CN109517728A - 循环肿瘤细胞过滤微流控制装置、其制备工艺及工作方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置，包括负压进样泵和微流控制芯片，微流控制芯片包括上层进样层、塑料微孔过滤膜和下层废液层；塑料微孔过滤膜上均匀布置有若干过滤孔；上层进样层连通样本试管中，下层废液层连接在负压进料泵；本发明还提供一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置的制备工艺，包括以下步骤：上层进样层和下层废液层制备、塑料微孔过滤膜制备、微流控制芯片组装和整体安装；又提供一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置的工作方法，包括以下步骤：制备样本，捕捉肿瘤细胞，加入抗体稀释液，免疫荧光染色观察计数。本发明中将细胞捕获、鉴定集于一体，减少了转移过程中肿瘤细胞细胞的损伤和污染，具有成本低，操作简单等特点。

Description

循环肿瘤细胞过滤微流控制装置、其制备工艺及工作方法

技术领域

本发明属于循环肿瘤细胞识别技术领域，更具体地涉及一种循环肿瘤细胞过滤微流控装置、其制备工艺及工作方法。

背景技术

循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）从原发肿瘤脱落进入外周循环并进一步侵染到远处器官形成转移灶。目前，很多研究证明已经CTC与癌症的发展和转移关系密切。因此，通过检测外周血液中循环肿瘤细胞的变化可以实时监控肿瘤的复发和转移、能够评估肿瘤的进程，具有重要的临床价值。

由于CTC含量稀少并具有异质性，因此检测CTC成为一种挑战。目前，主要有以下几种方法去捕获CTC：1. 密度梯度离心法：是CTC捕获的经典方法之一，但密度梯度离心法回收率较低，富集程度不高，故采用率不高。2. 免疫捕获法与过滤法是目前比较认可的富集手段，目前通过美国FDA认证的Cellsearch系统就是依赖EpCAM抗体进行免疫磁珠分选CTC，但是，由于CTC在转移的过程中会发生上皮-间质的转化（EMT），故一些基于上皮特征的CTC就不能被这种方法检测到。并且该方法成本高、操作复杂、通量低等特点限制了其在临床上的大规模应用。

近年来，过滤法逐渐获得研究者认可，过滤法由于不依赖特异性标志物，相比于免疫捕获法来说，它不受抗原表达或表面标志物丢失的影响，因此对于CTC的富集更加“盲目而全面”，不受不同类型肿瘤细胞及不同病患的影响，可以富集不同类型的CTC。由于对循环肿瘤细胞表型的不完全的认知才需要尽可能全面的捕获所有类型的细胞，包括免疫方法可能漏过的EpCAM不表达或者表达率下降的细胞，而正是这些未知细胞能够提供给研究者更多有关EMT及恶性肿瘤转移过程的信息。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置、其制备工艺及工作方法，以解决背景技术中所提出的问题。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置，其特征在于，包括负压进样泵和微流控制芯片，所述微流控制芯片包括上层进样层、塑料微孔过滤膜和下层废液层；所述塑料微孔过滤膜设置在上层进样层与下层废液层之间，所述塑料微孔过滤膜的上下两端分别与上层进样层、下层废液层密封形成进样腔和出液腔；所述塑料微孔过滤膜上均匀布置有若干过滤孔；所述上层进样层设置有进液口，所述进液口通过进液软管插入样本试管中，所述下层废液层的下端设置有出液口，所述出液口通过出液软管连接在负压进料泵。

进一步的，所述上层进样层设置为长方体结构且长方体结构的下端面开设有上流通凹槽，所述上流通凹槽内均匀布置有若干上支撑柱，所述下层废液层设置为长方体结构且长方体结构的上端面开设有下流通凹槽，所述下流通凹槽的形状、大小与上流通凹槽的形状、大小相同，所述下流通凹槽内在与上支撑柱的下端位置设置有若干下支撑柱，若干所述上支撑柱和若干下支撑柱之间夹持塑料微孔过滤膜。

