CN103060327A

CN103060327A - 肿瘤细胞识别探针、检测方法及应用

Info

Publication number: CN103060327A
Application number: CN2012105584861A
Authority: CN
Inventors: 蔡林涛; 龚萍; 石碧华; 杨月婷; 王碧; 张鹏飞; 郑明彬; 胡德红; 盛宗海; 刘朋; 高笃阳; 郑翠芳
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2032-12-20
Also published as: CN103060327B

Abstract

本发明公开了一种肿瘤细胞识别探针，长度大于等于70bp，包括与肿瘤细胞特异性结合的核酸适体及位于所述核酸适体5’端或3’端的延长序列，所述延长序列为一段自身不会形成二级结构的单链核苷酸序列。本发明还提供了利用所述识别探针进行肿瘤细胞检测的方法和试剂盒。本发明的肿瘤细胞识别探针制备简单，无免疫原性、无毒性，化学稳定性好；本发明的肿瘤细胞检测方法将基于核酸适体设计的识别探针与核酸扩增技术结合起来，检测灵敏度高，检测效率高。

Description

肿瘤细胞识别探针、检测方法及应用

技术领域

本发明涉及用于检测肿瘤细胞的识别探针；及使用所述识别探针进行肿瘤细胞检测的方法；和用于所述检测方法的试剂盒。

背景技术

由于环境污染、不良生活方式等多种因素的影响，目前肿瘤的发病率越来越高，而且逐渐呈现年轻化的趋势，严重威胁人类生命安全和健康。分子生物学及临床研究表明，肿瘤的侵袭和微转移在肿瘤发生的早期已经出现。

目前传统的肿瘤诊断方法主要依靠肿瘤组织和肿瘤细胞的形态学特征进行判断，需要对具有一定体积的肿瘤组织进行取样检测，无法实现在肿瘤细胞数量很少时检测其存在，即无法实现肿瘤的早期发现；此方法也无法判断肿瘤的转移或复发，更难以及时反映肿瘤治疗过程中的疗效。

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是自发或因诊疗操作，由实体瘤或转移病灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发或远处转移的重要标志。CTCs的检测有助于早期发现肿瘤的微转移、监测术后复发、评估疗效及预后或选择合适的个体化治疗。因此对肿瘤组织中肿瘤细胞的检测和对循环系统中肿瘤细胞的检测具有重要的意义。

随着分子生物学、肿瘤医学、分子工程技术和生物纳米技术的不断发展和交叉融合，一系列新型的分子探针被开发应用到肿瘤细胞的检测中，为肿瘤的早期诊断和术后复发诊断带来了新契机。现有技术中出现的探针主要包括以下几种。

第一种为基于抗原-抗体反应的识别探针，利用肿瘤发生发展过程中新出现或过度表达的抗原物质刺激免疫系统产生特异性抗体，肿瘤抗原物质主要是上皮细胞角蛋白、上皮细胞膜特异性抗原和肿瘤相关糖蛋白三类。以特异性的抗体作为探针，与上述抗原特异性结合进行检测，利用这种探针进行检测的缺点是制备过程复杂，需要对抗原进行纯化。

第二种为基于受体配体作用的识别探针，肿瘤细胞相对于正常细胞会表达出一些额外的受体因子，利用肿瘤细胞特有的表面受体作为靶向位点，将配体作为识别探针，实现对肿瘤细胞的检测及成像。利用这种探针进行检测的缺点是需要了解肿瘤细胞到底产生了哪些特异性的突变，配体探针通常为叶酸物质，特异性较低。

第三种为核酸适体探针，核酸适体（Aptamer）是一种DNA或RNA单链，通常由10-40个碱基组成，不同序列的核酸适体能特异性地与不同目标物结合。核酸适体的识别基础如下：当目标物存在时，单链DNA或RNA通过G-C碱基配对、A-U碱基配对、G-U碱基配对而形成一些稳定的二级结构，与靶分子通过氢键、输水堆积作用、范德华力和形状匹配等产生高特异性的结合力，形成稳定的复合物。

核酸适体是由一种指数富集的配基系统性进化（SELEX）方法筛选而来，其目标物可以是小分子、蛋白质、金属离子或特性细胞等。可将特定的肿瘤细胞作为目标物进行核酸适体的筛选（Cell-SELEX），无需了解肿瘤细胞产生了哪些特异性变化，也无需对抗原分子进行纯化，还保证了细胞表面原有构型状态下的结合效果。

