CN114592047A - 一种检测循环肿瘤细胞的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测循环肿瘤细胞的方法及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种检测循环肿瘤细胞的方法，先使用分别偶联有寡核苷酸A、B的抗体A、B对待测样本中的循环肿瘤细胞进行标记，然后使用核酸外切酶对经标记的循环肿瘤细胞进行消化，再对经消化的循环肿瘤细胞进行细胞裂解和核酸提取，最后以双链探针和肿瘤核酸标志物为靶标对提取而得的核酸体系进行qPCR，并根据qPCR的结果，判断待测样本中循环肿瘤细胞的数量和类型，抗体A、B能够与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原特异性结合，寡核苷酸A、B能够组成一对末端互补的邻位探针，邻位探针经延伸后形成能够与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原特异性结合的双链探针。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测循环肿瘤细胞的方法及其应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
循环肿瘤细胞（CTC）是从原发肿瘤灶脱落并释放到外周血液循环中的肿瘤细胞，大部分CTC在进入外周血后会发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险，造成临床上高达90%的癌症相关死亡率。
从外周血中分离CTC的可能性使得CTC可作为转移性肿瘤的“液体活检”，并以非侵入性的方式提供癌症相关信息。临床研究表明，癌症患者外周血中的CTC计数与其疾病相关，可以指示疾病进展并评估治疗反应（具体可见参考文献“Cohen, S. J. et al.Relationship of circulating tumor cells to tumor response,progression-freesurvival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer.Clin. Oncol. 26, 3213–3221 (2008).”和“Riethdorf, S. et al. Detection and HER2expression of circulating tumor cells:prospective monitoring in breast cancerpatients treated in the neoadjuvant GeparQuattro trial. Clin. Cancer Res. 16,2634–2645 (2010).”）。基于与癌症高度相关的丰富内在信息，CTC的分离和检测对于临床研究和治疗至关重要。
目前，常使用磁珠法、反向富集法、微流控法等技术实现外周血中CTC的分离，对于CTC的检测，则常通过先使用免疫荧光标记技术对分离的CTC进行标记，再使用荧光显微镜或流式细胞术对标记后的CTC进行检测的方法来实现。尽管这种基于免疫荧光标记技术的CTC检测方法表现出很高的特异性，但其敏感性并不足以在癌症早期检测稀有细胞。
为了提高CTC检测方法的灵敏度，有研究提出将逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）应用于CTC计数（具体可见参考文献“Guo W, Yang X R, Sun Y F, et al. Clinicalsignificance of EpCAM mRNA-positive circulating tumor cells in hepatocellularcarcinoma by an optimized negative enrichment and qRT-PCR–based platform[J].Clinical cancer research, 2014, 20(18): 4794-4805.”）。然而，研究发现，在许多癌细胞中存在解除基因表达调控的转录后调控，这种调节通过改变mRNA稳定性或转录效率来改变基因表达，并使蛋白质含量与mRNA水平无关（具体可见参考文献“Audic Y, Hartley RS(2004) Post-transcriptional regulation in cancer. Biol Cell 96: 479–498.”、“Crowe DL (1993) Retinoic acid mediates post-transcriptional regulation ofkeratin 19 mRNA levels. J Cell Sci 106 (Pt 1): 183–188.”和“Su L, Morgan PR,Lane EB (1996) Expression of cytokeratin messenger RNA versus protein”）。这一发现严重阻碍了RT-PCR在CTC检测方法中的实际应用。
GenoSaber Biotech则提出了叶酸靶向PCR（LT-PCR）在通过表面蛋白检测CTC方面极具应用前景。在这种CTC检测方法中，标记上寡核苷酸（Oligo）的肿瘤特异性配体叶酸偶联物作为衔接分子将CTC转化为检测分子“寡核苷酸”，以达到信号放大的目的。这种通过PCR检测CTC表面抗原的CTC检测方法虽具有高灵敏度，可实现CTC的定量分析，但其反应体系中未标记上的游离寡核苷酸会对检测结果造成干扰。现阶段，清除游离寡核苷酸的手段主要为将反应体系反复离心清洗后，将CTC上标记的寡核苷酸洗脱下来并离心收集以用于检测。离心给操作带来不便的同时，也必然会导致CTC的损失，严重影响了CTC检测的准确性。
