CN105675870A - 一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于：它包括：CD133、CD24和CD44抗体分别与不同的寡核苷酸偶联得到的抗体-寡核苷酸探针；用于将上述抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液；还包括荧光探针。本发明所述的试剂盒通过将CD133、CD24和CD44作为CSC的标识物，进行平行检测CTC中各抗原的含量，从而得到CTC中CSC的表达量，分析出CTC的侵袭力。检测成本低，灵敏度高，具有很强的实用性。

Description

一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫法检测领域，具体地说是一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)是指自发或因诊疗操作由实体瘤原发灶或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。转移是癌症相关死亡的主要原因，而CTC被视为转移的种子。CTC细胞是目前认为癌症转移的种子之一。对癌症的早期诊断和预后都有重要的作用。但是我们在研究过程中发现，目前的CTC检测方法无法区分有侵袭力和无侵袭力的CTC。由于CTC侵袭力不同，以致于当检测到的CTC在5个以上后，CTC的个数和癌症病人的生存期并不完全相对应。因此对于CTC的检测分析，有必要区分有侵袭力和无侵袭力的CTC。
癌症干细胞(CSC)又称癌干细胞、肿瘤干细胞，是指具有干细胞的自我复制及多细胞分化性质的肿瘤细胞，可以作为肿瘤细胞侵袭力判断的标志。
发明内容
本发明的主要目的是针对上述背景技术存在的不足提供一种用于检测CTC侵袭力的试剂盒，能分析出CTC中CSC的表达量，从而进行CTC侵袭力的检测。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，它包括：
CD133、CD24和CD44抗体各自独立的与不同的寡核苷酸偶联得到的抗体-寡核苷酸探针；
用于将上述抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液；
还包括荧光探针。
进一步的，所述抗体-寡核苷酸探针包括寡核苷酸探针部分和抗体部分；所述寡核苷酸探针部分是将寡核苷酸的5'端进行醛基修饰后得到的，所述抗体部分是将抗体进行肼基修饰后得到的；所述寡核苷酸探针部分和所述抗体部分经过偶联得到所述抗体-寡核苷酸探针。
更进一步的，所述寡核苷酸探针部分是将5’端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔当量为5-20倍的SFB进行醛基修饰后得到的；所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。
其中，上述的SFB是指4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯；上述的SANH是指4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。
所述抗体-寡核苷酸探针是将摩尔比为(7-10):1的寡核苷酸探针部分和抗体部分，在室温条件下反应4-24小时后得到的。
优选的，所述寡核苷酸的长度为16-22nt，5’端为6-14nt长度的引物识别序列，3’端用延伸引物进行延伸扩展。
进一步的，所述延伸引物的长度为50-80nt，它的3’端末端与寡核苷酸的3’端互补配对，5’端可以形成发卡结构，且中间序列与荧光探针的序列互补。延伸引物的序列优选为SEQIDNO：14所示。
优选的，所述寡核苷酸的序列为SEQIDNO：1-13中所示的任一个。
所述扩增引物中包括一对用于将抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的正向、反向引物，所述正向引物的5’端与寡核苷酸互补。
优选的，所述循环肿瘤细胞为宫颈癌、乳腺癌或前列腺癌循环肿瘤细胞中的一种或多种。
发明原理
癌症干细胞是一类具有干细胞性质的癌细胞，也就是具有自我更新、分化能力、高度增殖能力以及它们能在裸鼠形成肿瘤。癌症干细胞内部复杂的机制能够解释癌症耐药性以及很多典型的肿瘤的行为。癌症发生的细胞假说就是指有一小部分亚群的肿瘤细胞有干细胞的特质，有能力产生新的肿瘤。癌症干细胞不仅能诱导原发肿瘤的形成，还是引起肿瘤化疗和放射治疗后复发的关键诱因。针对不同来源的肿瘤，肿瘤干细胞表面的生物标志物不尽相同。
