CN113125708B - 一种基于核孔膜的微孔板及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于核孔膜的微孔板及其制备方法与应用。该基于核孔膜的微孔板，包括微孔板基体和位于微孔板基体底部的核孔膜，微孔板基体的内壁设置有疏水层。本发明通过对微孔板基体的内壁进行疏水修饰，消除微孔板基体的内壁和液体的非特异性吸附；通过在微孔板基体底部增加核孔膜，在免疫学检测时，捕获抗体或抗原偶联在粒径略大于核孔膜孔径的微球上，酶标抗体或抗原通过检测物结合在微球上，然后，使用吸水纸或者负压使微孔板中的液体通过核孔膜，结合在微球上的酶则留在微孔板基体内；使得微孔板基体内残留的液体少，降低检测的背景干扰；可以在20～40min内完成ELISA和板式化学发光免疫试验，提高了检测效率。

Description

一种基于核孔膜的微孔板及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物实验设备领域，尤其涉及一种基于核孔膜的微孔板及其制备方法与应用。
背景技术
微孔板，又称酶标板，是生物学分析中非常重要的设备。目前酶联免疫吸附试验(ELISA)，板式化学发光免疫试验，核酸适配体相关的生物学检测方法，DNA和RNA检测中都可能使用微孔板。目前商业化的微孔板是由聚苯乙烯制备，为透明或者黑色的。微孔板和蛋白质，核酸等分子吸附后，再和相应的检测靶标结合，最后通过一系列的信号方法实现靶标分子的检测。微孔板中进行生物学分析时，其检测信号可以是比色、荧光、化学发光、时间分辨荧光、电化学信号等。为了提高检测的灵敏度，微孔板和蛋白质，核酸等分子具有非常高的亲和力。因此，在生物学检测过程中，需要5-8次的洗涤过程，以消除核酸、蛋白质等分子与微孔板的非特异性吸附。多次洗涤步骤使得整个ELISA和板式化学发光免疫试验操作复杂，至少需要3.5小时，耗时，耗人力。
核孔膜，又称核径迹蚀刻膜，是加速器引出的重离子或反应堆裂变碎片穿过PET薄膜，沿着轨迹中心位置会产生一个高度损伤的区域，这个圆柱形的区域被称之为潜径迹，直径约10nm。径迹区域附近具有很高的化学反应能力，与一定浓度的化学试剂接触，潜径迹能够被蚀刻而成微米量级微孔。核孔膜具有低成本，低吸附和高透过率的特点，在防伪技术、医药过滤、半导体工业等领域展现出重要的应用价值，在生物医学方面具有诱人的应用前景。但是，目前尚无将核孔膜应用于微孔板的相关研究。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于核孔膜的微孔板。
本发明的另一目的在于提供上述基于核孔膜的微孔板的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述基于核孔膜的微孔板的应用。
为实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：
一种基于核孔膜的微孔板，包括微孔板基体和位于微孔板基体底部的核孔膜，微孔板基体的内壁设置有疏水层。
所述的微孔板基体优选为没有底部的微孔板。
所述的微孔板基体的颜色优选为透明或黑色：用于分析透射光强度时，所述的微孔板基体的颜色为透明；用于分析荧光或者化学发光强度时，所述的微孔板基体的颜色为黑色。
所述的核孔膜的颜色优选为透明或黑色：用于分析透射光强度时，所述的核孔膜的颜色为透明；用于分析荧光或者化学发光强度时，所述的核孔膜的颜色为黑色。
所述的核孔膜的材料优选为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯(PC)和聚丙烯(PP)中的至少一种。
所述的核孔膜的孔径优选为0.1～20μm。
所述的微孔板基体与核孔膜优选通过胶粘或者热键合方法固定；更优选通过热压机固定。
所述的疏水层的材料为疏水修饰的材料，优选为疏水涂层涂料或基于纳米材料的疏水材料。
所述的疏水涂层涂料优选为聚烯烃、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯腈和聚酯中的至少一种。
所述的基于核孔膜的微孔板包括但不限于单孔微孔板、板条微孔板、96孔微孔板和384孔微孔板。
上述基于核孔膜的微孔板的制备方法，步骤如下：在微孔板基体的内部喷涂或浸泡疏水修饰的材料，放置，得到具有疏水层的微孔板基体；然后将核孔膜固定在微孔板基体的底部，得到基于核孔膜的微孔板。
所述的微孔板基体优选通过3D打印技术制备；更优选通过如下步骤制备：
(1)用solidworks 2016软件设计微孔板基体；
(2)将设计的微孔板基体转化成stl格式，并且用3D打印机配套的软件转化成光敏打印机运行的格式；
(3)用3D打印机进行打印微孔板基体。
所述的疏水层的材料为疏水修饰的材料，优选为疏水涂层涂料或基于纳米材料的疏水材料。
所述的疏水涂层涂料优选为聚烯烃、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯腈和聚酯中的至少一种；更优选为聚四氟乙烯。
所述的基于纳米材料的疏水材料优选为佛山盛创达化工有限公司的NEC100。
所述的浸泡时间优选为30min。
所述的放置条件优选为室温放置20h以上。
所述的室温优选为10～30℃；更优选为24～26℃。