因此，基于PCR的检测循环肿瘤细胞的方法仍需要进一步探索，以使CTC的检测更加快速、高效和准确。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种检测循环肿瘤细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
标记步骤：同时使用偶联有寡核苷酸A的抗体A和偶联有寡核苷酸B的抗体B对待测样本中的循环肿瘤细胞进行标记，得到经标记的循环肿瘤细胞；所述抗体A和抗体B能够与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原特异性结合；所述寡核苷酸A和寡核苷酸B能够组成一对末端互补的邻位探针；所述邻位探针经DNA聚合酶延伸后形成能够与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原特异性结合的双链探针；
延伸步骤：使用DNA聚合酶对经标记的循环肿瘤细胞进行延伸，使得分别通过抗体A和抗体B标记在循环肿瘤细胞表面的寡核苷酸A和寡核苷酸B形成双链探针，得到经延伸的循环肿瘤细胞；
消化步骤：使用核酸外切酶对经延伸的循环肿瘤细胞进行消化，去除未形成双链探针的寡核苷酸A和寡核苷酸B，得到经消化的循环肿瘤细胞；
提取步骤：对经消化的循环肿瘤细胞进行核酸提取，释放双链探针，得到核酸体系；或者，对经消化的循环肿瘤细胞进行核酸提取，释放双链探针和肿瘤核酸标志物，得到核酸体系；
检测步骤：以双链探针为靶标对核酸体系进行荧光定量PCR，并根据荧光定量PCR的结果，判断待测样本中循环肿瘤细胞的数量和类型；或者，以双链探针和肿瘤核酸标志物为靶标对核酸体系进行多重荧光定量PCR，并根据多重荧光定量PCR的结果，判断待测样本中循环肿瘤细胞的数量和类型。
在本发明的一种实施方式中，所述特异性抗原为EpCAM、GPC3、CD133或HK2中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述抗体为anti-EpCAM、anti-GPC-3、anti-CD133或anti-HK2中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述肿瘤核酸标志物为TP53 R249S突变、TP53V157F突变、TP53 R175H突变、TP53 R248W突变、TP53 R273H突变、CTNNB1 D32G突变、CTNNB1S33Y突变、CTNNB1 G34V突变、CTNNB1 S45F突变、TERT C228T突变或TERT C250T突变中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，在标记步骤之前，所述方法还包括富集步骤；所述富集步骤为：对待测样本中的循环肿瘤细胞进行富集。
在本发明的一种实施方式中，在消化步骤与裂解步骤之间，所述方法还包括清洗步骤；所述清洗步骤为：使用清洗液对经消化的循环肿瘤细胞进行清洗。
在本发明的一种实施方式中，所述清洗液为缓冲液或水中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述寡核苷酸A和寡核苷酸B的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
在本发明的一种实施方式中，当寡核苷酸A和寡核苷酸B的核苷酸序列分别为SEQID NO:1和SEQ ID NO:2时，对核酸体系中的寡核苷酸进行荧光定量PCR的上游引物、下游引物以及探针的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
在本发明的一种实施方式中，当肿瘤核酸标志物为TP53 R249S突变时，对核酸体系中的肿瘤核酸标志物进行荧光定量PCR的上游引物、下游引物以及探针的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
在本发明的一种实施方式中，当肿瘤核酸标志物为CTNNB1 S45F突变时，对核酸体系中的肿瘤核酸标志物进行荧光定量PCR的上游引物、下游引物以及探针的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。
在本发明的一种实施方式中，所述标记步骤为：将偶联有寡核苷酸的抗体与待测样本混合后，于20~30℃下孵育30~60min进行标记，得到经标记的循环肿瘤细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述延伸步骤为：将延伸Mix与经标记的循环肿瘤细胞混合后，于30~400℃下孵育10~20min进行延伸，得到经延伸的循环肿瘤细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述消化步骤为：将核酸外切酶与经延伸的循环肿瘤细胞混合后，于20~65℃下孵育10~120min进行消化，得到经消化的循环肿瘤细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述提取步骤为：将经消化的循环肿瘤细胞表面标记的核酸进行解离，或者，依次对经消化的循环肿瘤细胞进行细胞裂解和核酸提取，释放双链探针，得到核酸体系；或者，所述提取步骤为：将经消化的循环肿瘤细胞表面标记的核酸进行解离，或者，依次对经消化的循环肿瘤细胞进行细胞裂解和核酸提取，释放双链探针和肿瘤核酸标志物，得到核酸体系。
在本发明的一种实施方式中，所述提取步骤为：将细胞裂解液与经消化的循环肿瘤细胞混合后，于20~30℃下孵育5~10min进行裂解，释放双链探针，得到裂解体系；使用核酸提取试剂盒提取裂解体系中的核酸，得到核酸体系。