CD133、CD24和CD44都是癌症干细胞的细胞表面标识物。它们的表达不仅在癌症细胞系中被发现，而且在宫颈癌、前列腺癌、头颈癌、肝脏肿瘤、脑癌、乳腺癌、肺癌等癌症患者的组织中均有发现。且多标志物抗体的联合应用可有效提高检测敏感性和特异性(JournaloftheNationalCancerInstitute,2009,101(1):61-66)。
因此可以通过平行检测这三种细胞表面标志物在血液中细胞表面的表达量高低来判断癌症病人血液中CTC的侵袭力。
本发明具有如下有益效果：
1.本发明所述的试剂盒通过将CD133、CD24和CD44作为CSC的标识物，进行平行检测CTC中各抗原的含量，从而得到CTC中CSC的表达量，分析出CTC的侵袭力高低。
2.本发明通过偶联醛基和肼基得到抗体-寡核苷酸的方式，可以制备得到上述抗体分别与寡核苷酸偶联的三种探针，每种抗体-寡核苷酸探针的寡核苷酸都不相同。从而可以通过寡核苷酸的PCR扩增，来平行检测CTC中各抗体分别对应的抗原含量。
3.用延伸引物对寡核苷酸的3’端扩增，可以保证寡核苷酸链过短时的PCR扩增要求，并且延伸引物5’端的发卡结构可以增加碱基的堆砌力，从而增强探针敏感性，使通用型抗体-寡核苷酸探针检测更加灵敏。
4.由于寡核苷酸与延伸引物是在3’端互补配对的，因此延伸扩展的过程在PCR扩增过程中可自行反应，延伸扩展之后再以延伸后的抗体-寡核苷酸为模板进行扩增，一步反应即可，反应效率高。
5.由于采用了PCR扩增的方式，比传统ELISA方法检测的敏感度提高了几个数量级，即使CTC的浓度很低，也可以对微量抗原进行检测。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明：下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明要得到抗体-寡核苷酸探针，其是通过先将寡核苷酸与抗体分别进行醛基和肼基的定向修饰得到寡核苷酸部分和抗体部分，再进行腙键偶联得到。优选的，所述寡核苷酸探针部分是将5’端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔当量为5-20倍的SFB进行醛基修饰后得到的，优选摩尔当量为10倍；所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍的SANH进行肼基修饰后得到的，优选摩尔当量为25倍。其中，SFB为4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯，SANH为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。用SFB修饰寡核苷酸的5’端上的氨基可以得到醛基活化的寡核苷酸，用SANH修饰抗体可以得到肼基活化的抗体蛋白。这两个反应为公开技术可以得到的，如中国文献“基于核酸分子杂交的免疫芯片抗体固定新方法”，《分析化学》，2013年第2期，沙莎等公开的。反应时间、反应温度等条件可根据文献内容做出本领域技术人员公知的调整。本发明优选的技术方案为：将5’端带有氨基修饰的寡核苷酸用pH值为7.4的PBS缓冲液溶解，然后与摩尔当量为寡核苷酸10倍的SFB溶液混合，室温反应2.5小时，再纯化得到醛基修饰的寡核苷酸探针部分。将抗体用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释后，与摩尔当量为抗体25倍的SANH溶液混合，室温反应2.5小时，再纯化得到肼基修饰的抗体部分。最后将摩尔比为(7-10)：1的寡核苷酸探针部分和抗体部分在室温下偶联反应得到所述抗体-寡核苷酸探针。
以下通过实施例1来进行进一步说明，其余未说明的具体条件及实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本实施例中所述的“室温”是指常规的室内温度，一般为15-30℃。
本实施例将序列为SEQIDNO：(1-13)的Oligo简写为Oligo(1-13)，Oligo为寡核苷酸。
本实施例中的PBS缓冲液为磷酸缓冲液，MES缓冲液为2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液。
本实施例中的QPCR为实时荧光定量PCR。
本实施例中的Nanodrop为分光光度计。
本实施例中的BCA法是指蛋白质浓度测定的定量方法。
本实施例所用的缓冲液为：配置不同pH值的PBS缓冲液，在本发明的具体实施方式中，具体包括pH值为6.0的PBS缓冲液，以及pH值为7.4的PBS缓冲液，并且配置pH值为5.0的MES缓冲液，过滤除菌处理，4℃存放。
实施例1CD133-寡核苷酸探针
(1)寡核苷酸探针的醛基修饰
将50nmol的Oligo1(寡核苷酸)用0.1M的pH7.4的磷酸缓冲液配置成溶液。称取500nmol的SFB(4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯)，用无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解后，在室温反应2.5h，过柱纯化得到Oligo-FB(醛基修饰的寡核苷酸)。
