MX2013009532A

MX2013009532A - Deteccion del biomarcador objetivo, analisis de diagnostico de la fiebre por dengue y diferenciacion de la fiebre hemorragica por dengue.

Info

Publication number: MX2013009532A
Application number: MX2013009532A
Authority: MX
Inventors: Elisabeth Hunsperger; Momar Ndao; Kay Tomashek; B Katherine Poole-Smith
Original assignee: Gov T Of The Usa As Rep By The Sec Y Dept Of Hlth And Hum N Srvcs Ctrs For Disease Ctrl & Prvn
Priority date: 2011-02-16
Filing date: 2012-02-16
Publication date: 2014-10-01
Also published as: AU2012327215A1; US20150233921A1; WO2013130029A1

Abstract

Se describe la vitronectina que se descubrió como un biomarcador del progreso de la fiebre por dengue a la fiebre hemorrágica por dengue de acuerdo con la presente invención. El análisis de la vitronectina en las muestras biológicas de los sujetos infectados con el virus del dengue ayuda al pronóstico, a al diagnóstico, y al tratamiento de la enfermedad, particularmente en la predicción del progreso de la fiebre por dengue al dengue severo, es decir, la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue.

Description

DETECCIÓN DEL BIOM ARCADOR OBJETIVO, ANALISIS DE DIAGNÓSTICO DE LA FIEBRE POR DENGUE Y DIFERENCIACIÓN DE LA FIEBRE HEMORRAGICA POR DENGUE Referencia a la Solicitud Relacionada Esta solicitud reclama la prioridad al Número de Serie de Solicitud de Patente Norteamericana Provisional 61/443,554, presentada el 16 de febrero de 2011, cuyo contenido completo se incorpora en la presente por referencia.

Interés Gubernamental La invención descrita en la presente puede ser manufacturada, usada, y autorizada por o para el Gobierno de los Estados Unidos de Norteamérica.

Campo de la Invención La invención se refiere generalmente a los diagnósticos de enfermedad, y en particular a los métodos para determinar la severidad de la infección de la fiebre por dengue en un paciente, la diferenciación de la fiebre por dengue y de la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue, y a la selección de los terapéuticos para la fiebre por dengue.

Antecedentes de la Invención El virus del dengue es un virus de la familia Flaviviridae, género Flavivirus. Se conocen cuatro serotipos, DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENY-4.

El desarrollo clínico de la infección por virus del dengue se puede describir como qge tiene varias fases, esquemáticamente mostradas en la figura 1. Una fase de incubación que comienza después de una picadura por un mosquito que alberga el virus del dengue y dura de tres a catorce días, comúnmente de cuatro a siete días. Seguido de la fase de incubación, la viremia ocurre y el virus del dengue entra en la circulación sanguínea desde el sitio de infección. Durante la viremia, una fase febril aguda ocurre, que dura de dos a siete días, comúnmente de tres a cinco días. La fase febril aguda es seguida por la fase crítica, también denominada fase afebril, que dura uno a tres días, comúnmente aproximadamente dos días. El paciente se recuperará u, ocasionalmente, progresará a la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue.

La progresión de la fiebre por dengue a la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue es imprevisible. Se reconoce que, siguiendo una primera infección con el virus del dengue, la infección con un segundo, un tercero o un cuarto serotipos del virus del dengue es un factor de riesgo para el desarrollo de la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue. Actualmente, existe una escasez de marcadores para la progresión de la fiebre por dengue a la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue. Frecuentemente, un paciente con fiebre por dengue se enviará a casa con instrucciones de volver a la clínica o al hospital si ocurren síntomas de la fiebre hemorrágica por dengue, a menudo con consecuencias desafortunadas. En vista de la gravedad y la naturaleza letal de la fiebre hemorrágica por dengue, un biomarcador de progresión de la fiebre por dengue a la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue se requiere para ayudar en el pronóstico, la diagnosis y el tratamiento de la enfermedad.

Breve Descripción de la Invención Se proporcionan procesos de acuerdo con los aspectos de la presente invención para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano que incluye la obtención de una muestra biológica del sujeto humano; y la cuantificación de vitronectina en la muestra, donde la cantidad de vitronectina presente en la muestra es indicativa de la severidad de la infección por virus del dengue en el sujeto humano.

Se proporcionan procesos de acuerdo con los aspectos de la presente invención para evaluar una enfermedad febril en un sujeto humano que incluye la obtención de un suero, un plasma o una muestra de sangre entera del sujeto humano; la cuantificación de vitronectina en la muestra para determinar el nivel de vitronectina en la muestra; y la comparación del nivel de vitronectina con un estándar o un control para diferenciar la fiebre por dengue u otra enfermedad febril del dengue severa, es decir, la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue.

Se proporcionan procesos de acuerdo con los aspectos de la presente invención para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano que incluye la obtención de una muestra biológica del sujeto humano; y la cgantificación de vitronectina mediante el inmunoensayo y/o la espectrometría de masa.

Se proporcionan procesos de acuerdo con los aspectos de la presente invención para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano que incluye la obtención de una muestra biológica del sujeto humano; y la cuantificación de vitronectina en la muestra, donde la cantidad de vitronectina presente en la muestra es indicativa de la severidad de la infección por virus del dengue en el sujeto humano, donde la muestra biológica es sangre entera, plasma o suero.

Se proporcionan procesos de acuerdo con los aspectos de la presente invención para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano que incluye la obtención de una muestra biológica del sujeto humano; la vitronectina de purificación a partir de la muestra biológica para producir una muestra purificada; y la cuantificación de vitronectina en la muestra purificada, donde la cantidad de vitronectina presente en la muestra purificada es indicativa de la severidad de la infección por virus del dengue en el sujeto humano, donde la muestra biológica es sangre entera, plasma o suero.

Se proporcionan los procesos de acuerdo con los aspectos de la presente invención para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano que incluye la obtención de una muestra biológica del sujeto humano; y la cuantificación de vitronectina mediante ELISA o un ensayo de captura del antígeno.

Se proporcionan los procesos de acuerdo con los aspectos de la presente invención para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano que incluye la obtención de una muestra biológica del sujeto humano; y la cuantificación de vitronectina mediante ensayo de flujo lateral.

Se proporcionan los procesos para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen la obtención de una primera muestra biológica del sujeto humano en un primer momento durante la fase febril aguda de la infección por virus del dengue; la obtención de una segunda muestra biológica del sujeto humano en un segundo momento después del primer momento durante la fase febril aguda o la fase crítica de la infección por virus del dengue; la cuantificación de vitronectina en la primera muestra biológica para obtener un primer nivel de vitronectina; la cuantificación de vitronectina en la segunda muestra biológica para obtener un segundo nivel de la vitronectina; y la comparación del primer nivel de la vitronectina y del segundo nivel de la vitronectina para evaluar la infección por virus del dengue en el sujeto humano, donde una disminución en el segundo nivel de la vitronectina comparado al primer nivel de la vitronectina indica que la infección por virus del dengue está progresando de la fiebre por dengue a la fiebre hemorrágica por dengue.

Se proporcionan los procesos para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen la obtención de una primera muestra biológica del sujeto humano en un primer momento durante la fase febril aguda de la infección por virus del dengue; la obtención de una segunda muestra biológica del sujeto humano en un segundo momento después de la primera vez durante la fase febril aguda o la fase crítica de la infección por virus del dengue; la cuantificación de vitronectina en la primera muestra biológica mediante inmunoensayo y/o espectrometría de masa para obtener un primer nivel de la vitronectina; la cuantificación de vitronectina en la segunda muestra biológica mediante inmunoensayo y/o espectrometría de masa para obtener un segundo nivel de la vitronectina; y la comparación del primer nivel de la vitronectina y el segundo nivel de la vitronectina para evaluar la infección por virus del dengue en el sujeto humano, donde una disminución en el segundo nivel de la vitronectina comparado al primer nivel de la vitronectina indica que la infección por virus del dengue está progresando de la fiebre por dengue a la fiebre hemorrágica por dengue.

Se proporcionan los procesos para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen la obtención de una primera muestra de sangre entera, de plasma o de suero del sujeto humano en un primer momento durante la fase febril aguda de infección por virus del dengue; la obtención de una segunda muestra de sangre entera, de plasma o de suero del sujeto humano en un segundo momento después del primer momento durante la fase febril aguda o la fase crítica de infección por virus del dengue; la cuantificación de vitronectina en la primera muestra de sangre entera, de plasma o de suero para obtener un primer nivel de la vitronectina; la cuantificación de vitronectina en la segunda muestra de sangre entera, de plasma o de suero para obtener un segundo nivel de la vitronectina; y la comparación del primer nivel de la vitronectina y el segundo nivel de la vitronectina para evaluar la infección por virus del dengue en el sujeto humano, donde una disminución en el segundo nivel de la vitronectina comparado al primer nivel de la vitronectina indica que la infección por virus del dengue está progresando de la fiebre por dengue a la fiebre hemorrágica por dengue.

