JP4071824B2 - 混合細胞母集団の細胞浮遊液内の特定標的細胞を分離して検出する方法 - Google Patents
混合細胞母集団の細胞浮遊液内の特定標的細胞を分離して検出する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4071824B2 JP4071824B2 JP52338595A JP52338595A JP4071824B2 JP 4071824 B2 JP4071824 B2 JP 4071824B2 JP 52338595 A JP52338595 A JP 52338595A JP 52338595 A JP52338595 A JP 52338595A JP 4071824 B2 JP4071824 B2 JP 4071824B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- cells
- antibody
- antibodies
- target
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
- G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/5748—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/809—Multifield plates or multicontainer arrays
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
【０００１】
本発明は細胞母集団または細胞母集団の溶液内の特定標的細胞を検出する免疫磁気（immunomagnetic）方法に関する。本発明は、また、異なった細胞母集団においてこの方法を実施するキットおよび装置に関する。
【０００２】
生物学、生物化学およびその隣接分野において、化学的存在物を相互につなぐ方法の需要はかなりある。正常、異常両方の細胞母集団に関する研究でこのような方法の重要性が高まっている。特に固体サポートを使用する場合、細胞を不動化し、検出し、隔離し、純化することができる。さらに、或る範囲の複雑な方法を用いて細胞内容を検査することができる。生存可能な形態で細胞を隔離することができることも重要である。
【０００３】
親和性結合は化学的／生物化学的存在物を相互につなぐ複雑な方法である。このような方法では、一対の結合パートナー（たとえば、つなごうとしている基質に取り付けてある）は接触したときに互いに結合する。このようなリンケージにおける結合パートナーの一方は、細胞表面の１つの分子として表現することができる。このような結合パートナー系のいくつかは公知である。たとえば、抗原−抗体、酵母−受容体、細胞上の配位子−受容体およびビオチン−アビジン結合があり、このうち抗原−抗原結合が最も頻繁に使用される。
【０００４】
これらの方法を特定細胞を隔離し、それをさらに種々の検査に供するのに使用する場合、初期状態に戻る際に細胞がその機能を回復することが必要である。いつもこうでなければならないというわけではないが、隔離された特定細胞がさらなる特定化が可能となるに充分な数に発育するような生理学的状態を得る方法が提案されている。
【０００５】
結合パートナーの一方を不溶性サポート、たとえば常磁性粒子に取り付け、混合細胞母集団内の標的細胞の隔離を消極的隔離あるいは積極的隔離として行う方法は公知である。消極的隔離作業では、不要な細胞を細胞母集団から除くのに、不要細胞に対して特定の目的を持つ抗体被覆した粒子と一緒に細胞をインキュベートする。インキュベートに続いて、これらの粒子を用いて細胞／抗体／粒子複合体を除去し、望みの標的細胞を残すことができる。この結果は満足できないことが多い。望みの細胞が多少とも純化された細胞母集団内に残るし、隔離作業の意図が特定標的細胞を検査したり、それらをさらに研究することにあるからである。積極的隔離のための粒子を用い、望みの標的細胞を混合細胞母集団から除去する試みも行われている。しかしながら、これらの作業は、或る種の標的細胞に向けられたものであり、すべての標的細胞系に向いているわけではない。ハプテン／アンチハプテン・リンケージ系を伴う積極的隔離手順が最近提案されている。（WO91/01368）。この提案は、互いに結合しようとしているハプテン、アンチハプテン抗体、アンチ細胞抗体の能力を用いることによって不溶性サポートに標的細胞を結合し、不溶性サポート、すなわち、粒子と標的細胞の間に、少なくともハプテンと、アンチハプテン抗体またはハプテン、アンチハプテン抗体、アンチアンチハプテン抗体の組み合わせまたはハプテン、アンチハプテン抗体、二次アンチ細胞抗体の組み合わせとからなるリンケージを構成する方法に関するものである。この複合体は、後にハプテンまたはハプテン類似体に再びさらすことによって分割する。こうして構成したリンクは、常に、１つまたはそれ以上の元素に加えてハプテンを包含する。この方法は、未特定化標的細胞に向けたものであり、標的細胞の隔離および不溶性サポートの解放を目的としている。
【０００６】
さらに、WO91/09938に、特定細胞、すなわち、骨髄の造血前駆細胞を隔離し、できるならば増殖させる目的で積極的、消極的選択の組み合わせを使用することが記載されているが、これは粒子の除去に依存している。WO092/04961には、コロイド状の磁性粒子を用いることによって非磁性試験液から細胞または種々の分子を分離する方法と複雑な装置が記載されている。この方法では、溶液内での粒子の沈殿を避ける必要があるために（サブミクロン）粒子に用いており、磁性強化手段を試験液に侵漬する複雑な装置が必要である。これは細胞に悪影響を与える可能性がある。
【０００７】
"Application of Magnetic Beads inBioassays", B. Haukanes and C. Kvam, Bio/Technology, 11:60-63, 1993には、磁性粒子を用いて腫瘍細胞を骨髄から取り出し、抹消血液からリンパ球様細胞を隔離し、DNA、RNA、DNA-結合タンパク質を隔離するいくつかの方法が記載されている。ここに記載されている方法は、すべて、標的細胞のみを検出するという本目的には適さない仕様を持っている。これらの方法は、標的細胞に加えて、抗体・粒子複合体の交差反応性および不特定接着性により非標的細胞も結合することになる。
【０００８】
また、マイクロリットル量の定量化を行うためのマルチウェル濾過装置（EP-A-0 098 534）、マイクロリットル量の流体を濾過するためのフィルタ・ストリップ／複合組立体（EP-A-0339 769）、ほぼ矩形のベース・プレート、ほぼ矩形のトップ・プレートおよび４つの側壁を有する定量カートリッジ（EP-A-0 131 934）も知られている。これらの装置は、いずれも、粒子・細胞ロゼットのみを保持するという本目的にとっては小さすぎる細孔寸法を記載しているという点で本目的に適用できない。さらに、フィルタが、濾過材から取り出すことなく保持された細胞のいくつかの検査にさらされるようには設計されていない。
【０００９】
標的細胞を不溶性サポートに連結し、しかも未特定化ハプテン・グループの化合物を含まず、非特定細胞群が最小限で特定標的細胞を検出することを目的とし、さらに、不溶性サポートと特定標的細胞の間の後の分割を不要とする簡単なリンケージが必要である。
【００１０】
本出願人のひとりが出願した審査中の出願（１９９３年９月１０日付けのWO094/07139）には、通常細胞への普通の結合に伴う問題を招くことなく診断目的で特定標的細胞を検出する方法が記載されている。これは、多数の細胞を顕微鏡で容易に見分けることができ、作業が迅速かつ簡単となるように種々の細胞タイプに敏感な検出方法である。さらに、この方法は、細胞・粒子複合体を分割する必要なく細胞を培養することに加えて、生化学、生物学、免疫学の検査のために細胞を隔離することにも、また、ヌクレオチド・レベルまたはタンパク質レベルで特殊遺伝子を研究することにも使用できる。しかしながら、非結合ビーズ、非特殊結合非標的細胞および非結合非標的細胞から標的細胞浮遊液内で粒子結合標的細胞を隔離するといような改良を行い、しかも時間もかからずに簡単に実施でき、標的細胞／粒子複合体をさらなる分析、たとえば、顕微鏡検査を行ったり、培養液内で増殖させたりするのに適したものとする必要がある。
【００１１】
これらの目的は、添付の請求の範囲に記載した方法、装置およびキットによって表される本発明によって達成できる。
【００１２】
混合細胞母集団および複数の細胞母集団を含有する生理学的溶液内の標的細胞を免疫磁気的に検出する方法は検出に適しているが、特殊タイプの正常細胞および病原性細胞の両方を積極的に隔離する際にも使用できる。この方法は、特定標的細胞と不溶性サポート（たとえば、常磁性粒子）の間の、１つまたは２つの元素からなるリンケージを生成する。所望の標的細胞の隔膜内の特殊抗原デターミントに向けたネズミまたはヒトのオリジンのアンチ細胞抗体で粒子を被覆するか、あるいは、標的細胞隔膜内の抗原決定基に向けた特殊アンチ細胞抗体のＦｃ部分に結合することのできるポリクロナール・アンチマウスまたはアンチヒューマン抗体で粒子を被覆する。粒子を被覆するためにポリクロナール・アンチマウス／アンチヒューマン抗体を用いる代わりに、モノクロナール・ラット・アンチマウス／アンチヒューマン抗体を用いてもよい。今述べたこの抗体は、部分的にそのモノクロナール・オリジンにより、アンチ細胞抗体へのより特殊な結合を提供し、溶液、たとえば血液内の他の細胞との交差反応を生じる可能性を低下させる。さらに、マイルドな洗浄剤あるいは蛍光剤、metallocolloids、放射性同位元素、ビオチン・コンプレックスあるいは視覚化を可能とする或る種の酵母で予め標識したあるいはしない第２セットの抗体または抗体フラグメントと共に細胞浮遊液をインキュベートすると、この方法の特殊性が劇的に増すことになる。
【００１３】
さらに、本発明によれば、この方法は、標的細胞／粒子複合体の浮遊液を本発明による細胞濾過装置あるいは細胞分離器に移送すること、および、顕微鏡観察したあるいは生理学的ベース培養液内で増殖させた標的細胞の全数を特殊生化学的、生物学的特徴の存在で特徴づけるこによって改善され、簡略化され得る。
【００１４】
図面について：
第１．１．図は、部分的に組み立てた細胞濾過装置または細胞分離器の一具体例の斜視図を示す。
第１．２．図は、部分的に組み立てた細胞分離器の別の具体例の斜視図を示す。
第２図は、細胞分離器マルチウェルの一形態の斜視図であり、マルチウェルから外した状態で薄膜フィルタを示す図を示す。
第３図は、細胞分離器マルチウェルの一部を示し、特にマルチウェル・ストリップから外した状態の膜基部を示す。
第４図は、細胞分離器マルチウェルまたは薄膜フィルタあるいはこれら両方のための蓋装置を備えた培養皿の一形態の斜視図を示す。
第４ａ図は、培養皿のマルチウェル構造の側面図を示す。
第５図は、細胞分離器濾過液収集ボックスの一形態の斜視図を示す。
第６図は、前述の方法を用いて細胞濾過装置に捕らえたメラノーマ細胞・粒子ロゼットを示す。
【００１５】
以下に、検出、できるならば隔離も行うために標的細胞として癌細胞を用いる方法のより詳しい説明を行う。しかしながら、本方法は癌細胞に限られるわけではなく、本方法は細胞学研究分野に適しているので、以下の説明でも本方法をこの特定の使用分野に限定するつもりはない。
【００１６】
癌患者の管理において、癌が局限されているか、他の組織に転移しているかどうかに関する病期は、個々の患者の治療法を選択するためには最も重要である。
【００１７】
悪性細胞は、周囲組織への直接的な浸潤によって広がったり、リンパ管を通して転移したり、血液内の腫瘍細胞が遠隔の器官（たとえば、骨髄、中枢神経系、髄液など）に送られることによって広がる。
【００１８】
悪性腫瘍細胞の検出は、最近まで、生検腫瘍標本や骨髄スミア、種々の体液の細胞遠心沈殿法を行って調製したスライドについて光と電子顕微鏡を用いて行う形態学的な方法に依存していた。抗原を認識するモノクロナール抗体の出現で種々のタイプの悪性細胞の表面を優れて表出できるようになったので、転移細胞の確認には免疫細胞化学法および免疫蛍光検査法もますます必要になってきている。したがって、生検腫瘍あるいは細胞遠心沈殿法から調製したスライドをモノクロナール抗体で処理した後、抗体の腫瘍細胞への結合状態を比色計あるいは蛍光で視覚化している。蛍光を使用する方法では、細胞浮遊液を調製したり、流動血球計算器を用いたりして蛍光顕微鏡を使用しなければならない。
【００１９】
前述の方法は、感度あるいは特定性またはこれら両方で限界があり、通常は面倒で、時間がかかる方法であり、また、高度な専門技術も必要とする。流動血球計算検査法も高価な機器を必要とする。
【００２０】
血液および骨髄内の腫瘍細胞を検出するための形態学方法は、免疫細胞化学法や免疫蛍光検査法を使用する方法よりもかなり感度を低い。しかしながら、後者の方法は、腫瘍細胞が有核細胞の全数の１％未満である場合には不適である。流動血球計算器は顕微鏡を用いる方法よりも感度は良いかもしれないが、多数の細胞を利用しなければならないし、また、いくつかの技術的な困難も伴う。細胞の凝集が問題を生じる可能性もあり、この方法では、標識付けした腫瘍細胞と普通に蛍光を発する正常細胞とを区別することはできない。
【００２１】
本発明は、たとえば、転移性腫瘍細胞の検出を非常に感度良く行うことができる。これは、大量かつ多数の細胞を顕微鏡で容易に識別でき、取り付けた磁気ビーズを容易に識別できるからである。本発明の方法および装置は、顕微鏡で容易に観察できる固体サポート・恒久レコードを提供し、小断片よりもむしろ試料全体の評価および定量化を可能とし、大体積の試料を分析することができ、また、普通のデンシトメトリ技術によって自動的に走査を行うことができる。使用するモノクロナール抗体は充分な特定性を持ってたとえば腫瘍細胞へ結合し、血液、骨髄などの混合細胞母集団および他の腫瘍発現部位に存在する標的細胞以外の細胞には結合しないので、ビーズを取り付けた細胞すべてが標的細胞を表すことになる。さらに、この作業は迅速かつ簡単であり、普通の顕微鏡を用いていかなる検査員によっても実施され得る。
【００２２】
この新規な方法では、腫瘍細胞に存在し、正常細胞に存在しない抗体を特定認識するために、あるいは、他の目的のために、たとえばネズミあるいはヒトのオリジンのモノクロナール抗体を、正常細胞の特殊化部分母集団、常磁性粒子に直接結合したり、あるいは、最初にそれぞれの抗体を特定認識する抗体で被覆したビーズまたは腫瘍細胞に結合するIgG抗体のFc部分に結合する。細胞結合抗体は、IgGタイプあるいはIgMタイプいずれであってもよく、あるいは、ab IgGまたはIgMのフラグメントであってもよい。使用するアンチ標的細胞抗体の例としては、抗原決定基のグループ、たとえば、動物細胞のうちのヒト細胞を検出するのに適したanti-pan-human antibody（Bruland等、未公開）に加えて、CD56/NCAM抗原（MOC-1）、Cluster２上皮抗原（MOC31）、Cluster２（MW-40kD）抗原（NrLulO）（Myklebust等、Br.J.CancerSuppt.63,49-53,1991）、ＨＭＷ−メラノーマ付随抗原（9.2,27）（Morgan等、Hybridoma,1,27-36,1981）、８０ｋＤ、肉腫付随抗原（TP1＆TP3）（CancerRes.48,5302-5309,1988）、ムチン抗原（Diel等、Breast Cancer Res.Treatm.,1991）、または、ＥＧＦレセプタ抗原（425.3）（Merck）に向けたものがある。４２５．３抗体は正常細胞および悪性細胞の両方にある抗原に向けたものである。さらに、抗体は成長因子レセプタ、たとえば、ＥＧＦ−レセプタ、ＰＤＧＦ（Ａ、Ｂ）レセプタ、インシュリン・レセプタ、インシュリン様レセプタ、トランスフェリン・レセプタ、ＮＧＦ、ＦＧＦレセプタ、インテグリン（integrins）のグループ、正常細胞、異常細胞の両方に存在する他の粘着性薄膜分子およびＭＤＲプロテイン、正常細胞の部分母集団に存在する抗原に向けることができ、その他に、正常細胞、悪性細胞の膜ならびに悪性細胞、たとえば、Neu/erbB2/HER2にのみ現れる腫瘍生成物にも用いることができる。悪性細胞としては、乳房、卵巣、肺の癌腫細胞、黒色腫、肉腫、神経グリア芽細胞腫、消化器系の癌細胞および網内系の癌細胞がある。または、標的細胞は非腫瘍疾病、たとえば、心臓血管疾患、神経性疾患、肺疾患、自己免疫性疾患、胃腸疾患、泌尿生殖器疾患、網内疾患その他の疾患に関連するものであってもよい。さらに、悪性細胞母集団は、骨髄、胸膜および腹膜の滲出液からの抹消血および他の体液成分、たとえば、尿、髄液、精液、リンパ液、あるいは、正常組織および器官、たとえば、肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚、粘膜の固形腫瘍にあるものであってもよい。本発明の方法で使用する抗原決定基および対応する抗体あるいは抗原フラグメントのより完全なリストは表１に示してある（付録参照）。
【００２３】
＜方法論＞
本方法は、常磁性粒子への直接的な抗体の結合を行う。すなわち、この結合は、表面境界抗体、たとえば、ポリクロナール・アンチマウス抗体、モノクロナール・ラット・アンチマウス抗体またはモノクロナール・アンチヒューマン抗体への結合によって行うことができ、これら個々の抗体のFc部分を特定認識する。
【００２４】
抗体被覆した常磁性ビーズは、次に、検査しようとしている細胞の浮遊液に混合し、穏やかな回転を与えながら好ましくは４℃で５−１０分間から２時間、好ましくは、３０分間インキュベートする。本方法は、また、ステップ順序を変えて、遊離標的細胞抗体を細胞浮遊液に加え、穏やかな回転を与えながら０−２０℃、好ましくは４℃で５−１０分間から２時間、好ましくは、３０分間焙養するように実施することもできる。アンチマウスあるいはアンチヒューマン抗体で予め被覆した常磁性粒子は、次に、上述したようにインキュベートした細胞浮遊液に加え、こうしてできた浮遊液を穏やかな回転を与えながら０−２５℃、好ましくは４℃で５−１０分間から２時間、好ましくは３０分間さらにインキュベートする。本方法は、また、より少ないステップ数で実施することもできる。その際、遊離標的細胞浮遊液を予め被覆した常磁性粒子と共に細胞浮遊液に添加し、穏やかに回転させながら０−２５℃、好ましくは４℃で５−１０分間から２時間、好ましくは３０分間インキュベートする。細胞浮遊液に加える抗体被覆ビーズの数は、標的細胞の数の０．５倍から１０倍出なければならない。この数が未知のときには、加える被覆ビーズの量を細胞の全数の１−１０％としなければならない。特定の目的のために、そして、標的細胞（たとえば、悪性細胞）の密度が低い場合、あるいは、標的細胞が細胞の全数のうち非常に低い割合（約１％）を占める場合には、標的細胞を磁界内で非標的細胞から積極的に分離することができる。細胞母集団内のこの隔離した標的細胞を次に細胞計数装置に移し、ビーズを取り付けた細胞の数を顕微鏡で測定することができる。
【００２５】