其中，所述上支撑柱或下支撑柱的直径均为300μm，所述上支撑柱或下支撑柱之间的间距为600μm。

优选的，所述上流通凹槽包括一椭圆状第一主凹槽、对称分设在第一主凹槽两侧的条状第一支凹槽和第二支凹槽，所述第一支凹槽和第二支凹槽连通且横向贯穿第一主凹槽；所述进液口设置在第一支凹槽上远离第一主凹槽一端；所述下流通凹槽包括一椭圆状第二主凹槽、对称分设在第二主凹槽两侧的条状第三支凹槽和第四支凹槽，所述第三支凹槽与第四支凹槽连通且横向贯穿第二主凹槽；所述出液口设置在第四支凹槽上远离第二主凹槽一端。

进一步的，所述过滤孔的直径为5-10μm，所述塑料微孔过滤膜上每1.5cm×1.5cm的面积上，过滤孔的个数为60万个。

进一步的，所述塑料微孔过滤膜可采用聚碳酸酯膜、聚丙烯、聚酯薄膜、聚甲基丙烯酸甲酯中的一种，所述塑料微孔过滤膜采用注塑成型工艺注塑而成。

进一步的，所述负压进液泵的进液端连接有一废液管，所述废液管的另一端连通出液软管。

进一步的，所述下层废液层、塑料微孔过滤膜、上层进样层通过卡合键和键槽进行键合连接。

本发明还提供了另一种技术方案：一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、上层进样层和下层废液层制备：制备上层硅片模具和下层硅片模具，使用浓硫酸和双氧水对上层硅片模具和下层硅片模具进行清洗，去除光刻胶，后等离子清洗；配置聚二甲基硅氧烷后进行真空抽气，将聚二甲基硅氧烷浇筑至上层模具和下层模具，水平放置于热板进行前烘，后曝光，再次烘烤、显影后再次硬烘至固化，将固化后的聚二甲基硅氧烷从上层模具和下层模具上剥离，打孔切割，去除毛边，蓝膜包裹备用；

（2）、塑料微孔过滤膜制备：根据上层进样层、下层废液层的结构及过滤孔的密度、直径要求，注塑成型微柱模具，微柱模具上具有5-10μm的支柱，支柱密度为60万个、每1.5cm×1.5cm的面积上；将聚合物材料抽真空后浇筑至微柱模具上；将模具水平置于热板80℃、加热30min至完全固化后；

（3）、微流控制芯片组装：将下层废液层的凹槽面朝上，将经等离子清洗剂清洗1min后的塑料微孔过滤膜置于下层废液层的上端，并对准键合；将上层进样层的凹槽面朝下，将上层进液层置于塑料微孔过滤膜的上端，将上层进样层与塑料微孔过滤膜进行对准键合；完成微流控制芯片的封装，蓝膜包裹；

（4）、整体安装：将组装好的微流控制芯片中上层进样层的进液口通过进液软管连通至样品试管；将组装好的微流控制芯片中下层废液层的出液口通过出液软管连通废液管，废液管安装在负压进料泵的进液端。

本发明还提供了另一种技术方案：一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置的工作方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将不同类型的人类肺癌肿瘤细胞A549，SK-MES-1，H446以不同数目加入健康人全血中模拟病人样本；对样品进行前处理；

S2、打开负压进样泵，设置好相关参数，经前处理后的200μl细胞悬液置于样品试管，在负压进样泵的负压作用下将样品试管内的细胞悬浊液吸引进微流控制芯片，对细胞悬液进行肿瘤细胞的分离；

S3、在样品试管中，加入200μl PBS和0.5% tween混合液在负压进样泵的负压作用下进入微流控制芯片、冲洗微流控制芯片，后加入20 µL 0.2% Triton-X在负压进样泵的负压作用下进入微流控制芯片，在室温环境中避光孵育10 min；加入200μl冲洗液冲洗微流控制芯片，冲洗之后，加入封闭液，封闭液在负压进样泵的负压作用下进入微流控制芯片、封闭微流控制芯片，之后将把20 µL CK-PE、DAPI、CD45抗体稀释液在负压进样泵的负压作用吸引进微流控制芯片，在37℃避光孵育45 min；

