CN107561265A - 一种固液分离用复合膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种固液分离用复合膜及其制备方法，所述复合膜包括径迹蚀刻膜和以直接或间接方式连接在径迹蚀刻膜的膜表面上和/或孔道内的用于与目标物进行特异性结合的一种或多种抗体分子，所述目标物为含抗原的固体物质，所述径迹蚀刻膜与抗体的连接中包括一处以上的化学连接，所述径迹蚀刻膜孔径为50纳米～40微米，优选5～28微米，所述径迹蚀刻膜上连接的抗体分子用于将目标物免疫截留在径迹蚀刻膜上。本发明所述复合膜结合了免疫分离和按大小物理分选的双重分离作用，该复合膜对尺寸比孔径大的目标物和尺寸比孔径小的目标物都能起到高效分离作用。

Description

一种固液分离用复合膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物样品过滤膜领域，具体涉及一种固液分离用复合膜及其制备方法。

背景技术

现代生物学和医学研究的对象越来越多地向微观方向发展。微观方向主要包括三个尺度范围：一为分子水平，如蛋白质分子、DNA分子、RNA分子等，大小约为几十纳米以下；二为微生物水平，如病毒、支原体、衣原体、细菌等，大小从几十纳米到几百纳米不等；三为细胞水平，如肿瘤细胞、红细胞、白细胞、上皮细胞等，大小为微米级，一般在几个微米到几十微米之间。

对上述生物样品的研究、检测或大规模生产都离不开对目的样品的分离富集纯化。这是因为这些微观的生物样品远远小于人肉眼所能分辨的尺度，只有对目的样品进行分离富集纯化，使得目的样品的数量达到一定的量时，才能对其进行研究和检测。而对生物样品的分离富集纯化，从根本上来说就是固体和液体的分离。这是因为绝大多数生物样品都需要处于溶液中才能保持活性或保持存活，如细胞必须在体液或培养液中才能存活，蛋白质分子必须在溶液里才能保持活性等。

目前，生物样品的固液分离方法主要有离心、过滤和免疫吸附分离。离心和过滤主要用于生物样品的粗分离，样品分离后还需要进一步的精细分离以纯化目的样品。免疫吸附分离是将抗体固定在固相支持物(如磁珠、琼脂糖、聚苯乙烯板)上，利用特异的抗体和目标样品发生特异的抗原抗体反应，对目标样品进行分离，因此可以从混合物样品中精确分离纯化目的样品。免疫吸附分离的缺点是1、分离步骤多；2、一般需要通过其它方法对样品进行预处理；3、分离后需要通过其它技术方法对样品进行检测；4、处理的样本量小等。

例如，在医学上最为常见的血液就是一种非常复杂的固液混合样品，其中含有各种血液细胞、蛋白质成分、甚至某些微生物。对血液样品中的各种成分根据需要进行精确的分离富集纯化，例如白细胞、癌细胞或乙型肝炎病毒表面抗原蛋白等，一直是科学研究和临床应用的难点和重点。

因此，本领域有必要开发一种新的分离方法或固液分离材料，以减少分离步骤，提高样品处理量，提升分离精度，增加分离效率。

发明内容

申请人在生物样品的固液分离领域进行探索时，发现一种固液分离用复合膜可以至少部分地解决上述技术问题。

因此，本发明首先提供一种固液分离用复合膜，所述复合膜包括径迹蚀刻膜和以直接或间接方式连接在径迹蚀刻膜的膜表面上和/或孔道内的用于与目标物进行特异性结合的一种或多种抗体分子，所述目标物为含抗原的固体物质，所述径迹蚀刻膜与抗体的连接中包括一处以上的化学连接，所述径迹蚀刻膜孔径为50nm～40微米，优选100nm～30微米，更优选5～28微米，所述径迹蚀刻膜上连接的抗体分子用于将目标物免疫截留在径迹蚀刻膜上。

本发明中，所述目标物例如为含抗原的化学分子、微生物和细胞中的一种或多种。在一种具体的实施方式中，所述目标物为蛋白质分子、核酸分子、病毒、支原体、衣原体、细菌和细胞中的一种或多种。

具体地，本发明中所述抗体通过生物和/或化学连接方式固定连接在所述径迹蚀刻膜上，而不是仅通过物理吸附作用暂时吸附在膜上。

在一种具体的实施方式中，所述径迹蚀刻膜上尺寸均匀的孔道的直径均为x上下偏差不超过15％的值，且x为100nm～30μm中的任一值；最优选孔道直径为8±1μm。

在一种具体的实施方式中，所述抗体通过生物素和亲和素的连接而固定在径迹蚀刻膜上。

在一种具体的实施方式中，所述抗体依次通过生物素、亲和素、偶联剂GMBS(N-y-maleimidobutyryloxysuccinimide ester，羟基琥珀酰亚胺酸)以及硅烷偶联剂连接在径迹蚀刻膜上。

在一种具体的实施方式中，所述目标物的直径为所述膜孔直径的0.5～5倍，优选为0.7～3倍，当所述目标物的尺寸大于膜孔尺寸时除免疫分选外还通过膜孔的物理尺寸分选将目标物截留在径迹蚀刻膜上，当所述目标物的尺寸小于膜孔尺寸时利用复合膜上直径均匀的孔道提高目标物的分离效率、分离精度和/或分离能力。

在一种具体的实施方式中，所述径迹蚀刻膜的膜面上的膜孔总面积为膜面总面积的40％以下，优选1～30％，更优选5～20％。

在一种具体的实施方式中，所述径迹蚀刻膜为使用重离子加速器轰击高分子膜材料后经过化学蚀刻而得到的包含多个孔径均匀直孔道的膜，优选所述径迹蚀刻膜为聚酯膜或聚碳酸酯膜。

在一种具体的实施方式中，所述径迹蚀刻膜的厚度为12～30微米，且所述抗体的分子尺寸为100nm以下，优选80nm以下。

本发明还提供一种如上所述复合膜的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤A、先对径迹蚀刻膜采用硅烷偶联剂浸泡荡洗进行膜表面的硅烷预处理；

步骤B、对膜采用偶联剂GMBS处理，使GMBS附着于膜上；

步骤C、对膜采用亲和素处理，使得亲和素附着于GMBS上；

步骤D、对膜采用生物素化的抗体处理，使得生物素化的抗体与亲和素结合；且步骤A～D中的每个步骤后均包括清洗除去未结合或未反应的相应化学物质。

在一种具体的实施方式中，所述硅烷偶联剂为3-巯丙基三甲氧基硅烷。

本发明在用于分离癌细胞等比孔道直径大的固体目标物时，物理分离和免疫分离两者联合使用，本发明有效利用了这两种方法分离的优点，互为补充，克服了使用单一方法分离的缺点，显著提高对目的细胞的分离效果和敏感性。