本方法は、また、本出願で説明する細胞濾過装置に隔離標的細胞浮遊液を移すことによっても実施することができ、またそうする方が好ましい。隔離標的細胞の全数は顕微鏡で調べることができる。フィルタ装置内の隔離標的細胞は光学顕微鏡での観察を容易にするために固定して染色してもよい。特殊な目的のために、そして、隔離標的細胞を機能的に活性状態にする必要がある場合には、生理学ベースの培養液を細胞フィルタ装置に加え、それを３７℃で不特定時間培養してもよい。隔離標的細胞は特定の生化学的、生物学的な特徴の存在のために増殖し、その後特徴づけることができる。さらに、標的細胞は特定の生化学的および生物学的な特徴の存在のために特徴づけることができる。特に重要なのは、分子生物学の研究のためにこのような細胞を使用するということである。上記の従来の方法と対照的に、本方法では、常磁性粒子・標的細胞リンケージの分割を行うことなく標的細胞の研究、増殖を行える。いくつかの目的のために、腫瘍生検試料ならびに血液、骨髄その他の体液、たとえば、尿、髄液、精液、リンパ液に存在する腫瘍細胞あるいは他の正常な組織および器官、たとえば、肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、消化器系、皮膚、粘膜からの細胞について純標的細胞母集団および他の細胞学研究活動分野において特定の遺伝子をＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパクのレベルで検査することは重要である。従来の方法では、南極、北極、西極のブロットから得た信号は生検試料内の正常細胞ならびに腫瘍細胞を表している。もし単一の細胞母集団を最初に腫瘍材料から調製し、腫瘍細胞を積極的に免疫磁気的に検出し、分離した場合には、この材料について行われるいかなる遺伝子研究も標的細胞のみを表すことになる。これは、たとえば、哺乳類の組織に存在する悪性細胞、たとえば、骨髄、抹消血、胸膜、腹膜滲出液および他の体液、たとえば、尿、髄液、精液、リンパ液に存在する悪性細胞にも関係する。ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）方法論を用いる研究も、この方法によって得られた純腫瘍細胞母集団に実施する場合には、特定性および信頼性で有利になろう。
【００２６】
この新方法ステップの用途は検査しようとしている組織のタイプに依存して異ならせるとよい。
ａ）固形または針状腫瘍生検材料からの組織を機械的にあるいは単一の細胞母集団に穏やかな酵素処理を行うことによって調製し、これに一次特定抗体または抗体フラグメントを直接あるいは胎児ウシ血清、ウシ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヤギ血清、ヒト血清などの血清ありまたはなしにリン酸緩衝生理食塩水または培養液で細胞母集団を洗った後に加える。
ｂ）材料が胸水、腹水、髄液、尿、リンパ液のサンプル、あるいは、種々の形態の関節炎を伴う患者の関節にある滲出液のような体液のサンプルである場合、特定抗体または抗体フラグメントを直接あるいは遠心分離後に、サンプル内の細胞を回転沈降させて浮遊液にもどす前あるいはその後の洗浄ありまたはなしでサンプルに加える。
ｃ）材料が血液あるいは骨髄吸引液からなる場合、特定抗体または抗体フラグメントを直接にあるいは遠心分離後にサンプル内の細胞を回転沈降させて浮遊液にもどす前あるいはその後の洗浄ありまたはなしにサンプルに加えるか、あるいは、適切な抗体または抗体フラグメントの洗浄、再浮遊液化および添加の前にたとえばLymphoprepに段階的な遠心分離を施すことによって単核細胞部分を調製してもよい。
ａ）およびｂ）についての作業条件は以下に述べる実験で得た結果によって説明するにつれて確立される。
ｃ）については、詳細に検査された多数のファクタによって結果が影響を受けることがわかった。これらのファクタとしては、抗体濃度、常磁性粒子の数対細胞の数の比、インキュベート時間、インキュベート体積、インキュベート液のタイプおよびｐＨレベルがある。すべての実験における粒子対単核細胞比は、一次特定抗体またはフラグメントの結合親和性に応じて０．５/１から２/１の範囲になければならない。
【００２７】
大きな問題としては、ヒツジまたはラットのアンチマウス抗体のみあるいはそれに加えて特定抗体で被覆した粒子を正常な血液または骨髄の細胞に不特定結合するということであった。実験では、特定抗体の存在なしに不特定結合が等しく高いということが示され、このことは標的抗体の正常細胞への交差反応によっては問題が生じないということを意味している。最適には達しない特定化がイオン結合によって生じる可能性は除外した。別の可能性としては、Ｂリネージの正常細胞の部分母集団が粒子・抗体複合体に付着するということがある。しかしながら、特定抗体／抗体・粒子複合体を加える前の細胞浮遊液からのＢ細胞の免疫磁気除去は特定抗体／抗体・粒子複合体の特定性を改善しない。
【００２８】
或る種の非標的細胞も常磁性粒子に結合する可能性があるという、骨髄および抹消血液の隔離した単核部分に用いる手順に伴う問題は、回避あるいは解消されている。したがって、ヒツジ・アンチマウス抗体被覆粒子でも特定抗体でも、少量の単核血液または骨髄細胞に不特定結合した粒子の数は平均１０から約１へ減少し、同時に、粒子を備えた正常細胞の部分は１−２％から０．５−１％またはそれ以下まで減少した。
【００２９】
常磁性粒子に結合した抗体に関連した疎水力によって問題が生じる可能性があるという証拠を得た。したがって、この疎水性を低減する方法が請求の範囲に記載してある。そのうちの１つの方法は、適当な濃度でのマイルドな洗剤、たとえば、０．１％未満の濃度のTween 20TMによって４℃で３０分間、抗体被覆粒子と細胞浮遊液を予備インキュベートすることである。標的細胞の可能性のある選択が保証されるときには、細胞浮遊液が低濃度の洗剤、たとえば、０．０１％のTween 20TMを含有していなければならない。いくつかの実験で、この手順は、血液または骨髄からの単核細胞部分に見られる不特定結合の問題をほとんどなくすか、あるいは、劇的に低減した。
【００３０】
保証されるとわかっている場合に洗剤ステップと共に用いることができる他の改良点は次の通りである。
【００３１】
先に説明したように一次抗体または抗体フラグメントと抗体被覆常磁性粒子を備えた細胞浮遊液のインキュベート後、この細胞浮遊液は、フォルムアルデヒドまたはアルコールのような細胞固定剤で予備処置するしないに係わらず、標的細胞の他の細胞外または細胞内抗原決定基に向けられた第２セットの抗体または抗体フラグメントでインキュベートする。これらの抗体またはそれらのフラグメントは、蛍光剤、メタロコロイド、ラジオアイソトープ、ビオチン複合体またはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼのような酵素によって予め標識付けしなければならない。こうすれば、顕微鏡または適当な計数装置あるいはこれら両方でそれ自体公知の方法によって視覚化することができる。
【００３２】
標的細胞は、標識付けされた第２セットの抗体又は抗体フラグメントを用いて視覚化する方法で視覚化したときにその表面に結合した粒子を計数することができる。
【００３３】
非標的細胞、標的細胞の区別を簡略化するために、細胞浮遊液またはその一部を、２回目の視覚化ステップの前に、シトスピン（cytospin）遠心分離にかけるか、浮遊液の部分を被覆ガラススライドに結合させ、そこに粒子結合細胞を塗り広げて薄い層にし、染色を２回行った非標的細胞と標的細胞の区別を容易にしてもよい。
【００３４】
非標的細胞、標的細胞の識別をさらに簡略化するための本発明の別の方法は、細胞フィルタ装置を包含し、標的細胞選択ステップ後に細胞浮遊液全体を細胞フィルタ装置に直接加えることができる。遊離した未結合ビーズ、不特定結合した非標的細胞および任意の非結合非標的細胞はフィルタを通過してしまい、フィルタ上には視覚化しようとしている結合標的細胞が残ることになる。隔離した標的細胞を持ったフィルタは装置から取り出し、公知の免疫組織化学法を用いて細胞を固定し、染色し、顕微鏡で見ることができる。フィルタは、装置から取り出した後、免疫組織化学で公知で、通常使用されているタイプの普通の顕微鏡スライドとして処理することができる。
【００３５】
特定の目的のために、フィルタを装置から取り出しても装置に一体の状態で残してもよいし、フィルタ上に置かれた隔離標的細胞を増殖させるために、アガロースありまたはなしの任意公知の培養液のような培養液を添加してもよい。
【００３６】
この新しい方法を使用するために、キットは、たとえば、各モノクロナール抗体について調製した予備被覆した常磁性粒子を含有することになる。別の具体例では、キットは、その一部としてIgGイソタイプ特定アンチマウスまたはアンチヒューマン抗体で予め被覆し、別の部分として異なった細胞と組み合わせた、たとえば腫瘍細胞、抗体で予め被覆した常磁性粒子を含有する。第３の具体例において、キットは、特定アンチFc抗体、たとえば、ポリクロナール・アンチマウスまたはモノクロナール・ラット・アンチマウスまたはアンチマウスまたはアンチヒューマンの抗体で予め被覆した、特定アンチ標的細胞抗体に結合した標的細胞関連抗体をＦｃ部分に結合することができる常磁性粒子を含有する。第４の具体例では、キットは、標的細胞抗原または標的細胞抗原群で被覆しても被覆しなくてもよい常磁性または非磁性の特異な粒子を含有し、本方法で処理したとき、これらの粒子は細胞フィルタ装置内に捕らえられることになり、それによって、たとえば本方法の抗体・抗原反応のすべての特徴が正しく有効となることを実地説明する際に対照として作用する。これらの粒子は本方法実施前あるいは実施中の段階で細胞浮遊液に加えてもよいし、分離しようとしている標的細胞を含む細胞浮遊液と同じ方法を用いて処理すべき別の「細胞浮遊液」として用いてもよい。さらに別の具体例では、キットは、望みの標的細胞内あるいはその上の抗原／レセプタに向けられた他の特定抗体または抗体フラグメントを含有し、前記抗体または抗体フラグメントはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼその他の酵素にこれらの酵素に関連した基質と共に結合するか、あるいは、前記抗体または抗体フラグメントは特殊な色またはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼのような結合酸素を持った非常磁性粒子に結合する。
【００３７】
＜装置＞
本発明の新しい特徴は、マルチウェル細胞分離器とも呼び得る細胞フィルタ装置に関するものであり、この細胞フィルタ装置は前述のキットの一部であってもよいし、なくてもよい。この装置はマイクロウェル細胞分離器構造に関し、これは血液または骨髄に見出されるような種々のサイズの細胞の混合母集団を分離するのに用いられる。こうして得た細胞は、顕微鏡または自動走査装置によって膜上で直接観察することができる。本発明は、従来の磁性粒子細胞隔離技術と一緒に用いて、多数の大体積または小体積のサンプルを１ないし４時間内に腫瘍細胞の存在について検査する迅速で感度の良い、簡単な方法を提供することができる。
【００３８】
本発明によれば、マイクロウェル細胞分離器構造は、頂部開放式濾過液収集ボックスを包含し、この濾過液収集ボックスは、真空チューブのためのアタッチメントを持っていてもよいし、持っていなくてもよく、また、細胞分離膜フィルタを備えた取り外し自在の使い捨てのマルチウェル構造を有し、この細胞分離膜フィルタはこれらマルチウェルの基部を構成する。この構成に対する蓋またはカバーを設けてもよい。濾過液収集ボックスおよび蓋構造は高温滅菌に適した材料で作ってもよいし、また、組織培養プラスチック製品について知られているような透明あるいは不透明なプラスチック材料で作ってもよいし、作らなくてもよい。
【００３９】
細胞分離膜フィルタは、ナイロン・モノフィラメント膜に見出されるような規則正しくて一貫した細孔形状、寸法を持ち、個々のウェルの基部を形成するものであるとよい。細胞分離膜フィルタは細胞分離方法の後に取り外して検査を容易にすることができるようにマイクロウェルに取り付けるとよい。細胞分離膜は、マイクロウェルから除去後の検査を容易にするようにカードまたはプラスチック製周囲フレームを包含するものであってもよい。
【００４０】
濾過液収集ボックスは２つ以上のウェルの取り外し可能なストリップを挿入することができるフレームを包含していてもよい。
【００４１】
濾過液収集ボックスは細胞分離膜、収集ボックスおよび低圧真空アタッチメントを収容するようになっている普通の９６−ウェル・プレートに類似したものであってもよい。
【００４２】
本発明は上方蓋または上方カバーを包含していてもよい。
【００４３】
マイクロウェル・ストリップを挿入し、ascepticallyに培養できる蓋付きの使い捨て培養皿を装置に設けてある。この培養皿に一体にくぼみまたは切り込みが設けてあり、濾過液収集ボックスのものと同様のマイクロウェル・ストリップの位置決めを容易にすると共に、培養中にマイクロウェル・ストリップの移動を防ぐことができる。前述したようにくぼみまたは切り込みは、マイクロウェル・ストリップから除去した後の細胞分離膜の位置に設けてもよいし、設けなくてもよい。
【００４４】
本発明は、さらに、添付図面の図に関連した以下の説明から明かとなろう。添付図面は、本発明を具体化したマイクロウェル細胞分離器構造の一形態を例示している。
【００４５】
図面の第１図から第５図を参照してわかるように、マイクロウェル細胞分離器構造２０は蓋またはカバー２１と濾過液収集ボックス２２とからなり、この濾過液収集ボックス２２は低圧真空アタッチメント・ポート２３を持っていてもよいし、持っていなくてもよく、サポート２５ａを有する取り外し自在の膜基部２５を持つ取り外し自在のマルチウェル・ストリップ２４を備えている。
【００４６】
第１．１．図および第１．２．図は部分的に組み立てた本発明の２つの具体例を示している。
【００４７】
濾過液収集ボックス２２は、いくつかの点で、取り外し自在のウェル・ストリップを備えた普通の９６−ウェル・プレート・フォーマットに類似したものであってもよく、また、１つまたは複数のウェル・ストリップを嵌合するようになっていてもよい。
【００４８】
マルチウェル２４は図示したような二重ストリップあるいは単一または複数のストリップで構成してもよい。
【００４９】
濾過液収集ボックス２２内へのマルチウェル２４の係合は、１つの向きでのみ可能となるようになっており、そのために、位置決めピン２８または位置決めノッチ２９を設けてもよい。
【００５０】
細胞分離膜フィルタ２５はマルチウェル２４の底に固定してあり、ウェルの基部を構成している。マルチウェル２４への膜フィルタ２５の固定は、膜フィルタ２５または膜フィルタ・サポート２５ａの変形なしに分離できるようにしてある。
【００５１】
膜フィルタ２５は顕微鏡で観察してもよいし、デンシトメトリーまたは類似の方法で走査してもよい。
【００５２】
膜フィルタ２５は、ナイロン・モノフィラメント膜に見出されるように規則正しい一貫した細孔形状、寸法を持つものでよく、個々のウェルの基部を形成し、５−７５ｍ細孔サイズ、好ましくは、２０ｍ細孔サイズであってもよい。
【００５３】
濾過液収集ボックス２２の有無に係わらず、マルチウェル２４は組織培養目的のために適した材料で作ってもよい。これは普通の９６−ウェル・プレート走査機あるいはプレート読み取り機で観察するのにも適している。
【００５４】
培養皿２６および培養皿蓋２７は組織培養目的に適した材料で作ることもできる。この場合、マルチウェルの頂部を通して、そして、培養皿２６の底に培養液を供給することが可能となる。
【００５５】
図に示す寸法は、すべて、例示であり、細胞濾過装置２０はこれらの寸法に限らない。さらに、本発明を上記の例にのみ限る意図はなく、発明の範囲から逸脱することなく多くの変更が可能であることは了解されたい。本発明は、以下、模型実験、新方法の有用性の例および実際の用途の例によって説明する。これらの例はいかなる方法でも発明を限定することに関係するものではない。
【００５６】
＜模型実験＞
１．腫瘍細胞系への抗体・ビーズ複合体の結合。腫瘍細胞への抗体・常磁性粒子複合体の結合のための抗体濃度および最適条件を決定するために、癌細胞系の大きなパネルを使用した。常磁性ビーズは、特定抗体をヒツジ・アンチマウス抗体（SAM）被覆常磁性粒子にコーティングするか、あるいは、最初に細胞を特定抗体でインキュベートし、洗浄してからSAM被覆粒子で二回目のインキュベートを行うことによって細胞に結合した。これらの実験の結果は表２ａ、表２ｂに示してある（付録参照のこと）。これらの表で、＋はいくつかのビーズの全細胞への結合を示しており、（＋）は各細胞に結合した少数のビーズあるいはすべての腫瘍細胞がそれらの表面に結合したビーズを持っておらず、なんら結合を反映していないことを示しており、（−）は非常に弱い結合を示している。
【００５７】
２．骨髄または抹消血液の単核部分における腫瘍細胞の検出。模型実験は、これらの単核細胞あるいは細胞浮遊液のいずれかに特定抗体およびSAM被覆常磁性粒子を加えて行った。このとき、ビトロ内培養細胞系からの異なった数の癌細胞を前記単核細胞に加えた。いくつかの実験で、単核細胞あるいは悪性細胞のいずれかを予め蛍光染料で染色し、２種類の細胞を識別できるようにした。すべての実験で、非結合一次抗体あるいはヒツジ・アンチマウス抗体被覆ビーズまたはこれら両方を対照として別個に用いた。抹消血液の単核細胞部分の調製を行わなかった付加的な実験を実施したが、この方法での細胞の分離ではLymphoprep分離血液分に比べて非特定結合の量が減ることがわかった。
【００５８】
３．細胞フィルタ装置を用いての腫瘍細胞系への抗体・ビーズ複合体の分離および視覚化。腫瘍細胞浮遊液および血液または骨髄浮遊液と混合した蛍光標識付け腫瘍細胞を調製し、模型実験１、２で述べたように処理し、細胞フィルタ装置にかけた。装置内のフィルタ上の細胞を洗浄、固定、染色後、フィルタを顕微鏡で観察した。腫瘍細胞浮遊液のみからの結果は抗体・ビーズ・腫瘍細胞複合体がフィルタ上ではっきりと隔離されていることを示していた。血液または骨髄と一緒の蛍光標識付け腫瘍細胞浮遊液からの結果も、抗体・ビーズ・腫瘍細胞複合体がフィルタ上ではっきりと隔離されていることを示した（第６図）。本方法の感度をテストする付加的な実験は、１０7個の血液または骨髄の細胞の浮遊液と混合した１００個の腫瘍細胞をこの方法を用いて検出できることを示した。
【００５９】
４．細胞フィルタ装置を用いて隔離した調製細胞の増殖。腫瘍細胞浮遊液を模型実験１、２で述べたように処理し、隔離し、フィルタ装置にかけた。次いで、フィルタを２０％子ウシ血清を含有する培養液内の０．３％アガロースを含有する半固形媒質内で培養した。細胞は３７℃の５％CO2の雰囲気中で培養した。腫瘍細胞は分裂、増殖する能力を示した。
【００６０】
いくつかの実験において、単核細胞への若干の不特定結合が観察されたが、特定抗体の性質に無関係であることがわかり、SAM被覆粒子でのみ等しく示された。この不特定結合の大きさはほぼ０％から０．５−２％のレベルまで変化した。
【００６１】
この不特定結合は、疎水細胞相互反応の問題を低減するように実施した、洗剤（Tween 20TM）でのマイルドな処理によってほとんどなくなった。
【００６２】
＜処理の有効性の例＞
１．血液、骨髄における微小転移性新生病態の検出。血液あるい骨髄またはこれら両方への癌細胞の転移についての早期の信頼性のある診断は、応用例１で説明するように、癌腫を含む多くのタイプの癌における最適な療法、おそらくは治療法の選択にとってますます重要になっている。悪性黒色腫、内腫、神経芽細胞腫、いくつかの他の癌についての同様の手順が確立されており、また、発展途上にある。