在本发明的一种实施方式中，所述判断待测样本中循环肿瘤细胞的数量为：将已知数量的循环肿瘤细胞样本进行浓度梯度稀释；通过上述方法对梯度稀释的循环肿瘤细胞样本中的靶标进行荧光定量PCR或多重荧光定量PCR；以循环肿瘤细胞数量为x轴，以梯度稀释的循环肿瘤细胞样本中靶标的Ct值为y轴，绘制标准曲线；通过上述方法对待测样本中的靶标进行荧光定量PCR或多重荧光定量PCR，得到待测样本中靶标的Ct值；将待测样本中靶标的Ct值带入标准曲线，计算得到待测样本中循环肿瘤细胞的数量。
在本发明的一种实施方式中，所述判断待测样本中循环肿瘤细胞的类型为：将已知数量的循环肿瘤细胞样本进行浓度梯度稀释；通过上述方法对梯度稀释的循环肿瘤细胞样本中的靶标进行荧光定量PCR或多重荧光定量PCR；以循环肿瘤细胞数量为x轴，以梯度稀释的循环肿瘤细胞样本中靶标的Ct值为y轴，绘制标准曲线；通过上述方法对待测样本中的靶标进行荧光定量PCR或多重荧光定量PCR，得到待测样本中靶标的Ct值；通过梯度稀释的循环肿瘤细胞样本中靶标的Ct值范围确定阴阳性阈值，通过待测样本中靶标的Ct值判断待测样本中靶标的阴阳性，通过多种靶标的阴阳性状态，判断待测样本中的循环肿瘤细胞属于何种类型。
本发明还提供了一种用于实施上述方法的微流控CTC芯片，所述微流控CTC芯片用于荧光定量PCR，包括上片、下片以及滤膜；所述上片与下片相贴的一面依次设有进样口、第一流道、第一凹槽、第二流道、第一出样口和第二出样口；所述进样口和第一凹槽之间通过第一流道相连通；所述第一凹槽和第一出样口之间通过第二流道相连通；所述下片与上片相贴的一面依次设有第二凹槽和第三流道；所述第二凹槽和第三流道相连通；所述第一凹槽和第二凹槽相合，共同形成微流控CTC芯片的混液腔；所述滤膜设于第一凹槽和第二凹槽之间；所述第一出样口和第二出样口与第三流道相连通。
在本发明的一种实施方式中，所述第一凹槽内设有若干缓冲块。
本发明还提供了一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒的成分包含偶联有寡核苷酸A的抗体A、偶联有寡核苷酸B的抗体B、核酸外切酶以及对双链探针进行荧光定量PCR所需的试剂；所述抗体A和抗体B能够与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原特异性结合；所述寡核苷酸A和寡核苷酸B能够组成一对末端互补的邻位探针；所述邻位探针经DNA聚合酶延伸后形成能够与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原特异性结合的双链探针。
在本发明的一种实施方式中，所述特异性抗原为EpCAM、GPC3、CD133或HK2中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述抗体为anti-EpCAM、anti-GPC-3、anti-CD133或anti-HK2中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述寡核苷酸A和寡核苷酸B的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
在本发明的一种实施方式中，当寡核苷酸A和寡核苷酸B的核苷酸序列分别为SEQID NO:1和SEQ ID NO:2时，所述对寡核苷酸进行荧光定量PCR所需的试剂包括核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的上游引物、下游引物以及探针。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的成分还包含对肿瘤核酸标志物进行荧光定量PCR所需的试剂。
在本发明的一种实施方式中，所述肿瘤核酸标志物为TP53 R249S突变、TP53V157F突变、TP53 R175H突变、TP53 R248W突变、TP53 R273H突变、CTNNB1 D32G突变、CTNNB1S33Y突变、CTNNB1 G34V突变、CTNNB1 S45F突变、TERT C228T突变或TERT C250T突变中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，当肿瘤核酸标志物为TP53 R249S突变时，对肿瘤核酸标志物进行荧光定量PCR所需的试剂包括核苷酸序列分别为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的上游引物、下游引物以及探针。
在本发明的一种实施方式中，当肿瘤核酸标志物为CTNNB1 S45F突变时，对肿瘤核酸标志物进行荧光定量PCR所需的试剂包括核苷酸序列分别为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的上游引物、下游引物以及探针。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的成分还包含细胞裂解液。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的成分还包含清洗液。
在本发明的一种实施方式中，所述清洗液为缓冲液或水中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的成分还包含上述微流控CTC芯片。