所述的微孔板基体与核孔膜优选通过胶粘或者热键合方法固定；更优选通过热压机固定。
上述基于核孔膜的微孔板在生物学检测中的应用。
所述的生物学检测包括但不限于免疫学检测。
一种免疫学检测方法，包括如下步骤：
(1)将捕获抗体或抗原偶联在微球上，然后将酶标记的抗体或抗原、检测物、抗体或抗原修饰的微球加入上述基于核孔膜的微孔板中，反应，酶标记的抗体或抗原通过检测物结合在微球上；
(2)将微孔板基体内的液体吸出；
(3)加入底物液，测量液体的吸光度、化学发光强度或者荧光强度。
步骤(1)中所述的微球优选为乳胶微球；更优选为羧基化聚苯乙烯微球。
步骤(1)中所述的微球优选为粒径大于核孔膜孔径的微球。
步骤(1)中所述的反应条件优选为室温反应15min。
步骤(2)中微孔板基体内的液体吸出方式优选通过吸水纸或者负压；更优选为通过吸水纸。
步骤(3)中所述的底物是能与酶标记的抗体或抗原中酶发生反应的物质。
步骤(3)中所述的测量工具优选为酶标仪。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明公开了一种全新的基于核孔膜的微孔板，通过对微孔板基体的内壁进行疏水修饰，消除微孔板基体的内壁和液体的非特异性吸附；通过在微孔板基体底部增加核孔膜，在免疫学检测时，捕获抗体或抗原偶联在粒径略大于核孔膜孔径的微球上，酶标抗体或抗原通过检测物结合在微球上，然后，使用吸水纸或者负压使微孔板中的液体通过核孔膜，结合在微球上的酶则留在微孔板基体内；使得微孔板基体内残留的液体少，降低检测的背景干扰。
2、本发明提供的基于核孔膜的微孔板可以在20～40min内完成整个ELISA和板式化学发光免疫试验操作步骤，减少了检测用时，提高了检测效率。
附图说明
图1为本发明的基于核孔膜的微孔板的剖面图；其中，1-微孔板基体、2-核孔膜。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1制备基于核孔膜的微孔板及ELISA检测降钙素原(procalcitonin,PCT)
1、方法
(1)使用3D打印技术(第一步：用solidworks 2016软件设计微孔板基体；第二步：将设计的微孔板基体转化成stl格式，并且用3D打印机配套的软件转化成光敏打印机运行的格式；第三步：用3D打印机进行打印微孔板基体，所用的材料为光敏树脂(深圳创想三维，UV光敏树脂)制备微孔板基体1，在微孔板基体1的内部浸泡疏水试剂(佛山盛创达化工有限公司，NEC100)30min后，24～26℃放置24h以上，最后用热压机将核孔膜2(孔径为7μm，武威科近新发有限责任公司，PET232507)固定在微孔板基体1上。
(2)在100μL粒径10μm的羧基化聚苯乙烯微球(天津赛尔群科技有限公司,SEQ02)中加入10μL浓度为10mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)和20μL浓度为10mM的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，混匀24～26℃静止。30min后，3000rpm离心5min，去上清，微球重新悬浮于500μL磷酸盐吐温缓冲液(PBST，0.02M的PBS缓冲液，含有0.05％的Tween-20,pH 7.4)。在微球中加入5μl浓度为3mg/mL的抗PCT捕获抗体(杭州启泰生物科技有限公司，MJG08)，24～26℃孵育2h后，加入100μl浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液，24～26℃孵育1h。最后，3000rpm离心5min，去上清，把微球重新悬浮于500μL浓度为10mg/mL的BSA中，得到抗体修饰的微球。
(3)分别取10μL步骤(2)获得的抗体修饰的微球加入到基于核孔膜的微孔板中，然后，各自加入100μL浓度为0pg/ml、10pg/mL、20pg/mL、40pg/mL、80pg/mL、160pg/mL、320pg/mL、640pg/mL、1280pg/mL的PCT样品，10μL浓度为1μg/mL的辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠单克隆抗体(杭州启泰生物科技有限公司，MJG09)，24～26℃反应15min。
(4)将吸水纸紧贴在核孔膜，使微孔板中的液体通过微孔流到吸水纸上。
(5)加入100μL TMB底物液，10min后加入50μL终止液(2M H2SO4)用酶标仪分析微孔板的吸光度，计算出PCT的浓度。
2、结果
采用基于核孔膜的微孔板进行ELISA，整个ELISA可以在35min完成，总共6个操作步骤，其检测PCT的检测范围是20-640pg/mL(0pg/mL、10pg/mL、1280pg/mL不在线性检测范围内，不能用所建立的标准曲线分析)，检测结果与样品浓度一致；使用传统的微孔板进行ELISA，整个ELISA可以在210min完成，总共20个操作步骤，检测PCT的检测范围是20-640pg/mL。
实施例2制备基于核孔膜的微孔板和化学发光免疫分析法检测降钙素原(procalcitonin,PCT)。
1、方法