【００６３】
２．胸膜滲出液または腹膜滲出液および尿における悪性細胞の検出。これらの体液の性質は、特に少数の癌細胞が正常反応細胞または上皮細胞と一緒に存在するときに重要な診断上の問題を示していることがある。いくつかの場合、従来の細胞学的検査が否定的であるかまたは決定的でない場合に、この新方法で明確な診断が迅速に行われた。腎臓あるいは尿路ならびに膀胱の癌の場合に同様の利点が見出された。
【００６４】
３．髄液内の新生細胞の検出。多くの癌タイプの組織的な処置が向上してきているので、症状付与性脳転移のケースの頻度が有意に高まってきており、同時に、このような転移の早期検出の必要性が高まってきている。この新方法を使用した場合、ほんの少数の悪性細胞も容易な識別でき、脳腫瘍症状発現の早期段階で治療法の選択を行うことができる。
【００６５】
４．生検組織における癌の診断。癌にかかったとき、外科的処置あるいは針生検によって組織生検材料を得た場合、この新方法を調製した細胞浮遊液に用いて、従来の形態学的方法、免疫組織化学的方法あるいは細胞化学的方法に比べて、かなり簡単かつ迅速に診断を下すことができる。いくつかの似たような癌の区別は適当な抗体を用いて行うことができる。
【００６６】
５．予後徴候インジケータの識別。いくつかの膜分子の表出がいくつかの癌における悪性症状の進行と関連していることが示されているので、本方法を用いて、たとえば、用途例２で説明しているように、予後徴候インジケータを識別することができる。
【００６７】
６．特定の病状あるいは病状の悪化または状態を示す細胞の識別。種々のタイプのリウマチ性疾患（たとえば、リウマチ性関節炎）やアレルギ疾患、自己免疫疾患、循環器疾患では、細胞の特定部分母集団の組織的あるいは局所的存在の確認は、診断のためにも症状の段階を決定するにも重要である。したがって、このような細胞母集団をこの新方法で迅速に検出するということは、診断上、治療上かなり重要である。
【００６８】
７．正常細胞の部分母集団の検出。いくつかの理由のために、或る母集団における正常細胞の或る特定の部分母集団の割合を検出することが重要となる。これは、たとえば、肝臓生検に応用することができ、この場合、胆嚢上皮抗原を表す細胞の確認は重要である。同様に、種々の正常細胞から調製した細胞浮遊液からの特定上皮細胞の識別および可能ならば隔離も当然可能である。
【００６９】
８．選定細胞の隔離、増殖。上記の目的のうちの多くの目的のために、細胞のより大きな母集団を研究することが必要であるかも知れない。細胞フィルタ装置を使用する本方法は、遊離した非結合粒子または他の不特定結合細胞の存在なしに、積極的に選定した標的細胞の増殖を可能とする状態を与えることができる。
【００７０】
上記の第１項から第６項に述べた細胞膜分子のいくつかは、いくつかのタイプの活性化したキラー細胞での免疫療法、あるいは、たとえば免疫毒素での免疫療法のための標的としても使用できる。したがって、このような分子の新しい表出方法での識別は、これらのタイプの治療法を使用しなければならないケースを決定するのにも価値がある。
【００７１】
＜本方法の実際的な用途の例＞
例１．血液または骨髄あるいはこれら両方における癌細胞の早期段階での転移を診断するために、我々は、本方法において、MOC-31、NrLu10、BM2、BM７、12H12、MLuClアンチ癌腫抗体を用いて、乳房、肺臓、結腸直腸、前立腺の癌からの微小転移性症状がこれらの体液において敏感に確認できるかどうかを調べた。これらの抗体による成功した結果は有意な臨床上の関係を持っていた。
【００７２】
例２．多くの細胞膜分子の表出はいくつかのタイプの癌における悪性症状の進行と相関することが示されてきた。したがって、このような分子のそれぞれの抗体への結合を検出することによって、高度な予後の情報を得ることができる。このような抗原としては、多数の粘着性分子、炭水化物抗原、糖脂質、成長因子レセプタおよび以下に示す癌腫マーカーがある。我々は、この新しい方法で、粒子・抗体複合体の、ＣＤ４４変異体、Ｅ-cadherin、ＬｅY、ＣＥＡ、ＥＧＥ−ｒ、トランスフェリン・レセプタ、ＭＵＣ−１エピトープ、ＬＵＢＣＲＵ−Ｇ７エピトープ、前立腺癌抗原、ＵＪ１３Ａエピトープ、２−ミクログロブリン、ＨＬ−Ａ抗原、アポプトシス・レセプタへの結合を識別した。
【００７３】
例３．悪性黒色腫に罹っていると思われる患者から胸膜液２リットルを採取した。遠心分離後、細胞を、１０％ウシ胎児血清を含む２ｍｌのＲＰＭＩに浮遊させ、４℃３０分間、9.2.27アンチ黒色腫抗体（10g/ml）と共にインキュベートし、洗浄した後に再び４℃で３０分間、DynabeadsTMSAMM450/IgG2Aと共にインキュベートした。次に、細胞浮遊液を顕微鏡で検査して表面に常磁性細胞が付着した細胞の割合を測定した。約１０％の細胞が有意数の結合粒子・ロゼットを持っていたので、悪性黒色腫という診断が確認された。
【００７４】
例４．小細胞肺癌または悪性黒色腫のいずれかである臨床的な適応症を持つケースで皮下腫瘍から生検組織を採取した。ただ１つの細胞浮遊液を生検材料から調製してから２つに分け、一方を9.2.27アンチ黒色腫抗体と共にインキュベートし、他方をMOC-31アンチ癌腫抗体と共にインキュベートした（共に、10g/mlであった）。このインキュベートは上記の例出使用したものに類似したものであった。黒色腫抗体と一緒にインキュベートした細胞はいずれもビーズと結合せず、MOC-31と共に培養した腫瘍細胞はすべて陽性であった。
【００７５】
例５．悪性黒色腫を持つと思われる患者からの生検組織を検査するのに、ただ１つの細胞浮遊液を調製し、9.2.27アンチ黒色腫抗体と共にインキュベートし、次いで、上記の作業を行った。細胞の大部分が陽性であり、多数の粒子・ロゼットが細胞膜に付着していた。
例６．乳癌患者からの胸膜液を検査して腫瘍細胞がその中に検出できるかどうかを調べた。１リットルの胸膜液を遠心分離にかけ、細胞を再浮遊させ、個別の小瓶で３種類のアンチ癌腫抗体（MOC-31、2E11 12H12）のそれぞれと共にインキュベートした。先の例と同様の作業完了後、細胞の大部分が３ケースすべてで抗体被覆粒子に結合していることがわかった。
【００７６】
例７．乳癌患者から得た骨髄浮遊液を検査して微小転移腫瘍細胞が存在するかどうかを調べた。単核細胞の調製後、これらを上記の例で使用した同じ３種類のアンチ癌腫抗体と共にインキュベートしたが、このケースでは、抗体が最初にdynabeadsTMSAM IgG常磁性粒子に付着した。これら直接被覆した粒子と共に１回インキュベートした後、細胞浮遊液を顕微鏡で検査した。多数の細胞が陽性であり、多数の粒子・ロゼットが細胞膜に付着していることがわかった。乳房を持つ患者から多数の胸膜液または腹水および骨髄において同様の実験を実施した。
【００７７】
例８．T47Dヒト乳房癌腫細胞をHoechst蛍光染料と共に時間の長さを変えてインキュベートし、標識付け細胞の生存能力をチェックした。次に、種々の数の標識付け乳房癌腫細胞を健康なボランティアから得た１×１０6個の骨髄細胞に加えた。種々の実験において、個別のアンチ癌腫抗体（NrLuIO、MOC31、１２Ｈ１２）で被覆した種々の濃度の常磁性単分散粒子（DynabeadsTMP450）を加えた。氷上で３０分間インキュベートした後、異なった試験官のサンプルを光および蛍光顕微鏡の下で計数室内で検査した。腫瘍細胞／全有核細胞の比率が低いときには、細胞浮遊液に磁界をかけ、細胞と底に付着した粒子を顕微鏡検査の前に隔離した。ここで、細胞混合物内の１腫瘍細胞あたり１−１０個の常磁性ビーズ、という最適比率で、すべての腫瘍細胞の表面に２−１５個のビーズが付着していた。この検出方法の感度は１０4個の有核細胞あたり１個の標的細胞に近かった。正常細胞に或る種の交差反応をするとして知られている抗体を用いての標識付け腫瘍細胞での対照実験において、抗体被覆常磁性粒子でこの交差反応を確認した。腫瘍関連抗体被覆なしのビーズでの実験では、標的細胞のいずれもビーズに結合しなかった。
【００７８】
他の乳癌細胞系と小細胞肺癌細胞系と共に同様に実験を実施した。これらの実験では同様の感度および特定性が得られた。
【００７９】
例９．乳癌患者と卵巣癌腫患者からの胸水、腹水を遠心分離にかけ、例１で用いたと同じ被覆常磁性粒子を添加し、磁界内でインキュベートして濃縮した後に浮遊液を光学顕微鏡で検査した。代表的には、腫瘍細胞の明瞭な形態学的特徴を持った細胞にビーズが付着しており、一方、少数の正常細胞のいずれにも抗体被覆ビーズは付着していなかった。胸水での２つのケースにおいて、独立した形態学的検査はいかなる腫瘍細胞の存在も示さず、一方、抗体被覆ビーズを使用することによって有意数の悪性細胞が検出された。いくつかのケースでは、磁界内で腫瘍細胞を分離し、乳癌細胞を増殖させるために特別に調製した成長液を含む組織培養フラスコに移し、これらの培養から恒久的な細胞系を隔離することを試みた。平行して、悪性滲出液からの細胞を、磁性ビーズと共に積極的な選択なしに直接培養した。後者のケースでは、細胞系はなんら確立されず、一方、積極的に選択した腫瘍細胞を使用したケースのうち５０％より多いケースで、細胞系が成功裡に確立された。
【００８０】
例１０．いくつかのケースで、乳癌患者から採取した骨髄および抹消血液を本方法で検査すべく、抗体被覆常磁性ビーズを加え、４℃で３０分間インキュベートし、磁界内で濃縮し、光学顕微鏡で浮遊液を検査した。両ケースで、骨髄および血液中の０．１−１％の有核細胞を示す、腫瘍細胞への常磁性粒子の結合が検出され、いかなる方法でも細胞は識別し得なかった。
【００８１】
例１１．特定細胞母集団の表面に表れた、或る種の成長因子レセプタまたは他の遺伝子生成物に対する抗体を用いてこれらの細胞を識別し、積極的に選択できる。
【００８２】
本発明によるこの新規な方法で用いられるアンチトランスフェリン・レセプタ抗体で被覆したビーズが示され、これはトランスフェリン・レセプタを表す細胞の識別のための迅速、簡単で敏感な方法を示している。
【００８３】
例１２．種々の理由のために、正常細胞の特定母集団の隔離が正当化される。正常組織あるいは腫瘍組織内の毛細血管あるいは小血管を内張りしている内皮細胞を関連組織から調製した細胞浮遊液から積極的に選択できた。この方法では、内皮細胞上に現れている構造に向けた抗体で被覆したビーズを用いたが、この構造は細胞混合物内の他の正常細胞上には現れなかった。
【００８４】
例１３．免疫免疫欠損齧歯類に注入したヒト細胞が、アンチパン・ヒト抗体で被覆した磁性粒子を用いることによって腫瘍異種移植片および種々のホスト器官／組織から調製した細胞浮遊液内に存在することが示された。
【００８５】
例１４．上述の細胞フィルタ装置を用いて濾過することにより、乳房癌腫患者および黒色腫患者からの腫瘍細胞系を血液細胞または骨髄細胞の混合母集団から分離した。培養液を添加し、次いで培養した後、フィルタ上の選定腫瘍細胞は遊離した非結合粒子または他の不特定結合細胞の存在なしに増殖することができた。
本発明は細胞母集団または細胞母集団の溶液内の特定標的細胞を検出する免疫磁気（immunomagnetic）方法に関する。本発明は、また、異なった細胞母集団においてこの方法を実施するキットおよび装置に関する。
【０００２】
生物学、生物化学およびその隣接分野において、化学的存在物を相互につなぐ方法の需要はかなりある。正常、異常両方の細胞母集団に関する研究でこのような方法の重要性が高まっている。特に固体サポートを使用する場合、細胞を不動化し、検出し、隔離し、純化することができる。さらに、或る範囲の複雑な方法を用いて細胞内容を検査することができる。生存可能な形態で細胞を隔離することができることも重要である。
【０００３】
親和性結合は化学的／生物化学的存在物を相互につなぐ複雑な方法である。このような方法では、一対の結合パートナー（たとえば、つなごうとしている基質に取り付けてある）は接触したときに互いに結合する。このようなリンケージにおける結合パートナーの一方は、細胞表面の１つの分子として表現することができる。このような結合パートナー系のいくつかは公知である。たとえば、抗原−抗体、酵母−受容体、細胞上の配位子−受容体およびビオチン−アビジン結合があり、このうち抗原−抗原結合が最も頻繁に使用される。
【０００４】
これらの方法を特定細胞を隔離し、それをさらに種々の検査に供するのに使用する場合、初期状態に戻る際に細胞がその機能を回復することが必要である。いつもこうでなければならないというわけではないが、隔離された特定細胞がさらなる特定化が可能となるに充分な数に発育するような生理学的状態を得る方法が提案されている。
【０００５】
結合パートナーの一方を不溶性サポート、たとえば常磁性粒子に取り付け、混合細胞母集団内の標的細胞の隔離を消極的隔離あるいは積極的隔離として行う方法は公知である。消極的隔離作業では、不要な細胞を細胞母集団から除くのに、不要細胞に対して特定の目的を持つ抗体被覆した粒子と一緒に細胞をインキュベートする。インキュベートに続いて、これらの粒子を用いて細胞／抗体／粒子複合体を除去し、望みの標的細胞を残すことができる。この結果は満足できないことが多い。望みの細胞が多少とも純化された細胞母集団内に残るし、隔離作業の意図が特定標的細胞を検査したり、それらをさらに研究することにあるからである。積極的隔離のための粒子を用い、望みの標的細胞を混合細胞母集団から除去する試みも行われている。しかしながら、これらの作業は、或る種の標的細胞に向けられたものであり、すべての標的細胞系に向いているわけではない。ハプテン／アンチハプテン・リンケージ系を伴う積極的隔離手順が最近提案されている。（WO91/01368）。この提案は、互いに結合しようとしているハプテン、アンチハプテン抗体、アンチ細胞抗体の能力を用いることによって不溶性サポートに標的細胞を結合し、不溶性サポート、すなわち、粒子と標的細胞の間に、少なくともハプテンと、アンチハプテン抗体またはハプテン、アンチハプテン抗体、アンチアンチハプテン抗体の組み合わせまたはハプテン、アンチハプテン抗体、二次アンチ細胞抗体の組み合わせとからなるリンケージを構成する方法に関するものである。この複合体は、後にハプテンまたはハプテン類似体に再びさらすことによって分割する。こうして構成したリンクは、常に、１つまたはそれ以上の元素に加えてハプテンを包含する。この方法は、未特定化標的細胞に向けたものであり、標的細胞の隔離および不溶性サポートの解放を目的としている。
【０００６】
さらに、WO91/09938に、特定細胞、すなわち、骨髄の造血前駆細胞を隔離し、できるならば増殖させる目的で積極的、消極的選択の組み合わせを使用することが記載されているが、これは粒子の除去に依存している。WO092/04961には、コロイド状の磁性粒子を用いることによって非磁性試験液から細胞または種々の分子を分離する方法と複雑な装置が記載されている。この方法では、溶液内での粒子の沈殿を避ける必要があるために（サブミクロン）粒子に用いており、磁性強化手段を試験液に侵漬する複雑な装置が必要である。これは細胞に悪影響を与える可能性がある。
【０００７】
"Application of Magnetic Beads inBioassays", B. Haukanes and C. Kvam, Bio/Technology, 11:60-63, 1993には、磁性粒子を用いて腫瘍細胞を骨髄から取り出し、抹消血液からリンパ球様細胞を隔離し、DNA、RNA、DNA-結合タンパク質を隔離するいくつかの方法が記載されている。ここに記載されている方法は、すべて、標的細胞のみを検出するという本目的には適さない仕様を持っている。これらの方法は、標的細胞に加えて、抗体・粒子複合体の交差反応性および不特定接着性により非標的細胞も結合することになる。
【０００８】
また、マイクロリットル量の定量化を行うためのマルチウェル濾過装置（EP-A-0 098 534）、マイクロリットル量の流体を濾過するためのフィルタ・ストリップ／複合組立体（EP-A-0339 769）、ほぼ矩形のベース・プレート、ほぼ矩形のトップ・プレートおよび４つの側壁を有する定量カートリッジ（EP-A-0 131 934）も知られている。これらの装置は、いずれも、粒子・細胞ロゼットのみを保持するという本目的にとっては小さすぎる細孔寸法を記載しているという点で本目的に適用できない。さらに、フィルタが、濾過材から取り出すことなく保持された細胞のいくつかの検査にさらされるようには設計されていない。
【０００９】
標的細胞を不溶性サポートに連結し、しかも未特定化ハプテン・グループの化合物を含まず、非特定細胞群が最小限で特定標的細胞を検出することを目的とし、さらに、不溶性サポートと特定標的細胞の間の後の分割を不要とする簡単なリンケージが必要である。
【００１０】
本出願人のひとりが出願した審査中の出願（１９９３年９月１０日付けのWO094/07139）には、通常細胞への普通の結合に伴う問題を招くことなく診断目的で特定標的細胞を検出する方法が記載されている。これは、多数の細胞を顕微鏡で容易に見分けることができ、作業が迅速かつ簡単となるように種々の細胞タイプに敏感な検出方法である。さらに、この方法は、細胞・粒子複合体を分割する必要なく細胞を培養することに加えて、生化学、生物学、免疫学の検査のために細胞を隔離することにも、また、ヌクレオチド・レベルまたはタンパク質レベルで特殊遺伝子を研究することにも使用できる。しかしながら、非結合ビーズ、非特殊結合非標的細胞および非結合非標的細胞から標的細胞浮遊液内で粒子結合標的細胞を隔離するといような改良を行い、しかも時間もかからずに簡単に実施でき、標的細胞／粒子複合体をさらなる分析、たとえば、顕微鏡検査を行ったり、培養液内で増殖させたりするのに適したものとする必要がある。
【００１１】
これらの目的は、添付の請求の範囲に記載した方法、装置およびキットによって表される本発明によって達成できる。
【００１２】
混合細胞母集団および複数の細胞母集団を含有する生理学的溶液内の標的細胞を免疫磁気的に検出する方法は検出に適しているが、特殊タイプの正常細胞および病原性細胞の両方を積極的に隔離する際にも使用できる。この方法は、特定標的細胞と不溶性サポート（たとえば、常磁性粒子）の間の、１つまたは２つの元素からなるリンケージを生成する。所望の標的細胞の隔膜内の特殊抗原デターミントに向けたネズミまたはヒトのオリジンのアンチ細胞抗体で粒子を被覆するか、あるいは、標的細胞隔膜内の抗原決定基に向けた特殊アンチ細胞抗体のＦｃ部分に結合することのできるポリクロナール・アンチマウスまたはアンチヒューマン抗体で粒子を被覆する。粒子を被覆するためにポリクロナール・アンチマウス／アンチヒューマン抗体を用いる代わりに、モノクロナール・ラット・アンチマウス／アンチヒューマン抗体を用いてもよい。今述べたこの抗体は、部分的にそのモノクロナール・オリジンにより、アンチ細胞抗体へのより特殊な結合を提供し、溶液、たとえば血液内の他の細胞との交差反応を生じる可能性を低下させる。さらに、マイルドな洗浄剤あるいは蛍光剤、metallocolloids、放射性同位元素、ビオチン・コンプレックスあるいは視覚化を可能とする或る種の酵母で予め標識したあるいはしない第２セットの抗体または抗体フラグメントと共に細胞浮遊液をインキュベートすると、この方法の特殊性が劇的に増すことになる。
【００１３】