本发明还提供了上述方法或上述微流控CTC芯片或上述试剂盒在检测循环肿瘤细胞中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种检测循环肿瘤细胞的方法，所述方法为：先同时使用偶联有寡核苷酸A的抗体A和偶联有寡核苷酸B的抗体B对待测样本中的循环肿瘤细胞进行标记，得到经标记的循环肿瘤细胞，然后使用核酸外切酶对经标记的循环肿瘤细胞进行消化，去除未形成双链探针的寡核苷酸A和寡核苷酸B，得到经消化的循环肿瘤细胞，再对经消化的循环肿瘤细胞依次进行细胞裂解和核酸提取，释放双链探针，得到核酸体系，最后以双链探针为靶标对核酸体系进行荧光定量PCR，并根据荧光定量PCR的结果，判断待测样本中循环肿瘤细胞的数量和类型；或者，以双链探针和肿瘤核酸标志物为靶标对核酸体系进行多重荧光定量PCR，并根据多重荧光定量PCR的结果，判断待测样本中循环肿瘤细胞的数量和类型，其中，所述抗体A和抗体B能够与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原特异性结合，所述寡核苷酸A和寡核苷酸B能够组成一对末端互补的邻位探针，所述邻位探针经DNA聚合酶延伸后形成能够与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原特异性结合的双链探针；所述方法具有以下优势：
（1）所述方法通过蛋白及核酸多个靶标的联合对待测样本中的循环肿瘤细胞进行联合检测，一方面提高了检测特异性及灵敏度，降低了假阳性风险，另一方面为疾病分型提供了更丰富的证据，提高CTC检测的准确性；
（2）所述方法使用的荧光定量PCR可以将待测核酸数量几何级数的扩增，进而实现信号放大，相比于无放大的免疫荧光标记方法极大的提高检测灵敏度；
（3）传统的蛋白检测方法如免疫组织化学、ELLSA、WB等与核算检测方法如测序、PCR、FISH等，其实现方式和检测仪器均有较大差异，因此很难实现针对同一样本的多靶标同时检测，所述方法将蛋白信号转化为核酸信号，进而通过多重PCR一体化的检测，使同一样本同时检测蛋白和核酸标志物成为可能，实现了蛋白及核酸多个靶标的一体化检测，简化了检测流程。
（4）所述方法采用加入核酸外切酶的方法处理未标记核酸，即通过邻位延伸技术，使得与抗原结合的核酸可以互补形成稳定双链，而未标记核酸是游离单链，然后利用可特异性水解单链的核酸外切酶即可去除未标记核酸，进而无需清洗，即可避免残留核酸对后续实验的干扰，极大提高了检测灵敏度。
附图说明
图1：微流控CTC芯片中上片的结构示意图。
图2：微流控CTC芯片中下片的结构示意图。
图3：微流控CTC芯片的整体结构示意图。
图4：对核酸体系中的双链探针进行荧光定量PCR的检测原理图。
图5：双链探针系列标准品的扩增曲线。
图6：双链探针系列标准品的熔解曲线。
图7：双链探针系列标准品的标准曲线。
图8：样本经过不同清洗方式后的扩增曲线（以双链探针为靶标）。
图9：含有10个CTC样品和无细胞样品的扩增曲线（以双链探针为靶标）。
图10：样本中不同靶标（双链探针、TP53 R249S突变和CTNNB1 S45F突变）的扩增曲线。
图11：样本经过消化处理后的扩增曲线（能区分阴性阳性）。
图12：样本不经过消化处理的扩增曲线（阳性信号跟阴性无法区分）。
图1~2中，上片1、下片2、进样口3、第一流道4、第一凹槽5、第二流道6、第一出样口7、第二出样口8、第二凹槽9、第三流道10、缓冲块11。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：一种微流控CTC芯片
如图1~3所示，本实施例提供了一种微流控CTC芯片，所述微流控CTC芯片用于荧光定量PCR，由上片1、下片2以及滤膜组成；所述上片1与下片2相贴的一面依次设有进样口3、第一流道4、第一凹槽5、第二流道6、第一出样口7和第二出样口8；所述进样口3和第一凹槽5之间通过第一流道4相连通；所述第一凹槽5和第一出样7口之间通过第二流道6相连通；所述下片2与上片1相贴的一面依次设有第二凹槽9和第三流道10；所述第二凹槽9和第三流道10相连通；所述第一凹槽5和第二凹槽9相合，共同形成微流控CTC芯片的混液腔；所述滤膜夹在第一凹槽5和第二凹槽9之间；所述第一出样口7和第二出样口8与第三流道10相连通；所述第一凹槽内5设有五个缓冲块11；其中，所述上片1和下片2之间通过去氧离子键合；所述上片和下片的材料为购自道康宁公司的PDMS，所述滤膜为购自Merck公司的TETP01300型号滤膜。
实施例2：一种检测循环肿瘤细胞的的试剂盒
本实施例提供了一种检测循环肿瘤细胞的的试剂盒，所述试剂盒由以下成分组成：
（1）寡核苷酸偶联抗体
抗体（购自Thermo Fisher，型号MA1-10195、14-1331-82）；
寡核苷酸A：
TATAGTTGGCGTGGGTTGGGTGCGCATCTCTAATTTTCTGCAAACACCAACTCCGACTCGCATAGAAAG（SEQ ID NO:1）；
寡核苷酸B：
AAGCTCAGCTCCGGCAGCTTTTACTTCTTTCTCGTCCGCTTCCCACTCCATCTTTCTATGCGAGTCGGA（SEQ ID NO:2）；
将寡核苷酸A和寡核苷酸B通过寡核苷酸偶联试剂盒偶联在抗体上，得到寡核苷酸偶联抗体A和寡核苷酸偶联抗体B，其中，寡核苷酸A与型号MA1-10195的抗体偶联，寡核苷酸B与型号14-1331-82的抗体偶联。
（2）以寡核苷酸延伸形成的双链探针为靶标的引物探针体系
寡核苷酸引物-F：GTTGGGTGCGCATCTCTAAT（SEQ ID NO:3）；
寡核苷酸引物-R；AGCTCCGGCAGCTTTTACTT（SEQ ID NO:4）；
寡核苷酸探针：TTCTGCAAACACCAACTCCGAC（SEQ ID NO:5）。
（3）以肿瘤核酸标志物为靶标的引物探针体系
TP53引物-F：GGAGTCTTCCAGTGTGATGAT（SEQ ID NO:6）；
TP53引物-R：CCACCATCCACTACAACTACA（SEQ ID NO:7）；
TP53 R249S突变探针：ATGGGCCTCCGGTTCATGCC（SEQ ID NO:8）；