Se proporcionan los procesos para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen la obtención de una primera muestra de sangre entera, de plasma o de suero del sujeto humano en un primer momento durante la fase febril aguda de infección por virus del dengue; la obtención de una segunda muestra de sangre entera, de plasma o de suero del sujeto humano en un segundo momento después del primer momento durante la fase febril aguda o la fase crítica de infección por virus del dengue; la purificación de la vitronectina a partir de la primera muestra para obtener una primera muestra purificada; la purificación de la vitronectina a partir de la segunda muestra para obtener una segunda muestra purificada; la cuantificación de vitronectina en la primera muestra purificada para obtener un primer nivel de la vitronectina; la cuantificación de vitronectina en la segunda muestra purificada para obtener un segundo nivel de la vitronectina; y la comparación del primer nivel de la vitronectina y el segundo nivel de la vitronectina para evaluar la infección por virus del dengue en el sujeto humano, donde una disminución en el segundo nivel de la vitronectina comparado al primer nivel de la vitronectina indica que la infección por virus del dengue está progresando de la fiebre por dengue a la fiebre hemorrágica por dengue.

Se proporcionan los procesos para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen la obtención de una primera muestra de sangre entera, de plasma o de suero del sujeto humano en un primer momento durante la fase febril aguda de infección por virus del dengue; la obtención de una segunda muestra de sangre entera, de plasma o de suero del sujeto humano en un segundo momento después del primer momento durante la fase febril aguda o la fase crítica de infección por virus del dengue; la cuantificación de vitronectina en la primera muestra de sangre entera, de plasma o de suero mediante inmunoensayo y/o espectrometría de masa para obtener un primer nivel de la vitronectina; la cuantificación de vitronectina en la segunda muestra de sangre entera, de plasma o de suero mediante inmunoensayo y/o espectrometría de masa para obtener un segundo nivel de la vitronectina; y la comparación del primer nivel de la vitronectina y el segundo nivel de la vitronectina para evaluar la infección por virus del dengue en el sujeto humano, donde una disminución en el segundo nivel de la vitronectina comparado al primer nivel de la vitronectina indica que la infección por virus del dengue está progresando de la fiebre por dengue a la fiebre hemorrágica por dengue.

Se proporcionan los procesos para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen la obtención de una primera muestra de sangre entera, de plasma o de suero del sujeto humano en un primer momento durante la fase febril aguda de infección por virus del dengue; la obtención de una segunda muestra de sangre entera, de plasma o de suero del sujeto humano en un segundo momento después del primer momento durante la fase febril aguda o la fase crítica de infección por virus del dengue; la cuantificación de vitronectina en la primera muestra de sangre entera, de plasma o de suero mediante ELISA o un ensayo de captura del antígeno para obtener un primer nivel de la vitronectina; la cuantificación de vitronectina en la segunda muestra de sangre entera, de plasma o de suero mediante ELISA o un ensayo de captura del antígeno para obtener un segundo nivel de la vitronectina; y la comparación del primer nivel de la vitronectina y el segundo nivel de la vitronectina para evaluar la infección por virus del dengue en el sujeto humano, donde una disminución en el segundo nivel de la vitronectina comparado al primer nivel de la vitronectina indica que la infección por virus del dengue está progresando de la fiebre por dengue a la fiebre hemorrágica por dengue.

Se proporcionan los procesos para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen la obtención de una primera muestra de sangre entera, de plasma o de suero del sujeto humano en un primer momento durante la fase febril aguda de infección por virus del dengue; la obtención de una segunda muestra de sangre entera, de plasma o de suero del sujeto humano en un segundo momento después del primer momento durante la fase febril aguda o la fase crítica de infección por virus del dengue; la cuantificación de vitronectina en la primera muestra de sangre entera, de plasma o de suero mediante ensayo de flujo lateral para obtener un primer nivel de la vitronectina; la cuantificación de vitronectina en la segunda muestra de sangre entera, de plasma o de suero mediante ensayo de flujo lateral para obtener un segundo nivel de la vitronectina; y la comparación del primer nivel de la vitronectina y el segundo nivel de la vitronectina para evaluar la infección por virus del dengue en el sujeto humano, donde una disminución en el segundo nivel de la vitronectina comparado al primer nivel de la vitronectina indica que la infección por virus del dengue está progresando de la fiebre por dengue a la fiebre hemorrágica por dengue.

Se proporcionan los dispositivos de inmunoensayo de vitronectina de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen un soporte poroso sólido o semisólido que incluye un agente de unión capaz de unirse específicamente a un primer epítopo de la vitronectina.

Se proporcionan los dispositivos de inmunoensayo de vitronectina de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen un soporte poroso sólido o semisólido que incluye un agente de unión capaz de unirse específicamente a un primer epítopo de vitronectina; y una almohadilla de conjugado que comprende un agente de unión detectablemente etiquetado capaz de unirse específicamente a un segundo epítopo de vitronectina.

Se proporcionan los dispositivos de inmunoensayo de vitronectina de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen un soporte poroso sólido o semisólido que incluye un agente de unión capaz de unirse específicamente a un primer epítopo de vitronectina; una almohadilla de conjugado que comprende un agente de unión detectablemente etiquetado capaz de unirse específicamente a un segundo epítopo de vitronectina; y una almohadilla de efecto mecha.

Se proporcionan los dispositivos de inmunoensayo de vitronectina de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen un soporte poroso sólido o semisólido que incluye un agente de unión capaz de unirse específicamente a un primer epítopo de vitronectina; y una almohadilla de conjugado que comprende una vitronectina detectablemente etiquetada.

Se proporcionan los dispositivos de inmunoensayo de vitronectina de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen un soporte poroso sólido o semisólido que incluye un agente de unión capaz de unirse específicamente a un primer epítopo de vitronectina; una almohadilla de conjugado que comprende una vitronectina detectablemente etiquetada; y una almohadilla de efecto mecha.

Se proporcionan los dispositivos de inmunoensayo de vitronectina de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen un soporte poroso sólido o semisólido que incluye un agente de unión capaz de unirse específicamente a un primer epítopo de vitronectina; y un alojamiento que encierra al menos parcialmente el soporte poroso sólido o semisólido.

Se proporcionan los dispositivos de inmunoensayo de vitronectina de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen un soporte poroso sólido o semisólido que incluye un agente de unión capaz de unirse específicamente a un primer epítopo de vitronectina; una almohadilla de conjugado que comprende un agente de unión detectablemente etiquetado capaz de unirse específicamente a un segundo epítopo de vitronectina; y un alojamiento que encierra al menos parcialmente el soporte poroso sólido o semisólido y la almohadilla de conjugado.

Se proporcionan los dispositivos de inmunoensayo de vitronectina de acuerdo con los aspectos de la presente invención que incluyen un soporte poroso sólido o semisólido que incluye un agente de unión capaz de unirse específicamente a un primer epítopo de vitronectina; una almohadilla de conjugado que comprende un agente de unión detectablemente etiquetado capaz de unirse específicamente a un segundo epítopo de vitronectina; una almohadilla de efecto mecha; y un alojamiento que encierra al menos parcialmente la almohadilla de conjugado, el soporte poroso sólido o semisólido, y la almohadilla de efecto mecha.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una ilustración esquemática de las fases de infección por virus del dengue; La figura 2A es una ilustración esquemática de una vista lateral de un dispositivo de flujo lateral de acuerdo con los aspectos de la presente invención; La figura 2B es una ilustración esquemática de una vista lateral de un dispositivo de flujo lateral de acuerdo con los aspectos de la presente invención; La figura 3 es un diagrama que muestra los niveles de vitronectina en muestras a partir de la fiebre por dengue (DF (n = 30)) y la fiebre hemorrágica por dengue (DHF (n = 30)) como se detecta mediante ELISA (*p < 0.001) (DV- = muestras negativas del virus del dengue); La figura 4 es una imagen de una inmunoelectrotransferencia que muestra los niveles de isoforma de vitronectina en muestras de pacientes; La Figura 5 es un diagrama que muestra una comparación de los niveles de vitronectina como se detecta mediante ELISA a partir de las muestras de estudio de Tailandia, donde la leyenda incluye fiebre por dengue (DF, por sus siglas en inglés), fiebre hemorrágica por dengue (DHF, por sus siglas en inglés), y hepatitis C (HepC, por sus siglas en inglés); el 1o o 2° se relaciona con la severidad clínica, mientras Gr define un grupo aglomerado geográfico y temporalmente infectado de pacientes; y La figura 6 es una gráfica que muestra las diferencias cuantificadas en los niveles de vitronectina en las muestras biológicas obtenidas de los pacientes con fiebre por dengue (DF, por sus siglas en inglés) y de fiebre hemorrágica por dengue (DHF, por sus siglas en inglés) de diferentes edades.