さらに、本発明によれば、この方法は、標的細胞／粒子複合体の浮遊液を本発明による細胞濾過装置あるいは細胞分離器に移送すること、および、顕微鏡観察したあるいは生理学的ベース培養液内で増殖させた標的細胞の全数を特殊生化学的、生物学的特徴の存在で特徴づけるこによって改善され、簡略化され得る。
【００１４】
図面について：
第１．１．図は、部分的に組み立てた細胞濾過装置または細胞分離器の一具体例の斜視図を示す。
第１．２．図は、部分的に組み立てた細胞分離器の別の具体例の斜視図を示す。
第２図は、細胞分離器マルチウェルの一形態の斜視図であり、マルチウェルから外した状態で薄膜フィルタを示す図を示す。
第３図は、細胞分離器マルチウェルの一部を示し、特にマルチウェル・ストリップから外した状態の膜基部を示す。
第４図は、細胞分離器マルチウェルまたは薄膜フィルタあるいはこれら両方のための蓋装置を備えた培養皿の一形態の斜視図を示す。
第４ａ図は、培養皿のマルチウェル構造の側面図を示す。
第５図は、細胞分離器濾過液収集ボックスの一形態の斜視図を示す。
第６図は、前述の方法を用いて細胞濾過装置に捕らえたメラノーマ細胞・粒子ロゼットを示す。
【００１５】
以下に、検出、できるならば隔離も行うために標的細胞として癌細胞を用いる方法のより詳しい説明を行う。しかしながら、本方法は癌細胞に限られるわけではなく、本方法は細胞学研究分野に適しているので、以下の説明でも本方法をこの特定の使用分野に限定するつもりはない。
【００１６】
癌患者の管理において、癌が局限されているか、他の組織に転移しているかどうかに関する病期は、個々の患者の治療法を選択するためには最も重要である。
【００１７】
悪性細胞は、周囲組織への直接的な浸潤によって広がったり、リンパ管を通して転移したり、血液内の腫瘍細胞が遠隔の器官（たとえば、骨髄、中枢神経系、髄液など）に送られることによって広がる。
【００１８】
悪性腫瘍細胞の検出は、最近まで、生検腫瘍標本や骨髄スミア、種々の体液の細胞遠心沈殿法を行って調製したスライドについて光と電子顕微鏡を用いて行う形態学的な方法に依存していた。抗原を認識するモノクロナール抗体の出現で種々のタイプの悪性細胞の表面を優れて表出できるようになったので、転移細胞の確認には免疫細胞化学法および免疫蛍光検査法もますます必要になってきている。したがって、生検腫瘍あるいは細胞遠心沈殿法から調製したスライドをモノクロナール抗体で処理した後、抗体の腫瘍細胞への結合状態を比色計あるいは蛍光で視覚化している。蛍光を使用する方法では、細胞浮遊液を調製したり、流動血球計算器を用いたりして蛍光顕微鏡を使用しなければならない。
【００１９】
前述の方法は、感度あるいは特定性またはこれら両方で限界があり、通常は面倒で、時間がかかる方法であり、また、高度な専門技術も必要とする。流動血球計算検査法も高価な機器を必要とする。
【００２０】
血液および骨髄内の腫瘍細胞を検出するための形態学方法は、免疫細胞化学法や免疫蛍光検査法を使用する方法よりもかなり感度を低い。しかしながら、後者の方法は、腫瘍細胞が有核細胞の全数の１％未満である場合には不適である。流動血球計算器は顕微鏡を用いる方法よりも感度は良いかもしれないが、多数の細胞を利用しなければならないし、また、いくつかの技術的な困難も伴う。細胞の凝集が問題を生じる可能性もあり、この方法では、標識付けした腫瘍細胞と普通に蛍光を発する正常細胞とを区別することはできない。
【００２１】
本発明は、たとえば、転移性腫瘍細胞の検出を非常に感度良く行うことができる。これは、大量かつ多数の細胞を顕微鏡で容易に識別でき、取り付けた磁気ビーズを容易に識別できるからである。本発明の方法および装置は、顕微鏡で容易に観察できる固体サポート・恒久レコードを提供し、小断片よりもむしろ試料全体の評価および定量化を可能とし、大体積の試料を分析することができ、また、普通のデンシトメトリ技術によって自動的に走査を行うことができる。使用するモノクロナール抗体は充分な特定性を持ってたとえば腫瘍細胞へ結合し、血液、骨髄などの混合細胞母集団および他の腫瘍発現部位に存在する標的細胞以外の細胞には結合しないので、ビーズを取り付けた細胞すべてが標的細胞を表すことになる。さらに、この作業は迅速かつ簡単であり、普通の顕微鏡を用いていかなる検査員によっても実施され得る。
【００２２】
この新規な方法では、腫瘍細胞に存在し、正常細胞に存在しない抗体を特定認識するために、あるいは、他の目的のために、たとえばネズミあるいはヒトのオリジンのモノクロナール抗体を、正常細胞の特殊化部分母集団、常磁性粒子に直接結合したり、あるいは、最初にそれぞれの抗体を特定認識する抗体で被覆したビーズまたは腫瘍細胞に結合するIgG抗体のFc部分に結合する。細胞結合抗体は、IgGタイプあるいはIgMタイプいずれであってもよく、あるいは、ab IgGまたはIgMのフラグメントであってもよい。使用するアンチ標的細胞抗体の例としては、抗原決定基のグループ、たとえば、動物細胞のうちのヒト細胞を検出するのに適したanti-pan-human antibody（Bruland等、未公開）に加えて、CD56/NCAM抗原（MOC-1）、Cluster２上皮抗原（MOC31）、Cluster２（MW-40kD）抗原（NrLulO）（Myklebust等、Br.J.CancerSuppt.63,49-53,1991）、ＨＭＷ−メラノーマ付随抗原（9.2,27）（Morgan等、Hybridoma,1,27-36,1981）、８０ｋＤ、肉腫付随抗原（TP1＆TP3）（CancerRes.48,5302-5309,1988）、ムチン抗原（Diel等、Breast Cancer Res.Treatm.,1991）、または、ＥＧＦレセプタ抗原（425.3）（Merck）に向けたものがある。４２５．３抗体は正常細胞および悪性細胞の両方にある抗原に向けたものである。さらに、抗体は成長因子レセプタ、たとえば、ＥＧＦ−レセプタ、ＰＤＧＦ（Ａ、Ｂ）レセプタ、インシュリン・レセプタ、インシュリン様レセプタ、トランスフェリン・レセプタ、ＮＧＦ、ＦＧＦレセプタ、インテグリン（integrins）のグループ、正常細胞、異常細胞の両方に存在する他の粘着性薄膜分子およびＭＤＲプロテイン、正常細胞の部分母集団に存在する抗原に向けることができ、その他に、正常細胞、悪性細胞の膜ならびに悪性細胞、たとえば、Neu/erbB2/HER2にのみ現れる腫瘍生成物にも用いることができる。悪性細胞としては、乳房、卵巣、肺の癌腫細胞、黒色腫、肉腫、神経グリア芽細胞腫、消化器系の癌細胞および網内系の癌細胞がある。または、標的細胞は非腫瘍疾病、たとえば、心臓血管疾患、神経性疾患、肺疾患、自己免疫性疾患、胃腸疾患、泌尿生殖器疾患、網内疾患その他の疾患に関連するものであってもよい。さらに、悪性細胞母集団は、骨髄、胸膜および腹膜の滲出液からの抹消血および他の体液成分、たとえば、尿、髄液、精液、リンパ液、あるいは、正常組織および器官、たとえば、肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚、粘膜の固形腫瘍にあるものであってもよい。本発明の方法で使用する抗原決定基および対応する抗体あるいは抗原フラグメントのより完全なリストは表１に示してある（付録参照）。
【００２３】
＜方法論＞
本方法は、常磁性粒子への直接的な抗体の結合を行う。すなわち、この結合は、表面境界抗体、たとえば、ポリクロナール・アンチマウス抗体、モノクロナール・ラット・アンチマウス抗体またはモノクロナール・アンチヒューマン抗体への結合によって行うことができ、これら個々の抗体のFc部分を特定認識する。
【００２４】
抗体被覆した常磁性ビーズは、次に、検査しようとしている細胞の浮遊液に混合し、穏やかな回転を与えながら好ましくは４℃で５−１０分間から２時間、好ましくは、３０分間インキュベートする。本方法は、また、ステップ順序を変えて、遊離標的細胞抗体を細胞浮遊液に加え、穏やかな回転を与えながら０−２０℃、好ましくは４℃で５−１０分間から２時間、好ましくは、３０分間焙養するように実施することもできる。アンチマウスあるいはアンチヒューマン抗体で予め被覆した常磁性粒子は、次に、上述したようにインキュベートした細胞浮遊液に加え、こうしてできた浮遊液を穏やかな回転を与えながら０−２５℃、好ましくは４℃で５−１０分間から２時間、好ましくは３０分間さらにインキュベートする。本方法は、また、より少ないステップ数で実施することもできる。その際、遊離標的細胞浮遊液を予め被覆した常磁性粒子と共に細胞浮遊液に添加し、穏やかに回転させながら０−２５℃、好ましくは４℃で５−１０分間から２時間、好ましくは３０分間インキュベートする。細胞浮遊液に加える抗体被覆ビーズの数は、標的細胞の数の０．５倍から１０倍出なければならない。この数が未知のときには、加える被覆ビーズの量を細胞の全数の１−１０％としなければならない。特定の目的のために、そして、標的細胞（たとえば、悪性細胞）の密度が低い場合、あるいは、標的細胞が細胞の全数のうち非常に低い割合（約１％）を占める場合には、標的細胞を磁界内で非標的細胞から積極的に分離することができる。細胞母集団内のこの隔離した標的細胞を次に細胞計数装置に移し、ビーズを取り付けた細胞の数を顕微鏡で測定することができる。
【００２５】
本方法は、また、本出願で説明する細胞濾過装置に隔離標的細胞浮遊液を移すことによっても実施することができ、またそうする方が好ましい。隔離標的細胞の全数は顕微鏡で調べることができる。フィルタ装置内の隔離標的細胞は光学顕微鏡での観察を容易にするために固定して染色してもよい。特殊な目的のために、そして、隔離標的細胞を機能的に活性状態にする必要がある場合には、生理学ベースの培養液を細胞フィルタ装置に加え、それを３７℃で不特定時間培養してもよい。隔離標的細胞は特定の生化学的、生物学的な特徴の存在のために増殖し、その後特徴づけることができる。さらに、標的細胞は特定の生化学的および生物学的な特徴の存在のために特徴づけることができる。特に重要なのは、分子生物学の研究のためにこのような細胞を使用するということである。上記の従来の方法と対照的に、本方法では、常磁性粒子・標的細胞リンケージの分割を行うことなく標的細胞の研究、増殖を行える。いくつかの目的のために、腫瘍生検試料ならびに血液、骨髄その他の体液、たとえば、尿、髄液、精液、リンパ液に存在する腫瘍細胞あるいは他の正常な組織および器官、たとえば、肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、消化器系、皮膚、粘膜からの細胞について純標的細胞母集団および他の細胞学研究活動分野において特定の遺伝子をＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパクのレベルで検査することは重要である。従来の方法では、南極、北極、西極のブロットから得た信号は生検試料内の正常細胞ならびに腫瘍細胞を表している。もし単一の細胞母集団を最初に腫瘍材料から調製し、腫瘍細胞を積極的に免疫磁気的に検出し、分離した場合には、この材料について行われるいかなる遺伝子研究も標的細胞のみを表すことになる。これは、たとえば、哺乳類の組織に存在する悪性細胞、たとえば、骨髄、抹消血、胸膜、腹膜滲出液および他の体液、たとえば、尿、髄液、精液、リンパ液に存在する悪性細胞にも関係する。ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）方法論を用いる研究も、この方法によって得られた純腫瘍細胞母集団に実施する場合には、特定性および信頼性で有利になろう。
【００２６】
この新方法ステップの用途は検査しようとしている組織のタイプに依存して異ならせるとよい。
ａ）固形または針状腫瘍生検材料からの組織を機械的にあるいは単一の細胞母集団に穏やかな酵素処理を行うことによって調製し、これに一次特定抗体または抗体フラグメントを直接あるいは胎児ウシ血清、ウシ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヤギ血清、ヒト血清などの血清ありまたはなしにリン酸緩衝生理食塩水または培養液で細胞母集団を洗った後に加える。
ｂ）材料が胸水、腹水、髄液、尿、リンパ液のサンプル、あるいは、種々の形態の関節炎を伴う患者の関節にある滲出液のような体液のサンプルである場合、特定抗体または抗体フラグメントを直接あるいは遠心分離後に、サンプル内の細胞を回転沈降させて浮遊液にもどす前あるいはその後の洗浄ありまたはなしでサンプルに加える。
ｃ）材料が血液あるいは骨髄吸引液からなる場合、特定抗体または抗体フラグメントを直接にあるいは遠心分離後にサンプル内の細胞を回転沈降させて浮遊液にもどす前あるいはその後の洗浄ありまたはなしにサンプルに加えるか、あるいは、適切な抗体または抗体フラグメントの洗浄、再浮遊液化および添加の前にたとえばLymphoprepに段階的な遠心分離を施すことによって単核細胞部分を調製してもよい。
ａ）およびｂ）についての作業条件は以下に述べる実験で得た結果によって説明するにつれて確立される。
ｃ）については、詳細に検査された多数のファクタによって結果が影響を受けることがわかった。これらのファクタとしては、抗体濃度、常磁性粒子の数対細胞の数の比、インキュベート時間、インキュベート体積、インキュベート液のタイプおよびｐＨレベルがある。すべての実験における粒子対単核細胞比は、一次特定抗体またはフラグメントの結合親和性に応じて０．５/１から２/１の範囲になければならない。
【００２７】
大きな問題としては、ヒツジまたはラットのアンチマウス抗体のみあるいはそれに加えて特定抗体で被覆した粒子を正常な血液または骨髄の細胞に不特定結合するということであった。実験では、特定抗体の存在なしに不特定結合が等しく高いということが示され、このことは標的抗体の正常細胞への交差反応によっては問題が生じないということを意味している。最適には達しない特定化がイオン結合によって生じる可能性は除外した。別の可能性としては、Ｂリネージの正常細胞の部分母集団が粒子・抗体複合体に付着するということがある。しかしながら、特定抗体／抗体・粒子複合体を加える前の細胞浮遊液からのＢ細胞の免疫磁気除去は特定抗体／抗体・粒子複合体の特定性を改善しない。
【００２８】
或る種の非標的細胞も常磁性粒子に結合する可能性があるという、骨髄および抹消血液の隔離した単核部分に用いる手順に伴う問題は、回避あるいは解消されている。したがって、ヒツジ・アンチマウス抗体被覆粒子でも特定抗体でも、少量の単核血液または骨髄細胞に不特定結合した粒子の数は平均１０から約１へ減少し、同時に、粒子を備えた正常細胞の部分は１−２％から０．５−１％またはそれ以下まで減少した。
【００２９】
常磁性粒子に結合した抗体に関連した疎水力によって問題が生じる可能性があるという証拠を得た。したがって、この疎水性を低減する方法が請求の範囲に記載してある。そのうちの１つの方法は、適当な濃度でのマイルドな洗剤、たとえば、０．１％未満の濃度のTween 20TMによって４℃で３０分間、抗体被覆粒子と細胞浮遊液を予備インキュベートすることである。標的細胞の可能性のある選択が保証されるときには、細胞浮遊液が低濃度の洗剤、たとえば、０．０１％のTween 20TMを含有していなければならない。いくつかの実験で、この手順は、血液または骨髄からの単核細胞部分に見られる不特定結合の問題をほとんどなくすか、あるいは、劇的に低減した。
【００３０】
保証されるとわかっている場合に洗剤ステップと共に用いることができる他の改良点は次の通りである。
【００３１】
先に説明したように一次抗体または抗体フラグメントと抗体被覆常磁性粒子を備えた細胞浮遊液のインキュベート後、この細胞浮遊液は、フォルムアルデヒドまたはアルコールのような細胞固定剤で予備処置するしないに係わらず、標的細胞の他の細胞外または細胞内抗原決定基に向けられた第２セットの抗体または抗体フラグメントでインキュベートする。これらの抗体またはそれらのフラグメントは、蛍光剤、メタロコロイド、ラジオアイソトープ、ビオチン複合体またはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼのような酵素によって予め標識付けしなければならない。こうすれば、顕微鏡または適当な計数装置あるいはこれら両方でそれ自体公知の方法によって視覚化することができる。
【００３２】
標的細胞は、標識付けされた第２セットの抗体又は抗体フラグメントを用いて視覚化する方法で視覚化したときにその表面に結合した粒子を計数することができる。
【００３３】
非標的細胞、標的細胞の区別を簡略化するために、細胞浮遊液またはその一部を、２回目の視覚化ステップの前に、シトスピン（cytospin）遠心分離にかけるか、浮遊液の部分を被覆ガラススライドに結合させ、そこに粒子結合細胞を塗り広げて薄い層にし、染色を２回行った非標的細胞と標的細胞の区別を容易にしてもよい。
【００３４】
非標的細胞、標的細胞の識別をさらに簡略化するための本発明の別の方法は、細胞フィルタ装置を包含し、標的細胞選択ステップ後に細胞浮遊液全体を細胞フィルタ装置に直接加えることができる。遊離した未結合ビーズ、不特定結合した非標的細胞および任意の非結合非標的細胞はフィルタを通過してしまい、フィルタ上には視覚化しようとしている結合標的細胞が残ることになる。隔離した標的細胞を持ったフィルタは装置から取り出し、公知の免疫組織化学法を用いて細胞を固定し、染色し、顕微鏡で見ることができる。フィルタは、装置から取り出した後、免疫組織化学で公知で、通常使用されているタイプの普通の顕微鏡スライドとして処理することができる。
【００３５】
特定の目的のために、フィルタを装置から取り出しても装置に一体の状態で残してもよいし、フィルタ上に置かれた隔離標的細胞を増殖させるために、アガロースありまたはなしの任意公知の培養液のような培養液を添加してもよい。
【００３６】
この新しい方法を使用するために、キットは、たとえば、各モノクロナール抗体について調製した予備被覆した常磁性粒子を含有することになる。別の具体例では、キットは、その一部としてIgGイソタイプ特定アンチマウスまたはアンチヒューマン抗体で予め被覆し、別の部分として異なった細胞と組み合わせた、たとえば腫瘍細胞、抗体で予め被覆した常磁性粒子を含有する。第３の具体例において、キットは、特定アンチFc抗体、たとえば、ポリクロナール・アンチマウスまたはモノクロナール・ラット・アンチマウスまたはアンチマウスまたはアンチヒューマンの抗体で予め被覆した、特定アンチ標的細胞抗体に結合した標的細胞関連抗体をＦｃ部分に結合することができる常磁性粒子を含有する。第４の具体例では、キットは、標的細胞抗原または標的細胞抗原群で被覆しても被覆しなくてもよい常磁性または非磁性の特異な粒子を含有し、本方法で処理したとき、これらの粒子は細胞フィルタ装置内に捕らえられることになり、それによって、たとえば本方法の抗体・抗原反応のすべての特徴が正しく有効となることを実地説明する際に対照として作用する。これらの粒子は本方法実施前あるいは実施中の段階で細胞浮遊液に加えてもよいし、分離しようとしている標的細胞を含む細胞浮遊液と同じ方法を用いて処理すべき別の「細胞浮遊液」として用いてもよい。さらに別の具体例では、キットは、望みの標的細胞内あるいはその上の抗原／レセプタに向けられた他の特定抗体または抗体フラグメントを含有し、前記抗体または抗体フラグメントはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼその他の酵素にこれらの酵素に関連した基質と共に結合するか、あるいは、前記抗体または抗体フラグメントは特殊な色またはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼのような結合酸素を持った非常磁性粒子に結合する。