CTNNB1引物-F：CAGCAACAGTCTTACCTGGAC（SEQ ID NO:9）；
CTNNB1引物-R：TCATACAGGACTTGGGAGGT（SEQ ID NO:10）；
CTNNB1 S45F突变探针：ACAGCTCCTTCTCTGAGTGG（SEQ ID NO:11）。
实施例3：一种检测循环肿瘤细胞的方法
本实施例提供了一种检测循环肿瘤细胞的方法，所述方法使用实施例1所述的微流控CTC芯片以及实施例2所述的试剂盒在精密蠕动泵（购自保定迪创电子科技有限公司，型号BT100-2J+DG-2A）上进行，包括如下步骤：
富集步骤：在进样口安装进样注射器，第一出样口用堵头堵住，第二出样口连接蠕动泵管，待测样本加载在进样注射器中；调节蠕动泵的流速，使得进样注射器中的待测样本在负压的驱动下以3mL/min的流速通过滤膜，此过程中，循环肿瘤细胞被滤膜截留在第一凹槽内，剩余液体则依次经第二凹槽、第三流道和第二出样口流出微流控CTC芯片；截留结束后，用10mL PBS缓冲液（购自Solarbio，货号P1020）清洗第一凹槽内的循环肿瘤细胞；截留和清洗过程保证液体充满混液腔；
封闭步骤：在进样注射器中加入2mL浓度1%（v/v）的牛血清白蛋白（BSA，购自Beyotime，货号ST023-50g）水溶液；调节蠕动泵的流速，使得浓度1%（v/v）的牛血清白蛋白水溶液在负压的驱动下以200μL/min的流速通过滤膜，此过程中，牛血清白蛋白对第一凹槽内的循环肿瘤细胞进行封闭；封闭30min后，用10 mL PBS缓冲液清洗第一凹槽内的循环肿瘤细胞；
标记步骤：关闭蠕动泵，第一出样口连接蠕动泵管，第二出样口用堵头堵住；调节蠕动泵的流速，将溶于100μL PBS缓冲液中的寡核苷酸偶联抗体A和寡核苷酸偶联抗体B（寡核苷酸偶联抗体A和寡核苷酸偶联抗体B在PBS缓冲液中的浓度均为2.5μg/mL）用蠕动泵以200μL/min的流速加入混液腔中后，于室温（25℃）孵育60min，此过程中，寡核苷酸偶联抗体A和寡核苷酸偶联抗体B对第一凹槽内的循环肿瘤细胞进行标记；
延伸步骤：将溶于80μL PBS缓冲液的20μL延伸Mix（购自翌圣公司，货号10108ES03）用蠕动泵以200μL/min的流速加入混液腔中后，于37℃孵育15min，此过程中，寡核苷酸A和寡核苷酸B在DNA聚合酶的作用下延伸，形成能够与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原特异性结合的双链探针；
消化步骤：将溶于100μL PBS缓冲液的0.01mg核酸外切酶（购自Thermo Fisher，货号720735KU）用蠕动泵以200μL/min的流速加入混液腔中后，于室温（25℃）孵育120min，此过程中，核酸外切酶对第一凹槽内未形成双链探针的寡核苷酸A和寡核苷酸B进行消化；
裂解步骤：调节蠕动泵的流速，将300μL细胞裂解液（购自Thermo Fisher，货号4405443）用蠕动泵以100μL/min的流速加入混液腔中后，于室温（25℃）孵育10min，此过程中，细胞裂解液对第一凹槽内的循环肿瘤细胞进行裂解，释放核酸；裂解结束后，在第一出样口收集裂解体系，并使用核酸提取试剂盒（购自Thermo Fisher，货号A29319）提取裂解体系中的核酸，得到核酸体系；
检测步骤：在实时荧光定量PCR仪（购自ThermoFisher公司，型号QuantStudio™ 7Flex）上使用以寡核苷酸延伸形成的双链探针为靶标的引物探针体系和以肿瘤核酸标志物为靶标的引物探针体系对核酸体系中的寡核苷酸和肿瘤核酸标志物进行多重荧光定量PCR（对核酸体系中的双链探针进行荧光定量PCR的检测原理见图2），并根据多重荧光定量PCR的结果，判断待测样本中循环肿瘤细胞的数量和类型；多重荧光定量PCR中，抗体指标用FAM通道，突变指标TP53 R249S用VIC通道，突变指标CTNNB1 S45F用CY5通道，反应程序为：95℃，持续30s；95℃，持续10s，60℃，持续30s（45个循环）；
其中，判断待测样本中循环肿瘤细胞的数量为：以含有1000个/mL循环肿瘤细胞（购自中国科学院细胞库）的水溶液作为样本，使用PBS缓冲液将样本进行浓度梯度稀释至1000、100、50、10、5和1个/mL；通过上述方法对浓度梯度稀释的循环肿瘤细胞样本中的靶标进行荧光定量PCR或多重荧光定量PCR；以循环肿瘤细胞数量为x轴，以梯度稀释的循环肿瘤细胞样本中靶标的Ct值为y轴，绘制标准曲线；通过上述方法对待测样本中的靶标进行荧光定量PCR或多重荧光定量PCR，得到待测样本中靶标的Ct值；将待测样本中靶标的Ct值带入标准曲线，计算得到待测样本中循环肿瘤细胞的数量；
判断待测样本中循环肿瘤细胞的类型为：以含有1000个/mL循环肿瘤细胞（购自中国科学院细胞库）的水溶液作为样本，使用PBS缓冲液将样本进行浓度梯度稀释至1000、100、50、10、5和1个/mL；通过上述方法对浓度梯度稀释的循环肿瘤细胞样本中的靶标进行荧光定量PCR或多重荧光定量PCR；以循环肿瘤细胞数量为x轴，以梯度稀释的循环肿瘤细胞样本中靶标的Ct值为y轴，绘制标准曲线；通过上述方法对待测样本中的靶标进行荧光定量PCR或多重荧光定量PCR，得到待测样本中靶标的Ct值；通过梯度稀释的循环肿瘤细胞样本中靶标的Ct值范围确定阴阳性阈值，通过待测样本中靶标的Ct值判断待测样本中靶标的阴阳性，通过多种靶标的阴阳性状态，判断待测样本中的循环肿瘤细胞属于何种类型。
对核酸体系中的双链探针进行荧光定量PCR的检测原理见图4。双链探针系列标准品的扩增曲线和熔解曲线见图5~6。双链探针系列标准品的标准曲线见图7。从图7可知，以循环肿瘤细胞数量为x轴，以梯度稀释的循环肿瘤细胞样本中靶标的Ct值为y轴绘制得到的标准曲线相关性R2可达0.99，扩增效率Eff可达94.84%，说明检测体系符合要求。