S4、对塑料微孔过滤膜上捕获到的细胞进行免疫荧光染色，分析细胞类型，荧光显微镜下观察计数。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

（1）本发明的循环肿瘤细胞过滤微流控制装置通过启动负压进样泵时，微流控制芯片内部形成负压效果，样本从上层进样层的进液口被吸引进入微流控制芯片，样本经由中间的塑料微孔过滤膜时，由于循环肿瘤细胞尺寸大于普通的血液细胞（白细胞和红细胞），塑料微孔过滤膜的过滤作用将循环肿瘤细胞拦截在塑料微孔过滤膜上，而大部分的白细胞和红细胞被过滤至下层废液层的出液腔内，经由下层废液层的出液口至负压进样泵相连的废液管里；后导入洗液对微流控制芯片进行冲洗，再依次将封闭液，细胞通透液以及相应特异性抗体导入微流控制芯片，在微流控制芯片中进行细胞染色；将未结合抗体冲洗掉，在荧光显微镜下对细胞进行观察和计数；从而检测到样本溶液中的循环肿瘤细胞，本发明中所采用的微流控制芯片将细胞捕获、鉴定集于一体，减少了转移过程中肿瘤细胞细胞的损伤和污染，具有成本低，灵敏度高，操作简单等特点。

（2）本发明的塑料微孔过滤膜依据循环肿瘤细胞尺寸，采用富集过滤的方式，这种过滤法相比于免疫法通量更大，这种基于塑料材料的通孔过滤膜由于价格便宜、操作简单、易批量生产，可以被广泛应用于临床。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为本发明中微流控制装置的结构示意图；

图3为本发明中塑料微孔过滤膜的SEM扫描图；

图4为图3中A部的放大图；

图5为过滤后荧光显微镜下塑料通孔膜的检测CTCs的结果图，其中，A、B分别为过滤后荧光显微镜下塑料微孔过滤膜在两种不同滤光片下的检测CTCs的结果图；C为过滤后荧光显微镜下塑料微孔过滤膜在自然光下检测CTCs的细胞形态图。

附图标记说明：1、负压进样泵；2、微流控制芯片；21、上层进样层；211、进液口；22、塑料微孔过滤膜；221、过滤孔；23、下层废液层；231、出液口；232、下流通凹槽；233、下支撑柱；3、样本试管；4、进液软管；5、出液软管；6、废液管；7、支座。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”、“前”、“后”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应作为广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

如图1和图2所示，一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置，包括负压进样泵1和微流控制芯片2，所述微流控制芯片2包括上层进样层21、塑料微孔过滤膜22和下层废液层23；所述塑料微孔过滤膜22设置在上层进样层21与下层废液层23之间，所述塑料微孔过滤膜22的上下两端分别与上层进样层21、下层废液层密23封形成进样腔和出液腔；所述塑料微孔过滤膜22上均匀布置有若干过滤孔221；所述上层进样层21设置有进液口211，所述进液口211通过进液软管4插入样本试管3中，所述下层废液层23的下端设置有出液口231，所述出液口231通过出液软管5连接在负压进料泵1，可行的，所述负压进液泵1的进液端连通有一废液管6，所述废液管6的另一端连通出液软管5。可行的，所述微流控制芯片2的下端固定设置有一支座7，所述支座7卡扣式连接在下层废液层23下端各顶角的位置，起到支撑微流控制芯片2的作用，以保证微流控制芯片2水平放置。本发明的循环肿瘤细胞过滤微流控制装置通过启动负压进样泵时，微流控制芯片2内部形成负压效果，样本从上层进样层21的进液口211被吸引进入微流控制芯片2，样本经由中间的塑料微孔过滤膜22时，由于循环肿瘤细胞尺寸大于普通的血液细胞（白细胞和红细胞），塑料微孔过滤膜22的过滤作用将循环肿瘤细胞拦截在塑料微孔过滤膜22上，而大部分的白细胞和红细胞被过滤至下层废液层23的出液腔内，经由下层废液层23的出液口231至负压进样泵1相连的废液管6里；后导入洗液对微流控制芯片2进行冲洗，再依次将封闭液，细胞通透液以及相应特异性抗体导入微流控制芯片2，在微流控制芯片2中进行细胞染色；将未结合抗体冲洗掉，在荧光显微镜下对细胞进行观察和计数；从而检测到样本溶液中的循环肿瘤细胞，本发明中所采用的微流控制芯片2将细胞捕获、鉴定集于一体，减少了转移过程中肿瘤细胞细胞的损伤和污染，具有成本低，灵敏度高，操作简单等特点。