Descripción Detallada de la Invención Los términos científicos y técnicos usados en la presente se proponen para tener los significados entendidos comúnmente por los expertos en la técnica. Tales términos se encuentran definidos y usados en el contexto en varias referencias estándar ilustrativamente que incluyen J. Sambrook y D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3a Ed., 2001; F.M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5a Ed., 2002; B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4a Ed., Garland, 2002; D.L. Nelson and M.M. Cox, Lehninger Principies of Biochemistry, 4a Ed., W.H. Freeman & Company, 2004; Wild, D., The Immunoassay Handbook, 3a Ed., Elsevier Science, 2005; Gosling, J. P., Imunoassays: A Practical Approach, Practical Approach Series, Oxford University Press, 2005; E.Harlow and D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; F. Breitling y S. Dübel, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York, 1999; H. Zola, Monoclonal Antibodies: 5 Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Basics: From Background to Bench, BIOS Scientific Publishers, 2000; B.K.C. Lo, Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2003; F. M. Ausubel et al., Eds., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Wiley, 2002; Ormerod, M. G., Flow 10 Cytometry: a practical approach, Oxford University Press, 2000; Givan, A. L., Flow Cytometry: first principies, Wiley, New York, 2001; and Herdewijn, P. (Ed.), Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2004.

Los términos singulares "un", "uno", y "el" no se proponen para limitar e incluir referentes plurales a menos que de forma explícita o el contexto indique claramente lo contrario.

Ensayo para valorar la infección por virus del dengue Se proporcionan los procesos para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano de acuerdo con la presente invención que incluyen la recolección de una muestra biológica del sujeto humano; y la cuantificación de vitronectina en la muestra biológica.

Los niveles de vitronectina se aumentan de la muestra biológica de un sujeto humano que tiene fiebre por dengue en comparación con un sujeto humano sano y los niveles de vitronectina se disminuyen en una muestra biológica de un sujeto humano que tiene fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue comparado a un sujeto humano que tiene la fiebre por dengue u otra enfermedad febril (OFI, por sus siglas en inglés). La fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue puede ser diferenciada de la fiebre por dengue o de otra enfermedad febril mediante la cuantificación de vitronectina en una muestra biológica obtenida de un sujeto humano. De acuerdo con los aspectos de la presente invención, la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue es diferenciada de la fiebre por dengue o de otra enfermedad febril mediante la cuantificación de vitronectina en un suero, un plasma o una muestra de sangre entera obtenida de un sujeto humano.

Los niveles de vitronectina se aumentan en la muestra biológica de un sujeto humano que tiene fiebre por dengue secundaria en comparación con un sujeto humano sano y los niveles de vitronectina se disminuyen en una muestra biológica de un sujeto humano que tiene fiebre hemorrágica por dengue secundaria en comparación con un sujeto humano que tiene fiebre por dengue secundaria u otra enfermedad febril. La fiebre hemorrágica por dengue secundaria/síndrome de choque por dengue puede ser diferenciada de la fiebre por dengue o de otra enfermedad febril mediante la cuantificación de vitronectina en una muestra biológica obtenida de un sujeto humano. De acuerdo con los aspectos de la presente invención, la fiebre hemorrágica por dengue secundaria/síndrome de choque por dengue es diferenciada de la fiebre por dengue o de otra enfermedad febril mediante la cuantificación de vitronectina en un suero, un plasma o una muestra de sangre entera obtenida de un sujeto humano.

Los niveles de vitronectina se aumentan en la muestra biológica de un sujeto humano de 15 años de edad y más viejo que tiene fiebre por dengue comparada con un sujeto humano de 15 años de edad sano más viejo y los niveles de vitronectina se disminuyen en una muestra biológica de un sujeto humano de 15 años de edad y más viejo que tiene fiebre hemorrágica por dengue comparada con un sujeto humano de 15 años de edad y más viejo que tiene fiebre por dengue o un sujeto humano de 15 años de edad y más viejo que tiene aún otra enfermedad febril. La fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue puede ser diferenciada de la fiebre por dengue o de otra enfermedad febril mediante la cuantificación de vitronectina en una muestra biológica obtenida de un sujeto humano de 15 años de edad y más viejo. De acuerdo con los aspectos de la presente invención, la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue es diferenciada de la fiebre por dengue o de otra enfermedad febril mediante la cuantificación de vitronectina en un suero, un plasma o una muestra de sangre entera obtenida de un sujeto humano de 15 años de edad y más viejo.

Los niveles de vitronectina se aumentan en la muestra biológica de un sujeto humano de 15 años de edad y más viejo que tiene fiebre por dengue secundaria comparada con un sujeto humano de 15 años de edad sano y más viejos y los niveles de vitronectina se disminuyen en una muestra biológica de un sujeto humano de 15 años de edad y más viejo que tiene fiebre hemorrágica por dengue secundaria comparada con un sujeto humano de 15 años de edad y más viejo que tiene fiebre por dengue secundaria o un sujeto humano de 15 años de edad y más viejo que tiene aún otra enfermedad febril. La fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue puede ser diferenciada de la fiebre por dengue secundaria o de otra enfermedad febril mediante la cuantificación de vitronectina en una muestra biológica obtenida de un sujeto humano de 15 años de edad y más viejo. De acuerdo con los aspectos de la presente invención, la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue es diferenciada de la fiebre por dengue secundaria o de otra enfermedad febril mediante la cuantificación de vitronectina en un suero, un plasma o una muestra de sangre entera obtenida de un sujeto humano de 15 años de edad y más viejo.

De acuerdo con los aspectos de la invención, la vitronectina se cuantifica en una muestra obtenida de un sujeto que tiene una enfermedad febril. Donde la vitronectina en una muestra obtenida a partir del sujeto que tiene una enfermedad febril se encuentra para ser disminuida por el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más comparado con un estándar o un nivel de vitronectina en una muestra comparable obtenida de un sujeto que tiene fiebre por dengue u otra enfermedad febril, se encuentra que el pronóstico del sujeto es pobre y la enfermedad está progresando de la fiebre por dengue a la fiebre por dengue severa, es decir el fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue.

De acuerdo con los aspectos de la invención, la vitronectina se cuantifica en las muestras de sangre entera, de plasma o de suero obtenidas de un sujeto que tiene una enfermedad febril.

Donde la vitronectina en una muestra de sangre entera, de plasma o de suero obtenida a partir del sujeto que tiene una enfermedad febril se encuentra para ser disminuida por el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más comparada con un estándar o un nivel de vitronectina en una muestra de sangre entera, de plasma o de suero obtenida de un sujeto que tiene fiebre por dengue u otra enfermedad febril, se encuentra que el pronóstico del sujeto es pobre y la enfermedad está progresando de la fiebre por dengue a la fiebre por dengue severa, es decir la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue.

De acuerdo con los aspectos de la invención, la vitronectina se cuantifica en muestras de sangre entera, de plasma o de suero obtenidas de un sujeto que tiene una enfermedad febril. Donde la vitronectina en una muestra de sangre entera, de plasma o de suero obtenida a partir del sujeto que tiene una enfermedad febril se encuentra para ser disminuida por el 50% o para ser comparada con un estándar o un nivel de vitronectina en una muestra de sangre entera, de plasma o de suero obtenida de un sujeto que tiene la fiebre por dengue u otra enfermedad febril, se encuentra que el pronóstico del sujeto es pobre y la enfermedad está progresando de la fiebre por dengue a la fiebre por dengue severa, es decir la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue.

De acuerdo con los aspectos de la invención, la vitronectina se cuantifica en dos o más muestras obtenidas de un sujeto a momentos diferentes. Donde la vitronectina en una muestra obtenida de un sujeto que tiene fiebre por dengue en la fase febril aguda o crítica de infección por virus del dengue se encuentra para ser disminuido por el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más comparado con un nivel de vitronectina en una muestra obtenida a partir del sujeto en un tiempo anterior en el curso clínico de la fiebre por dengue en el paciente, se encuentra que el pronóstico del sujeto es pobre y la enfermedad está progresando de la fiebre por dengue a la fiebre por dengue severa, es decir, dengue síndrome de choque por dengue de la fiebre hemorrágica.