实验例1：清洗方式对人血液中白细胞表面DNA残留量的影响
本实施例提供了清洗方式对人血液中白细胞表面DNA残留量的影响实验，实验所用样本如下：
取10mL外周血样本（取自苏州科技城医院，此样本为健康血样，无肿瘤细胞）与10倍体积的一步裂解固定液（购自Thermo Fisher，型号00-5333-54）混合后，于室温（25℃）孵育1h，得到待测样本；
实验过程如下：
实验组（微流控过滤法+邻位延伸技术）：采用实施例3的方法将待测样本通入实施例1所述的微流控CTC芯片中，在蠕动泵的驱动下完成富集、封闭、标记、延伸、消化、裂解和检测步骤（检测步骤单独以寡核苷酸延伸形成的双链探针为靶标），得到样本的扩增曲线，扩增曲线见图8；
对照组1（离心法）：参照文献“Lou J, Ben S, Yang G, et al. Quantificationof rare circulating tumor cells in non-small cell lung cancer by ligand-targeted PCR[J]. PloS one, 2013, 8(12): e80458.”对待测样本进行循环肿瘤细胞检测，得到样本的扩增曲线，此文献采用传统离心法对核酸化抗体标记的细胞进行清洗，去除未结合的寡核苷酸，扩增曲线见图8；
对照组2（微流控过滤法）：在实验组的基础上，单独采用微流控过滤法对滤膜上的细胞提供横向剪切力，去除未结合的寡核苷酸（即在实施例3的基础上，去除延伸和消化步骤），扩增曲线见图8。
如图8所示，实施例3中微流控过滤法和邻位延伸技术的结合可以大大降低残留DNA的背景干扰。
实验例2：循环肿瘤细胞检测的灵敏度评估
本实施例提供了循环肿瘤细胞检测的灵敏度评估实验，实验所用样本如下：
在1mL外周血样本（取自苏州科技城医院，此样本为健康血样，无肿瘤细胞）中掺入10个循环肿瘤细胞（购自中国科学院细胞库）后，与10倍体积的一步裂解固定液（购自Thermo Fisher，型号00-5333-54）混合，并于室温（25℃）孵育1h，得到含有10个CTCs的待测样本1；
取1mL外周血样本（取自苏州科技城医院，此样本为健康血样，无肿瘤细胞）与10倍体积的一步裂解固定液（购自Thermo Fisher，型号00-5333-54）混合后，于室温（25℃）孵育1h，得到无CTC的待测样本2；
实验过程如下：
实验组：采用实施例3的方法将待测样本1通入实施例1所述的微流控CTC芯片中，在蠕动泵的驱动下完成富集、封闭、标记、延伸、消化、裂解和检测步骤（检测步骤单独以寡核苷酸延伸形成的双链探针为靶标），得到样本的扩增曲线，扩增曲线见图9；
对照组：采用实施例3的方法将待测样本2通入实施例1所述的微流控CTC芯片中，在蠕动泵的驱动下完成富集、封闭、标记、延伸、消化、裂解和检测步骤（检测步骤单独以寡核苷酸延伸形成的双链探针为靶标），得到样本的扩增曲线，扩增曲线见图9。
如图9所示，实验组和对照组有明显的Ct值区分，说明在微流控的基础上结合邻位延伸技术对待测样本中的循环肿瘤细胞进行检测，检测灵敏度高，每毫升血液中至少能检测到10个CTCs。
实验例3：循环肿瘤细胞检测的多指标一体化综合评估
本实施例提供了循环肿瘤细胞检测的多指标一体化综合评估实验，实验所用样本如下：
在1mL外周血样本（取自苏州科技城医院，此样本为健康血样，无肿瘤细胞）中掺入500个循环肿瘤细胞（购自中国科学院细胞库）后，与10倍体积的一步裂解固定液（购自Thermo Fisher，型号00-5333-54）混合，并于室温（25℃）孵育1h，得到含有500个CTCs的待测样本；
实验过程如下：
采用实施例3的方法将待测样本通入实施例1所述的微流控CTC芯片中，在蠕动泵的驱动下完成富集、封闭、标记、延伸、消化、裂解和检测步骤（检测步骤以寡核苷酸延伸形成的双链探针和肿瘤核酸标志物为靶标），得到样本的扩增曲线，扩增曲线见图10。
如图10所示，含有500个CTCs的待测样本用实施例3的方法能明显检测出相关抗体指标和突变指标，说明实施例3的方法能实现循环肿瘤细胞的多指标一体化综合评估。
实验例4：循环肿瘤细胞检测的准确性评估
本实施例提供了循环肿瘤细胞检测的准确性评估实验，实验所用样本如下：
在1mL外周血样本（取自苏州科技城医院，此样本为健康血样，无肿瘤细胞）中掺入10个循环肿瘤细胞（购自中国科学院细胞库）后，与10倍体积的一步裂解固定液（购自Thermo Fisher，型号00-5333-54）混合，并于室温（25℃）孵育1h，得到含有10个CTCs的待测样本1；
取1mL外周血样本（取自苏州科技城医院，此样本为健康血样，无肿瘤细胞）与10倍体积的一步裂解固定液（购自Thermo Fisher，型号00-5333-54）混合后，于室温（25℃）孵育1h，得到无CTC的待测样本2；
实验过程如下：
实验组：采用实施例3的方法将待测样本1和待测样本2分别通入实施例1所述的微流控CTC芯片中，在蠕动泵的驱动下完成富集、封闭、标记、延伸、消化、裂解和检测步骤（检测步骤单独以寡核苷酸延伸形成的双链探针为靶标），得到样本的扩增曲线，扩增曲线见图11；
对照组：在实验组的基础上，去除消化步骤，得到样本的扩增曲线，扩增曲线见图12。
如图11~12所示，有消化步骤处理的样本，阴阳性的扩增曲线Ct值有明显区分（图11，阳性Ct值30~33，阴性Ct值36~38），没有消化步骤处理的样本，阴阳性的扩增曲线Ct值无法区分（图12），说明消化步骤能显著降低最终的非特异信号，降低阴性背景，提升检测灵敏度。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
<120> 一种检测循环肿瘤细胞的方法及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tatagttggc gtgggttggg tgcgcatctc taattttctg caaacaccaa ctccgactcg 60