进一步的实施例中，如图2所示，所述上层进样层21设置为长方体结构且长方体结构的下端面开设有上流通凹槽，所述上层进样层21和下层废液层22均采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料，该材料弹性良好且具有较强的粘附力；所述上流通凹槽内均匀布置有若干上支撑柱，所述下层废液层23设置为长方体结构且长方体结构的上端面开设有下流通凹槽232，所述下流通凹槽232的形状、大小与上流通凹槽的形状、大小相同，所述下流通凹槽232内在与上支撑柱的下端位置设置有若干下支撑柱233，若干所述上支撑柱和若干下支撑柱233之间夹持塑料微孔过滤膜22。上支撑柱和下支撑柱233对整个微流控制芯片2起到支撑作用，从而保证微流控制芯片2在负压吸附下不发生形变。

其中，所述上支撑柱或下支撑柱233的直径均为300μm，所述上支撑柱或下支撑柱233之间的间距为600μm。

优选的，所述上流通凹槽包括一椭圆状第一主凹槽、对称分设在第一主凹槽两侧的条状第一支凹槽和第二支凹槽，所述第一支凹槽和第二支凹槽连通且横向贯穿第一主凹槽；所述上支撑柱设置在第一主凹槽内；所述进液口设置在第一支凹槽上远离第一主凹槽一端；所述下流通凹槽232包括一椭圆状第二主凹槽、对称分设在第二主凹槽两侧的条状第三支凹槽和第四支凹槽，所述第三支凹槽与第四支凹槽连通且横向贯穿第二主凹槽；所述下支撑柱233设置在第二主凹槽内；所述出液口231设置在第四支凹槽上远离第二主凹槽一端。

进一步的实施例中，如图3和图4所示，所述过滤孔221的直径为5-10μm，所述塑料微孔过滤膜22上每1.5cm×1.5cm的面积上，过滤孔221的个数为60万个，本发明的塑料微孔过滤膜22设计基于循环肿瘤细胞直径一般大于8μm，大于普通血液细胞如白细胞和红细胞，所述塑料微孔过滤膜22可将大于该尺寸的细胞拦截在塑料微孔过滤膜22上，而尺寸较小的白细胞和红细胞则被滤过到下层废液层23的出液腔最终被冲走，高密度的过滤孔221设置为后续高效及高通量进行细胞捕获检测提供了可能。

进一步的实施例中，所述塑料微孔过滤膜22可采用聚碳酸酯膜、聚丙烯、聚酯薄膜、聚甲基丙烯酸甲酯中的一种，所述塑料微孔过滤膜采用注塑成型工艺注塑而成。

进一步的实施例中，所述下层废液层23、塑料微孔过滤膜22、上层进样层21通过卡合键和键槽进行键合连接。

本发明还提供了另一种技术方案：一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置的制备工艺，包括以下步骤：