检测Oligo-FB的浓度：用Nanodrop分光光度计检测A260的值，计算Oligo-FB的浓度为0.73nmol/μL。
检测醛基修饰率：用定量的2-肼吡啶-2-盐酸盐溶液检测醛基修饰率。取上述Oligo-FB加入到2-肼吡啶-2-盐酸盐溶液中，振荡混匀后于37℃反应1h，用Nanodrop检测360nm处的吸光值为1.41，计算其修饰率，A360下的修饰率为0.79。
(2)抗体CD133的肼基修饰
对抗体CD133进行脱盐纯化后用Nanodrop检测抗体蛋白浓度为5mg/mL。
用pH值为7.4的磷酸缓冲液稀释抗体CD133至浓度为2.8mg/mL。称取30倍量SANH(抗体与SANH的摩尔比为1:30)，溶解在无水DMF中，再加入到抗体中，在室温反应2.5h，过柱纯化得到CD133-SANH(肼基修饰的CD133)。
检测CD133-SANH的浓度：通过BCA法计算修饰后的CD133-SANH的浓度为2.2mg/mL。
检测肼基修饰率：用定量的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液检测肼基修饰率。取纯化后的抗体-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液中，涡旋混匀后于37℃反应1h，Nanodrop检测348nm处的吸光值为0.42。通过348nm处的吸光值和CD133-SANH的浓度计算出CD133-SANH的肼基修饰率为6.5。
(3)Oligo-FB与CD133-SANH的偶联
将Oligo-FB与CD133-SANH按照摩尔比7:1混合涡旋混匀，室温反应4h，最后得到的产物经过过柱纯化后即可得到所述通用型CD133-Oligo探针。
取CD133-Oligo探针进行Nanodrop检测。在354nm下有明显吸收峰出现，说明Oligo-FB与CD133-SANH的偶联成功。
取CD133-Oligo探针进行SDS-PAGE检测，分析CD133与oligo偶联程度，跟纯的CD133比较，得到多条电泳条带，说明CD133上偶联了不同数量的寡核苷酸。
取CD133-Oligo探针进行BCA法浓度检测。BCA法浓度检测计算偶联物抗体的浓度。用单链定量试剂盒定量CD133-Oligo中Oligo1的浓度。可以计算出CD133与Oligo1的比例，并可以和修饰率结果比较。说明了CD133-Oligo分子中Oligo1与抗体的偶联比，结果如表1所示。
表1CD133-Oligo分子中Oligo与抗体的偶联比
实施例2
Oligo分子的QPCR扩增特异性检测
将Oligo1-13分子稀释至浓度为25000分子数/μl、83333分子数/μl和250000分子数/μl三个浓度。然后以Oligo1-3为例，将Oligo1-3在相同浓度下混合，得到混合样品A、B、C，如表2所示。
表2实施例2样品配方
将上述样品按照表3配置QPCR扩增液，得到QPCR扩增试剂盒。然后按照表4所示的程序对Oligo1-3进行QPCR扩增，以及对混合样品A、B、C中的Oligo1-3各自进行QPCR扩增，以各自延伸扩展后的Oligo1-3为模板，扩增结果的Ct值如表5所示。其中，延伸引物为RT-P，它的3’端末端与寡核苷酸的3’端互补配对，5’端可以形成发卡结构，且中间序列与MGB探针(MGty)的序列互补即可，本实施例的RT-P以序列为SEQIDNO：14所示为例。正向引物为FP，反向序列为RP。FP以序列为SEQIDNO：15所示为例，RP以序列为SEQIDNO：16所示为例，MGty以序列为SEQIDNO：17所示为例，5’端的荧光基团用FAM标记，3’端为MGB。
表3Oligo分子的QPCR扩增试剂盒
试剂 1份用量(μl) 终浓度
Nuclear free water 1.35
RT-P(1uM) 0.25 25nM
FP(10uM) 0.3 300nM
RP(10uM) 0.3 300nM
MGty(10uM) 0.1 100nM
Premix Ex Taq(2×) 5
Oligo 2.5
表4QPCR扩增程序
表5扩增结果Ct值
Oligo1 Oligo2 Oligo3
25000分子数/μl 25.33 25.92 23.98
83333分子数/μl 23.50 24.17 22.43
250000分子数/μl 21.96 22.54 20.60
A 25.25 25.88 24.03
B 23.40 24.08 22.27
C 21.81 22.56 20.69