【００３７】
＜装置＞
本発明の新しい特徴は、マルチウェル細胞分離器とも呼び得る細胞フィルタ装置に関するものであり、この細胞フィルタ装置は前述のキットの一部であってもよいし、なくてもよい。この装置はマイクロウェル細胞分離器構造に関し、これは血液または骨髄に見出されるような種々のサイズの細胞の混合母集団を分離するのに用いられる。こうして得た細胞は、顕微鏡または自動走査装置によって膜上で直接観察することができる。本発明は、従来の磁性粒子細胞隔離技術と一緒に用いて、多数の大体積または小体積のサンプルを１ないし４時間内に腫瘍細胞の存在について検査する迅速で感度の良い、簡単な方法を提供することができる。
【００３８】
本発明によれば、マイクロウェル細胞分離器構造は、頂部開放式濾過液収集ボックスを包含し、この濾過液収集ボックスは、真空チューブのためのアタッチメントを持っていてもよいし、持っていなくてもよく、また、細胞分離膜フィルタを備えた取り外し自在の使い捨てのマルチウェル構造を有し、この細胞分離膜フィルタはこれらマルチウェルの基部を構成する。この構成に対する蓋またはカバーを設けてもよい。濾過液収集ボックスおよび蓋構造は高温滅菌に適した材料で作ってもよいし、また、組織培養プラスチック製品について知られているような透明あるいは不透明なプラスチック材料で作ってもよいし、作らなくてもよい。
【００３９】
細胞分離膜フィルタは、ナイロン・モノフィラメント膜に見出されるような規則正しくて一貫した細孔形状、寸法を持ち、個々のウェルの基部を形成するものであるとよい。細胞分離膜フィルタは細胞分離方法の後に取り外して検査を容易にすることができるようにマイクロウェルに取り付けるとよい。細胞分離膜は、マイクロウェルから除去後の検査を容易にするようにカードまたはプラスチック製周囲フレームを包含するものであってもよい。
【００４０】
濾過液収集ボックスは２つ以上のウェルの取り外し可能なストリップを挿入することができるフレームを包含していてもよい。
【００４１】
濾過液収集ボックスは細胞分離膜、収集ボックスおよび低圧真空アタッチメントを収容するようになっている普通の９６−ウェル・プレートに類似したものであってもよい。
【００４２】
本発明は上方蓋または上方カバーを包含していてもよい。
【００４３】
マイクロウェル・ストリップを挿入し、ascepticallyに培養できる蓋付きの使い捨て培養皿を装置に設けてある。この培養皿に一体にくぼみまたは切り込みが設けてあり、濾過液収集ボックスのものと同様のマイクロウェル・ストリップの位置決めを容易にすると共に、培養中にマイクロウェル・ストリップの移動を防ぐことができる。前述したようにくぼみまたは切り込みは、マイクロウェル・ストリップから除去した後の細胞分離膜の位置に設けてもよいし、設けなくてもよい。
【００４４】
本発明は、さらに、添付図面の図に関連した以下の説明から明かとなろう。添付図面は、本発明を具体化したマイクロウェル細胞分離器構造の一形態を例示している。
【００４５】
図面の第１図から第５図を参照してわかるように、マイクロウェル細胞分離器構造２０は蓋またはカバー２１と濾過液収集ボックス２２とからなり、この濾過液収集ボックス２２は低圧真空アタッチメント・ポート２３を持っていてもよいし、持っていなくてもよく、サポート２５ａを有する取り外し自在の膜基部２５を持つ取り外し自在のマルチウェル・ストリップ２４を備えている。
【００４６】
第１．１．図および第１．２．図は部分的に組み立てた本発明の２つの具体例を示している。
【００４７】
濾過液収集ボックス２２は、いくつかの点で、取り外し自在のウェル・ストリップを備えた普通の９６−ウェル・プレート・フォーマットに類似したものであってもよく、また、１つまたは複数のウェル・ストリップを嵌合するようになっていてもよい。
【００４８】
マルチウェル２４は図示したような二重ストリップあるいは単一または複数のストリップで構成してもよい。
【００４９】
濾過液収集ボックス２２内へのマルチウェル２４の係合は、１つの向きでのみ可能となるようになっており、そのために、位置決めピン２８または位置決めノッチ２９を設けてもよい。
【００５０】
細胞分離膜フィルタ２５はマルチウェル２４の底に固定してあり、ウェルの基部を構成している。マルチウェル２４への膜フィルタ２５の固定は、膜フィルタ２５または膜フィルタ・サポート２５ａの変形なしに分離できるようにしてある。
【００５１】
膜フィルタ２５は顕微鏡で観察してもよいし、デンシトメトリーまたは類似の方法で走査してもよい。
【００５２】
膜フィルタ２５は、ナイロン・モノフィラメント膜に見出されるように規則正しい一貫した細孔形状、寸法を持つものでよく、個々のウェルの基部を形成し、５−７５ｍ細孔サイズ、好ましくは、２０ｍ細孔サイズであってもよい。
【００５３】
濾過液収集ボックス２２の有無に係わらず、マルチウェル２４は組織培養目的のために適した材料で作ってもよい。これは普通の９６−ウェル・プレート走査機あるいはプレート読み取り機で観察するのにも適している。
【００５４】
培養皿２６および培養皿蓋２７は組織培養目的に適した材料で作ることもできる。この場合、マルチウェルの頂部を通して、そして、培養皿２６の底に培養液を供給することが可能となる。
【００５５】
図に示す寸法は、すべて、例示であり、細胞濾過装置２０はこれらの寸法に限らない。さらに、本発明を上記の例にのみ限る意図はなく、発明の範囲から逸脱することなく多くの変更が可能であることは了解されたい。本発明は、以下、模型実験、新方法の有用性の例および実際の用途の例によって説明する。これらの例はいかなる方法でも発明を限定することに関係するものではない。
【００５６】
＜模型実験＞
１．腫瘍細胞系への抗体・ビーズ複合体の結合。腫瘍細胞への抗体・常磁性粒子複合体の結合のための抗体濃度および最適条件を決定するために、癌細胞系の大きなパネルを使用した。常磁性ビーズは、特定抗体をヒツジ・アンチマウス抗体（SAM）被覆常磁性粒子にコーティングするか、あるいは、最初に細胞を特定抗体でインキュベートし、洗浄してからSAM被覆粒子で二回目のインキュベートを行うことによって細胞に結合した。これらの実験の結果は表２ａ、表２ｂに示してある（付録参照のこと）。これらの表で、＋はいくつかのビーズの全細胞への結合を示しており、（＋）は各細胞に結合した少数のビーズあるいはすべての腫瘍細胞がそれらの表面に結合したビーズを持っておらず、なんら結合を反映していないことを示しており、（−）は非常に弱い結合を示している。
【００５７】
２．骨髄または抹消血液の単核部分における腫瘍細胞の検出。模型実験は、これらの単核細胞あるいは細胞浮遊液のいずれかに特定抗体およびSAM被覆常磁性粒子を加えて行った。このとき、ビトロ内培養細胞系からの異なった数の癌細胞を前記単核細胞に加えた。いくつかの実験で、単核細胞あるいは悪性細胞のいずれかを予め蛍光染料で染色し、２種類の細胞を識別できるようにした。すべての実験で、非結合一次抗体あるいはヒツジ・アンチマウス抗体被覆ビーズまたはこれら両方を対照として別個に用いた。抹消血液の単核細胞部分の調製を行わなかった付加的な実験を実施したが、この方法での細胞の分離ではLymphoprep分離血液分に比べて非特定結合の量が減ることがわかった。
【００５８】
３．細胞フィルタ装置を用いての腫瘍細胞系への抗体・ビーズ複合体の分離および視覚化。腫瘍細胞浮遊液および血液または骨髄浮遊液と混合した蛍光標識付け腫瘍細胞を調製し、模型実験１、２で述べたように処理し、細胞フィルタ装置にかけた。装置内のフィルタ上の細胞を洗浄、固定、染色後、フィルタを顕微鏡で観察した。腫瘍細胞浮遊液のみからの結果は抗体・ビーズ・腫瘍細胞複合体がフィルタ上ではっきりと隔離されていることを示していた。血液または骨髄と一緒の蛍光標識付け腫瘍細胞浮遊液からの結果も、抗体・ビーズ・腫瘍細胞複合体がフィルタ上ではっきりと隔離されていることを示した（第６図）。本方法の感度をテストする付加的な実験は、１０7個の血液または骨髄の細胞の浮遊液と混合した１００個の腫瘍細胞をこの方法を用いて検出できることを示した。
【００５９】
４．細胞フィルタ装置を用いて隔離した調製細胞の増殖。腫瘍細胞浮遊液を模型実験１、２で述べたように処理し、隔離し、フィルタ装置にかけた。次いで、フィルタを２０％子ウシ血清を含有する培養液内の０．３％アガロースを含有する半固形媒質内で培養した。細胞は３７℃の５％CO2の雰囲気中で培養した。腫瘍細胞は分裂、増殖する能力を示した。
【００６０】
いくつかの実験において、単核細胞への若干の不特定結合が観察されたが、特定抗体の性質に無関係であることがわかり、SAM被覆粒子でのみ等しく示された。この不特定結合の大きさはほぼ０％から０．５−２％のレベルまで変化した。
【００６１】
この不特定結合は、疎水細胞相互反応の問題を低減するように実施した、洗剤（Tween 20TM）でのマイルドな処理によってほとんどなくなった。
【００６２】
＜処理の有効性の例＞
１．血液、骨髄における微小転移性新生病態の検出。血液あるい骨髄またはこれら両方への癌細胞の転移についての早期の信頼性のある診断は、応用例１で説明するように、癌腫を含む多くのタイプの癌における最適な療法、おそらくは治療法の選択にとってますます重要になっている。悪性黒色腫、内腫、神経芽細胞腫、いくつかの他の癌についての同様の手順が確立されており、また、発展途上にある。
【００６３】
２．胸膜滲出液または腹膜滲出液および尿における悪性細胞の検出。これらの体液の性質は、特に少数の癌細胞が正常反応細胞または上皮細胞と一緒に存在するときに重要な診断上の問題を示していることがある。いくつかの場合、従来の細胞学的検査が否定的であるかまたは決定的でない場合に、この新方法で明確な診断が迅速に行われた。腎臓あるいは尿路ならびに膀胱の癌の場合に同様の利点が見出された。
【００６４】
３．髄液内の新生細胞の検出。多くの癌タイプの組織的な処置が向上してきているので、症状付与性脳転移のケースの頻度が有意に高まってきており、同時に、このような転移の早期検出の必要性が高まってきている。この新方法を使用した場合、ほんの少数の悪性細胞も容易な識別でき、脳腫瘍症状発現の早期段階で治療法の選択を行うことができる。
【００６５】
４．生検組織における癌の診断。癌にかかったとき、外科的処置あるいは針生検によって組織生検材料を得た場合、この新方法を調製した細胞浮遊液に用いて、従来の形態学的方法、免疫組織化学的方法あるいは細胞化学的方法に比べて、かなり簡単かつ迅速に診断を下すことができる。いくつかの似たような癌の区別は適当な抗体を用いて行うことができる。
【００６６】
５．予後徴候インジケータの識別。いくつかの膜分子の表出がいくつかの癌における悪性症状の進行と関連していることが示されているので、本方法を用いて、たとえば、用途例２で説明しているように、予後徴候インジケータを識別することができる。
【００６７】
６．特定の病状あるいは病状の悪化または状態を示す細胞の識別。種々のタイプのリウマチ性疾患（たとえば、リウマチ性関節炎）やアレルギ疾患、自己免疫疾患、循環器疾患では、細胞の特定部分母集団の組織的あるいは局所的存在の確認は、診断のためにも症状の段階を決定するにも重要である。したがって、このような細胞母集団をこの新方法で迅速に検出するということは、診断上、治療上かなり重要である。
【００６８】
７．正常細胞の部分母集団の検出。いくつかの理由のために、或る母集団における正常細胞の或る特定の部分母集団の割合を検出することが重要となる。これは、たとえば、肝臓生検に応用することができ、この場合、胆嚢上皮抗原を表す細胞の確認は重要である。同様に、種々の正常細胞から調製した細胞浮遊液からの特定上皮細胞の識別および可能ならば隔離も当然可能である。
【００６９】
８．選定細胞の隔離、増殖。上記の目的のうちの多くの目的のために、細胞のより大きな母集団を研究することが必要であるかも知れない。細胞フィルタ装置を使用する本方法は、遊離した非結合粒子または他の不特定結合細胞の存在なしに、積極的に選定した標的細胞の増殖を可能とする状態を与えることができる。
【００７０】
上記の第１項から第６項に述べた細胞膜分子のいくつかは、いくつかのタイプの活性化したキラー細胞での免疫療法、あるいは、たとえば免疫毒素での免疫療法のための標的としても使用できる。したがって、このような分子の新しい表出方法での識別は、これらのタイプの治療法を使用しなければならないケースを決定するのにも価値がある。
【００７１】
＜本方法の実際的な用途の例＞
例１．血液または骨髄あるいはこれら両方における癌細胞の早期段階での転移を診断するために、我々は、本方法において、MOC-31、NrLu10、BM2、BM７、12H12、MLuClアンチ癌腫抗体を用いて、乳房、肺臓、結腸直腸、前立腺の癌からの微小転移性症状がこれらの体液において敏感に確認できるかどうかを調べた。これらの抗体による成功した結果は有意な臨床上の関係を持っていた。
【００７２】
例２．多くの細胞膜分子の表出はいくつかのタイプの癌における悪性症状の進行と相関することが示されてきた。したがって、このような分子のそれぞれの抗体への結合を検出することによって、高度な予後の情報を得ることができる。このような抗原としては、多数の粘着性分子、炭水化物抗原、糖脂質、成長因子レセプタおよび以下に示す癌腫マーカーがある。我々は、この新しい方法で、粒子・抗体複合体の、ＣＤ４４変異体、Ｅ-cadherin、ＬｅY、ＣＥＡ、ＥＧＥ−ｒ、トランスフェリン・レセプタ、ＭＵＣ−１エピトープ、ＬＵＢＣＲＵ−Ｇ７エピトープ、前立腺癌抗原、ＵＪ１３Ａエピトープ、２−ミクログロブリン、ＨＬ−Ａ抗原、アポプトシス・レセプタへの結合を識別した。
【００７３】
例３．悪性黒色腫に罹っていると思われる患者から胸膜液２リットルを採取した。遠心分離後、細胞を、１０％ウシ胎児血清を含む２ｍｌのＲＰＭＩに浮遊させ、４℃３０分間、9.2.27アンチ黒色腫抗体（10g/ml）と共にインキュベートし、洗浄した後に再び４℃で３０分間、DynabeadsTMSAMM450/IgG2Aと共にインキュベートした。次に、細胞浮遊液を顕微鏡で検査して表面に常磁性細胞が付着した細胞の割合を測定した。約１０％の細胞が有意数の結合粒子・ロゼットを持っていたので、悪性黒色腫という診断が確認された。
【００７４】
例４．小細胞肺癌または悪性黒色腫のいずれかである臨床的な適応症を持つケースで皮下腫瘍から生検組織を採取した。ただ１つの細胞浮遊液を生検材料から調製してから２つに分け、一方を9.2.27アンチ黒色腫抗体と共にインキュベートし、他方をMOC-31アンチ癌腫抗体と共にインキュベートした（共に、10g/mlであった）。このインキュベートは上記の例出使用したものに類似したものであった。黒色腫抗体と一緒にインキュベートした細胞はいずれもビーズと結合せず、MOC-31と共に培養した腫瘍細胞はすべて陽性であった。
【００７５】
例５．悪性黒色腫を持つと思われる患者からの生検組織を検査するのに、ただ１つの細胞浮遊液を調製し、9.2.27アンチ黒色腫抗体と共にインキュベートし、次いで、上記の作業を行った。細胞の大部分が陽性であり、多数の粒子・ロゼットが細胞膜に付着していた。
例６．乳癌患者からの胸膜液を検査して腫瘍細胞がその中に検出できるかどうかを調べた。１リットルの胸膜液を遠心分離にかけ、細胞を再浮遊させ、個別の小瓶で３種類のアンチ癌腫抗体（MOC-31、2E11 12H12）のそれぞれと共にインキュベートした。先の例と同様の作業完了後、細胞の大部分が３ケースすべてで抗体被覆粒子に結合していることがわかった。
【００７６】
例７．乳癌患者から得た骨髄浮遊液を検査して微小転移腫瘍細胞が存在するかどうかを調べた。単核細胞の調製後、これらを上記の例で使用した同じ３種類のアンチ癌腫抗体と共にインキュベートしたが、このケースでは、抗体が最初にdynabeadsTMSAM IgG常磁性粒子に付着した。これら直接被覆した粒子と共に１回インキュベートした後、細胞浮遊液を顕微鏡で検査した。多数の細胞が陽性であり、多数の粒子・ロゼットが細胞膜に付着していることがわかった。乳房を持つ患者から多数の胸膜液または腹水および骨髄において同様の実験を実施した。
【００７７】
例８．T47Dヒト乳房癌腫細胞をHoechst蛍光染料と共に時間の長さを変えてインキュベートし、標識付け細胞の生存能力をチェックした。次に、種々の数の標識付け乳房癌腫細胞を健康なボランティアから得た１×１０6個の骨髄細胞に加えた。種々の実験において、個別のアンチ癌腫抗体（NrLuIO、MOC31、１２Ｈ１２）で被覆した種々の濃度の常磁性単分散粒子（DynabeadsTMP450）を加えた。氷上で３０分間インキュベートした後、異なった試験官のサンプルを光および蛍光顕微鏡の下で計数室内で検査した。腫瘍細胞／全有核細胞の比率が低いときには、細胞浮遊液に磁界をかけ、細胞と底に付着した粒子を顕微鏡検査の前に隔離した。ここで、細胞混合物内の１腫瘍細胞あたり１−１０個の常磁性ビーズ、という最適比率で、すべての腫瘍細胞の表面に２−１５個のビーズが付着していた。この検出方法の感度は１０4個の有核細胞あたり１個の標的細胞に近かった。正常細胞に或る種の交差反応をするとして知られている抗体を用いての標識付け腫瘍細胞での対照実験において、抗体被覆常磁性粒子でこの交差反応を確認した。腫瘍関連抗体被覆なしのビーズでの実験では、標的細胞のいずれもビーズに結合しなかった。
【００７８】
他の乳癌細胞系と小細胞肺癌細胞系と共に同様に実験を実施した。これらの実験では同様の感度および特定性が得られた。
【００７９】
例９．乳癌患者と卵巣癌腫患者からの胸水、腹水を遠心分離にかけ、例１で用いたと同じ被覆常磁性粒子を添加し、磁界内でインキュベートして濃縮した後に浮遊液を光学顕微鏡で検査した。代表的には、腫瘍細胞の明瞭な形態学的特徴を持った細胞にビーズが付着しており、一方、少数の正常細胞のいずれにも抗体被覆ビーズは付着していなかった。胸水での２つのケースにおいて、独立した形態学的検査はいかなる腫瘍細胞の存在も示さず、一方、抗体被覆ビーズを使用することによって有意数の悪性細胞が検出された。いくつかのケースでは、磁界内で腫瘍細胞を分離し、乳癌細胞を増殖させるために特別に調製した成長液を含む組織培養フラスコに移し、これらの培養から恒久的な細胞系を隔離することを試みた。平行して、悪性滲出液からの細胞を、磁性ビーズと共に積極的な選択なしに直接培養した。後者のケースでは、細胞系はなんら確立されず、一方、積極的に選択した腫瘍細胞を使用したケースのうち５０％より多いケースで、細胞系が成功裡に確立された。
【００８０】
例１０．いくつかのケースで、乳癌患者から採取した骨髄および抹消血液を本方法で検査すべく、抗体被覆常磁性ビーズを加え、４℃で３０分間インキュベートし、磁界内で濃縮し、光学顕微鏡で浮遊液を検査した。両ケースで、骨髄および血液中の０．１−１％の有核細胞を示す、腫瘍細胞への常磁性粒子の結合が検出され、いかなる方法でも細胞は識別し得なかった。
【００８１】
例１１．特定細胞母集団の表面に表れた、或る種の成長因子レセプタまたは他の遺伝子生成物に対する抗体を用いてこれらの細胞を識別し、積極的に選択できる。
【００８２】