catagaaag 69
<210> 2
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aagctcagct ccggcagctt ttacttcttt ctcgtccgct tcccactcca tctttctatg 60
cgagtcgga 69
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gttgggtgcg catctctaat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
agctccggca gcttttactt 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ttctgcaaac accaactccg ac 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggagtcttcc agtgtgatga t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ccaccatcca ctacaactac a 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
atgggcctcc ggttcatgcc 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cagcaacagt cttacctgga c 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tcatacagga cttgggaggt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
acagctcctt ctctgagtgg 20
Claims (10)
1.一种检测循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
标记步骤：同时使用偶联有寡核苷酸A的抗体A和偶联有寡核苷酸B的抗体B对待测样本中的循环肿瘤细胞进行标记，得到经标记的循环肿瘤细胞；所述抗体A和抗体B能够与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原特异性结合；所述寡核苷酸A和寡核苷酸B能够组成一对末端互补的邻位探针；所述邻位探针经DNA聚合酶延伸后形成能够与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原特异性结合的双链探针；
延伸步骤：使用DNA聚合酶对经标记的循环肿瘤细胞进行延伸，使得分别通过抗体A和抗体B标记在循环肿瘤细胞表面的寡核苷酸A和寡核苷酸B形成双链探针，得到经延伸的循环肿瘤细胞；
消化步骤：使用核酸外切酶对经延伸的循环肿瘤细胞进行消化，去除未形成双链探针的寡核苷酸A和寡核苷酸B，得到经消化的循环肿瘤细胞；
提取步骤：对经消化的循环肿瘤细胞进行核酸提取，释放双链探针，得到核酸体系；或者，对经消化的循环肿瘤细胞进行核酸提取，释放双链探针和肿瘤核酸标志物，得到核酸体系；
检测步骤：以双链探针为靶标对核酸体系进行荧光定量PCR，并根据荧光定量PCR的结果，判断待测样本中循环肿瘤细胞的数量和类型；或者，以双链探针和肿瘤核酸标志物为靶标对核酸体系进行多重荧光定量PCR，并根据多重荧光定量PCR的结果，判断待测样本中循环肿瘤细胞的数量和类型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在标记步骤之前，所述方法还包括富集步骤；所述富集步骤为：对待测样本中的循环肿瘤细胞进行富集。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在消化步骤与裂解步骤之间，所述方法还包括清洗步骤；所述清洗步骤为：使用清洗液对经消化的循环肿瘤细胞进行清洗。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记步骤为：将偶联有寡核苷酸的抗体与待测样本混合后，于20~30℃下孵育30~60min进行标记，得到经标记的循环肿瘤细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化步骤为：将核酸外切酶与经延伸的循环肿瘤细胞混合后，于20~65℃下孵育10~120min进行消化，得到经消化的循环肿瘤细胞。
6.如权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，所述提取步骤为：将经消化的循环肿瘤细胞表面标记的核酸进行解离，或者，依次对经消化的循环肿瘤细胞进行细胞裂解和核酸提取，释放双链探针，得到核酸体系；或者，所述提取步骤为：将经消化的循环肿瘤细胞表面标记的核酸进行解离，或者，依次对经消化的循环肿瘤细胞进行细胞裂解和核酸提取，释放双链探针和肿瘤核酸标志物，得到核酸体系。
7.一种用于实施权利要求1~6任一项所述的方法的微流控CTC芯片，其特征在于，所述微流控CTC芯片用于荧光定量PCR，包括上片、下片以及滤膜；所述上片与下片相贴的一面依次设有进样口、第一流道、第一凹槽、第二流道、第一出样口和第二出样口；所述进样口和第一凹槽之间通过第一流道相连通；所述第一凹槽和第一出样口之间通过第二流道相连通；所述下片与上片相贴的一面依次设有第二凹槽和第三流道；所述第二凹槽和第三流道相连通；所述第一凹槽和第二凹槽相合，共同形成微流控CTC芯片的混液腔；所述滤膜设于第一凹槽和第二凹槽之间；所述第一出样口和第二出样口与第三流道相连通。