从表5可以看出，混合样品A、B、C中的Oligo1-3，在相同浓度下扩增的Ct值与单个Oligo的扩增Ct值相差为0.1左右。同时，根据每条Oligo的不同浓度样品绘出回归直线，可以算得回归直线方程及相关系数R2如下：
Oligo1：y＝-3.3664x+40.11，R2＝0.99937；
Oligo2：y＝-3.384x+40.809，R2＝0.99997；
Oligo3：y＝-3.3824x+38.928，R2＝0.99463。
将每条Oligo对应的A-C号样品根据各个方程进行计算，算得分子数除以对应理论分子数，所得检测效率如下：
Oligo1 Oligo2 Oligo3
A 104.0％ 103.4％ 101.6％
B 110.5％ 105.6％ 101.0％
C 109.0％ 99.0％ 98.5％
因此，平行样品间扩增Ct差值为0.1左右，检测效率为98.5％-110.5％之间，说明三条Oligo分别与其余两条没有非特异性扩增，相互之间不会影响扩增效率。其余Oligo经鉴定可以得到同样结果，说明本实验设计的多条Oligo之间无交叉影响，可以保证多重PCR的特异性、精确性和灵敏度。其他Oligo可以得到同样的结论，由于篇幅原因不一一详细说明。
实施例3制作标准曲线
以Oligo1-13可以得到同样的结果，为了简化过程，以下实施例以Oligo1-3为例。
按照实施例1的步骤，用摩尔当量为5倍的SFB对Oligo2进行修饰得到Oligo-FB，用摩尔当量为10倍的SANH对CD24进行肼基修饰得到CD24-SANH，将摩尔比为10:1的Oligo-FB与CD24-SANH在室温条件下反应16小时后得到CD24-Oligo2。
按照实施例1的步骤，用摩尔当量为20倍的SFB对Oligo3进行修饰得到Oligo-FB，用摩尔当量为50倍的SANH对CD44进行肼基修饰得到CD44-SANH，将摩尔比为8:1的Oligo-FB与CD44-SANH在室温条件下反应24小时后得到CD44-Oligo3。
将CD133-Oligo1、CD24-Oligo2和CD44-Oligo3按照表3的试剂盒和表4的程序进行QPCR扩增，以延伸扩展后的Oligo1-3为模板，得到的扩增结果与Oligo1-3单独扩增一致，说明偶联的抗体部分对Oligo的QPCR扩增没有影响。
用标准品稀释液将CD133-Oligo1、CD24-Oligo2和CD44-Oligo3各自稀释成浓度为：833、2500、8333、25000、83333和250000分子数/2.5μl，共六个浓度，空白对照组为去离子水。
按照表3所示的配方配置PCR扩增试剂盒，然后按照表4所示的程序对以上各浓度的CD133-Oligo1、CD24-Oligo2和CD44-Oligo3进行QPCR扩增，以延伸扩展后的Oligo1-3为模板，扩增结果如表6所示：
表6标准曲线QPCR扩增结果Ct值
浓度(分子数/2.5μl) CD133-Oligo1 CD24-Oligo2 CD44-Oligo3
0 32.39 31.23 32.21
833 31.52 29.18 30.40
2500 30.28 27.95 28.97
8333 28.54 26.36 28.06
25000 26.99 24.66 25.89
83333 25.12 22.75 23.48
250000 23.44 21.02 20.62
根据抗体-Oligo的不同浓度的Ct值，绘出标准曲线，进行线性回归计算，得到回归直线方程及相关系数如下：
CD133-Oligo1：y＝-3.2951x+41.354，R2＝0.99782；
CD24-Oligo2：y＝-3.3332x+39.184，R2＝0.99609；
CD44-Oligo3：y＝-3.872x+42.342，R2＝0.96588。
实施例4CTC细胞抗原的QPCR检测
取不同癌症病人的外周血血液，对血液中的CTC细胞抗原量进行检测。要求受试者血常规白细胞值位于2×106～1.2×107个/mL之间，并且血液样本在处理过程中，样本没有出现以下异常现象：如样本红细胞裂解不完全导致样本细胞粘连、样本红细胞裂解后剩余细胞偏少/白细胞偏少，全血样本出现溶血或血块凝结。并且受试者相关信息完整，样本采集、保存方法规范，实验操作规范，具体步骤如下：
(1)取不同癌症病人血液3ml，加入12mL细胞裂解液，轻轻颠倒充分混匀。然后将样品置于2-8℃冰箱中裂解15min后离心弃上清，加入10mLPBS洗涤细胞；离心弃上清，再加入400μLPBS重悬细胞。
(2)加入100μlblockingbuffer后室温封闭20min；再加入CD133-Oligo1、CD24-Oligo2和CD44-Oligo3探针后，在室温孵育40min后终止反应并离心去上清。
(3)使用PBS洗涤细胞3遍后加入120ul洗脱液混合均匀，冰上孵育2min，离心取100ul上清，洗脱未反应的探针；最后加入20μL反应中和液中和。