本発明によるこの新規な方法で用いられるアンチトランスフェリン・レセプタ抗体で被覆したビーズが示され、これはトランスフェリン・レセプタを表す細胞の識別のための迅速、簡単で敏感な方法を示している。
【００８３】
例１２．種々の理由のために、正常細胞の特定母集団の隔離が正当化される。正常組織あるいは腫瘍組織内の毛細血管あるいは小血管を内張りしている内皮細胞を関連組織から調製した細胞浮遊液から積極的に選択できた。この方法では、内皮細胞上に現れている構造に向けた抗体で被覆したビーズを用いたが、この構造は細胞混合物内の他の正常細胞上には現れなかった。
【００８４】
例１３．免疫免疫欠損齧歯類に注入したヒト細胞が、アンチパン・ヒト抗体で被覆した磁性粒子を用いることによって腫瘍異種移植片および種々のホスト器官／組織から調製した細胞浮遊液内に存在することが示された。
【００８５】
例１４．上述の細胞フィルタ装置を用いて濾過することにより、乳房癌腫患者および黒色腫患者からの腫瘍細胞系を血液細胞または骨髄細胞の混合母集団から分離した。培養液を添加し、次いで培養した後、フィルタ上の選定腫瘍細胞は遊離した非結合粒子または他の不特定結合細胞の存在なしに増殖することができた。
Claims (3)
- 混合細胞母集団の細胞浮遊液内の特定標的細胞を分離して検出する方法であって、
常磁性粒子又は常磁性ビーズを、細胞混合物内の標的細胞上に特に表出し、非標的細胞上に表出しない膜構造に向けた抗体又は抗体フラグメントで被覆する段階、
細胞浮遊液と前記常磁性粒子又は常磁性ビーズに付着した前記抗体又は抗体フラグメントとの混合物を５分間から２時間の間、０℃から２５℃の温度で穏やかな回転のもとでインキュベートする段階、
細胞浮遊液内の細胞粒子複合体を視覚化する段階、
細胞浮遊液を規則正しい一貫した形状・寸法の孔を持つナイロンモノフィラメント膜からなるフィルターで濾過して細胞粒子複合体のみを取る段階、および、
細胞粒子複合体を検査し計数する段階、からなる方法。 - 抗体又は抗体フラグメントで被覆された前記常磁性粒子又は常磁性ビーズがマイルドな洗剤で予めインキュベートされることを特徴とする請求項１記載の方法。
- 濾過によって単離される細胞粒子複合体がさらに、生物学的に、生化学的に、または免疫学的に分析されることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO940866A NO180658C (no) | 1994-03-10 | 1994-03-10 | Fremgangsmåte og anordning for deteksjon av spesifikke målceller i spesialiserte eller blandede cellepopulasjoner og opplösninger som inneholder blandede cellepopulasjoner |
| NO940866 | 1994-03-10 | ||
| PCT/NO1995/000052 WO1995024648A1 (en) | 1994-03-10 | 1995-03-10 | Method and device for detection of specific target cells in specialized or mixed cell populations and solutions containing mixed cell populations |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09510779A JPH09510779A (ja) | 1997-10-28 |
| JP4071824B2 true JP4071824B2 (ja) | 2008-04-02 |
Family
ID=19896917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52338595A Expired - Lifetime JP4071824B2 (ja) | 1994-03-10 | 1995-03-10 | 混合細胞母集団の細胞浮遊液内の特定標的細胞を分離して検出する方法 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6265229B1 (ja) |
| EP (1) | EP0749580B2 (ja) |
| JP (1) | JP4071824B2 (ja) |
| AT (1) | ATE191973T1 (ja) |
| AU (1) | AU690244B2 (ja) |
| CA (1) | CA2185128C (ja) |
| CZ (1) | CZ265296A3 (ja) |
| DE (1) | DE69516401T3 (ja) |
| DK (1) | DK0749580T3 (ja) |
| ES (1) | ES2147607T3 (ja) |
| FI (1) | FI963533A (ja) |
| GR (1) | GR3033946T3 (ja) |
| HU (1) | HU221278B1 (ja) |
| NO (1) | NO180658C (ja) |
| PL (1) | PL177483B1 (ja) |
| PT (1) | PT749580E (ja) |
| SK (1) | SK115196A3 (ja) |
| WO (1) | WO1995024648A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9034279B2 (en) | 2012-12-06 | 2015-05-19 | Samsung Electro-Mechanics Co., Ltd. | Bio-chip |
Families Citing this family (74)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994007138A1 (en) | 1992-09-14 | 1994-03-31 | Fodstad Oystein | Detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations |
| NO180658C (no) | 1994-03-10 | 1997-05-21 | Oeystein Fodstad | Fremgangsmåte og anordning for deteksjon av spesifikke målceller i spesialiserte eller blandede cellepopulasjoner og opplösninger som inneholder blandede cellepopulasjoner |
| NO180167C (no) | 1994-09-08 | 1997-02-26 | Photocure As | Fotokjemisk fremgangsmåte til å innföre molekyler i cellers cytosol |
| US6190870B1 (en) * | 1995-08-28 | 2001-02-20 | Amcell Corporation | Efficient enrichment and detection of disseminated tumor cells |
| NO961031D0 (no) | 1996-03-13 | 1996-03-13 | Det Norske Radiumshospital Tum | Fremgangsmåte til å drepe uönskede målceller |
| NO961221D0 (no) * | 1996-03-26 | 1996-03-26 | Oeystein Fodstad | Fremgangsmåte til å identifisere nye gener assosiert med setepreferert cancer mestastasedannelse |
| DE19706617C1 (de) * | 1997-02-20 | 1998-04-30 | Mueller Ruchholtz Wolfgang Pro | Verfahren zur Zählung mikroskopischer Objekte |
| DE19725894A1 (de) * | 1997-06-19 | 1998-12-24 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Differentielle Vakuumkammer |
| US5985658A (en) * | 1997-11-14 | 1999-11-16 | Health Research Incorporated | Calmodulin-based cell separation technique |
| BR9907852A (pt) | 1998-02-12 | 2000-10-24 | Immunivest Corp | Processos para detectar e enumerar células raras e cancerosas em uma população celular mista, para diagnosticar câncer de estágio precoce em um paciente de teste, para determinar a probabilidade de recorrência de câncer em um paciente humano anteriormente tratado de câncer, para distinguir um carcinoma confinado ao órgão de um carcinoma com propriedades metastáticas, para acompanhar a situação de remissão em um paciente humano com câncer que passa pelo tratamento de terapia contra o câncer e para aumentar quantidades de células epiteliais circulantes em uma amostra de sangue, partìcula magnética revestida, composição, conjuntos de teste para avaliar uma amostra de paciente quanto a presença de células raras circulantes, quanto a presença de células de tumor circulantes, quanto a presença de células de câncer de mama circulantes, quanto a presença de células de câncer de próstata circulantes, quanto a presença de células de câncer de cólon circulantes, quanto a presença de células de câncer de bexiga circulantes e para monitorar um paciente quanto a recorrência de câncer, e, fração de sangue periférico enriquecido quanto a células neoplásticas circulantes |
| US6277588B1 (en) * | 1998-05-01 | 2001-08-21 | Tel Aviv University | Screening of cell populations |
| DE19833738A1 (de) * | 1998-07-27 | 2000-02-03 | Michael Giesing | Verfahren zur Isolierung von Krebszellen aus zellhaltigen Körperflüssigkeiten sowie Sets zur Durchführung dieses Verfahrens |
| FR2782730B1 (fr) * | 1998-08-25 | 2002-05-17 | Biocom Sa | Procede de separation cellulaire pour l'isolation de cellules pathogeniques, notamment cancereuses rares, equipement et reactif pour la mise en oeuvre du procede et application du procede |
| WO2000067021A1 (en) * | 1999-05-04 | 2000-11-09 | Pankowsky Dan A | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells |
| US6828157B1 (en) | 1999-05-04 | 2004-12-07 | Dan A. Pankowsky | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells |
| US6682940B2 (en) | 1999-05-04 | 2004-01-27 | Dan A. Pankowsky | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells |
| US6692702B1 (en) * | 2000-07-07 | 2004-02-17 | Coulter International Corp. | Apparatus for biological sample preparation and analysis |
| US6913697B2 (en) | 2001-02-14 | 2005-07-05 | Science & Technology Corporation @ Unm | Nanostructured separation and analysis devices for biological membranes |
| US6656587B2 (en) * | 2001-05-02 | 2003-12-02 | Phillips Plastics Corporation | Composite particles |
| US7863012B2 (en) * | 2004-02-17 | 2011-01-04 | Veridex, Llc | Analysis of circulating tumor cells, fragments, and debris |
| US8986944B2 (en) | 2001-10-11 | 2015-03-24 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for separating rare cells from fluid samples |
| US8980568B2 (en) | 2001-10-11 | 2015-03-17 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for detecting non-hematopoietic cells from a blood sample |
| WO2003066191A1 (en) * | 2002-02-04 | 2003-08-14 | Colorado School Of Mines | Laminar flow-based separations of colloidal and cellular particles |
| WO2003071252A2 (en) | 2002-02-15 | 2003-08-28 | Exact Sciences Corporation | Methods for analysis of molecular events |
| US7745180B2 (en) * | 2002-04-24 | 2010-06-29 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | Device and method for high-throughput quantification of mRNA from whole blood |
| WO2003091407A2 (en) * | 2002-04-24 | 2003-11-06 | Hitachi Chemical Research Center, Inc. | Device and method for high-throughput quantification of mrna from whole blood |
| EP2359689B1 (en) | 2002-09-27 | 2015-08-26 | The General Hospital Corporation | Microfluidic device for cell separation and use thereof |
| WO2004042401A1 (ja) * | 2002-11-08 | 2004-05-21 | Hiroshi Takahashi | 癌細胞の検査方法及びそのための試薬 |
| WO2004075855A2 (en) | 2003-02-26 | 2004-09-10 | Biomed Solutions, Llc | Process for in vivo treatment of specific biological targets in bodily fluid |
| CA2522700A1 (en) * | 2003-04-18 | 2004-11-04 | Cytovia, Inc. | Methods of treating diseases responsive to induction of apoptosis and screening assays |
| EP1668160B1 (en) * | 2003-09-12 | 2010-04-28 | BioControl Systems, Inc. | Methods, compositions, and kits for the concentration and detection of microorganisms |
| US20050181353A1 (en) * | 2004-02-17 | 2005-08-18 | Rao Galla C. | Stabilization of cells and biological specimens for analysis |
| CN101142314A (zh) * | 2004-03-03 | 2008-03-12 | 综合医院公司 | 用于微流体环境中的细胞和生物分子分离的磁力装置 |
| US20080241827A1 (en) * | 2004-05-10 | 2008-10-02 | Exact Sciences Corporation | Methods For Detecting A Mutant Nucleic Acid |