(1)使用3D打印技术(第一步：用solidworks 2016软件设计微孔板基体；第二步：将设计的微孔板基体转化成stl格式，并且用3D打印机配套的软件转化成光敏打印机运行的格式；第三步：用3D打印机进行打印微孔板基体，所用的材料为光敏树脂(深圳创想三维，UV光敏树脂)制备微孔板基体1，在微孔板基体1的内部浸泡疏水试剂(佛山盛创达化工有限公司，NEC100)30min后，24～26℃放置20h以上，最后用热压机将核孔膜2(孔径为7μm，武威科近新发有限责任公司，PET232507)固定在微孔板基体1上。
(2)在100μL粒径10μm的羧基化聚苯乙烯微球(天津赛尔群科技有限公司,SEQ02)中加入10μL浓度为10mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)和20μL浓度为10mM的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，混匀24～26℃静止。30min后，3000rpm离心5min，去上清，微球重新悬浮于500μL磷酸盐吐温缓冲液(PBST，0.02M的PBS缓冲液，含有0.05％的Tween-20,pH 7.4)。在微球中加入5μl浓度为3mg/mL的抗PCT捕获抗体(杭州启泰生物科技有限公司，MJG08)，24～26℃孵育2h后，加入100μl浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)，24～26℃孵育1h。最后，3000rpm离心5min，去上清，把微球重新悬浮于500μL 10mg/mL的BSA中，得到抗体修饰的微球。
(3)分别取10μL步骤(2)获得的抗体修饰的微球加入到基于核孔膜的微孔板中，然后，各自加入100μL浓度为0pg/ml、10pg/mL、20pg/mL、40pg/mL、80pg/mL、160pg/mL、320pg/mL、640pg/mL、1280pg/mL的PCT样品，10μL浓度为1μg/mL的辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠单克隆抗体(杭州启泰生物科技有限公司，MJG09)，24～26℃反应15min。
(4)将吸水纸紧贴在核孔膜，使微孔板中的液体通过微孔流到吸水纸上。
(5)加入100μL化学发光底物液(广州普洋仪器仪表有限公司，A020326)。最后用酶标仪分析微孔板的化学发光强度，计算出PCT的浓度。
2、结果
使用基于核孔膜的微孔板进行化学发光免疫试验，整个化学发光免疫分析可以在30min完成，总共5个操作步骤，其检测PCT的检测范围是2-512pg/mL，检测结果与样品浓度一致；使用传统的微孔板进行化学发光免疫分析，整个化学发光免疫分析可以在200min完成，总共19个操作步骤，检测PCT的检测范围是2-512pg/mL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种免疫学检测方法，其特征在于步骤如下：
（1）将捕获抗体或抗原偶联在微球上，然后将酶标记的抗体或抗原、检测物、抗体或抗原修饰的微球加入基于核孔膜的微孔板中，反应，酶标记的抗体或抗原通过检测物结合在微球上；
（2）将微孔板基体内的液体吸出；
（3）加入底物液，测量液体的吸光度、化学发光强度或者荧光强度；
所述的基于核孔膜的微孔板包括微孔板基体和位于微孔板基体底部的核孔膜，微孔板基体的内壁设置有疏水层；
所述的疏水层的材料为疏水涂层涂料或基于纳米材料的疏水材料；
所述的核孔膜的孔径为0.1～20μm；
步骤（1）中所述的微球为粒径大于核孔膜孔径的微球；
步骤（2）中所述的将微孔板基体内的液体吸出的方式为通过吸水纸。
2.根据权利要求1所述的免疫学检测方法，其特征在于：
所述的微孔板基体与核孔膜通过胶粘或者热键合方法固定。
3.根据权利要求1所述的免疫学检测方法，其特征在于：
所述的微孔板基体与核孔膜通过热压机固定。
4.根据权利要求1所述的免疫学检测方法，其特征在于：
所述的基于核孔膜的微孔板的颜色为透明或黑色：用于分析透射光强度时，所述的基于核孔膜的微孔板的颜色为透明；用于分析荧光或者化学发光强度时，所述的基于核孔膜的微孔板的颜色为黑色。
5.根据权利要求1所述的免疫学检测方法，其特征在于：
所述的核孔膜的材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯和聚丙烯中的至少一种。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的免疫学检测方法，其特征在于：
所述的基于核孔膜的微孔板为单孔微孔板、板条微孔板、96孔微孔板和384孔微孔板。
7.权利要求1～5中任一项所述的免疫学检测方法，其特征在于：所述的基于核孔膜的微孔板通过如下步骤制备得到：在微孔板基体的内部喷涂或浸泡疏水修饰的材料，放置，得到具有疏水层的微孔板基体；然后将核孔膜固定在微孔板基体的底部，得到基于核孔膜的微孔板。
8.根据权利要求7所述的免疫学检测方法，其特征在于：
所述的微孔板基体通过3D打印技术制备；
所述的放置条件为10～30℃放置20h以上。
9.根据权利要求8所述的免疫学检测方法，其特征在于：
所述的放置条件为24～26℃放置20h以上。
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