本发明中，所述液体可以是血液，也可以是如骨髓、胸水、腹水等体液。所述液体为血液时，所述肿瘤细胞为循环肿瘤细胞即CTC。

本发明中，对于不同的肿瘤细胞相应可以选择不同的特异性结合的抗体。因此，本发明所述径迹蚀刻膜上连接的肿瘤细胞抗体可以是一种或多种。

本发明中，所述径迹蚀刻膜上尺寸均匀的孔道的直径均为x±1μm是指孔道直径的设计尺寸，事实上因加工等原因，例如会形成少量的双联孔或三联孔而使得膜上的某孔道尺寸明显变大，这种情况是被允许且属于本发明保护范畴的。

本发明中，径迹蚀刻膜具体可以是孔径为7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米和20微米等多种不同的型号。

本发明中使用的复合膜在用于从血液中分离CTC时，要几乎滤过所有的红细胞，因而径迹蚀刻膜的孔径需要大于等于5微米，同时为了能够有效截留肿瘤细胞，径迹蚀刻膜的孔径需要小于28微米。因此，最优的孔径为7-10微米。

在一种具体的实施方式中，所述抗体包括抗人EpCAM的单克隆抗体。该抗体能跟大多数种类的癌细胞的表面抗原(细胞膜上的蛋白质)进行特异性结合。

任何一种形式的分离都会出现截留效率和载量(最大承受能力)有限等问题，且任何一种单一的分离方法或复合分离方法都不可能做到100％的分离某种细胞。在本发明的复合膜中，待分离的目的癌细胞有可能从孔中穿过该膜，也可能被孔内的抗体截留而堵塞该孔，而绝大多数的待分离目的癌细胞会被截留在膜表面上。本发明的复合膜中，待分离的目的白细胞有可能从孔中穿过该膜，也可能被孔内的抗体截留而堵塞该孔，当然更多的目的白细胞被膜面上的抗体截留而留在膜面上。

本发明中，对于不同的目的白细胞相应可以选择不同的特异性结合的抗体，可以是能特异性结合所有白细胞的抗体，也可以是特异性结合某种白细胞(例如T淋巴细胞)的抗体。因此，本发明所述径迹蚀刻膜上连接的目的白细胞抗体可以是一种或多种。

在一种具体的实施方式中，用于分离白细胞的抗体包括CD45、CD4、CD5和CD19中的一种或多种。本领域技术人员知晓，在白细胞分选领域，抗体种类非常多。例如本发明所述CD45抗体是对所有白细胞呈阳性，而CD4抗体可以特异性地使得某类T淋巴细胞(辅助T淋巴细胞)截留，CD5抗体可以特异性地使得所有的T淋巴细胞截留，CD19抗体可以特异性地使得B淋巴细胞截留。当然，本发明所述与目的白细胞进行特异性结合的抗体并不仅限于上述数种。

本发明还提供一种用于分离血液中循环肿瘤细胞的方法，所述方法包括使用固定有复合膜的过滤器对血液进行过滤，所述复合膜包括径迹蚀刻膜滤膜和以直接或间接方式连接在滤膜上且能与目的肿瘤细胞进行特异性结合的一种或多种抗体分子；含有肿瘤细胞的血液在流经过滤器的复合膜时，其上的目的肿瘤细胞被位于膜面上和/或膜孔中的所述抗体截留，或目的肿瘤细胞被径迹蚀刻膜上直径均匀的孔道截留，而允许包括红细胞和白细胞的其它成分顺利通过该复合膜；所述复合膜中包含抗原抗体免疫分离和径迹蚀刻膜物理尺寸分离而共同截留所述循环肿瘤细胞。

在一种具体的实施方式中，所述过滤器为立体式过滤柱，过滤柱中包含一个或多个过滤子柱，且同一个过滤子柱中设置的不同复合膜的滤液流动方向不同或同一复合膜上不同位置的滤液流动方向不同。

本发明中使用的径迹蚀刻膜的厚度是12～30μm，膜厚跟孔道直径的尺寸相当或略大。本发明中使用的抗体是一种蛋白质，其尺寸一般为数十纳米以下，而亲和素以及生物素的尺寸比抗体更小，因而本发明中的抗体完全可以连接在径迹蚀刻膜的孔道中。

本发明中，使用GFP即绿色荧光蛋白是为了使得在待分离的目的细胞为活体细胞的情况下示踪检测。

本发明所述复合膜在用于分离癌细胞等大小比孔道直径大的目标物时，至少具有如下有益效果：

1、本发明首次将抗体化学交联至径迹蚀刻膜上，本发明提供的复合膜完美地结合了抗原抗体免疫分离以及径迹蚀刻膜物理分离的效果，膜结构稳定，分离效果稳定高效可靠。具体地，本发明所述径迹蚀刻膜的膜面上的非孔区域面积大，而膜孔一般只允许单个血细胞通过，膜面和膜孔中能大量且无死角、均匀地结合特异性抗体，使得抗体对目的细胞的免疫分离全面且无遗漏。且所述径迹蚀刻膜上膜孔尺寸均匀一致，一般仅适合单个血细胞垂直膜面通过该膜，因而在免疫分离的同时复合膜中同时会对目的细胞产生尺寸选择的物理过滤效应。

2、从实施例中用于少数癌细胞分离的灵敏度实验可见，本发明所述复合膜大幅提高了癌细胞的分离效率和可靠性。

3、该复合膜有望在血液中分离CTC领域得到实际应用。在该领域中，CTC分离越彻底对患者的身体越有利，可以预期含该复合膜的过滤器用于净化人体血液中的CTC时，能够分离得更干净彻底。同时，复合膜的分离效率比单独的径迹蚀刻膜更高，更快速，因而可以预期含该复合膜的过滤器用于净化人体血液中的CTC时，能够显著加快血液中CTC的净化速度，净化血液时血液在体外循环的遍数更少。

4、本发明所述复合膜能截留一些尺寸很小的肿瘤细胞，避免了径迹蚀刻膜不能截留小尺寸CTC的缺陷。

5、径迹蚀刻膜上难免会存在多孔融合在一起的膜缺陷，例如三个膜孔重叠在一起就可能导致正常尺寸的癌细胞从该大孔穿过径迹蚀刻膜，本发明提供的复合膜能很好地弥补该缺陷。

6、本发明实施例中使用的是EpCAM抗体交联。在实际应用中可根据具体目的肿瘤细胞表面标记物的不同，生产出交联不同种类甚至是多种抗体同时交联在一起的复合膜，满足临床工作的不同需要。

总的说来，本发明结合了免疫分离和按大小物理分选的双重截留分离作用，和现有的液体中肿瘤细胞分选方法相比，显著提高了目的肿瘤细胞分离的敏感性和效率。

本发明所述复合膜在用于分离白细胞等大小比孔道直径小的目标物时，至少具有如下有益效果：

1、本发明首次将分离目的白细胞的抗体化学交联至径迹蚀刻膜上，本发明提供的复合膜完美地结合了抗原抗体免疫分离以及径迹蚀刻膜均匀一致直孔道的优势，复合膜结构稳定，分离效果稳定高效可靠。