| US7981607B2 (en) * | 2004-08-27 | 2011-07-19 | Esoterix Genetic Laboratories LLC | Method for detecting recombinant event |
| US9109256B2 (en) | 2004-10-27 | 2015-08-18 | Esoterix Genetic Laboratories, Llc | Method for monitoring disease progression or recurrence |
| US20060171846A1 (en) * | 2005-01-10 | 2006-08-03 | Marr David W M | Microfluidic systems incorporating integrated optical waveguides |
| US20070196820A1 (en) | 2005-04-05 | 2007-08-23 | Ravi Kapur | Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles |
| US20060223178A1 (en) * | 2005-04-05 | 2006-10-05 | Tom Barber | Devices and methods for magnetic enrichment of cells and other particles |
| WO2007044071A2 (en) * | 2005-04-21 | 2007-04-19 | Exact Sciences Corporation | Analysis of heterogeneous nucleic acid samples |
| US8921102B2 (en) | 2005-07-29 | 2014-12-30 | Gpb Scientific, Llc | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
| US9878326B2 (en) * | 2007-09-26 | 2018-01-30 | Colorado School Of Mines | Fiber-focused diode-bar optical trapping for microfluidic manipulation |
| US9487812B2 (en) | 2012-02-17 | 2016-11-08 | Colorado School Of Mines | Optical alignment deformation spectroscopy |
| US8119976B2 (en) * | 2007-07-03 | 2012-02-21 | Colorado School Of Mines | Optical-based cell deformability |
| US9885644B2 (en) | 2006-01-10 | 2018-02-06 | Colorado School Of Mines | Dynamic viscoelasticity as a rapid single-cell biomarker |
| US20080070792A1 (en) | 2006-06-14 | 2008-03-20 | Roland Stoughton | Use of highly parallel snp genotyping for fetal diagnosis |
| US20080050739A1 (en) | 2006-06-14 | 2008-02-28 | Roland Stoughton | Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats |
| US8137912B2 (en) | 2006-06-14 | 2012-03-20 | The General Hospital Corporation | Methods for the diagnosis of fetal abnormalities |
| US8372584B2 (en) | 2006-06-14 | 2013-02-12 | The General Hospital Corporation | Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags |
| WO2008008515A2 (en) * | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for detecting rare cells from a biological sample |
| US7955867B2 (en) | 2007-01-31 | 2011-06-07 | Millipore Corporation | High throughput cell-based assays, methods of use and kits |
| WO2008130910A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Wellstat Biologics Corporation | Detection her-2/neu protein from non-isolated circulating cancer cells and treatment |
| KR100926485B1 (ko) | 2007-07-27 | 2009-11-12 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 정량 관찰이 용이한 면역조직화학 염색 방법 |
| US10722250B2 (en) | 2007-09-04 | 2020-07-28 | Colorado School Of Mines | Magnetic-field driven colloidal microbots, methods for forming and using the same |
| US20090062828A1 (en) * | 2007-09-04 | 2009-03-05 | Colorado School Of Mines | Magnetic field-based colloidal atherectomy |
| JP2011509405A (ja) * | 2008-01-07 | 2011-03-24 | ルミネックス コーポレーション | 生物学的標的の免疫磁気捕捉および撮像の方法 |
| JP5550182B2 (ja) * | 2008-01-07 | 2014-07-16 | ルミネックス コーポレーション | 複合試料マトリクスからの細胞の単離および計数の方法 |
| US7927561B2 (en) * | 2008-01-10 | 2011-04-19 | Becton, Dickinson And Company | Rapid particle detection assay |
| ES2620012T3 (es) | 2008-09-20 | 2017-06-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Diagnóstico no invasivo de la aneuploidia fetal por secuenciación |
| WO2010078404A1 (en) * | 2008-12-31 | 2010-07-08 | 3M Innovative Properties Company | Methods, kits and systems for processing samples |
| US9128082B2 (en) * | 2009-03-24 | 2015-09-08 | Biocept, Inc. | Devices and methods of cell capture and analysis |
| DE102010001322A1 (de) * | 2010-01-28 | 2011-08-18 | Siemens Aktiengesellschaft, 80333 | Anordnung und Verfahren zur Filtration einer Flüssigkeit und Verwendung in der Mikroskopie |
| EP2363501A1 (en) * | 2010-03-02 | 2011-09-07 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf | Method for isolating target cells |
| MX345017B (es) | 2011-02-16 | 2017-01-13 | The Government Of The Us Secretary Dept Of Health And Human Services Centers For Disease Control And | Metodos y aparatos para la vigilancia y el control de los vectores de insecto. |
| MX2013009532A (es) * | 2011-02-16 | 2014-10-01 | Gov T Of The Usa As Rep By The Sec Y Dept Of Hlth And Hum N Srvcs Ctrs For Disease Ctrl & Prvn | Deteccion del biomarcador objetivo, analisis de diagnostico de la fiebre por dengue y diferenciacion de la fiebre hemorragica por dengue. |
| JP2014521958A (ja) * | 2011-07-28 | 2014-08-28 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | 胸腔内液若しくは漿液と関連する腫瘍細胞の特徴づけによる癌の診断方法 |
| EP2996789B1 (en) | 2013-05-17 | 2019-07-17 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Particle release and collection |
| CN104492595B (zh) * | 2014-12-18 | 2017-08-01 | 佛山市赛科科技股份有限公司 | 一种介质盒及具有该介质盒的除铁装置 |
| GB201703383D0 (en) | 2017-03-02 | 2017-04-19 | Gargle Tech Ltd | Testing for particulates |
| CN108165479A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-06-15 | 王辉 | 一种用于检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒 |
| CN110850067B (zh) * | 2018-08-21 | 2023-08-15 | 上海恒润达生生物科技股份有限公司 | 嵌合抗原受体亲和力检测方法 |
| US11680877B2 (en) | 2018-09-05 | 2023-06-20 | Hero Scientific Ltd. | Testing for particulates |
| WO2022149135A2 (en) | 2021-01-06 | 2022-07-14 | Hero Scientific Ltd. | Filtration sampling devices |
| WO2023133566A1 (en) * | 2022-01-07 | 2023-07-13 | The Regents Of The University Of California | Systems and methods for particle mapping |
Family Cites Families (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4219411A (en) | 1978-09-18 | 1980-08-26 | California Institute Of Technology | Cell sorting apparatus |
| US4230685A (en) | 1979-02-28 | 1980-10-28 | Northwestern University | Method of magnetic separation of cells and the like, and microspheres for use therein |
| US4510244A (en) | 1980-04-17 | 1985-04-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Cell labeling with antigen-coupled microspheres |
| AU563827B2 (en) | 1982-07-01 | 1987-07-23 | Millipore Corp. | Filtration apparatus |
| US4659678A (en) | 1982-09-29 | 1987-04-21 | Serono Diagnostics Limited | Immunoassay of antigens |
| US4925922A (en) | 1983-02-22 | 1990-05-15 | Xoma Corporation | Potentiation of cytotoxic conjugates |
| US4664911A (en) | 1983-06-21 | 1987-05-12 | Board Of Regents, University Of Texas System | Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties |
| US4704255A (en) | 1983-07-15 | 1987-11-03 | Pandex Laboratories, Inc. | Assay cartridge |
| US4920061A (en) | 1984-03-02 | 1990-04-24 | The University Of Texas System | Biological magnetic colloids |
| US4752569A (en) | 1984-06-21 | 1988-06-21 | The Regents Of The University Of California | Sialylated Lewisx epitope, antibodies and diagnosis |
| US5019497A (en) | 1984-11-09 | 1991-05-28 | Lennart Olsson | Human squamous lung carcinoma cell specific antigens and antibodies |
| US4710472A (en) | 1985-09-25 | 1987-12-01 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Magnetic separation device |
| US5076950A (en) * | 1985-12-20 | 1991-12-31 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Magnetic composition for particle separation |
| EP0241042A3 (en) | 1986-04-11 | 1988-05-04 | Hitachi, Ltd. | A method for cell analysis |
| EP0256471A3 (en) | 1986-08-15 | 1989-10-25 | Xoma Corporation | Cytotoxic conjugates for cancer therapy |
| US4895706A (en) * | 1986-10-28 | 1990-01-23 | Costar Corporation | Multi-well filter strip and composite assemblies |
| US4857452A (en) | 1986-12-04 | 1989-08-15 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Assay for carcinoma of breast, colon and ovary |
| WO1988005309A1 (en) | 1987-01-27 | 1988-07-28 | Xoma Corporation | Potentiation of cytotoxic conjugates |
| US4847199A (en) † | 1987-02-27 | 1989-07-11 | Eastman Kodak Company | Agglutination immunoassay and kit for determination of a multivalent immune species using a buffered salt wash solution |
| JPH07104349B2 (ja) | 1987-04-11 | 1995-11-13 | 株式会社日立製作所 | 細胞測定法 |
| US5194300A (en) | 1987-07-15 | 1993-03-16 | Cheung Sau W | Methods of making fluorescent microspheres |
| US5322678A (en) | 1988-02-17 | 1994-06-21 | Neorx Corporation | Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification |
| US5256532A (en) * | 1988-05-02 | 1993-10-26 | Zynaxis Technologies, Inc. | Methods, reagents and test kits for determination of subpopulations of biological entities |
| FR2638848B1 (fr) | 1988-11-04 | 1993-01-22 | Chemunex Sa | Procede de detection et/ou de dosage dans un milieu liquide ou semi-liquide d'au moins une substance organique, biologique ou medicamenteuse soluble, par une methode d'agglutination |
