的肿瘤细胞株的检测来验证该方法的可行性。我们先选定肿瘤细胞株上2种特异的抗原，然后制备分别针对这2种抗原的2对特异的连接酶激活型探针。然后将探针加入到细胞悬浮液中，使之与细胞进行孵化。这时2组探针将能分别与肿瘤细胞上的特异抗原结合，同时部分探针因为交叉反应或非特异吸附到细胞表面的抗体也将结合到细胞上。随后两种连接子被加入，结合在同一抗原上的探针对因为相互接近而在连接子的作用下，形成一条有缺口的杂交链。连接酶加入后，杂交链被连接而形成新的完整的长链，而交叉反应或非特异吸附到细胞表面的抗体上的核酸序列则无法被连接；此时再加入PCR引物，DNA聚合酶等，新形成的长链就能得到指数扩增；最后通过这扩增产物的检测就通对两种特异抗原的PCR检测实现对CTCs的特异检测。

（5）基于连接酶激活型探针的CTCs检测

在上述步骤成功的基础上，我们将首先对加入了已知数量的肿瘤细胞的模拟样品进行检测，随后再对来自病人和健康人的血液样本进行分析。

（6）该方法的检测灵敏度和准确性研究

为了验证这种新建立的方法的灵敏度和准确性，我们将该方法与传统的方法进行比较。我们采用传统的细胞学组织化学方法和免疫磁性分离方法同时对模拟样品进行检测，以比较我们的方法的灵敏度和准确性。

实施例一，人乳腺癌SKBr3细胞株的模拟CTCs检测

组织特异性标志抗原，肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原都成为我们的抗原目标，如于上皮组织特有的角蛋白（cytokeratin，CK）抗原，癌胚抗原（carcinoembryonicantigen,CEA），表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR），乳腺细胞上皮表面糖蛋白的变异体CA15-3，由Her2/neu原癌基因编码的Her2/neu蛋白，急性髓系白血病细胞表面抗原CD11b等。

（一）设计探针及检测原理

人乳腺癌SKBr3细胞株高表达HER2抗原，选择与HER2抗原特异结合的2个不同的抗体：抗体Trastuzumab(商品名：Herclon,Herceptin)和单链抗体Anti-HER2-scFv。在这2个抗体上通过化学的方法分别偶联上DNA连接探针A（60mer）和DNA连接探针B（40mer）。探针A和探针B在连接子的作用下可以反应杂交成一条长链（100mer）。随后通过进一步的连接酶催化的连接反应可以将杂交后的长链连接起来形成一条新的DNA链，这条DNA链即使去除了连接子也不会解聚。这时再在反应体系中加入PCR反应的引物及聚合酶等。新的长链就在PCR引物作用下进行PCR扩展反应。通过检测PCR扩展产物的量可以间接检出HER2抗原的含量。

表1碱基序列信息

（二）探针与肿瘤细胞的结合及连接试验

首先制备抗体-DNA探针偶联物

1μl4mM的琥珀酰亚胺酯钠盐（sulfo-SMCC）与20μg的溶解在10μl PBS中的抗体（Trastuzumab或者Anti-HER2-scFv）混合，孵化2h。然后加入3μl100μM的DNA连接探针A或者DNA连接探针B溶液（探针溶解加了100mM二硫苏糖醇的在7.0的PBS缓冲液中），孵化2h。混合物通过3次滤膜离心分离，得到纯化的产物（探针A和探针B）。

取含一定数量的培养的人乳腺癌SKBr3细胞悬浮液50μl，加入封闭液（包含牛血清白蛋白250μg/ml,鲑鱼精DNA2.5μg/ml，EDTA50μM，0.05%Tween20的Tris缓冲液），37℃孵化2小时。离心洗涤细胞。最后将细胞悬浮在10μl的封闭液中。然后加入修饰好抗体的1μg/ml探针A和探针B各1μl，然后在37℃孵化1小时或者4过夜孵化。然后用含有0.05%Tween20的Tris缓冲液的洗涤细胞三次。用包含连接子125nM，ATP1mM，小牛血清250μg/ml，0.05%Tween20，NaCl250mM，T4连接酶0.05U/μl的10μl连接酶缓冲液悬浮细胞。在37℃孵化1小时。然后洗涤细胞，用10μl磷酸缓冲液悬浮细胞。95℃加热5min然后快速冰浴。然后进行PCR反应。

本实施例所述的人乳腺癌检测试剂盒，包括有：

a）偶联抗体Trastuzumab抗体的探针A，所述探针A的碱基组成如SEQ ID NO.1所示,

b)偶联单链抗体Anti-HER2-scFv的探针B,所述探针B的碱基组成如SEQ ID NO.2所示，

c）碱基组成如SEQ ID NO.2所示的连接子；

D）碱基组成如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物。

（三）PCR反应

在进行荧光定量PCR反应之前，先用普通PCR来证明探针扩增的可行性。具体反应条件如下：

PCR反应体系：

PCR反应条件

PCR解释后，用2%琼脂糖电泳对PCR产物进行电泳。结果发现77bp条带很清楚。

荧光定量PCR

PCR反应体系如下：

PCR反应条件

每个探针浓度重复三孔。实验结束后，采用决定定量的方法求的标准曲线，算出每个浓度的CT值。

通过使用不同浓度的肿瘤细胞来定量计算出不同浓度的CT值与细胞的对应关系。在试验重现性很好的情况下，再加入一定量的血液模拟CTC细胞的环境。再进行上述试验。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种人乳腺癌细胞的检测信号放大试剂盒，其特征是，包括有：

a)偶联抗体Trastuzumab抗体的探针A，所述探针A的碱基组成如SEQ ID NO.1所示,

b)偶联单链抗体Anti-HER2-scFv的探针B,所述探针B的碱基组成如SEQ ID NO.2所示，

c)碱基组成如SEQ ID NO.3所示的连接子。

2.根据权利要求1所述的人乳腺癌细胞的检测信号放大试剂盒，其特征是，还包括有连接酶。

3.根据权利要求1所述的人乳腺癌细胞的检测信号放大试剂盒，其特征是，还包括碱基组成如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物。

4.一种人乳腺癌检测试剂盒，其特征是，包括有：

a)偶联抗体Trastuzumab抗体的探针A，所述探针A的碱基组成如SEQ ID NO.1所示,

b)偶联单链抗体Anti-HER2-scFv的探针B,所述探针B的碱基组成如SEQ ID NO.2所示，

c)碱基组成如SEQ ID NO.3所示的连接子；

D)碱基组成如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物。