De acuerdo con los aspectos de la invención, la vitronectina se cuantifica en dos o más muestras de sangre entera, de plasma o de suero obtenidas de un sujeto en momentos diferentes. Donde la vitronectina en una muestra de sangre entera, de plasma o de suero obtenida de un sujeto que tiene fiebre por dengue en la fase febril aguda o crítica de infección por virus del dengue se encuentra para ser disminuido por el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más para ser comparado con un nivel de vitronectina en una muestra de sangre entera, de plasma o de suero obtenida a partir del sujeto en un momento anterior en el curso clínico de la fiebre por dengue en el paciente, se encuentra que el pronóstico del sujeto es pobre y la enfermedad está progresando de la fiebre por dengue a la fiebre por dengue severa, es decir, la fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue.

Una muestra biológica probada para la vitronectina de acuerdo con los procesos de la invención puede ser cualquier muestra biológica que contiene vitronectina que incluye, sangre entera, plasma, suero, fluido extracelular, fluido citosólico, y tejido. De acuerdo con los aspectos de la presente invención, la muestra biológica es sangre entera, plasma o suero.

Los términos "sujeto" y "paciente" se usan alternativamente en la presente y se refieren a un individuo humano. Se aprecia que los aspectos de la presente invención son aplicables a los sujetos mamíferos o aviares no humanos para el virus del dengue.

Los términos "control" y "estándar" son familiares a los expertos en la técnica y se refieren a cualquier control o estándar que se pueda usar para la comparación. El control o el estándar pueden ser determinados antes del ensayo para la vitronectina, en paralelo, simultáneamente, en un múltiple ensayo u otro formato de ensayo. Un control o un estándar puede ser un primer nivel de vitronectina determinado por ensayo en una primera muestra obtenida de un paciente. Un control o un estándar pueden ser un nivel o un intervalo de vitronectina normal de niveles de vitronectina en una población de sujetos sanos, de pacientes con fiebre por dengue o de pacientes con dengue severo, por ejemplo.

La cuantificación de vitronectina en una muestra biológica de acuerdo con los aspectos de la presente invención es lograda mediante ensayos que incluyen, pero no se limitan a, un ensayo de unión y/o una espectrometría de masa.

Los ensayos de unión incluyen el uso de un agente de unión para detectar un analito.

El término "agente de unión" como se usa en la presente se refiere a un agente caracterizado por la unión sustancialmente específica a una sustancia especificada. La frase "unión específica" y los equivalentes gramaticales como se usan en la presente en referencia a la unión de un agente de unión a una sustancia especificada se refiere a la unión del agente de unión a la sustancia especificada sin la unión sustancial a otras sustancias presentes en una muestra que se probará para la presencia de la sustancia especificada. Se entiende por el experto en la técnica que la unión específica se refiere a la unión específica como es determinable por el uso de controles apropiados para distinguirla de la unión no específica.

Los agentes de unión sustancialmente específicos para la vitronectina se pueden obtener a partir de fuentes comerciales o generar para el uso en los métodos de la presente invención de acuerdo con las metodologías bien conocidas.

El término "unión" se refiere a una interacción física o química entre un agente de unión y el objetivo. La unión incluye, pero no se limita a, unión iónica, unión no iónica, unión covalente, unión de hidrógeno, interacción hidrofóbica, interacción hidrofílica, e interacción de Van der Waals.

La cuantificación de vitronectina en una muestra biológica de acuerdo con los aspectos de la presente invención puede incluir la detección de una etiqueta detectable unida directamente o indirectamente a la vitronectina. El término "etiqueta detectable" se refiere a cualquier átomo o porción que pueda proporcionar una señal detectable y que se puedan unir a un agente de unión o un analito. Los ejemplos de tales etiquetas detectables incluyen porciones fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, porciones bioluminiscentes, ligandos, partículas, partículas magnéticas, partículas fluorescentes, oro coloidal, enzimas, sustratos enzimáticos, radioisótopos y cromóforos.

Cualquier método apropiado, que incluye pero no se limita a espectroscópico, óptico, fotoquímico, bioquímico, enzimático, eléctrico y/o inmunoquímico se usa para detectar una etiqueta detectable en un ensayo descrito en la presente.

Los inmunoensayos y los ensayos de hibridación del ácido nucleico son ensayo de unión usados para detectar la vitronectina en una muestra biológica obtenida a partir de un paciente de acuerdo con las modalidades de la presente invención.

Los inmunoensayos son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés), inmunocromatografía, captura del antígeno, citometría de flujo, inmunotransferencia, inmunoprecipitación, inmunodifusión, inmunocitoquímica, radioinmunoensayo, y combinaciones de cualquiera de estos. Los inmunoensayos para tanto el ensayo cualitativo y cuantitativo de una muestra se describen en detalle en referencias estándar, ilustrativamente incluyen Wild, D., The Immunoassay Handbook, 3a Ed., Elsevier Science, 2005; Gosling, J. P., Imunoassays: A Practica! Approach, Practical Approach Series, Oxford University Press, 2005; E.Harlow y D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; F. Breitling and S. Dübel, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York, 1999; H. Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Basics: From Background to Bench, BIOS Scientific Publishers, 2000; B.K.C. Lo, Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2003; F. M. Ausubel et al., Eds., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Wiley, 2002; Ormerod, M. G., Flow Cytometry: a practical approach, Oxford University Press, 2000; and Givan, A. L., Flow Cytometry: first principies, Wiley, New York, 2001.

El inmunoensayo de acuerdo con los aspectos de la presente invención puede incluir poner en contacto un soporte de fase sólida, que puede ser un soporte semisólido, que incluye un anticuerpo anti-vitronectina y una muestra biológica para detectar la unión del anticuerpo anti-vitronectina y la vitronectina en la muestra biológica. El sustrato puede estar en cualquiera de varias formas o perfiles, que incluye plana, por ejemplo pero sin limitarse a membranas, a matrices de silicio, a placas de cristal y a tiras reactivas; o tridimensionales por ejemplo pero sin limitarse a partículas, a placas de microtitulación, a pozos de microtitulación, a espigas y a fibras.

Un soporte sólido, el cual incluye el soporte semisólido, para la unión de un agente de unión, puede ser cualquiera de varios materiales como vidrio; plástico, como polipropileno, poliestireno, nilón; papel; silicio; nitrocelulosa; o cualquier otro material al cual un agente de unión se pueda unir para el uso en un ensayo.

En aspectos particulares, un soporte sólido al cual se une un agente de unión es una partícula.

Las partículas a las cuales un agente de unión es unido pueden ser cualquiera de las partículas sólidas o semisólidas a las cuales un agente de unión puede ser unido y a las cuales son estables e insolubles bajo condiciones de ensayo. Las partículas pueden ser de cualquier forma, tamaño, composición, o característica fisicoquímicas compatibles con condiciones de ensayo. Las características de partícula pueden ser elegidas para poder separarse la partícula del fluido, por ejemplo, en un filtro con un tamaño de poro particular o por alguna otra propiedad física, por ejemplo, una propiedad magnética.

Las micropartículas, como microperlas, usadas pueden tener un diámetro de menos de un milímetro, por ejemplo, un tamaño que oscila de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1,000 micrómetros en diámetro, inclusive, como aproximadamente 3-25 micrones en diámetro, inclusive, o aproximadamente 5-10 micrones en diámetro, inclusive. Las nanopartículas, como nanoperlas usadas puede tener un diámetro de aproximadamente 1 nanómetro (nm) a aproximadamente 100,000 nanómetro en diámetro, inclusive, por ejemplo, un tamaño que se oscila de aproximadamente 10-1,000 nm, inclusive, o por ejemplo, un tamaño que oscila de 200-500 nm, inclusive. En ciertas modalidades, las partículas usadas son perlas, particularmente microperlas y nanoperlas.

Las partículas a las cuales un agente de unión se une son ilustrativamente partículas orgánicas o inorgánicas, como vidrio o metal y pueden ser partículas de un polímero sintético o que ocurre naturalmente, como poliestireno, policarbonato, silicio, nilón, celulosa, agarosa, dextrano, y poliacrilamida. Las partículas son perlas de látex de acuerdo con los aspectos de la presente invención.

Las partículas a las cuales un agente de unión se une son opcionalmente codificadas y distinguibles de otras partículas basadas en una característica como color, índice de reflexión y/o un patrón impreso de otra manera ópticamente detectable. Por ejemplo, las partículas se pueden codificar el usar etiquetas ópticas, químicas, físicas, o electrónicas. Las partículas codificadas se pueden contener o unir a, uno o más fluoróforos que son distinguibles, por ejemplo, por longitud de onda de excitación y/o de emisión, intensidad de emisión, tiempo de vida de estado excitado o una combinación de éstas u otras características ópticas. Los códigos de barras ópticas se pueden usar para codificar partículas.