| FR2638849B1 (fr) | 1988-11-04 | 1994-03-18 | Chemunex Sa | Procede d'amplification d'un signal fluorescent pour la recherche specifique de la presence eventuelle de particules et application a la detection et a la numeration desdites particules |
| DE68919715T2 (de) | 1988-12-28 | 1995-04-06 | Stefan Miltenyi | Verfahren sowie materialien zur hochgraduierten magnetischen abspaltung biologischer materialien. |
| GB8905001D0 (en) * | 1989-03-04 | 1989-04-19 | Univ Leicester | Screening for natural products of microbial metabolism |
| WO1990010692A1 (en) | 1989-03-15 | 1990-09-20 | University Of Florida | Monoclonal antibody for use in detection and treatment of childhood leukemia |
| US5081030A (en) | 1989-04-25 | 1992-01-14 | The Johns Hopkins University | Release of cells from affinity matrices |
| DE3919873A1 (de) * | 1989-06-19 | 1990-12-20 | Behringwerke Ag | Magnetische protein-konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| DE3919923A1 (de) | 1989-06-19 | 1990-12-20 | Behringwerke Ag | Magnetische protein-konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| GB8916859D0 (en) * | 1989-07-24 | 1989-09-06 | Dynal As | Hapten linking |
| ATE196477T1 (de) | 1989-12-14 | 2000-10-15 | Sloan Kettering Inst Cancer | Therapeutische verwendungen der hypervariablen region des monoklonalen antikörpers m195 und konstrukte davon |
| GB8929297D0 (en) * | 1989-12-29 | 1990-02-28 | Dynal As | Method of separation |
| GB9007966D0 (en) | 1990-04-09 | 1990-06-06 | Dynal As | Antigen/anti-antigen cleavage |
| US5200084A (en) * | 1990-09-26 | 1993-04-06 | Immunicon Corporation | Apparatus and methods for magnetic separation |
| US5340719A (en) | 1990-11-23 | 1994-08-23 | Corporation Coulter | Method and apparatus for optically screening microscopic cells |
| JPH05107249A (ja) | 1991-02-04 | 1993-04-27 | Toyobo Co Ltd | リガンド・レセプター反応の高感度検出法 |
| US5491068A (en) * | 1991-02-14 | 1996-02-13 | Vicam, L.P. | Assay method for detecting the presence of bacteria |
| AU2115092A (en) | 1991-10-08 | 1993-04-22 | Eastman Kodak Company | Method, test device and kit for assay of specific binding ligand using controlled flow through filtration membrane |
| US5290707A (en) | 1991-11-25 | 1994-03-01 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Method for detection of microorganisms |
| US5256542A (en) | 1992-03-09 | 1993-10-26 | Tanox Biosystems, Inc. | Selecting low frequency antigen-specific single B lymphocytes with correction for background noise |
| BR9306104A (pt) * | 1992-03-20 | 1997-11-18 | Celsis Ltd | Método para analisar material em uma amostra líquida dispositivo adaptado para o uso em um método para analisar o material em uma amostra líquida e dispositivo integral |
| US5422277A (en) | 1992-03-27 | 1995-06-06 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Cell fixative composition and method of staining cells without destroying the cell surface |
| CA2141428A1 (en) | 1992-07-28 | 1994-02-03 | Steven Kessler | Methods for positive immunoselection of stem cells |
| WO1994007138A1 (en) | 1992-09-14 | 1994-03-31 | Fodstad Oystein | Detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations |
| ES2123063T3 (es) | 1992-09-14 | 1999-01-01 | Stanford Res Inst Int | Marcadores convertidores al alza para ensayos biologicos y otros mediante tecnicas de excitacion laser. |
| FR2700010B1 (fr) * | 1992-12-24 | 1995-03-17 | Rocher Yves Biolog Vegetale | Méthode et dispositif pour tester la réactivité de cellules à l'égard de produits. |
| US5374531A (en) * | 1993-03-22 | 1994-12-20 | Zynaxis, Inc. | Immunoassay for determination of cells |
| US5514340A (en) * | 1994-01-24 | 1996-05-07 | Magnetix Biotechnology, Inc. | Device for separating magnetically labelled cells |
| NO180658C (no) | 1994-03-10 | 1997-05-21 | Oeystein Fodstad | Fremgangsmåte og anordning for deteksjon av spesifikke målceller i spesialiserte eller blandede cellepopulasjoner og opplösninger som inneholder blandede cellepopulasjoner |
| US5968753A (en) | 1994-06-14 | 1999-10-19 | Nexell Therapeutics, Inc. | Positive and positive/negative cell selection mediated by peptide release |
| AUPN214095A0 (en) | 1995-04-03 | 1995-04-27 | Australian Water Technologies Pty Ltd | Method for detecting microorganisms using flow cytometry |
-
1994
- 1994-03-10 NO NO940866A patent/NO180658C/no not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-10 AU AU20864/95A patent/AU690244B2/en not_active Ceased
- 1995-03-10 PL PL95316209A patent/PL177483B1/pl unknown
- 1995-03-10 EP EP95913431A patent/EP0749580B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-10 CZ CZ962652A patent/CZ265296A3/cs unknown
- 1995-03-10 JP JP52338595A patent/JP4071824B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-10 US US08/704,619 patent/US6265229B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-10 DK DK95913431T patent/DK0749580T3/da active
- 1995-03-10 WO PCT/NO1995/000052 patent/WO1995024648A1/en not_active Application Discontinuation
- 1995-03-10 DE DE69516401T patent/DE69516401T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-10 CA CA002185128A patent/CA2185128C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-10 PT PT95913431T patent/PT749580E/pt unknown
- 1995-03-10 HU HU9602432A patent/HU221278B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-03-10 AT AT95913431T patent/ATE191973T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-03-10 ES ES95913431T patent/ES2147607T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-10 SK SK1151-96A patent/SK115196A3/sk unknown
-
1996
- 1996-09-09 FI FI963533A patent/FI963533A/fi unknown
-
2000
- 2000-07-12 GR GR20000401631T patent/GR3033946T3/el not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9034279B2 (en) | 2012-12-06 | 2015-05-19 | Samsung Electro-Mechanics Co., Ltd. | Bio-chip |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE191973T1 (de) | 2000-05-15 |
| CZ265296A3 (en) | 1997-10-15 |
| GR3033946T3 (en) | 2000-11-30 |
| JPH09510779A (ja) | 1997-10-28 |
| AU690244B2 (en) | 1998-04-23 |
| DK0749580T3 (da) | 2000-10-23 |
| AU2086495A (en) | 1995-09-25 |
| FI963533A (fi) | 1996-11-07 |
| CA2185128C (en) | 2009-01-13 |
| PL177483B1 (pl) | 1999-11-30 |
| EP0749580A1 (en) | 1996-12-27 |
| PT749580E (pt) | 2000-10-31 |
| DE69516401D1 (de) | 2000-05-25 |
| FI963533A0 (fi) | 1996-09-09 |
| EP0749580B2 (en) | 2005-07-27 |
| NO940866L (no) | 1995-09-11 |
| US6265229B1 (en) | 2001-07-24 |
| WO1995024648A1 (en) | 1995-09-14 |
| ES2147607T3 (es) | 2000-09-16 |
| PL316209A1 (en) | 1996-12-23 |
| HU221278B1 (en) | 2002-09-28 |
| EP0749580B1 (en) | 2000-04-19 |
| NO940866D0 (no) | 1994-03-10 |
| DE69516401T2 (de) | 2001-01-04 |
| CA2185128A1 (en) | 1995-09-14 |
| NO180658C (no) | 1997-05-21 |
| NO180658B (no) | 1997-02-10 |
| HU9602432D0 (en) | 1996-11-28 |
| HUT75370A (en) | 1997-05-28 |
| SK115196A3 (en) | 1997-06-04 |
| DE69516401T3 (de) | 2006-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4071824B2 (ja) | 混合細胞母集団の細胞浮遊液内の特定標的細胞を分離して検出する方法 | |
| JP3417563B2 (ja) | 特殊細胞集団もしくは混合細胞集団および混合細胞集団を含有する溶液中の特異標的細胞の検出方法 | |
| US7364906B2 (en) | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells | |
| US7560226B2 (en) | Assay to detect a binding partner | |
| US7537907B2 (en) | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells | |
| JP4590109B2 (ja) | 細胞の単一パラメータ及び複数パラメーター表現型解析のための生成物と方法 | |
| US20210063385A1 (en) | Composition, method and kit for pathology |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040420 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20061120 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20061221 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070111 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061221 |
|
| A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20070219 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070220 |
|
| A59 | Written plea |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A59 Effective date: 20070403 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071030 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071116 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20071031 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080118 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110125 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120125 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130125 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140125 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |