CN113005002A - 微流控过滤芯片、基于AuNPs的核酸三重检测试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸检测技术领域，涉及用于核酸检测的微流控芯片、试剂盒及方法。微流控过滤芯片，该芯片从上到下依次包括加样层、过滤层、检测层；其中，所述加样层上设有第一微腔；所述过滤层上与所述第一微腔对应的位置设有过滤膜；所述检测层上与所述过滤膜对应的位置设有第二微腔；进入所述第一微腔中的混合物在驱动力的作用下经过所述过滤膜进入所述第二微腔中，实现固液分离。本发明通过将比色反应后的AuNPs溶液利用该芯片进行过滤分离，随着miRNA浓度的升高，形成的双链增加，吸附在AuNPs表面的DNA探针减少，停留在滤膜上与DNA探针结合的荧光基团的拉曼光谱强度降低；溶液中游离的双链的荧光强度也会越来越高，结合比色结果，进行三重验证，提高检测的准确性。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，涉及用于核酸检测的微流控芯片、试剂盒及方法。
背景技术
近年来，研究者们陆续发现miRNA在癌症早期表达发生异常，作为一种新型的肿瘤标志物受到越来越多的关注。传统的miRNA检测手段例如Northern blot，PCR和微阵列等。这些方法需要转录和扩增，检测步骤繁琐，费时且费力。
为了对miRNA进行绝对或相对定量检测，现有技术中已经通过使用比色法、荧光、SERS，电化学和表面等离振子共振作为检测平台，开发了许多新颖的传感方法。其中，比色法简单，成本低，易于操作并且可以直观地监视信号变化，因此备受关注。由于AuNPs聚集时其可见的颜色变化，独特的光学特性和高比表面积，因此被广泛用于比色传感器的制备。当该传感器用于核酸检测时，DNA跟AuNPs依靠正负电荷吸附原理被吸附在AuNPs表面，可以使AuNPs抵抗盐诱导的聚集。在存在miRNA的情况下，DNA探针往往会与miRNA杂交形成双链。双链刚性结构构象使它们与AuNPs保持一定距离，致使脱离DNA保护的AuNPs在盐溶液中被诱导聚集。因此AuNPs的吸光度依赖于miRNA浓度而变化。
然而，实际检测样本的组成成分很复杂，不同的物质都有可能诱导AuNPs吸光度发生变化，导致检测结果的准确性不高。为了对miRNA进行更加准确的定量检测，需要排除一些干扰物质的影响。
现有技术中，关于提高AuNPs比色法检测准确性的相关措施和解决手段鲜有报道。因此，如何解决AuNPs比色法对miRNA定量检测的准确性问题是需要关注的焦点。
发明内容
本发明的目的是解决现有AuNPs比色法检测准确性不高的问题，提供一种基于AuNPs的miRNA三重检测微流控芯片、试剂盒和方法。本发明通过将比色反应之后的AuNPs溶液利用该芯片进行过滤分离，停留在滤膜上的AuNPs，因为具有拉曼增强效果，可以对吸附在其表面的DNA分子的荧光基团进行拉曼检测。随着miRNA浓度的升高，形成的双链增加，吸附在AuNPs表面的DNA也会减少，停留在滤膜上与DNA探针结合的荧光基团的拉曼光谱强度也会降低；溶液中游离的双链随着miRNA浓度的升高而升高，荧光强度也会越来越高，结合比色结果，进行三重验证，提高检测的准确性。
为了解决本发明的技术问题，本发明首先采用的技术方案是提供一种微流控过滤芯片，该芯片从上到下依次包括加样层、过滤层、检测层；其中，所述加样层上设有第一微腔；所述过滤层上与所述第一微腔对应的位置设有过滤膜；所述检测层上与所述过滤膜对应的位置设有第二微腔；进入所述第一微腔中的混合物在驱动力的作用下经过所述过滤膜进入所述第二微腔中，实现固液分离；所述的基底层上修饰多聚赖氨酸。
作为本发明的一种优选方式，所述的过滤膜为纳米孔径的过滤膜。
作为本发明的一种优选方式，所述的检测层上设有第三微腔，所述第三微腔通过微流道与所述第二微腔连接。
进一步优选地，所述的加样层上方设有抽吸层，所述抽吸层与所述第三微腔连接，用于传递负压抽吸力。
作为本发明的一种优选方式，所述的检测层下方设有多聚赖氨酸衬底。
作为本发明的一种优选方式，所述检测层和过滤层之间设置有阀门控制层，用于控制所述第二微腔与第三微腔之间微流道的通断。
为了解决其技术问题，本发明还提供一种基于AuNPs的核酸三重检测试剂盒，该试剂盒包括所述的微流控过滤芯片。
进一步优选地，所述试剂盒还包括修饰有荧光基团的核酸探针、AuNPs溶液。
进一步优选地，所述试剂盒还包括核酸标准品溶液。