现有技术中利用核酸适体检测肿瘤细胞采用将核酸适体交联在玻片等基片上固定，检测灵敏度低。

发明内容

本发明旨在解决上述现有技术中存在的问题，提出一种肿瘤细胞识别探针，长度大于等于70bp，包括与肿瘤细胞特异性结合的核酸适体及位于所述核酸适体5’端或3’端的延长序列，所述延长序列为一段自身不会形成二级结构的单链核苷酸序列。

优选地，所述识别探针长度为80-100bp。

优选地，所述核酸适体为肺癌A549细胞核酸适体S11e。

优选地，所述识别探针具有序列表中SEQ ID No.2或SEQ ID No.5所述核苷酸序列。

本发明还提供了一种肿瘤细胞检测方法，包括：

将所述肿瘤细胞识别探针与待测肿瘤细胞混合孵育，除去未与肿瘤细胞结合的游离识别探针，再进行细胞裂解，提取裂解液；

以所述识别探针延长序列为模版对裂解液进行实时荧光定量PCR，得到达到荧光强度阈值时的特征扩增循环数；

产生表示识别探针初始浓度与达到荧光强度阈值时的特征扩增循环数之间的相关性的函数；

利用所述函数计算裂解液中识别探针初始浓度，即与肿瘤细胞结合的识别探针的浓度。

本发明还提供了一种肿瘤细胞定量测定方法，包括：

将已知浓度的肿瘤细胞稀释成不同的浓度作为标准细胞样品；

用上述肿瘤细胞检测方法检测标准细胞样品结合识别探针的浓度；

产生表示肿瘤细胞浓度和与肿瘤细胞结合的识别探针浓度之间的相关性函数；

用上述肿瘤细胞检测方法对待测样品进行检测；

利用所述函数计算待测样品的肿瘤细胞浓度。

本发明另外提供了用于检测肿瘤细胞的试剂盒，包含：

所述肿瘤细胞识别探针和用于检测与肿瘤细胞结合的识别探针的数量的试剂。

优选地，所述试剂盒还包括阳性对照肿瘤细胞。

优选地，其中所述试剂含有用于扩增识别探针的引物。

优选地，所述引物包括序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的寡核苷酸或序列为SEQ ID No.6和SEQ ID No.7的寡核苷酸。

本发明最后提供了所述的识别探针在制备用于肿瘤细胞检测试剂盒中的用途。

本发明的肿瘤细胞识别探针制备简单，无免疫原性、无毒性，化学稳定性好；本发明的肿瘤细胞检测方法将基于核酸适体设计的识别探针与核酸扩增技术结合起来，检测灵敏度高，检测效率高。

附图说明

图1是实施例1的识别探针与肺癌细胞结合的荧光成像图。

图2是实施例1的识别探针的核酸扩增电泳图。

图3是实施例1的识别探针浓度与达到荧光强度阈值时的特征扩增循环数之间的相关关系图。

图4是实施例2的识别探针的核酸扩增电泳图。

图5是实施例2的识别探针浓度与达到荧光强度阈值时的特征扩增循环数之间的相关关系图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本申请的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

本发明将核酸适体探针技术与核酸扩增技术结合起来，设计了一种肿瘤细胞识别探针，所述识别探针既能够与肿瘤细胞特异性的结合，还能够作为扩增模版进行实时荧光定量核酸扩增。

本发明的识别探针是以与肿瘤细胞特异性结合的核酸适体为基础进行设计的，包括与肿瘤细胞特异性结合的核酸适体及位于所述核酸适体5’端或3’端的延长序列，为了保证核酸扩增的顺利进行，所述延长序列自身不会形成二级结构。核酸适体的序列长度为10-40bp，为了保证核酸扩增的效果，所述识别探针的长度优选为大于等于70bp，进一步考虑探针的合成成本，所述识别探针的长度更优选为80-100bp。

本发明提供的肿瘤细胞检测方法，包括：

利用上述检测方法，可满足不同的检测需求：

第一，用于肿瘤细胞的快速筛查，将所述识别探针与待测肿瘤细胞混合孵育，除去未与肿瘤细胞结合的游离识别探针，再进行细胞裂解，提取裂解液，再以所述识别探针延长序列为模版对裂解液进行实时荧光定量PCR，能够检测出荧光信号证明有肿瘤细胞的存在。