De acuerdo con los aspectos de la presente invención, el inmunoensayo incluye el ensayo de vitronectina en una muestra biológica mediante una técnica de inmunocromatografía. Descritas ampliamente, las técnicas de inmunocromatografía incluyen hacer fluir una muestra de prueba fluida que contiene o es sospechosa de contener un analito de interés a lo largo de un soporte sólido o semisólido que incluye un anticuerpo anti-analito para detectar la unión específica del anticuerpo y del analito.

De acuerdo con los aspectos de la presente invención, la cuantificación de vitronectina en una muestra biológica obtenida de un sujeto incluye la captura del antígeno, como mediante el ensayo de flujo lateral.

De acuerdo con los aspectos de la presente invención, la cuantificación de vitronectina en una muestra biológica obtenida de un sujeto es realizada mediante un ensayo de flujo lateral. Un ensayo de flujo lateral de acuerdo con los aspectos de la presente invención incluye hacer fluir una muestra biológica obtenida a partir de un paciente a lo largo de un soporte sólido o semisólido que incluye un agente de unión anti-vitronectina para detectar la unión específica del anticuerpo anti-vitronectina y de la vitronectina en la muestra biológica.

La muestra biológica obtenida a partir del paciente se puede diluir o procesar para purificar la vitronectina antes del análisis.

Un ensayo de flujo lateral de acuerdo con los aspectos de la presente invención incluye hacer fluir una muestra biológica obtenida a partir de un paciente a lo largo de un soporte sólido o semisólido que incluye µ? agente de unión anti-vitronectina, como un anticuerpo, en presencia de un competidor para detectar la competencia para la unión del agente de unión anti-vitronectina, como un anticuerpo, con vitronectina en la muestra biológica.

De acuerdo con los aspectos de la presente invención, un proceso del ensayo de flujo lateral para la cuantificación de vitronectina incluye proporcionar: una almohadilla de conjugado donde el agente de unión anti-vitronectina detectablemente etiquetada, como un anticuerpo, o la vitronectina detectablemente etiquetada se une por difusión, la almohadilla de conjugado adyacente a un soporte poroso sólido o semisólido que permite el flujo lateral de la muestra de fluido biológico y que tiene por lo menos una zona de detección de prueba que incluye un reactivo de detección unida sin difusión y por lo menos una zona de control que incluye un reactivo de control unida sin difusión, el soporte poroso sólido o semisólido adyacente a una almohadilla absorbente que promueve el flujo capilar de la muestra de fluido biológico a lo largo de una trayectoria de flujo que incluye la almohadilla de conjugado y el soporte poroso sólido o semisólido.

Un reactivo de detección unida sin difusión es un agente de unión anti-vitronectina, como un anticuerpo. De acuerdo con los aspectos de la presente invención en la cual la almohadilla de conjugado contiene un agente de unión anti-vitronectina detectablemente etiquetada, el reactivo de detección es no competitivo con el agente de unión anti-vitronectina detectablemente etiquetada.

Una muestra biológica obtenida de un sujeto se aplica a la almohadilla de conjugado. La muestra biológica obtenida a partir del sujeto se puede diluir o procesar para purificar la vitronectina antes del uso a la almohadilla de conjugado.

De acuerdo con los aspectos donde un agente de unión de vitronectina detectable etiquetada se incluye en la almohadilla de conjugado, la etiqueta detectable se detecta en la zona de prueba para cuantificar la vitronectina en la muestra y mayores cantidades de la etiqueta detectable detectada son indicativas de mayores cantidades de vitronectina en la muestra. De acuerdo con los aspectos donde una vitronectina detectablemente etiquetada se incluye en la almohadilla de conjugado, la etiqueta detectable se detecta en la zona de prueba para cuantificar la vitronectina en la muestra y cantidades menores de etiqueta detectable detectada son indicativas de mayores cantidades de vitronectina en la muestra.

Uno o más estándares se pueden usar para asociar una cantidad de etiqueta detectable detectada con una cantidad de vitronectina en una muestra.

La almohadilla de conjugado se bloquea comúnmente para inhibir la unión no específica. Un ejemplo no limitante de una solución de bloqueo es 10 mM de Borato, 3% de BSA, 1% de PVP-40, 0.25% de Tritón x-100, pH 8.

Cualquier reacción o amortiguador de diluyente compatible con la muestra, los reactivo y la reacción se puede usar, que incluye pero no se limita a solución salina amortiguada de fosfato, a amortiguador de fosfato de sodio, a amortiguador de fosfato de potasio, a amortiguador Tris-HCI, a amortiguador de Tricina y a otros amortiguadores descritos en la presente.

La almohadilla de conjugado se coloca adyacente al soporte poroso sólido o semisólido y el soporte poroso sólido o semisólido se coloca adyacente a la almohadilla absorbente. Cada componente, la almohadilla de conjugado, el soporte poroso sólido o semisólido y la almohadilla absorbente tiene una superficie superior en sustancialmente el mismo plano que la superficie superior cada otro componente. La almohadilla de conjugado, el soporte poroso sólido o semisólido y la almohadilla absorbente pueden ser unidos juntos para que puedan moverse como una unidad. Alternativamente o adicionalmente, la almohadilla de conjugado, el soporte poroso sólido o semisólido y la almohadilla absorbente se pueden todos unir a un soporte estructural, como un material de apoyo para soporte y para poderlos moverse como una unidad.

De acuerdo con los aspectos de la presente invención, se proporciona un dispositivo de ensayo de flujo lateral que incluye 1) una almohadilla de conjugado donde el anticuerpo anti-vitronectina detectablemente etiquetada o la vitronectina detectablemente etiquetada se une por difusión, 2) un soporte poroso sólido o semisólido que permite el flujo lateral de la muestra de fluido biológico y que tiene por lo menos una zona de detección de prueba que incluye un reactivo de detección no unido por difusión y por lo menos una zona de control que incluye un de control de detección no unido por difusión, y 3) una almohadilla absorbente que permite el flujo capilar de la muestra de fluido biológico.

La figura 2A es una ilustración esquemática de un dispositivo, 10, para el ensayo de flujo lateral de vitronectina de acuerdo con los aspectos de la presente invención. La almohadilla de conjugado 20, el soporte poroso sólido o semisólido, 30, y la almohadilla absorbente 40, se unen y se colocan adyacentes entre sí. La almohadilla de conjugado 20, el soporte poroso sólido o semisólido 30, y la almohadilla absorbente 40 cada uno tienen por lo menos una superficie superior 75, sustancialmente el mismo plano como cada otra superficie superior 75. Se muestra la dirección del flujo lateral 50. Se demuestra un alojamiento opcional 60, el cual incluye la almohadilla de conjugado 20, el soporte sólido o poroso semisólido 30, y la almohadilla absorbente 40. El alojamiento tiene opcionalmente una o más aberturas 70, como para la aplicación de una muestra a ser probada para la vitronectina o la visualización de los resultados de prueba y/o de control. El alojamiento incluye una abertura 80 para la inserción y el retiro de la almohadilla de conjugado 20, el soporte poroso sólido o semisólido 30, y la almohadilla absorbente 40. Se muestran una zona de prueba 114 y una zona de control 116.

La figura 2B muestra la almohadilla de conjugado 20, el soporte poroso sólido o semisólido 30, y la almohadilla absorbente 40, la zona de prueba 114 y una zona de control 116. Un primer agente de unión detectablemente etiquetado capaz de unirse específicamente a la vitronectina 102 se une por difusión al conjugado 20. Se agrega una muestra de prueba a la almohadilla de conjugado que contiene o se sospecha de contener la vitronectina 100. La vitronectina y primero el agente de unión detectablemente etiquetado capaces de unirse específicamente a vitronectina forma un complejo 104. El complejo 104 es movido mediante el flujo lateral en la dirección de la zona de prueba 114 donde está unido a un segundo agente de unión capaz de unirse específicamente a la vitronectina la cual no compite con el primer agente de unión detectablemente etiquetado capaz de unirse específicamente a la vitronectina, que forma el complejo 106. El complejo 106 es detectado en la zona de prueba mediante la detección de la etiqueta detectable, de esta manera cuantifica la vitronectina en la muestra de prueba. El agente de unión detectablemente etiquetado en exceso capaz de unirse específicamente a la vitronectina 102 se mueve mediante el flujo lateral a la zona de control donde une a un agente de unión 112 capaz de unirse específicamente al agente de unión capaz de unirse específicamente a la vitronectina 102, que forma un complejo 110.