本发明进一步提供了一种基于AuNPs的核酸三重检测方法，包括：
（1）首先，将核酸探针溶液添加到AuNPs溶液中，并在室温下孵育20-40分钟；
（2）将梯度浓度的核酸标准溶液添加到步骤（1）的混合溶液中，并在室温下孵育20-30分钟；
（3）添加5X SSC以达到AuNP的聚集，并将混合物孵育5-15分钟；
（4）测定步骤（3）孵育后溶液的吸光度；
（5）测完吸光度之后的溶液倒进微流控芯片中，进行固液分离，分离之后的固相AuNPs被留在滤膜表面；液相被吸附在多聚赖氨酸衬底表面；
（6）对固相AuNPs上附着的带荧光基团的探针进行拉曼检测，对多聚赖氨酸衬底上的液相进行荧光检测；
（7）根据测得的吸光度、荧光值、拉曼值，采用双对数坐标，以核酸浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，根据柱状图做直线拟合，得到标准曲线；
（8）测定待测核酸的荧光值，对照标准曲线，判断其是否表达异常。
本发明与现有技术相比，具有的有益效果是：
1.本发明中的微流控过滤芯片可以简单，快速的进行固液分离；
2.装配简单，可以根据实际检测的需求更改滤膜的孔径尺寸，进行不同混合物的过滤分离，实用性广泛；
3.本发明提供的试剂盒及方法，能够快速、准确的检测核酸，并且操作简单、特异性好、灵敏度高。
附图说明
图1为本发明实施例1的微流控过滤芯片结构示意图；
图2是抽吸层结构示意图；
图3是加样层结构示意图；
图4是滤膜结构示意图；
图5是检测层结构示意图；
图6是本发明实施例2的微流控过滤芯片结构示意图；
图7是实施例2中阀门控制层结构示意图；
图8为本发明实施3中的miRNA检测试剂盒检测工作原理图；
图9为本发明实施3中的miRNA检测试剂盒特异性检测结果图；
图10为本发明实施3中的miRNA检测试剂盒比色灵敏度检测结果图；
图11为本发明实施3中的miRNA检测试剂盒荧光灵敏度检测结果图；
图12为本发明实施3中的miRNA检测试剂盒拉曼灵敏度检测结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1：本发明提供的第一种微流控过滤芯片，如图1所示，该芯片的结构从上到下依次包括抽吸层1、加样层2、过滤层3、检测层4、和基底层5。
如图2所示，在抽吸层1上设有抽吸口11、与抽吸口11连接的第一微流道12和用于连接下方加样层的通孔。其中，抽吸口11用于连接微泵。
如图3所示，在加样层2上设有第一微腔13和第四微腔14。其中，第一微腔13与抽吸层1上预留的通孔对应，用于从抽吸层1上方将混合物倒入第一微腔13中。第一微流道12与第四微腔14连接，用于传递微泵提供的负压抽吸力。
如图4所示，在过滤层3上，与第一微腔13对应的位置设有纳米孔径过滤膜15，用于对倒入第一微腔13的混合物进行过滤；与第四微腔14对应的位置预留有通孔。
如图5所示，在检测层4上，分别设有第二微腔16和第三微腔18，其中第二微腔16与过滤膜15及第一微腔13相上下对应，第三微腔18与第四微腔14上下对应。第二微腔16和第三微腔18之间通过第二微流道17连通。其中，第二+微腔16用于接收经过过滤膜15的液相。第二微流道17、第三微腔18、过滤层上的通孔、第四微腔13、第一微流道12及抽吸口11共同组成了传递微泵负压抽吸力的通道。
如图1所示，在检测层4的下方设有基底层5，基底层上修饰有多聚赖氨酸。
本实施例的微流控过滤芯片的工作原理和使用方法为：芯片组装好之后，将发生比色反应后的AuNPs溶液从抽吸层1上方倒入第一微腔13中，在抽吸层1的抽吸口11处通过微泵抽吸，微泵提供的负压抽吸力作为驱动力，依次通过第一微流道12、第四微腔14、第三微腔18、第二微流道17作用于第一微腔13中的混合溶液。第一微腔13中的混合溶液在抽吸力的驱动下，经过过滤层3上的纳米孔径过滤膜15时，固相纳米金颗粒被留在膜上，液相透过滤膜，进入第二微腔16，经第二微流道17，被抽到微腔第三微腔18中。
进入第二微腔16、第二微流道17及第三微腔18中的液相中，带有荧光基团的DNA探针与miRNA形成的双链被基底层5上修饰的多聚赖氨酸吸附固定。从而实现固液分离，以便后续分别对固相进行拉曼检测，对液相进行荧光检测。
实施例2 本发明提供的第二种微流控过滤芯片，如图7所示，其主体结构与实施例1的微流控过滤芯片相同，区别仅在于：本实施例中的芯片不包含多聚赖氨酸衬底，在检测层4与过滤层3之间增加了阀门控制层6，如图8所示，在阀门控制层6上，设有注水口19阀门21，连接阀门与注水口的流道20。
本实施例的微流控过滤芯片的工作原理和使用方法为：芯片组装好之后，将混合物溶液从抽吸层1上方倒入第一微腔13中，在抽吸层1的抽吸口11处通过微泵抽吸，微泵提供的负压抽吸力作为驱动力，依次通过第一微流道12、第四微腔14、第三微腔18、第二微流道17作用于第一微腔13中的混合溶液。第一微腔13中的混合溶液在抽吸力的驱动下，经过过滤层3上的纳米孔径过滤膜15时，固相被留在膜上，液相透过滤膜，进入第二微腔16，经第二微流道17，被抽到微腔第三微腔18中。
然后，将去离子水从注水口19通过流道20注入到阀门21中，将检测层上的第二微流道17压断，让液体保留在第三微腔18中，以便进行后续检测。本实施例中的芯片适用于检测需要在液相中进行的情况，如光致发光检测。
实施例3 本发明提供的第三个实施例是：一种基于AuNPs的核酸三重检测试剂盒，该试剂盒包括：如实施例1中提供的微流控过滤芯片、修饰有Cy3荧光基团的DNA探针溶液，AuNPs溶液；miRNA标准品溶液。
实施例4、本发明还提供了采用上述实施例中的试剂盒，对核酸进行三重检测的方法，该方法以乳腺癌miRNA的检测为例，试剂盒检测原理如图8所示，具体过程和步骤如下：
1.试剂配制
（1）、DNA探针溶液、miRNA标准品溶液的配制：将100uM的DNA探针母液稀释200倍，用于检测时使用的终浓度为0.5uM；将100uM的miRNA标准品母液，在10-7-10-12M之间，以10倍为梯度进行稀释，稀释成梯度浓度的标准品溶液。
（2）、AuNPs溶液的配制：用柠檬酸三钠还原HAuCl4可以合成AuNPs。 简而言之，将HAuCl4的水溶液（0.01％，200ml）加热至沸腾，然后在剧烈搅拌下将6ml的柠檬酸三钠溶液（1％）快速加入到沸腾的溶液中。溶液的颜色从黄色变为酒红色。 将该溶液另外加热20分钟，然后继续搅拌以冷却至室温。 AuNP颗粒的粒径约为17.7 nm，所获得的AuNP具有相似的尺寸，几乎为圆形，并且具有良好的分散性。检测时时取85uL溶液放在96孔板中。
（3）、SSC溶液的配制：取PH=7.0 浓度为20X 的SSC溶液用去离子水稀释成5X SSC用于检测。
2．杂交检测
（1）首先，将DNA探针溶液（0.5μM，10μl）添加到AuNPs溶液（2.33 nM，85μl）中，并在室温下孵育30分钟。 孵育后，基于静电相互作用，DNA探针被完全吸附到AuNPs上；
（2）然后，将不同浓度的miRNA（10μl）标准品溶液添加到上述混合溶液中，并在室温下孵育20分钟；
（3）最后，添加6ul 5X SSC以达到AuNP的聚集，并将混合物孵育10分钟；
（4）用酶标仪测定上述溶液的吸光度；
（5）测完吸光度之后的溶液倒进微流控过滤芯片中，利用过滤芯片将比色反应之后的混合物溶液进行固液分离，分离之后的固相AuNPs被留在滤膜表面；液相通过滤膜到达底部多聚赖氨酸衬底上，依靠正负电荷吸附原理，液相中的DNA探针与miRNA形成的双链被吸附在多聚赖氨酸衬底表面；
（6）然后利用拉曼光谱仪对固相AuNPs上附着的DNA-Cy3进行检测，采用微阵列芯片扫描仪对液相中的DNA-Cy3进行荧光检测。
制作标准曲线
根据酶标仪读出的不同浓度的miRNA标准品溶液的吸光值，微阵列芯片扫描仪读出的荧光值，拉曼光谱仪读出拉曼值；采用双对数坐标，以miRNA标准品溶液浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，根据柱状图做直线拟合，获得miRNA浓度标准曲线。
计算
实际样本检测时，根据检测得到的待测样本的荧光值，依据标准曲线计算待测miRNA浓度，从而判断其是否表达异常。
为了评价本发明提供的试剂盒及检测方法对miRNA的检测效果，本发明提供了对试剂盒的特异性、灵敏度检测的验证实验。
本发明选取了乳腺癌乳头溢液中三种表达具有显著意义的miRNA，并根据其miRNA序列合成了相应检测探针序列，如表1所示。
实施例5 在本实施例中，该试剂盒的特异性检测是通过在AuNPs中加入DNA探针来保护其不受SSC的诱导而产生聚集，其中目标基因是miR-12-5， DNA探针与靶基因杂交形成双链，脱离AuNPs，从而导致AuNPs失去保护受到SSC的诱导而产生聚集，不同浓度的miR-12-5溶液吸光度发生较大变化，而非目标基因miR-4732 、miR-3646，因为不与DNA探针反生反应，吸光度不随其浓度变化而变化，从而证明该试剂盒具有较高的特异性，如图9（a）、（b）所示。