用实施例3制作标准曲线相同的QPCR条件检测CD133-Oligo1、CD24-Oligo2和CD44-Oligo3探针的Ct值，结果如表7所示：
表7CTC的QPCR检测结果
实施例5CTC细胞抗原的免疫荧光检测
为了检测本发明试剂盒检测结果的可靠性，对与实施例4相同的血液进行免疫荧光检测，其步骤如下：
(1)取与实施例4相同的病人血液3ml，加入12mL细胞裂解液，轻轻颠倒充分混匀。然后将样品置于2-8℃冰箱中裂解15min后离心弃上清，加入10mLPBS洗涤细胞；离心弃上清，再加入400μLPBS重悬细胞。
(2)使用CD45磁珠去除部分白细胞，离心后使用100ulPBS重悬细胞。
(3)加入浓度为4％的多聚甲醛溶液固定后涂片，PBS洗三遍后封闭30分钟，PBS再洗三遍。
(4)分别加入各个标记的一抗CD133、CD24和CD44抗体，在4℃湿盒内过夜，PBS洗三遍。
(5)DAPI染核并封片后，用荧光显微镜鉴定计数，结果如表8所示：
表8CTC的免疫荧光检测结果
从表7和表8的检测结果可以看出，Ct值越低的样品，含有的抗原分子个数越高。而镜检所得荧光阳性CTC个数越多，即CD133、CD24及CD44含量越多，荧光阳性CTC个数即有侵袭力的CTC个数越多，表明Ct值与镜检个数二者呈负相关，一致性良好。从检测结果来看，C和E号病人的CD133、CD24及CD44含量较多，CSC表达量高于A、B、D号病人。
对上述A-E编号的病人进行术后跟踪，术后复发的结果如表9所示：
表9术后复发结果
病人编号 术后复发
A 无复发临床表征
B 无复发临床表征
C 术后3个月复发
D 无复发临床表征
E 术后3个月复发
通过表9可以看出，C、E组的病人术后3个月复发，说明其CTC细胞的侵袭力较强，结果与表7、8一致。
对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于：它包括：
由CD133、CD24和CD44抗体各自独立的与不同的寡核苷酸偶联得到的抗体-寡核苷酸探针；
用于将上述抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液；
还包括荧光探针。
2.根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于：所述抗体-寡核苷酸探针包括寡核苷酸探针部分和抗体部分；所述寡核苷酸探针部分是将寡核苷酸的5'端进行醛基修饰后得到的，所述抗体部分是将抗体进行肼基修饰后得到的；所述寡核苷酸探针部分和所述抗体部分经过偶联得到所述抗体-寡核苷酸探针。
3.根据权利要求2所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于：所述寡核苷酸探针部分是将5’端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔当量为5-20倍的SFB进行醛基修饰后得到的；所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-30倍的SANH进行肼基修饰后得到的。
4.根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于：所述抗体-寡核苷酸探针是将摩尔比为(7-10):1的寡核苷酸探针部分和抗体部分，在室温条件下反应12-24小时后得到的。
5.根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于：所述寡核苷酸的长度为16-22nt，5’端为6-14nt长度的引物识别序列，3’端用延伸引物进行延伸扩展。
6.根据权利要求5所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于：所述延伸引物的长度为50-80nt，它的3’端末端与寡核苷酸的3’端互补配对，5’端可以形成发卡结构，且中间序列与荧光探针的序列互补。
7.根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于：所述寡核苷酸的序列为SEQIDNO：1-13中所示的任一个。
8.根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于：所述扩增引物中包括一对用于将抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的正向、反向引物，所述正向引物的5’端与寡核苷酸互补。
9.根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于：所述循环肿瘤细胞为宫颈癌、乳腺癌或前列腺癌循环肿瘤细胞中的一种或多种。
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