（1）、上层进样层21和下层废液层23制备：制备上层硅片模具和下层硅片模具，使用浓硫酸和双氧水对上层硅片模具和下层硅片模具进行清洗，去除光刻胶，后等离子清洗；配置聚二甲基硅氧烷后进行真空抽气，将聚二甲基硅氧烷浇筑至上层模具和下层模具，水平放置于热板进行前烘，后曝光，再次烘烤、显影后再次硬烘至固化，将固化后的聚二甲基硅氧烷从上层模具和下层模具上剥离，打孔切割，去除毛边，蓝膜包裹备用。上层硅片模具和下层硅片模具可反复多次使用，能够很大程度上减少时间与成本，实现上层进样层21和下层废液层23的大批量低成本制作。

（2）、塑料微孔过滤膜22制备：根据上层进样层21、下层废液层23的结构及过滤孔221的密度、直径要求，注塑成型微柱模具，微柱模具上具有5-10μm的支柱，支柱密度为60万个、每1.5cm×1.5cm的面积上；将聚合物材料抽真空后浇筑至微柱模具上；将模具水平置于热板80℃、加热30min至完全固化后使用；微柱模具可反复多次使用，能够很大程度上减少时间与成本，实现塑料微孔过滤膜22的大批量低成本制作。

（3）、微流控制芯片2组装：将下层废液层23的凹槽面朝上，将经等离子清洗剂清洗1min后的塑料微孔过滤膜置于下层废液层23的上端，并对准键合；将上层进样层21的凹槽面朝下，将上层进液层21置于塑料微孔过滤膜22的上端，将上层进样层21与塑料微孔过滤膜22进行对准键合；完成微流控制芯片的封装，蓝膜包裹。

（4）、整体安装：将组装好的微流控制芯片2中上层进样层21的进液口211通过进液软管4连通至样品试管3；将组装好的微流控制芯片2中下层废液层23的出液口231通过出液软管5连通废液管6，废液管安装在负压进料泵1的进液端。

本发明还提供了另一种技术方案：一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置的工作方法，包括以下步骤：

S1、将不同类型的人类肺癌肿瘤细胞A549，SK-MES-1，H446以不同数目加入健康人全血中模拟病人样本；对样品进行前处理；前处理的过程包括：吸掉上层血浆，对剩余血细胞通过红细胞裂解液处理两次，加入PBS重悬至1ml备用；当理解，样本前处理步骤亦可采用其他方式。

S2、打开负压进样泵1，设置好相关参数，经前处理后的200μl细胞悬液置于样品试管3，在负压进样泵1的负压作用下将样品试管3内的细胞悬浊液吸引进微流控制芯片2，对细胞悬液进行肿瘤细胞的分离；控制样本进入微流控制芯片2的流速为8mL/h~12mL/h。

S3、在样品试管3中，加入200μl PBS和0.5% tween混合液在负压进样泵1的负压作用下进入微流控制芯片2、冲洗微流控制芯片2，后加入20 µL 0.2% Triton-X在负压进样泵1的负压作用下进入微流控制芯片2，在室温环境中避光孵育10 min；加入200μl冲洗液冲洗微流控制芯片2，冲洗之后，加入封闭液，封闭液在负压进样泵1的负压作用下进入微流控制芯片2、封闭微流控制芯片，之后将把20 µL CK-PE、DAPI、CD45抗体稀释液在负压进样泵的负压作用吸引进微流控制芯片2，在37℃避光孵育45 min。由现有材料可知，相应的特异性抗体CK、CD45、DAPI都是现有文献中已证明的，荧光显微镜下能够根据不同的颜色清晰的分辨出肿瘤细胞和白细胞。应当理解，该 CK-PE、DAPI、CD45抗体稀释液根据后续染色所用的抗体类型而定，如果免疫荧光抗体不是针对细胞内的细胞质类抗原，可以省略；抗体作用是对捕获到的细胞进行免疫荧光染色，进一步分析细胞类型，原理是利用循环肿瘤细胞与白细胞表达抗原的不同，采用免疫荧光染色的方法对细胞做更准确的分析，避免假阳性的出现，应当理解，根据目标细胞的不同，可以更换不同的免疫荧光抗体，然后用200μl冲洗液冲洗微流控制芯片2，中止反应；最后荧光显微镜下观察计数。