实施例6 为了评价AuNPs比色检测的灵敏度，在优化的实验条件下检测了含有不同浓度靶miRNA的样品溶液。如图10（a）所示，随着miRNA浓度的增加，AuNPs在520 nm处的特征吸收峰逐渐减小，在690 nm处的吸收峰逐渐增大。从图10（b）对数图中可以看出，吸收比(A690nm / A520nm)与靶miRNA浓度在10-7 M ~ 10-12 M范围内呈线性关系，回归方程为y =1.9046+0.12193 lg(x) ，(R2 = 0.97163)。
实施例7为了评价AuNPs拉曼和荧光检测的灵敏度，本实施例将比色反应之后的AuNPs溶液通过过滤芯片分离之后，对留在滤膜上的吸附在AuNPs表面的DNA上的Cy3荧光基团进行拉曼检测。如图11（a）所示，随着miRNA浓度的增加，Cy3的拉曼峰逐渐减弱。在图11（b）的对数图中可以看出，拉曼强度与靶miRNA浓度在10-7 M ~ 10-12 M范围内呈线性关系，回归方程为y = 687.69856-139.71135lg(x)，(R2=0.97563)。
过滤之后的液体中进行荧光测量发现荧光值随miRNA浓度的升高而升高，如图12（a），荧光强度与靶miRNA浓度在10-7 M ~ 10-12 M范围内呈线性关系，回归方程为y =1880227.31429+12406.08571lg(x)，(R2=0.9796)，如图12（b）所示。
Claims (10)
1.一种微流控过滤芯片，其特征在于：该芯片从上到下依次包括加样层、过滤层、检测层；其中，所述加样层上设有第一微腔；所述过滤层上与所述第一微腔对应的位置设有过滤膜；所述检测层上与所述过滤膜对应的位置设有第二微腔；进入所述第一微腔中的混合物在驱动力的作用下经过所述过滤膜进入所述第二微腔中，实现固液分离。
2.根据权利要求1所述的微流控过滤芯片，其特征在于：所述的过滤膜为纳米孔径的过滤膜。
3.根据权利要求1所述的微流控过滤芯片，其特征在于：所述的检测层上设有第三微腔，所述第三微腔通过微流道与所述第二微腔连接。
4.根据权利要求3所述的微流控过滤芯片，其特征在于：所述的加样层上方设有抽吸层，所述抽吸层与所述第三微腔连接，用于传递负压抽吸力。
5.根据权利要求1-4任一项所述的微流控过滤芯片，其特征在于：所述的检测层下方设有多聚赖氨酸衬底。
6.根据权利要求1-4任一项所述的微流控过滤芯片，其特征在于：所述检测层和过滤层之间设置有阀门控制层，用于控制所述第二微腔与第三微腔之间微流道的通断。
7.一种基于AuNPs的核酸三重检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括权利要求5所述的微流控过滤芯片。
8.根据权利要求7所述的基于AuNPs的核酸三重检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括修饰有荧光基团的核酸探针、AuNPs溶液。
9.根据权利要求8所述的基于AuNPs的核酸三重检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括核酸标准品溶液。
10.一种基于AuNPs的核酸三重检测方法，其特征在于，包括：
（1）将核酸探针溶液添加到AuNPs溶液中，并在室温下孵育20-40分钟；
（2）将梯度浓度的核酸标准品溶液添加到步骤（1）的混合溶液中，并在室温下孵育20-30分钟；
（3）添加5X SSC以达到AuNP的聚集，并将混合物孵育5-15分钟；
（4）测定步骤（3）孵育后溶液的吸光度；
（5）测完吸光度之后的溶液倒进微流控过滤芯片中，进行固液分离，分离之后的固相AuNPs被留在滤膜表面；液相被吸附在多聚赖氨酸衬底表面；
（6）对固相AuNPs上附着的核酸探针进行拉曼检测，对多聚赖氨酸衬底上的液相进行荧光检测；
（7）根据测得的吸光度、荧光值、拉曼值，采用双对数坐标，以核酸浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，根据柱状图做直线拟合，得到标准曲线；
（8）测定待测核酸的荧光值，对照标准曲线，判断其是否表达异常。
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