El término "unido por difusión" se refiere a la unión reversible o a la adsorción de un material a la almohadilla de conjugado de tal manera que el material se mueve con el flujo lateral cuando hace contacto con la muestra biológica. El término "no unido por difusión" se refiere a la unión de un material al soporte sólido donde un material no unido por difusión se inmoviliza y por lo tanto no se mueve con el flujo lateral cuando entra en contacto con la muestra biológica.

El término "zona de detección de prueba" se refiere a una región del soporte poroso sólido o semisólido donde el reactivo de detección no es unido por difusión. La zona de detección de prueba puede tener cualquiera de varias formas y de tamaños configurados para la determinación de la unión de un analito al reactivo de detección. Comúnmente, la zona de detección de prueba es una línea de reactivo de detección no unido por difusión, referida como una "línea de prueba".

El término "zona de control" se refiere a una región del soporte poroso sólido o semisólido donde el reactivo de control no es unido por difusión. La zona de control puede tener cualquiera de varias formas y de tamaños configurados para permitir la determinación de la unión de una sustancia de control al reactivo de control. Comúnmente, la zona de control es una línea de control no unido por difusión, referida como una "línea de control".

Un reactivo de control permite a un usuario para confirmar que el inmunoensayo está funcionando correctamente. Por ejemplo, un reactivo de control puede ser un anticuerpo el cual une específicamente al anticuerpo anti-vitronectina detectablemente etiquetada.

De acuerdo con los aspectos de la presente invención, un dispositivo de ensayo de flujo lateral incluye 1) el anticuerpo anti-vitronectina detectablemente etiquetada unido por difusión a la almohadilla de conjugado, 2) un soporte poroso sólido o semisólido que tiene una zona de detección de prueba que incluye el anticuerpo anti-vitronectina no unido por difusión y 3) una almohadilla absorbente. De acuerdo con este aspecto, el anticuerpo anti-vitronectina detectablemente etiquetada unido por difusión a la almohadilla de conjugado y el anticuerpo anti-vitronectina no unido por difusión al soporte poroso sólido o semisólido unido específicamente a diferentes epítopos de vitronectina.

De acuerdo con los aspectos de la presente invención, un dispositivo de ensayo de flujo lateral incluye 1) un epítopo de vitronectina detectablemente etiquetada unido por difusión a la almohadilla de conjugado, 2) un soporte poroso sólido o semisólido que tiene una zona de detección de prueba que incluye el anticuerpo anti-vitronectina no unido por difusión y 3) una almohadilla absorbente. De acuerdo con este aspecto, el epítopo de vitronectina detectablemente etiquetada unido por difusión a la almohadilla de conjugado específicamente unida al anticuerpo anti-vitronectina no unido por difusión al soporte poroso sólido o semisólido y por lo tanto compite con la vitronectina en una muestra de prueba.

La almohadilla de conjugado es un material al cual un agente de unión de vitronectina detectablemente etiquetada se puede unir por difusión, pero sin limitarse a, fibra de vidrio, fibra de vidrio unida, poliéster, celulosa y derivados de celulosa incluyen acetato de celulosa y nitrocelulosa, nilón, fluoruro de polivinilideno, polietileno, policarbonato, polipropileno, poliétersulfona y combinaciones de cualquiera de estos.

El soporte poroso sólido o semisólido puede ser cualquier material poroso adsorbente sólido o semisólido adecuado para las aplicaciones cromatográficas que incluyen, pero no se limitan a, fluoruro de polivinilideno, nilón, poliétersulfona, poliéster, polipropileno, papel, sílice, rayón, celulosa y derivados de celulosa incluyen acetato de celulosa y nitrocelulosa naturales, fibras sintéticas tejidas o no tejidas, y geles porosos como agarosa, gelatina, dextrano y gel de sílice. El soporte poroso sólido o semisólido puede ser autosoportado, como una membrana, o se puede depositar en un soporte estructural, como una capa delgada de agarosa depositada en un portaobjetos. De acuerdo con los aspectos de la invención, el soporte poroso sólido o semisólido es una membrana de nitrocelulosa.

La almohadilla absorbente es un material absorbente que facilita el flujo lateral mediante el fuljo absorbente que incluye, pero no se limita a, un polímero sintético o natural absorbente, como celulosa.

Un soporte estructural al cual se unen la almohadilla de conjugado, el soporte poroso sólido o semisólido, y/o la almohadilla absorbente puede ser cualquier material el cual proporciona el soporte que incluye, pero no se limita a, una tarjeta de soporte, vidrio, sílice, membrana de cerámica y/o de plástico. Un adhesivo se puede usar para unir la almohadilla de conjugado, el soporte poroso sólido o semisólido, y/o la almohadilla absorbente al soporte estructural.

Un alojamiento se puede incluir por lo menos para parcialmente incluir la almohadilla de conjugado, el soporte poroso sólido o semisólido, y la almohadilla absorbente. El alojamiento se puede configurar para incluir un pozo para la aplicación de la muestra de fluido biológico a la almohadilla de conjugado. El alojamiento opcionalmente permite que el usuario directamente visualice los resultados del ensayo. Alternativamente, el alojamiento puede incluir un dispositivo de detección, como un explorador óptico, para la detección de los resultados del ensayo.

La muestra de fluido biológico fluye mediante la acción capilar a través de la almohadilla absorbente a una línea de control y una línea de prueba tienen agentes de unión, preferiblemente anticuerpos, colocados en una concentración exacta determinada a través de experimentos de validación. La línea de control es un control interno de calidad que asegura que la muestra ha emigrado apropiadamente y valida el ensayo. La línea de prueba determina un resultado positivo o negativo para el analito probado.

En aspectos particulares, un ensayo para la vitronectina incluye el uso de una técnica de espectrometría de masa. Por ejemplo, la vitronectina se puede ionizar al usar un método de ionización como ionización por electropulverización (ESI, por sus siglas en inglés), desorción/ionización de láser asistida por matriz (MALDI por sus siglas en inglés) o desorción/ionización láser mejorada para superficie (SELDI, por sus siglas en inglés). Se conduce el ensayo de masa al usar, por ejemplo, la espectrometría de masa de tiempo de vuelo (TOF, por sus siglas en inglés) o espectrometría de masas de resonancia de ion ciclotrón con Transformada de Fourier. Las técnicas de espectrometría de masa se conocen en la técnica y las descripciones detalladas ejemplares de los métodos para el ensayo de proteína y/o de péptido se encuentran en Li J., et al., Clin Chem., 48(8): 1296-304, 2002; Hortin, G.L., Clinical Chemistry 52:1223-1237, 2006; Hortin, G.L., Clinical Chemistry 52: 1223-1237, 2006; A.L. Burlingame, et al. (Eds.), Mass Spectrometry in Biology and Medicine, Humana Press, 2000; y D.M. Desiderio, Mass Spectrometry of Peptides, CRC Press, 1990.

La vitronectina contenida en una muestra biológica de un sujeto se purifica opcionalmente para el ensayo de acuerdo con un método de la presente invención.

El término "purificado" en el contexto de una muestra biológica se refiere a la separación de un material deseado en la muestra biológica por lo menos de otro componente presente en la muestra biológica.

En modalidades particulares, la vitronectina se purifica sustancialmente de manera opcional a partir de la muestra para producir una muestra sustancialmente purificada para el uso en un ensayo inventivo. El término "sustancialmente purificado" se refiere a un material deseado separado a partir de otras sustancias naturalmente presentes en una muestra obtenida a partir del sujeto de modo que el material deseado constituye por lo menos aproximadamente 1-100% de la masa, en peso, como aproximadamente 1%, 5%, 10%, 25%, 50% 75% o mayor de aproximadamente 75% de la masa, en peso, de la muestra sustancialmente purificada.

La purificación de la muestra es alcanzada por las técnicas que ilustrativamente incluyen métodos electroforéticos como electroforesis en gel y electroforesis en gel 2.D; métodos de cromatografía como HPLC, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de capa delgada y de papel. Se aprecia que la electroforesis y los métodos cromatográficos se pueden también usar para separar un péptido o péptidos de otros componentes en una muestra en el curso de realizar un ensayo, como en, por ejemplo, separación de proteínas en el ensayo de inmunotransferencia.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, un biomarcador objetivo es aislado y concentrado mediante la absorción de vitronectína sobre un sustrato sólido.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, un biomarcador objetivo es aislado y concentrado mediante la unión a perlas u otras partículas conjugadas con anticuerpos específicos a vitronectina.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, un biomarcador objetivo es aislado y concentrado mediante la unión a perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos a vitronectina.

Se proporcionan composiciones y métodos de acuerdo con aspectos de la presente invención donde un agente de unión es un anticuerpo anti-vitronectina. El término "anticuerpo" se usa en la presente en su sentido más amplio e incluye anticuerpos individuales y mezclas de anticuerpos caracterizados por la unión sustancialmente específica a un antígeno. Un anticuerpo proporcionado de acuerdo con las composiciones y los métodos es ilustrativamente un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, y/o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno, por ejemplo. El término anticuerpo se refiere a una inmunoglobulina intacta estándar que tiene cuatro cadenas de polipéptido que incluye dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) ligadas por enlaces de disulfuro en las modalidades particulares. Los fragmentos del anticuerpo de unión al antígeno incluyen ilustrativamente un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento scFv y un anticuerpo de dominio (dAb, por sus siglas en inglés), por ejemplo. Además, el término anticuerpo se refiere a anticuerpos de varias clases que incluyen IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, así como subclases, ilustrativamente que incluyen, por ejemplo, subclases humanas IgGI, lgG2, lgG3 e lgG4 y subclases murinas IgGI, lgG2, lgG2a, lgG2b, lgG3 e IgGM, por ejemplo.

En modalidades particulares, un anticuerpo el cual es caracterizado por la unión sustancialmente específica tienen una constante de disociación, Kd, menos que aproximadamente 10"7 M, como menos de aproximadamente 10 M, menos de aproximadamente 10"9 M o menos de aproximadamente 10"10 M, o menos dependiendo de la composición específica. La afinidad de unión de un anticuerpo se puede determinar mediante el análisis de Scatchard como se describe en P.J. Munson y D. Rodbard, Anal. Biochem., 107:220-239, 1980 o por otros métodos como el Análisis de Interacción Biomolecular al usar resonancia de plasmón.

Los anticuerpos y los métodos para la preparación de anticuerpos son bien conocidos en la técnica.

Ampliamente, un inmunógeno se administra a un animal en métodos particulares, como un conejo, una cabra, un ratón, una rata, una oveja o un pollo e inmunoglobulinas producidas en el animal se obtienen a partir del animal, y opcionalmente, purificado para evaluación y uso. Un fragmento inmunogenético es un péptido o una proteína que tiene aproximadamente 4-500 aminoácidos, y en modalidades particulares, por lo menos 5 aminoácidos, o en modalidades adicionales, por lo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200, 300, o 400 aminoácidos.

Los péptidos y/o las proteínas usadas como inmunógenos se pueden conjugar a un portador, como hemocianina de lapa californiana o albúmina de suero bovino.

Los detalles de métodos de generación de anticuerpo y de evaluación de anticuerpos generados para la unión sustancialmente específica a un antígeno se describen en referencias estándar como E. Harlow y D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; F. Breitling y S. Dübel, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York, 1999; H. Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Basics: From Background to Bench, BIOS Scientific Publishers, 2000; y B.K.C. Lo, Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods ¡n Molecular Biology, Humana Press, 2003.

Los anticuerpos monoclonales se pueden usar en ensayo de acuerdo con los aspectos de la presente invención. Los anticuerpos monoclonales se preparan al usar técnicas conocidas en la técnica como se describe en E. Harlow y D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; F. Breitling y S. Dübel, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York, 1999; H. Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Basics: From Background to Bench, BIOS Scientific Publishers, 2000; y B.K.C. Lo, Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2003, por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la presente invención y/o usados en métodos de acuerdo con la presente invención son producidos mediante técnicas que incluyen ilustrativamente, pero no se limitan a, técnicas de hibridoma, metodología recombinante del ácido nucleico y/o aislamiento a partir de una biblioteca de fago, por ejemplo, como se describe en las referencias antes citadas. Los anticuerpos monoclonales son ventajosamente usados en modalidades particulares debido a la especificidad de la unión de anticuerpos monoclonales que reconocen un solo epítopo.

Los métodos particulares de preparación del anticuerpo monoclonal incluyen la obtención de células del bazo a partir de un animal inmunizado con un inmunógeno y la fusión de los linfocitos secretores de anticuerpos con mieloma o células transformadas para obtener una célula del hibridoma capaz de replicarse indefinidamente en cultivo.

Los anticuerpos obtenidos son probados para la unión sustancialmente específica al inmunógeno mediante métodos que incluyen ilustrativamente ELISA, transferencia de tipo Western e inmunocitoquímica.

Un agente de unión puede ser un agente de unión del ácido nucleico. Un agente de unión del ácido nucleico, por ejemplo, pero sin limitarse a, una sonda de ácido nucleico o un cebador capaz de hibridizarse con un ARNm de vitronectina objetivo o ADNc se puede usar para la detección y/o la cuantificación del ARNm de vitronectina o el ADNc que codifica una proteína de vitronectina o un fragmento de la misma. Una sonda de ácido nucleico puede ser un oligonucleótido de por lo menos 10, 15, 20, 30, 50 o 100 nucleótidos en longitud y suficiente para específicamente hibridizar bajo condiciones rigurosas al ácido nucleico de vitronectina como ARNm o ADNc o la secuencia complementaria del mismo. Un cebador del ácido nucleico puede ser un oligonucleótido de por lo menos 10, 15 o 20 nucleótidos en longitud y suficiente para específicamente hibridizar bajo condiciones rigurosas al ARNm o el ADNc, o la secuencia complementaria del mismo.

De acuerdo con los aspectos de la presente invención, la cuantificacion de vitronectina en una muestra biológica obtenida de un sujeto es realizada mediante una técnica de ensayo de ácido nucleico que incluye, pero no se limita a, transferencia de tipo Western, ensayo de protección de ARNasa, transferencia puntual e hibridación in situ. De acuerdo con los aspectos de la presente invención, la cuantificación de vitronectina en una muestra biológica obtenida de un sujeto es realizada mediante un ensayo de ácido nucleico que incluye una técnica de amplificación del ácido nucleico como, pero sin limitarse a, PCR, PCR mediado por ligadura de RT-PCR y PCR phi-29. Se describen ensayos de ácido nucleico detalle en referencias estándar, ilustrativamente que incluye J. Sambrook y D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3a Ed., 2001; F. M. Ausubel et al., Eds., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Wiley, 2002; C.W. Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003; y V. Demidov et al., DNA Amplificaron: Current Technologies and Applications, Taylor & Francis, 2004.

Un agente de unión puede ser una proteína aislada de no- inmunoglobulina, un péptido o un ácido nucleico que une a una molécula de interés con especificidad sustancial. Por ejemplo, un agente de unión es ilustrativamente un aptámero el cual une sustancialmente de manera específica a la vitronectina. El término "aptámero" se refiere a un péptido y/o a un ácido nucleico que une sustancialmente de manera específica a una sustancia especificada. En el caso de un aptámero de ácido nucleico, el aptámero es caracterizado mediante la interacción de unión con un objetivo con excepción de la combinación de base de Watson/Crick o la unión de triple hélice con un segundo y/o tercer ácido nucleico. Tal interacción de unión puede incluir la interacción de Van der Waals, la interacción hidrofóbica, la unión de hidrógeno y/o las interacciones electrostáticas, por ejemplo. Similarmente, los aptámeros basados en péptido son caracterizados mediante la unión específica a un objetivo donde el aptámero no es un ligando que ocurre naturalmente para el , objetivo. Las técnicas para la identificación y la generación de '. péptido y aptámeros de ácido nucleico se conocen en la técnica ; como se describe, por ejemplo, en F. M. Ausubel et al., Eds., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Wiley, 2002; S. Klussman, Ed., The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications, Wiley, 2006; y J.

Sambrook y D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a Ed., 2001.

Diagnosis y caracterización de la infección por virus del dengue De acuerdo con los aspectos de procesos de la presente invención, un sujeto se diagnostica con infección por virus del dengue. La diagnosis de la infección por virus del dengue es establecida mediante la observación de signos y de síntomas característicos de la infección por virus del dengue en combinación con una historia del paciente constante con la exposición al vector del mosquito para el virus; detección de virus del dengue en una muestra biológica obtenida de un sujeto sospechoso de estar infectado con el virus del dengue; y/o detección de anticuerpos al virus del dengue en una muestra biológica obtenida de un sujeto sospechoso de estar infectado con el virus del dengue. El virus del dengue puede ser detectado en una muestra biológica mediante aislamiento del virus; métodos de hibridación del ácido nucleico que incluye, pero no se limita a, transferencia de tipo Western, transferencia de tipo Sorthern, ensayo de protección de la ARNasa y transferencia puntual; métodos de amplificación de ácido nucleico, que incluyen, pero no se limitan a, PCR, RT-PCR, PCR mediado por ligadura y PCR phi-29. Los ensayo de ácido nucleico para el ensayo cualitativo y cuantitativo de un ácido nucleico en una muestra se describen en detalle en referencias estándar, ilustrativamente que incluyen J.