S4、对塑料微孔过滤膜上捕获到的细胞进行免疫荧光染色，分析细胞类型，荧光显微镜下观察计数。

本发明中样本试管3中的细胞悬液经微流控制芯片2捕获后，尺寸较大的肿瘤细胞和部分白细胞被截留在塑料微孔过滤膜22上，通过荧光显微镜（Olympus）观察结果如图5A-5C。CK-PE为上皮细胞特异性抗体，CD45为白细胞特异性抗体，DAPI可以标记所有类型细胞核；使用CD45及DAPI这两种抗体：能够实现在发现肿瘤细胞后先在DAPI下明确是细胞而不是杂质，再跟据颜色和大小区分是肿瘤细胞（CK标记）还是白细胞（CD45标记）；因此，当CK-PE，上皮细胞特异荧光抗体阳性（在WU滤光片下为橘黄色），且DAPI核染料阳性（在WIB滤光片下为亮蓝色）的细胞可被确认为肿瘤细胞；而CD45-FITC，白细胞特异性抗体阳性（在WU滤光片下为绿色），且DAPI阳性（在WIB滤光片下为亮蓝色）的细胞则被确认为白细胞。

由于循环肿瘤细胞体积比白细胞和红细胞体积明显大，除了颜色不同，从体积上也能将循环肿瘤细胞和白细胞或红细胞分辨出来；如图5A所示，其中，亮色大细胞为肿瘤细胞，而暗色小细胞为白细胞。如图5B所示，其中，亮色大细胞为肿瘤细胞，而暗色小细胞为白细胞。如图5C所示，大细胞为肿瘤细胞，而小细胞为白细胞。

图5A-5B分别为过滤后荧光显微镜下塑料微孔过滤膜在两种不同滤光片下的检测CTCs的结果图；图5C为过滤后荧光显微镜下塑料微孔过滤膜在自然光下检测CTCs的细胞形态图。在本实施例中，图5A是采用WU滤光片时检测CTCs的结果图，图5B是采用WIB滤光片时检测CTCs的结果图。抗体不同，所使用滤光片不同。图5A-5C中CTC表示肿瘤细胞，WBC表示白细胞。另外也可根据实际情况标记不同抗体。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置，其特征在于，包括负压进样泵和微流控制芯片，所述微流控制芯片包括上层进样层、塑料微孔过滤膜和下层废液层；所述塑料微孔过滤膜设置在上层进样层与下层废液层之间，所述塑料微孔过滤膜的上下两端分别与上层进样层、下层废液层密封形成进样腔和出液腔；所述塑料微孔过滤膜上均匀布置有若干过滤孔；所述上层进样层设置有进液口，所述进液口通过进液软管插入样本试管中，所述下层废液层的下端设置有出液口，所述出液口通过出液软管连接在负压进料泵。

2.根据权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置，其特征在于，所述上层进样层设置为长方体结构且长方体结构的下端面开设有上流通凹槽，所述上流通凹槽内均匀布置有若干上支撑柱，所述下层废液层设置为长方体结构且长方体结构的上端面开设有下流通凹槽，所述下流通凹槽的形状、大小与上流通凹槽的形状、大小相同，所述下流通凹槽内在与上支撑柱的下端位置设置有若干下支撑柱，若干所述上支撑柱和若干下支撑柱之间夹持塑料微孔过滤膜。

3.根据权利要求2所述的一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置，其特征在于，所述上支撑柱或下支撑柱的直径均为300μm，所述上支撑柱或下支撑柱之间的间距为600μm。

4.根据权利要求2所述的一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置，其特征在于，所述上流通凹槽包括一椭圆状第一主凹槽、对称分设在第一主凹槽两侧的条状第一支凹槽和第二支凹槽，所述第一支凹槽和第二支凹槽连通且横向贯穿第一主凹槽；所述进液口设置在第一支凹槽上远离第一主凹槽一端；所述下流通凹槽包括一椭圆状第二主凹槽、对称分设在第二主凹槽两侧的条状第三支凹槽和第四支凹槽，所述第三支凹槽与第四支凹槽连通且横向贯穿第二主凹槽；所述出液口设置在第四支凹槽上远离第二主凹槽一端。