2、使用所述复合膜分离目的白细胞时不需要对待分离样品进行预处理，如裂解红细胞、固定、标记荧光抗体等，分离方法更简单。且由于不需要对血液样品进行预处理，可以直接过滤分离，因此，本发明处理样品的量可以极大的增加。这对于富集分离稀少的特殊类型白细胞具有极大的优势。

3、本发明复合膜分离目的白细胞的方法可以处理的样本量大，更重要的，该方法分离白细胞的效率大幅度提高。具体地，本发明中，因尺寸均匀的径迹蚀刻膜孔道上基本只允许白细胞(包括目的白细胞和非目的白细胞)和红细胞等成分呈单细胞通过，这给目的白细胞与抗体的结合提供了充足的时间和空间，因而该复合膜可以全面无死角地对目的白细胞进行免疫分选，在免疫分选时很难错漏目的白细胞，而非目的白细胞和红细胞等细胞几乎全部从膜孔通过；因血液中白细胞相对红细胞来说数量稀少，该复合膜能将红细胞和非目的白细胞几乎完全顺利地滤过，且膜面上的非孔道区域面积比例大，膜面上有足够的位置供目的白细胞结合，这种将富集结合和分离相结合的方式(即富集结合和分离是一步完成的)简化了操作步骤，进一步提高了免疫分选目的白细胞的效率。

4、本发明中不再需要使用磁力架或流式细胞仪，进一步简化分离装置。

总得来说，使用该复合膜分离白细胞可以用于代替现有技术中磁珠法或流式细胞仪法分离白细胞。可以不再需要使用红细胞裂解液先破坏血液中的红细胞，且复合膜分离目的白细胞的方法可以处理的样本量大，更重要的，该方法分离白细胞的效率大幅度提高。

本发明所述复合膜在用于分离乙型肝炎病毒表面抗原蛋白等大小比孔道直径小得多的目标物时，至少具有如下有益效果：

1、本发明中富集和分离液体在同一步完成，没有多余的步骤，不需要去处理需丢弃的液体，不需要将目标物转移到玻片或其它部件上才能进行CCD和显微镜等检测，相比磁珠法和ELISA法等方法具有明显的优势。即本发明提供的复合膜可使得对目标物的分离富集和上检观察同时完成。

2、本发明中将抗体连接在径迹蚀刻膜上得到复合膜，与将抗体连接在普通的滤膜上得到的复合膜相比，因径迹蚀刻膜上的孔道为尺寸均匀的单向直孔道，而普通的滤膜中的孔道结构为无规则的立体结构，本发明至少具有如下优势。一是在同等程度的孔径下，普通滤膜不能确保除目标物以外的血液细胞全部透过该膜，相反多数血细胞会堵塞在弯曲的孔道内使得膜分离效率迅速下降。二是普通滤膜的抗体会主要连接在孔道内部，而不是主要连接在膜表面，因而普通滤膜需要的抗体量多，且因径迹蚀刻复合膜捕获的目标物主要位于膜表面，而普通滤膜不能像已捕获目标物的径迹蚀刻复合膜一样可以直接送至CCD仪器和显微镜下检测。三是因普通滤膜中孔道内部的直径各处不一致，因而无法在对尺寸的精细分离中起到作用。

附图说明

图1为径迹蚀刻聚碳酸酯过滤膜示意图。图1中，A：直径25mm、8微米孔径的径迹蚀刻聚碳酸酯过滤膜外观，B：滤器用于放置过滤膜过滤，C：显微镜下的径迹蚀刻聚碳酸酯过滤膜，8微米孔径，标尺为20微米，D：8微米孔径的径迹蚀刻圆孔。

图2为GFP-HCC827细胞株的建立及HCC827细胞表达EpCAM分子。图2中，A-B：稳定表达GFP的HCC827细胞；A：100倍放大倍数，标尺为100微米；B：200倍放大倍数，标尺为50微米；C：贴壁的HCC827细胞免疫荧光检测EpCAM分子表达，蓝色为细胞核DAPI染色，绿色为EpCAM(呈包裹在HCC827细胞外围形态)；D：悬浮细胞进行细胞免疫荧光检测EpCAM分子表达，证实HCC827细胞表面表达EpCAM。

图3为对比例1中建立肿瘤细胞血行转移动物模型以及利用ISET技术分离CTC，图3中，A：5-8F肿瘤细胞株，B：GFP蛋白标记的5-8F肿瘤细胞株，C：SCID免疫缺陷鼠(黑色箭头)，D：形成的移植肿瘤(双黑色箭头)，E：血液中用ISET技术检测到的带GFP蛋白的CTC(白色箭头)。

图4为对比例1中临床研究结肠癌转移到肺患者血液中ISET技术分离CTC及鉴定，且具体包括图4-1(A～F)和图4-2(G～L)。其中，A-B：结肠癌患者血液标本使用ISET技术分离到CTC细胞，巴氏染色；C-D：PET-CT显示该患者肺转移并骨转移(白色箭头处)；E-F：免疫荧光证实CTC细胞表达肠道特异性分子CDX2；E：使用CDX2抗体进行免疫荧光染色；F：DAPI染细胞核；G-L：免疫组化证实肺部转移灶为结肠来源，G-H：CDX2抗体检测，DAB染色.，I：CK7抗体检测，AEC染色，J：CK20抗体检测，AEC染色，K：TTF-1抗体检测，AEC染色，L：villin抗体检测，AEC染色；M-N：患者5年前原发灶CDX2抗体行免疫组化检测，DAB染色。

图5为EpCAM抗体交联过滤膜对肿瘤细胞的吸附情况；其中，A-B：EpCAM抗体交联组；C-D：未交联组；A：荧光显微镜下(488nm波长激发)观察交联了EpCAM抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中带绿色荧光的为EpCAM阳性的GFP-HCC827细胞；B：白场视野下观察交联了EpCAM抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中细箭头所指为膜上过滤孔，粗箭头所指为GFP-HCC827细胞；C：荧光显微镜下(488nm波长激发)观察未交联抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中带绿色荧光的为EpCAM阳性的GFP-HCC827细胞；D：白场视野下观察未交联抗体的过滤膜上截取细胞情况，其中细箭头所指为膜上过滤孔，粗箭头所指为GFP-HCC827细胞。

图6为显微镜白场光下检测复合过滤膜对白细胞分离效果对比图，其中图6A为使用未交联抗体的径迹蚀刻过滤膜，图6B为交联了CD45抗体的过滤膜过滤等量人血提取的白细胞，固定后PBS洗涤，观察两张过滤膜上细胞分布情况。分离样品为人全血经红细胞裂解后提取的白细胞悬液。

图7为吖啶橙染色后倒置荧光显微镜检测复合过滤膜对白细胞分离效果图。其中A和B是未交联抗体的径迹蚀刻膜，C和D是交联有CD45抗体的径迹蚀刻过滤膜。分离样品为人全血经红细胞裂解后提取的白细胞悬液。

图8为荧光染色和常规染色显微镜检测复合过滤膜对白细胞的结合效果图。其中A、B和C是未交联抗体的径迹蚀刻膜，D、E和F是交联有CD45抗体的径迹蚀刻过滤膜。具体地，图8A为吖啶橙染色后，正常过滤膜在激发光波长为488nm的荧光通道下细胞分布情况，图8B为白场光下正常过滤膜情况；图8C为苏木素染色后正常过滤膜在白场光下情况；图8D为交联了CD45抗体的过滤膜吖啶橙染色后，在激发光波长为488nm的荧光通道下细胞分布情况，图8E为白场光下交联了CD45抗体的过滤膜情况；图8F为苏木素染色后交联了CD45抗体的过滤膜在白场光下细胞情况。分离样品为人全血，未经预处理直接过滤。

图9为HBs抗体偶联复合膜分离检测乙型肝炎病毒感染的病人血液中乙型肝炎病毒表面抗原蛋白的检测示意图，其中图9A和图9B的左边均为HBs抗体偶联的复合膜，图9A和图9B的右边均为未偶联任何抗体的径迹蚀刻膜对照组；图9A为白场光下的两种过滤膜，图9B为两种过滤膜分离含有乙肝病毒的人全血后，加入发光液，冷CCD成像系统检测结果。

图10中提供一种膜孔径为0.2微米的径迹蚀刻膜的电镜照片，其中图10A为视野中出现多个膜孔的电镜照片，而图10B为视野中仅一个膜孔的径迹蚀刻膜电镜照片。

具体实施方式

本发明通过以下实施例具体说明，但本发明的保护范围并不仅限于下述实施例。

实施例1

(1)先准备径迹蚀刻聚碳酸酯过滤膜，如图1为所示。

(2)再利用普通的径迹蚀刻聚碳酸酯过滤膜建立起ISET技术分离CTC。体外实验表明ISET技术可以很好的分离截留肿瘤细胞，而让正常血液细胞顺利通过。

(3)将抗体交联至所述径迹蚀刻膜膜上。在本研究中我们使用的抗体为抗人EpCAM的单克隆抗体，因为该抗体被广泛应用于血液CTC细胞的分选中。先将上述制备的过滤膜进行烷基化处理，烷基化处理后使用交联剂将抗人EpCAM的单克隆抗体交联至过滤膜上。清洗，干燥后，抗体交联的径迹蚀刻聚碳酸酯/聚酯滤过膜制备完成。

(4)构建GFP-HCC827细胞株。我们利用Piggybac转座子系统，成功将GFP基因导入HCC827细胞内，并构建了稳定表达细胞株。该细胞株既表达GFP做为示踪蛋白，并且EpCAM表面分子表达阳性，是用来验证新型交联EpCAM抗体径迹蚀刻聚碳酸酯/聚酯过滤膜的理想细胞株。

图2为GFP-HCC827细胞株的建立及HCC827细胞表达EpCAM分子。图2中，A-B：稳定表达GFP的HCC827细胞；A：100倍放大倍数，标尺为100微米；B：200倍放大倍数，标尺为50微米；C：贴壁的HCC827细胞免疫荧光检测EpCAM分子表达，蓝色为细胞核DAPI染色，绿色为EpCAM(呈包裹在HCC827细胞外围形态)；D：悬浮细胞进行细胞免疫荧光检测EpCAM分子表达，证实HCC827细胞表面表达EpCAM。

(5)下一步将先制备得到偶联有EpCAM抗体的径迹蚀刻膜，并通过带有绿色荧光蛋白(GFP)的HCC827细胞株研究复合膜分离截留效率以及复合膜的敏感性。

对比例1

本对比例中说明仅使用径迹蚀刻膜分离(ISET技术)CTC细胞的效果。

动物模型实验表明ISET技术可以从移植瘤小鼠中分离得到CTC细胞，但是阳性率较低(9只小鼠中，3只检测到CTC，阳性率33.3％)，如图3所示。临床实验证实了ISET技术可以分离血液中的CTC细胞，但是阳性率较低，如图4所示。

图3为对比例1中建立肿瘤细胞血行转移动物模型以及利用ISET技术分离CTC，图3中，A：5-8F肿瘤细胞株，B：GFP蛋白标记的5-8F肿瘤细胞株，C：SCID免疫缺陷鼠(黑色箭头)，D：形成的移植肿瘤(双黑色箭头)，E：血液中用ISET技术检测到的带GFP蛋白的CTC(白色箭头)。

图4为对比例1中临床研究结肠癌转移到肺患者血液中ISET技术分离CTC及鉴定。其中，A-B：结肠癌患者血液标本使用ISET技术分离到CTC细胞，巴氏染色；C-D：PET-CT显示该患者肺转移并骨转移(白色箭头处)；E-F：免疫荧光证实CTC细胞表达肠道特异性分子CDX2；E：使用CDX2抗体进行免疫荧光染色；F：DAPI染细胞核；G-L：免疫组化证实肺部转移灶为结肠来源，G-H：CDX2抗体检测，DAB染色.，I：CK7抗体检测，AEC染色，J：CK20抗体检测，AEC染色，K：TTF-1抗体检测，AEC染色，L：villin抗体检测，AEC染色；M-N：患者5年前原发灶CDX2抗体行免疫组化检测，DAB染色。

临床实验研究共67例肺部恶性肿瘤患者入肿瘤组，取得67份可检测血液样本；良性肺部疾病患者29例和健康志愿者6例入非肿瘤组，取得35份可检测血液样本。其中4例Ⅳ期患者入远处转移组；63例I-Ⅲ期患者入未远处转移组。所有血液样本均通过ISET外周血筛查装置进行检测，定义CTC阳性为每5ml血液样本检出CTC数为1个及以上者，且进行单盲识别CTC，即对样本镜下观察的研究人员并不知道样本来源(因此时患者尚未行手术并且无病理诊断资料)。肿瘤组CTC的检出率为2.99％(2/67)，非肿瘤组CTC的检出率为0.00％(0/35)。远处转移组CTC的检出率为50.00％(2/4)，显著高于未远处转移组CTC的检出率0.00％(0/63)，P<0.05。具体数据见表1。67例肺部恶性肿瘤患者中有2例患者外周血中检测出CTC，1例为结肠癌肺、骨转移患者，无病生存期为5年，其术前检测到CTC；1例为结肠癌肺转移患者，无病生存期为1.5年，其术前检测到CTC。

表1各组CTC检出率

*远处转移组和未远处转移组比较(四格表的Fisher精确检验，P<0.05)

对比例1的结果说明仅使用ISET技术分离CTC时(包括动物实验和人类临床实验)，其效果有待改进。

实施例2

本实施例为CD326抗体(一种EpCAM抗体)偶联径迹蚀刻膜得到复合膜，和该复合膜结合肺癌细胞HCC827实验。

1.配制溶液：

溶液1，4％(v/v)3-巯丙基三甲氧基硅烷-酒精溶液；

溶液2，50mgGMBS溶于0.5ml DMSO(二甲亚砜)，加乙醇配置为0.28％(v/v)混合液；

溶液3，蒸馏水修复冻干中性亲和素，加PBS配制为0.1％(v/v)混合液；

溶液4，1％(w/v)BSA和0.09％(w/v)叠氮化钠的PBS溶液；

溶液5，生物素化EpCAM抗体+溶液4，配制为浓度10ug/ml。

2.实验步骤：

1)溶液1浸泡荡洗过滤膜，室温45分钟，使硅烷预处理表面；

2)乙醇洗涤除去未反应的硅烷；

3)溶液2浸泡荡洗过滤膜，反应15分钟，使GMBS附着于膜上；

4)乙醇洗涤；

5)亲和素溶液3浸泡荡洗过滤膜，存放在冰箱里过夜，使亲和素附着于GMBS；

6)溶液4，PBS洗涤，除去未反应的亲和素；

7)溶液5浸泡荡洗过滤膜，反应15-30分钟，生物素化的抗体与亲和素结合；

8)PBS洗涤过滤膜，除去未结合的抗体；空气中干燥，常温保存最多三周。

3.实验结果：

我们选取了肺癌细胞株HCC827作为实验细胞株。HCC827经免疫荧光实验证实细胞膜表面表达EpCAM蛋白(也被称为CD326分子)。我们将绿色荧光蛋白转染至HCC827细胞中，使其稳定表达GFP蛋白(HCC827-GFP细胞株)。绿色荧光蛋白可以清晰的帮助我们观察细胞。体外培养HCC827-GFP细胞株，消化计数细胞，使用5×10⁵个细胞加入PBS缓冲液中(50ml)；同时加入上述制备的EpCAM抗体偶联的8微米孔径的径迹蚀刻过滤膜；4度孵育30分钟；彻底吸出含细胞的缓冲液上清，并加入不含细胞的PBS(50ml)置于摇床上清洗，共3次，每次10min；过滤膜经过充分洗涤后，置于荧光显微镜下检测。可以看到，没有偶联EpCAM抗体的过滤膜和HCC827-GFP共同孵育后，不能结合细胞；而偶联EpCAM抗体的过滤膜和HCC827-GFP共同孵育后，可以有效的结合捕获细胞。

图5为EpCAM抗体交联过滤膜对肿瘤细胞的吸附情况；其中，A-B：EpCAM抗体交联组；C-D：未交联组；A：荧光显微镜下(488nm波长激发)观察交联了EpCAM抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中带绿色荧光的为EpCAM阳性的GFP-HCC827细胞；B：白场视野下观察交联了EpCAM抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中细箭头所指为膜上过滤孔，粗箭头所指为GFP-HCC827细胞；C：荧光显微镜下(488nm波长激发)观察未交联抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中带绿色荧光的为EpCAM阳性的GFP-HCC827细胞；D：白场视野下观察未交联抗体的过滤膜上截取细胞情况，其中细箭头所指为膜上过滤孔，粗箭头所指为GFP-HCC827细胞。

实施例3

本实施例旨在验证本发明所述复合膜对肿瘤细胞的吸附效果。

1、配制溶液：

溶液1，4％(v/v)3-巯丙基三甲氧基硅烷-酒精溶液；

溶液2，50mgGMBS溶于0.5ml DMSO(二甲亚砜)，加乙醇配置为0.28％(v/v)混合液；

溶液3，蒸馏水修复冻干中性亲和素，加PBS配制为0.1％(v/v)混合液；

溶液4，1％(w/v)BSA和0.09％(w/v)叠氮化钠的PBS溶液；

溶液5，生物素化EpCAM抗体+溶液4，配制为浓度10ug/ml。

2、复合膜制备的实验步骤：

1)溶液1浸泡荡洗过滤膜，室温45分钟，使硅烷预处理表面；

2)乙醇洗涤除去未反应的硅烷；

3)溶液2浸泡荡洗过滤膜，反应15分钟，使GMBS附着于膜上；

4)乙醇洗涤；

5)亲和素溶液3浸泡荡洗过滤膜，存放在冰箱里过夜，使亲和素附着于GMBS；

6)溶液4，PBS洗涤，除去未反应的亲和素；

7)溶液5浸泡荡洗过滤膜，反应15-30分钟，生物素化的抗体与亲和素结合；

8)PBS洗涤过滤膜，除去未结合的抗体；空气中干燥，常温保存最多三周。

3.EpCAM(CD326)抗体偶联过滤膜效果质量检测

(1)取带绿色荧光蛋白GFP的肺癌HCC827细胞(EpCAM阳性细胞)，计数后配制成细胞密度为1.0×10⁵个/ml的PBS细胞溶液。

(2)取交联了EpCAM抗体的过滤膜、未交联抗体的过滤膜各1张，置于六孔板中，分别往其孔中加入2ml上述细胞溶液使过滤膜被完全浸泡。

(3)将六孔板置于37℃培养箱中孵育1h，使过滤膜与细胞充分接触。

(4)1h后取出膜，分别放入含4ml PBS的小玻璃容器内，置于摇床上洗涤3次，每次5min，将膜上未与抗体结合的细胞除去。

(5)荧光显微镜下观察过滤膜上细胞分布及密度等实验结果，拍照保存。

4.实验结果

(1).荧光显微镜观察两种过滤膜上附着细胞情况：交联了EpCAM抗体的过滤膜可以十分有效的与EpCAM阳性细胞特异性结合；而未交联EpCAM抗体的过滤膜则几乎不能有效吸附EpCAM阳性细胞。

图5为EpCAM抗体交联过滤膜对肿瘤细胞的吸附情况；其中，A-B：EpCAM抗体交联组；C-D：未交联组；A：荧光显微镜下(488nm波长激发)观察交联了EpCAM抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中带绿色荧光的为EpCAM阳性的GFP-HCC827细胞；B：白场视野下观察交联了EpCAM抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中细箭头所指为膜上过滤孔，粗箭头所指为GFP-HCC827细胞；C：荧光显微镜下(488nm波长激发)观察未交联抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中带绿色荧光的为EpCAM阳性的GFP-HCC827细胞；D：白场视野下观察未交联抗体的过滤膜上截取细胞情况，其中细箭头所指为膜上过滤孔，粗箭头所指为GFP-HCC827细胞。

(2).两种过滤膜上附着细胞数目：

分别计数200倍放大倍数下两个过滤膜上随机3个视野中的细胞数，计算其平均细胞数及标准差(见表2，放大倍数为200倍)。可见抗体复合膜上细胞数目明显多余正常径迹蚀刻过滤膜。

表2随机三个视野中两种过滤膜上细胞数

膜	视野1(个)	视野2(个)	视野3(个)	平均细胞数(个)	标准差
						抗体膜	150	132	144	142	7.483315
径迹蚀刻膜	1	3	0	1.33	1.246667

结论：本发明所述制备方法可将EpCAM抗体交联至径迹蚀刻膜(又称核孔膜)上，且交联EpCAM抗体的径迹蚀刻膜可以十分有效地与EpCAM阳性细胞特异性结合。

实施例4

本实施例旨在验证和比对本发明所述复合膜以及现有技术中未交联抗体的径迹蚀刻膜对肿瘤细胞的吸附分离效果。

本发明所述敏感性实验研究过滤10个HCC827-GFP细胞。

1)实验过程：

1.组装膜过滤装置，实验组为交联了EpCAM抗体的滤过膜，对照组为未交联抗体的正常径迹蚀刻滤过膜；排气后关闭三通阀，加入生理盐水至与过滤柱上口相平；

2.取培养的HCC827-GFP细胞，消化分散混匀后，取少量细胞溶液，用适量培养基稀释混匀后，置于荧光显微镜下；

3.显微镜下使用微量注射器逐个精确吸取10个HCC827-GFP单细胞，分别加入到上述两过滤柱中；

4.在过滤柱上口接一个20ml注射器管，加入15ml生理盐水，打开三通阀洗涤；重复3次；

5.将滤完时逐次加入1-2ml4％多聚甲醛过滤固定，共加入约10ml多聚甲醛使之充分固定；

6.室温充分固定15min后，加入15ml生理盐水清洗2次；

7.取出滤过膜，置小号培养皿中，PBS洗涤2次，每次5min；

8.取出滤过膜，置于干净载玻片上，加入15ul 40％甘油封片剂予以封片；

9.荧光显微镜下观察，分别记录两膜上截留的绿色荧光细胞数目。

10.实验再次重复2次，统计结果。

2)实验结果：

显微镜下使用微量注射器逐个精确吸取10个HCC827-GFP肿瘤细胞，过滤后荧光显微镜下滤过膜吸附截留肿瘤细胞数，其中交联EpCAM抗体的滤过膜吸附截留9.333±0.471个肿瘤细胞，截留率为(93.33±4.71)％；未交联抗体的正常滤过膜截留4.000±0.632个肿瘤细胞，截留率为(40.00±6.32)％。表明抗体膜在极少肿瘤细胞(10个HCC827-GFP细胞)的条件下具有很强的肿瘤特异性吸附能力，较同等条件下未交联抗体的滤过膜截留肿瘤细胞能力提高了133％；P<0.01。

表3两种滤过膜过滤10个HCC827-GFP细胞截留的细胞数目

	第1次(个)	第2次(个)	第3次(个)	平均数(个)	标准差
						抗体复合膜	9	9	10	9.33	0.471
径迹蚀刻膜	3	4	5	4.00	0.632

3)实验结论：

交联了EpCAM抗体的滤过膜过滤截留HCC827-GFP细胞的能力显著优于未交联抗体的正常滤过膜。

实施例5

本实施例中对比不连接抗体的径迹蚀刻膜和连接有目的白细胞分选用抗体的径迹蚀刻膜的分离结果。本实施例中使用的抗体为CD45，所使用的径迹蚀刻膜为聚碳酸酯膜(孔径8微米)，即PC滤过膜。所用的血液经过裂解红细胞预处理。

一、实验过程：

1.生物素化CD45抗体交联PC滤过膜制备

(1)取孔密度分布均匀的PC过滤膜，分别完全浸泡至含有3ml 4％(v/v)硅烷-酒精溶液的小玻璃容器内，封闭，放于摇床上震荡，室温45分钟，使硅烷充分预处理膜表面；

(2)将膜转至含2ml无水乙醇的小培养皿内，回收4％(v/v)硅烷-酒精溶液，荡洗除去未反应的硅烷，洗涤3次，每次7min；

(3)洗涤完成后，吸尽酒精，往容器加入1ml的1mM GMBS溶液内，荡洗过滤膜反应15分钟，使GMBS附着于膜上；

(4)回收1mM的GMBS溶液，分别加入2ml无水乙醇荡洗滤过膜，洗除去未反应的GMBS，洗涤3次，每次7min；

(5)洗涤完成后，加入1ml的10ug/ml中性亲和素溶液至容器内，完全浸泡过滤膜，放在4℃冰箱里过夜，使亲和素附着于GMBS；

(6)回收10ug/ml中性亲和素溶液后，加入PBS荡洗过滤膜3次，每次7min，除去未反应的亲和素；

(7)洗涤完成后，加入1ml的10ug/ml生物素化CD45抗体液至容器内，完全浸泡过滤膜，室温下荡洗反应30分钟，生物素化的抗体与亲和素结合；

(8)回收CD45抗体液后，PBS荡洗过滤膜3次，每次7min，除去未结合的抗体；

(9)吸出PBS溶液，使抗体膜处于含少量PBS溶液的湿润环境中；封口膜封闭小培养皿，4℃冰箱内存放(常温保存最多3周)。

2.提取人外周血白细胞

(1)取15ml离心管，加约13ml的1×红细胞裂解液(不含tris)；

(2)将2ml的人抗凝全血加入上述管中，轻轻颠倒混匀，裂解15分钟至溶液清亮；

(3)2000转离心5分钟，倾倒去掉上层红细胞液，留沉淀细胞(白细胞)；

(4)加5ml红细胞裂解液吹匀重悬沉淀细胞，混匀；

(5)2000转离心5分钟，弃上清，得沉淀细胞(白细胞)；

(6)洗涤：5ml PBS溶液重悬细胞，2000转离心5分钟，弃上清，得沉淀细胞；

(7)2ml PBS重悬细胞，混匀后分装转移至1.5ml EP离心管中，每管1ml。此即为提取的人血白细胞。

3.设置变量：

实验组：交联生物素化CD45抗体的PC滤过膜；

对照组：未交联抗体的PC滤过膜。

4.膜过滤实验

(1)分别使用未交联抗体的过滤膜、交联了CD45抗体的过滤膜组装膜过滤装置，排气后关闭三通阀，加入15ml生理盐水洗涤过滤后留2ml备用。

(2)分别取上述人血中提取的1ml白细胞溶液，充分混匀后，用枪头加入至过滤柱内，混匀后打开过滤柱下口三通阀，使溶液从下口缓慢流出，待白细胞溶液基本进入过滤柱中时，关闭三通阀。

(3)分别将过滤柱放置于50ml离心管上，放稳后将其放入37℃恒温箱中静置1小时，让过滤柱中白细胞沉降至过滤膜上，使其充分接触。

(4)1h后拿出过滤柱置于铁架台上固定，加入15ml生理盐水，打开下口的三通阀使液体流出，待液体快流完时补加生理盐水15ml，充分洗涤过滤装置并除去过滤膜上未

固定的细胞；重复4次。

(5)将滤完时逐次加入1-2ml4％多聚甲醛过滤固定，共加入约10ml多聚甲醛使之充分固定15min。

(6)室温充分固定15min后，加入15ml生理盐水清洗2次。

(7)分别取出滤过膜，置六孔板中，摇床上PBST洗5min×3次。

(8)在倒置显微镜下观察膜上细胞分布情况。

5.吖啶橙染色实验

(1)洗涤完成后，吸去过滤膜洗涤剂PBST液，分别加入1.8ml PBS液充分浸泡过滤膜。

(2)分别往两膜中加入0.1％吖啶橙溶液200ul，使吖啶橙染色浓度为0.01％；震荡混匀后置于摇床上染色5min。

(3)吸去吖啶橙染液，加入3ml PBST液震荡洗涤过滤膜，每次5min，直至溶液澄清无染液。

(4)洗涤完成后可倒置显微镜下观察细胞分布情况、荧光观察细胞荧光情况等。

(5)40％甘油封片剂封片，荧光显微镜下观察实验结果并拍照记录。

二、实验结果：

1.过滤前两膜上过滤孔分布情况基本一致。

2.显微镜白场光下观察细胞分布情况：

图6为膜滤过白细胞固定后细胞分布对比图，其中图6A为使用未交联抗体的径迹蚀刻过滤膜，图6B为交联了CD45抗体的过滤膜过滤等量人血提取的白细胞，固定后PBS洗涤，观察两张过滤膜上细胞分布情况。由图6A和图6B可见交联了CD45抗体的过滤膜上细胞数量明显较正常径迹蚀刻膜多。

3.吖啶橙染色洗涤后倒置荧光显微镜观察细胞分布情况：

图7为吖啶橙染色洗涤后倒置显微镜观察细胞分布情况。其中A和B是未交联抗体的径迹蚀刻膜，C和D是交联有CD45抗体的径迹蚀刻过滤膜。

分别使用0.01％吖啶橙溶液室温下对未交联抗体的正常过滤膜、交联了CD45抗体的过滤膜染色5min，PBS洗涤后倒置显微镜下观察两张过滤膜上细胞分布情况。图A为正常过滤膜在激发光波长为488nm的荧光通道下情况，图B为白场光下正常过滤膜情况；图C为交联了CD45抗体的过滤膜在绿色荧光通道下情况，图D为白场光下交联了CD45抗体的过滤膜情况。从图7可见，正常过滤膜在激发光波长为488nm的荧光通道仅有较弱的绿色荧光，结合白场光下所见考虑主要为过滤孔残留的吖啶橙荧光染剂所致，白细胞数量极少；交联了CD45抗体的过滤膜上细胞数量明显较正常膜多。

三、实验结论

交联了CD45抗体的径迹蚀刻过滤膜可特异性吸附白细胞，明显增强径迹蚀刻过滤膜对白细胞的截留能力。

实施例6

本实施例中对比不连接抗体的径迹蚀刻膜和连接有目的白细胞分选用抗体的径迹蚀刻膜对人全血直接过滤的分离结果。本实施例中使用的抗体为CD45，所使用的径迹蚀刻膜为聚碳酸酯膜(孔径8微米)，即PC滤过膜。血液不预先裂解红细胞处理，直接过滤。

一、实验过程：

1.生物素化CD45抗体交联PC滤过膜制备

该步骤与实施例5中的第1步相同。

2.设置变量：

实验组：交联生物素化CD45抗体的PC滤过膜；

对照组：未交联抗体的PC滤过膜。

3.膜过滤实验

(1)分别使用未交联抗体的过滤膜、交联了CD45抗体的过滤膜组装膜过滤装置，排气后关闭三通阀，加入15ml生理盐水洗涤过滤后留2ml备用。

(2)分别取人抗凝全血2毫升，用枪头加入至过滤柱内，混匀后打开过滤柱下口三通阀，使溶液从下口缓慢流出，待血液基本进入过滤柱中时，关闭三通阀。

(3)分别将过滤柱放置于50ml离心管上，放稳后将其放入37℃恒温箱中静置1小时，让过滤柱中白细胞沉降至过滤膜上，使其充分接触。

(4)1h后拿出过滤柱置于铁架台上固定，加入15ml生理盐水，打开下口的三通阀使液体流出，待液体快流完时补加生理盐水15ml，充分洗涤过滤装置并除去过滤膜上未固定的细胞；重复4次。

(5)将滤完时逐次加入1-2ml4％多聚甲醛过滤固定，共加入约10ml多聚甲醛使之充分固定15min。

(6)室温充分固定15min后，加入15ml生理盐水清洗2次。

(7)分别取出滤过膜，置六孔板中，摇床上PBST洗5min×3次。

(8)可倒置显微镜下观察膜上细胞分布情况。

4.吖啶橙染色实验

该步骤与实施例5中的第5步相同。

5.苏木素染色

(1)洗涤完成后，吸去过滤膜洗涤剂PBST液，分别加入1.8ml PBS液充分浸泡过滤膜。

(2)分别往两膜中加入苏木素染色液1ml，染色1min。

(3)吸去苏木素染色液，加入3ml PBS液震荡洗涤过滤膜，每次5min，共3次。

(4)40％甘油封片剂封片，显微镜下观察实验结果并拍照记录。

二、实验结果：

1.过滤前两膜上过滤孔分布情况基本一致。

2.过滤固定后细胞分布情况：

图8为荧光染色和常规染色显微镜检测交联CD45抗体的径迹蚀刻膜对白细胞的结合效果图。其中A、B和C是未交联抗体的径迹蚀刻膜，D、E和F是交联有CD45抗体的径迹蚀刻过滤膜。具体地，图8A为吖啶橙染色后，正常过滤膜在激发光波长为488nm的荧光通道下细胞分布情况，图8B为白场光下正常过滤膜情况；图8C为苏木素染色后正常过滤膜在白场光下情况；图8D为交联了CD45抗体的过滤膜吖啶橙染色后，在激发光波长为488nm的荧光通道下细胞分布情况，图8E为白场光下交联了CD45抗体的过滤膜情况；图8F为苏木素染色后交联了CD45抗体的过滤膜在白场光下细胞分布情况。其中白色箭头指示为白细胞，深色箭头指示为膜上直径为8微米的过滤孔。

由图8可见正常过滤膜在激发光波长为488nm的荧光通道下仅有较弱的绿色荧光，结合白场光下所见考虑主要为过滤孔残留的吖啶橙荧光染剂所致，白细胞数量极少；交联了CD45抗体的过滤膜上细胞数量明显较正常膜多。