第二，用于肿瘤细胞表面受体密度检测，当核酸适体的特异性结合目标物为肿瘤细胞表面特定受体时，可根据所得与肿瘤细胞结合的识别探针的浓度计算肿瘤细胞表面特定受体的密度。

第三，用于肿瘤细胞的定量检测，以已知浓度的肿瘤细胞作为阳性对照，将已知浓度的肿瘤细胞稀释成不同的浓度作为标准细胞样品；用上述肿瘤细胞检测方法检测标准细胞样品结合识别探针的浓度；产生表示肿瘤细胞浓度和与肿瘤细胞结合的识别探针浓度之间的相关性函数（即肿瘤细胞浓度与识别探针浓度的标准曲线）；用上述肿瘤细胞检测方法对待测样品进行检测；利用所述函数计算待测样品的肿瘤细胞浓度。

下面为实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

以人肺癌细胞为待测肿瘤细胞，以人肺癌A549细胞的核酸适体S11e（SEQ ID No.1）为基础设计序列为SEQ ID No.2的识别探针（识别探针1）。

S11e的长度为45bp，在S11e的5’端增加了一段32bp的延长序列，形成探针1。

探针1与人肺癌A549细胞的特异性结合实验

具体步骤如下：

将探针1的5’端标记荧光素FAM，形成FAM-探针1；

在激光共聚焦专用皿中培养人肺腺癌A549细胞；

用磷酸缓冲液PBS洗涤人肺腺癌A549细胞3次；

用磷酸缓冲液稀释FAM-探针1；

将FAM-探针1的磷酸缓冲溶液与人肺癌A549细胞混合，在常温下孵育20min；以不加入FAM-探针1的肺癌A549细胞作为对照1；以荧光标记的随机DNA单链寡核苷酸与肺癌A549细胞混合孵育列作为对照2；

再用PBS洗涤孵育后的人肺癌A549细胞1-2次，除去未与肿瘤细胞结合的游离FAM-探针1；

在激光共聚焦显微镜下观察其肺癌A549细胞的荧光成像情况。

结果如图1所示，对照1和对照2观察不到荧光，而与FAM-探针1混合孵育的人肺癌A549细胞观察到荧光，说明探针1与肺癌A549细胞可特异性的结合。

以探针1为模版的PCR扩增实验

根据探针1的序列设计序列如SEQ ID No.3所示的上游引物和如SEQ ID No.4所示的下游引物，PCR反应体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示。

表1探针1的PCR反应体系

表2探针1的PCR反应条件

PCR结束后用2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，结果如图2所示，77bp条带清晰。77bp条带为探针1的扩增产物，说明探针1作为模版的PCR效果较好。

应用本实施例设计的探针1对肺癌A549细胞进行检测

具体步骤如下：

首先，探针1标准溶液的配置及实时荧光定量PCR

将探针1稀释成以下浓度梯度：0.1μmol/L、10nmol/L、1nmol/L、0.1nmol/L、10pmol/L、1pmol/L、0.1pmol/L、10fmol/L、1fmol/L和0.1fmol/L，按照表3的反应体系和表4的反应条件进行实时荧光定量PCR，计算每个浓度梯度的Ct值。以探针1的浓度的负对数为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线（图3所示）。由图3可知，本发明的肿瘤细胞检测方法中识别探针浓度的检测限可达10^-9μmol/L数量级。

表3实时荧光定量PCR反应体系

表4实时荧光定量PCR反应条件

然后，肺癌A549细胞的检测

在培养皿中培养人肺癌A549细胞，用细胞刮刀将A549细胞从培养皿上刮下，置于磷酸缓冲液中悬浮，离心后去上清液，洗涤沉淀1-2次，将沉淀重新置于磷酸缓冲液中悬浮，对细胞进行计数；取一定量的A549细胞悬浮液与探针1溶液混合，于37℃下孵育20min；离心除去未与A549细胞结合的游离探针1；加入胰酶对A549细胞进行消化，于室温下反应10min，并将反应后的A549细胞于95℃高温下放置10min；再次离心，上清液即为裂解液；按照表3的反应体系和表4的反应条件对裂解液进行实时荧光定量PCR；得出CT值，代入以上标准曲线计算裂解液中探针1的初始浓度，即得出与肺癌A549细胞结合的探针浓度，再根据肺癌A549细胞的数量计算出每个肺癌A549细胞表面结合的探针1的数量。