5.根据权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置，其特征在于，所述过滤孔的直径为5-10μm，所述塑料微孔过滤膜上每1.5cm×1.5cm的面积上，过滤孔的个数为60万个。

6.根据权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置，其特征在于，所述塑料微孔过滤膜可采用聚碳酸酯膜、聚丙烯、聚酯薄膜、聚甲基丙烯酸甲酯中的一种，所述塑料微孔过滤膜采用注塑成型工艺注塑而成。

7.根据权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置，其特征在于，所述负压进液泵的进液端连接有一废液管，所述废液管的另一端连通出液软管。

8.根据权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置，其特征在于，所述下层废液层、塑料微孔过滤膜、上层进样层通过卡合键和键槽进行键合连接。

9.一种根据权利要求1-8任一项的一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、上层进样层和下层废液层制备：制备上层硅片模具和下层硅片模具，使用浓硫酸和双氧水对上层硅片模具和下层硅片模具进行清洗，去除光刻胶，后等离子清洗；配置聚二甲基硅氧烷后进行真空抽气，将聚二甲基硅氧烷浇筑至上层模具和下层模具，水平放置于热板进行前烘，后曝光，再次烘烤、显影后再次硬烘至固化，将固化后的聚二甲基硅氧烷从上层模具和下层模具上剥离，打孔切割，去除毛边，蓝膜包裹备用；

（2）、塑料微孔过滤膜制备：根据上层进样层、下层废液层的结构及过滤孔的密度、直径要求，注塑成型微柱模具，微柱模具上具有5-10μm的支柱，支柱密度为60万个、每1.5cm×1.5cm的面积上；将聚合物材料抽真空后浇筑至微柱模具上；将模具水平置于热板80℃、加热30min至完全固化后；

（3）、微流控制芯片组装：将下层废液层的凹槽面朝上，将经等离子清洗剂清洗1min后的塑料微孔过滤膜置于下层废液层的上端，并对准键合；将上层进样层的凹槽面朝下，将上层进液层置于塑料微孔过滤膜的上端，将上层进样层与塑料微孔过滤膜进行对准键合；完成微流控制芯片的封装，蓝膜包裹；

（4）、整体安装：将组装好的微流控制芯片中上层进样层的进液口通过进液软管连通至样品试管；将组装好的微流控制芯片中下层废液层的出液口通过出液软管连通废液管，废液管安装在负压进料泵的进液端。

10.一种根据权利要求1-8的一种循环肿瘤细胞过滤微流控制装置的工作方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将不同类型的人类肺癌肿瘤细胞A549，SK-MES-1，H446以不同数目加入健康人全血中模拟病人样本；对样品进行前处理；

S2、打开负压进样泵，设置好相关参数，经前处理后的200μl细胞悬液置于样品试管，在负压进样泵的负压作用下将样品试管内的细胞悬浊液吸引进微流控制芯片，对细胞悬液进行肿瘤细胞的分离；

S3、在样品试管中，加入200μl PBS和0.5% tween混合液在负压进样泵的负压作用下进入微流控制芯片、冲洗微流控制芯片，后加入20 µL 0.2% Triton-X在负压进样泵的负压作用下进入微流控制芯片，在室温环境中避光孵育10 min；加入200μl冲洗液冲洗微流控制芯片，冲洗之后，加入封闭液，封闭液在负压进样泵的负压作用下进入微流控制芯片、封闭微流控制芯片，之后将把20 µL CK-PE、DAPI、CD45抗体稀释液在负压进样泵的负压作用吸引进微流控制芯片，在37℃避光孵育45 min；

S4、对塑料微孔过滤膜上捕获到的细胞进行免疫荧光染色，分析细胞类型，荧光显微镜下观察计数。