三、实验结论

交联了CD45抗体的径迹蚀刻过滤膜可特异性吸附白细胞，明显增强径迹蚀刻过滤膜对白细胞的截留能力。

实施例7

本实施例说明应用抗体偶联径迹蚀刻膜可以快速简便的检测血液中的蛋白质或其他微生物成分。

现以8微米孔径的径迹蚀刻复合膜从人血液中分离检测乙型肝炎病毒表面抗原蛋白为例。

目前，检测乙型肝炎病毒表面抗原蛋白多采用酶联免疫吸附试验(ELISA)来检测。ELISA首先为收集病人血清(首先采集血液，使血液凝固，再离心分离得到血清)，一般只检测100ul待测样本血清。然后依次经过1加样；2温育：置37℃温育60分钟；3、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间；4、加酶：在每一微孔中加入酶标记抗体50ul；5、温育：置37℃温育30分钟；6、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间；7、显色：每孔加底物A、底物B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃暗置30分钟。8、终止：每孔加入终止液50ul，混匀。9、测定：用酶标仪双波长法450nm/630nm测定每一微孔OD值，记录结果。也就是说ELISA检测法至少包括上述多个步骤。

而本发明中使用上述实施例中的方法先制备得到偶联有HBs抗体的径迹蚀刻膜(简称HBs抗体偶联膜)。再通过将血液通过HBs抗体偶联膜的方法得到型肝炎病毒表面抗原蛋白。

具体地，使用HBs抗体偶联膜可以十分快速简便的检测血液中乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。1、首先取抗凝全血4-5毫升(样品量可以根据需要调整，可以处理大量血液)，无需任何预处理和离心直接使用HBs抗体偶联复合膜过滤；2、无需再将血液样品吸出(因为已经过滤去除)，直接加PBS-T缓冲液20毫升洗涤，洗涤完也不需要用额外的步骤吸出洗涤液；3、直接加入稀释好的酶标记抗体，继续过滤；4、直接加PBS-T缓冲液20毫升洗涤，5、将膜取出，加入发光液，使用冷CCD成像系统检测。使用本发明的复合膜检测和使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测相比，HBs抗体偶联膜在结合目标蛋白的同时对血液中的其它成分进行去除(8微米孔径的径迹蚀刻膜使得红细胞、白细胞等成分顺利通过膜孔)，并且由于和过滤技术相结合，因此在洗涤时，不需要额外的步骤去将洗涤液去掉，因此大大简化了步骤。

图9为HBs抗体偶联复合膜分离检测乙型肝炎病毒感染的病人血液中乙型肝炎病毒表面抗原蛋白的检测示意图，其中图9A和图9B的左边均为HBs抗体偶联的复合膜，图9A和图9B的右边均为未偶联任何抗体的径迹蚀刻膜对照组；图9A为白场光下的两种过滤膜，图9B为两种过滤膜分离含有乙肝病毒的人全血后，加入发光液，冷CCD成像系统检测结果。

从图9可以看出，HBs抗体偶联的复合膜出现很强的信号，而未偶联抗体的径迹蚀刻过滤膜无任何信号。这说明应用抗体偶联径迹蚀刻膜可以快速简便的检测血液中的蛋白质成分。

本领域技术人员知晓地，待检测的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白可以是游离(10nm左右)存在于血液中，也可以是位于病毒颗粒(100～200nm左右)表面，乙型肝炎病毒表面抗原蛋白的尺寸远小于该实施例中使用的复合膜的孔径，因而会有少量待检测蛋白透过膜孔，但我们检测时只需将足够量的目标物截留在复合膜上即可。例如目标物为某些稀有蛋白或稀有细胞时，本发明中完全可以通过加大样本量来实现获取足量目标物的目的。例如ELISA的样本量一般是100微升，而本发明中例如使用3ml或5ml的样本量即可。也就是说，本发明所述方法用于检测含量极低、稀有的目标物时，具有显著的优势。

上述实施例中均给出的是从血液中分离目标物，这都需要将血液中的正常成分滤过径迹蚀刻膜，因而使用的复合膜的膜孔径为8微米。但例如从化合物水溶液中或其它某些体液中分离目标物时，例如截留的目标物为蛋白质分子，则复合膜的孔径可以更低得多，例如图10中提供一种膜孔径为0.2微米的径迹蚀刻膜的电镜照片，其中图10A为视野中出现多个膜孔的电镜照片，而图10B为视野中仅一个膜孔的径迹蚀刻膜电镜照片。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种固液分离用复合膜，所述复合膜包括径迹蚀刻膜和以直接或间接方式连接在径迹蚀刻膜的膜表面上和/或孔道内的用于与目标物进行特异性结合的一种或多种抗体分子，所述目标物为含抗原的固体物质，所述径迹蚀刻膜与抗体的连接中包括一处以上的化学连接，所述径迹蚀刻膜孔径为50nm～40微米，优选100nm～30微米，更优选5～28微米，所述径迹蚀刻膜上连接的抗体分子用于将目标物免疫截留在径迹蚀刻膜上。

2.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述径迹蚀刻膜上尺寸均匀的孔道的直径均为x上下偏差不超过15％的值，且x为100nm～30μm中的任一值；最优选孔道直径为8±1μm。

3.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述抗体通过生物素和亲和素的连接而固定在径迹蚀刻膜上，优选所述抗体依次通过生物素、亲和素、偶联剂GMBS以及硅烷偶联剂连接在径迹蚀刻膜上。

4.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述目标物为蛋白质分子、核酸分子、病毒、支原体、衣原体、细菌和细胞中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述目标物的直径为所述膜孔直径的0.5～5倍，优选为0.7～3倍，当所述目标物的尺寸大于膜孔尺寸时除免疫分选外还通过膜孔的物理尺寸分选将目标物截留在径迹蚀刻膜上，当所述目标物的尺寸小于膜孔尺寸时利用复合膜上直径均匀的孔道提高目标物的分离效率、分离精度和/或分离能力。

6.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述径迹蚀刻膜的膜面上的膜孔总面积为膜面总面积的40％以下，优选1～30％，更优选5～20％。

7.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述径迹蚀刻膜为使用重离子加速器轰击高分子膜材料后经过化学蚀刻而得到的包含多个孔径均匀直孔道的膜，优选所述径迹蚀刻膜为聚酯膜或聚碳酸酯膜。

8.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述径迹蚀刻膜的厚度为12～30微米，且所述抗体的分子尺寸为100nm以下，优选80nm以下。

9.一种如权利要求1～8中任意一项所述复合膜的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤A、先对径迹蚀刻膜采用硅烷偶联剂浸泡荡洗进行膜表面的硅烷预处理；

步骤B、对膜采用偶联剂GMBS处理，使GMBS附着于膜上；

步骤C、对膜采用亲和素处理，使得亲和素附着于GMBS上；

步骤D、对膜采用生物素化的抗体处理，使得生物素化的抗体与亲和素结合；且步骤A～D中的每个步骤后均包括清洗除去未结合或未反应的相应化学物质。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂为3-巯丙基三甲氧基硅烷。