实施例2

以人肺癌细胞为待测肿瘤细胞，以人肺癌A549细胞的核酸适体S11e（SEQ ID No.1）为基础设计序列为SEQ ID No.5的识别探针（识别探针2）。

为了消除实时荧光定量PCR过程中出现的引物二聚体干扰，将识别探针的序列增加，S11e的长度为45bp，在S11e的5’端增加了一段55bp的延长序列，形成探针2。

以探针2为模版的PCR扩增实验

根据探针2的序列设计序列如SEQ ID No.6所示的上游引物和如SEQ ID No.7所示的下游引物，PCR反应体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示。

PCR结束后用2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，结果如图4所示，100bp条带清晰。100bp条带为探针2的扩增产物，说明探针2作为模版的PCR效果较好。

应用本实施例设计的探针2对肺癌A549细胞进行检测

具体步骤如下：

首先，探针2标准溶液的配置及实时荧光定量PCR

将探针2稀释成以下浓度梯度：0.1μmol/L、10nmol/L、1nmol/L、0.1nmol/L、10pmol/L、1pmol/L、0.1pmol/L、10fmol/L、1fmol/L和0.1fmol/L，按照表3的反应体系和表4的反应条件进行实时荧光定量PCR，计算每个浓度梯度的Ct值。以探针2的浓度的负对数为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线（图5所示）。

然后，肺癌A549细胞的检测

在培养皿中培养人肺癌A549细胞，用细胞刮刀将A549细胞从培养皿上刮下，置于磷酸缓冲液中悬浮，离心后去上清液，洗涤沉淀1-2次，将沉淀重新置于磷酸缓冲液中悬浮，对细胞进行计数；取一定量的A549细胞悬浮液与探针2溶液混合，于37℃下孵育20min；离心除去未与A549细胞结合的游离探针2；加入胰酶对A549细胞进行消化，于室温下反应10min，并将反应后的A549细胞于95℃高温下放置10min；再次离心，上清液即为裂解液；按照表3的反应体系和表4的反应条件对裂解液进行实时荧光定量PCR；得出CT值，代入以上标准曲线计算裂解液中探针2的初始浓度，即得出与肺癌A549细胞结合的探针浓度，再根据肺癌A549细胞的数量计算出每个肺癌A549细胞表面结合的探针2的数量。

虽然本发明参照当前的较佳实施方式进行了描述，但本领域的技术人员应能理解，上述较佳实施方式仅用来说明本发明，并非用来限定本发明的保护范围，任何在本发明的精神和原则范围之内，所做的任何修饰、等效替换、改进等，均应包含在本发明的权利保护范围之内。

Claims

1.一种肿瘤细胞识别探针，长度大于等于70bp，包括与肿瘤细胞特异性结合的核酸适体及位于所述核酸适体5’端或3’端的延长序列，所述延长序列为一段自身不会形成二级结构的单链核苷酸序列。

2.权利要求1所述的识别探针，其特征在于，所述识别探针长度为80-100bp。

3.权利要求1所述的识别探针，其特征在于，所述核酸适体为肺癌A549细胞核酸适体S11e。

4.权利要求3所述的识别探针，其特征在于，具有序列表中SEQ ID No.2或SEQ ID No.5所述核苷酸序列。

5.一种肿瘤细胞检测方法，包括：

将权利要求1所述识别探针与待测肿瘤细胞混合孵育，除去未与肿瘤细胞结合的游离识别探针，再进行细胞裂解，提取裂解液；

6.一种肿瘤细胞定量测定方法，包括：

用权利要求5所述的检测方法检测标准细胞样品结合识别探针的浓度；

用权利要求5所述的检测方法对待测样品进行检测；

利用所述函数计算待测样品的肿瘤细胞浓度。

7.用于检测肿瘤细胞的试剂盒，包含：

权利要求1所述肿瘤细胞识别探针；和

用于检测与肿瘤细胞结合的识别探针的数量的试剂。

8.权利要求7所述的试剂盒，还包括阳性对照肿瘤细胞。

9.权利要求7或8所述的试剂盒，其中所述试剂含有用于扩增识别探针的引物。

10.权利要求9所述的试剂盒，所述引物包括序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的寡核苷酸或序列为SEQ ID No.6和SEQ ID No.7的寡核苷酸。