8.一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的成分包含偶联有寡核苷酸A的抗体A、偶联有寡核苷酸B的抗体B、核酸外切酶以及对双链探针进行荧光定量PCR所需的试剂；所述抗体A和抗体B能够与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原特异性结合；所述寡核苷酸A和寡核苷酸B能够组成一对末端互补的邻位探针；所述邻位探针经DNA聚合酶延伸后形成能够与循环肿瘤细胞表面的特异性抗原特异性结合的双链探针。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的成分还包含对肿瘤核酸标志物进行荧光定量PCR所需的试剂。
10.权利要求1~6任一项所述的方法或权利要求7所述的微流控CTC芯片或权利要求8或9所述的试剂盒在检测循环肿瘤细胞中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115641916A (zh) * | 2022-09-29 | 2023-01-24 | 杭州准芯生物技术有限公司 | 一种分子生物学检测方法、计算机设备及可读存储介质 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105675870A (zh) * | 2016-04-05 | 2016-06-15 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒 |
| CN105823878A (zh) * | 2016-04-05 | 2016-08-03 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒 |
| CN108430336A (zh) * | 2015-11-11 | 2018-08-21 | 格拉茨医科大学 | 循环细胞、蛋白质和核酸的体内收集和局部定量以及特征分析 |
| CN109517728A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-03-26 | 南通大学附属医院 | 循环肿瘤细胞过滤微流控制装置、其制备工艺及工作方法 |
| CN109852530A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-06-07 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种集循环肿瘤细胞捕获、裂解与核酸检测于一体的微流控芯片及其装置以及方法 |
| CN111733072A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-10-02 | 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所 | 一种循环肿瘤细胞筛选分离装置及方法和应用 |
-
2022
- 2022-04-24 CN CN202210433311.1A patent/CN114592047B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108430336A (zh) * | 2015-11-11 | 2018-08-21 | 格拉茨医科大学 | 循环细胞、蛋白质和核酸的体内收集和局部定量以及特征分析 |
| CN105675870A (zh) * | 2016-04-05 | 2016-06-15 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒 |
| CN105823878A (zh) * | 2016-04-05 | 2016-08-03 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒 |
| CN109517728A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-03-26 | 南通大学附属医院 | 循环肿瘤细胞过滤微流控制装置、其制备工艺及工作方法 |
| CN109852530A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-06-07 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种集循环肿瘤细胞捕获、裂解与核酸检测于一体的微流控芯片及其装置以及方法 |
| CN111733072A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-10-02 | 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所 | 一种循环肿瘤细胞筛选分离装置及方法和应用 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115641916A (zh) * | 2022-09-29 | 2023-01-24 | 杭州准芯生物技术有限公司 | 一种分子生物学检测方法、计算机设备及可读存储介质 |
| CN115641916B (zh) * | 2022-09-29 | 2024-05-03 | 杭州准芯生物技术有限公司 | 一种分子生物学检测方法、计算机设备及可读存储介质 |
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