Sambrook y D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3a Ed., 2001;F. M. Ausubel et al., Eds., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Wiley, 2002; C.W. Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003; and V. Demidov et al., DNA Amplification: Current Technologies and Applications, Taylor & Francis, 2004. Los ejemplos de ensayo para diagnosticar la infección por virus del dengue se describen en detalle en Velathanthiria, V. et al., Dengue Bulletin, 30:191-196, 2006; Bai. Z. et al., J. Med. Microbiol., 57, 1547- 1552, 2008; Johnson, B. W. et al., J. Clin. Microbiol., 43(10): 4977-4983, 2005; y Poloni et al., Virology J., 7:22, 2010.

La detección de anticuerpos al virus del dengue en una muestra biológica obtenida de un sujeto sospechoso de estar infectado con el virus del dengue incluye metodologías serológicas que incluyen pero no se limitan a ELISA, inhibición de la hemoaglutinación, fijación de complemento, prueba de neutralización, Reducción de Placa y Prueba de Neutralización (PRNT, por sus siglas en inglés), microneutralización PRNT, ensayo inmunosorbente ligado a enzima de captura del anticuerpo de inmunoglobulina M (MAC-ELISA, por sus siglas en inglés), ensayo inmunosorbente ligado a enzima de inmunoglobulina G (IgG ELISA, por sus siglas en inglés) y ensayo de antígeno basado en ELISA de NS1, como descrito en detalle en Martin, D. A. et al., J. Clin. Microbiol., 38(5):1823-1826, 2000; Qiu LW, et al., Clin Vaccine Immunol., 16(1):88-95, 2009; Ding, X. et al., Clin Vaccine Immunol., 18(3):430-4, 2011; Wang, S. M., Am J Trop Med Hyg., 83(3): 690-695, 2010 Kittigul L, et al. Am. J. Trop. Med. Hyg., 59(3):352-6, 1998; y Clarke D. H., et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 7(5):561-73, 1958.

El término "fiebre por dengue primaria" se refiere a la infección de un sujeto con un primer serotipos de virus del dengue. El término "fiebre hemorrágica por dengue primaria" se refiere a la infección de un sujeto con un primer serotipos de virus del dengue, que ha progresado a la manifestación más severa de la fiebre por dengue, fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue. El término "fiebre por dengue secundaria" se refiere a una infección de un sujeto con una infección de virus del dengue subsecuente, particularmente infección por un segundo, tercer o cuarto serotipos del virus del dengue donde el sujeto se ha infectado previamente con el primer serotipo de virus del dengue. El término "fiebre hemorrágica por dengue secundaria" se refiere a la manifestación más severa de la fiebre por dengue secundaria, fiebre hemorrágica por dengue secundaria/síndrome de choque por dengue, donde el sujeto se ha infectado previamente con un primer serotipos de virus del dengue. Como será reconocido por los expertos en la técnica, los procesos de la presente invención aplicable a "fiebre por dengue secundaria" y a la "fiebre hemorrágica por dengue secundaria" son también aplicables a los casos de infección de un sujeto con un tercer o cuarto serotipos de virus del dengue puesto que estas infecciones subsecuentes también se conocen para aumentar el riesgo de fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue.

Para determinar si la infección por dengue es una infección "primaria" o "secundaria", el inmunoensayo se puede usar para detectar anticuerpos dirigidos al virus del dengue. La infección por dengue primaria es caracterizada por una respuesta del anticuerpo de título lenta y baja. El anticuerpo IgM es el primer isotipo de inmunoglobulina a aparecer, generalmente alrededor cinco días después del inicio de los síntomas. El IgG anti-dengue es detectable en el título bajo al final de la primera semana de la enfermedad, y aumenta lentamente. En cambio, durante una infección secundaria, los títulos del anticuerpo se elevan extremadamente rápido y el anticuerpo reacciona ampliamente con muchos flavivirus. Altos niveles de IgG son detectables incluso en la fase aguda y se elevan dramáticamente durante las siguientes dos semanas. La infección por dengue primaria contra secundaria puede ser determinada al usar un algoritmo simple. Las muestras negativas para la IgG de virus del dengue en la fase aguda y positiva para la IgG de virus del dengue en la fase convaleciente de la infección son infecciones de virus del dengue primarias. Las muestras positivas para la IgG de virus del dengue en la fase aguda y aumentaron unas 4 veces en el título de IgG del virus del dengue en la fase convaleciente (con por lo menos un intervalo de 7 días entre las dos muestras) son una infección del dengue secundaria.

En particular, una prueba de inhibición de hemoaglutinación o una ELISA se usa frecuentemente para detectar anticuerpos del virus anti-dengue en un sujeto. Donde se detectan anticuerpos del virus anti-dengue, un nuevo caso de fiebre por dengue o de fiebre hemorrágica por dengue se determina para ser fiebre por dengue secundaria o fiebre hemorrágica por dengue secundaria.

Vitronectina Se produce la vitronectina como proteína precursora de 478 aminoácidos que incluye un péptido señal de 19 aminoácidos. La vitronectina madura es una glicoproteína multifuncional con una secuencia de longitud completa de 459 aminoácidos. La fuente principal de vitronectina es el hígado sin embargo que está presente en la sangre y en la matriz extracelular. La vitronectina une glicosaminoglicanos, colágeno, plasminógenos y el receptor de urocinasa, y también estabiliza la conformación inhibidora del inhibitor-1 de activación del plasminógeno (PAI-1, por sus siglas en inglés). Contiene tres sitios de glicosilación y existe en dos isoformas importantes: un monómero (kDa 75) y una forma de doble cadena dividida (kDa 65 + 10 kDa) unidas por un enlace de disulfuro.

Es un aspecto de la presente invención que la vitronectina ha sido observada en tres diferentes isoformas (75kDa, 65kDa y 54kDa) en suero de pacientes infectados con virus del dengue por los presentes inventores. Sin desear ser unido por teoría, se cree que el isoforma 54kDa es debido a las modificaciones después de la traducción que incluye la glicosilación y las diferencias en división. Además, la infección por virus del dengue puede causar cambios en las modificaciones después de la traducción. Las modificaciones después de la traducción incluyen la adición de sulfato en 2 residuos de tirosina y la fosforilación de una treonina 69 y 76. La variación de tamaño en la vitronectina a partir de 10 kDa (dominio terminal C dividido) y 12 kDa (producto dividido de terminal C de 10 kDa glicosilado) a 54 kDa (monómero de vitronectina de 75 kDa deglicosilado), 65 kDa (producto dividido grande, dominio de Stomatomedin B glicosilado), y 75 kDa (forma completamente glicosilada no dividido de vitronectina) incluso a tamaños grandes (75 kDa +) también refleja complejos de proteína los cuales funcionan en la homeostasis de vitronectina como: el inhibidor-1 activador de plasminógeno (PAI-1, por sus siglas en inglés), receptor de urocinasa, e insulina. VTN regula la coagulación sanguínea al inhibir la inactivación rápida de la trombina por la antitrombina III en presencia de la heparina detallada en Conlan, M. G. et al.. (1988), Blood, 72(1): 185-190. En contraste con otras proteínas de adhesión, la vitronectina puede participar en funciones reguladoras localizadas de la coagulación sanguínea así como fibrinólisis en interacciones de matriz de plaqueta. Aproximadamente 0.08% de la vitronectina derivada de plasma se encuentra en plaquetas que se pueden liberar sobre el estímulo apropiado en diferentes formas moleculares, (es decir, como una proteína soluble y como un complejo con PAI-1, como se detalla en Preissner, K. T. et al., (1989), Blood, 74(6): 1989-1996.

Además de las varias isoformas, la vitronectina se puede encontrar en complejos con otras proteínas humanas que incluyen: SERPINE 1 o inhibidor de la serpina peptidasa (el dominio Stomatomedina B en terminal N de Vnt interactúa con PAI-1). Otros complejos incluyen: Interacción del dominio Stomatomedina B con el receptor de urocinasa e interacción de la vitronectina V75 con heparina e insulina. Se conocen estas interacciones de la proteína-vitronectina como: complejo vitronectina-PAI-1 , complejo vitronectina-urocinasa, complejo vitronectina-heparina , y complejo vitronectina-insulina.

La proteína vitronectina humana también se llama V75, factor de propagación en suero, factor S y Epiboin. La vitronectina consiste de dominios de proteína basados en la homología: una Stomatomedina B N-terminal, dominios similares a 4 hemopexina y un dominio C-terminal sin homología conocida. Cuando estos dominios se reclasifican de acuerdo con la función, la vitronectina también contiene un dominio de unión a la heparina como se detalla en Hayashi, M. et al., (1985). J. Biochem., 98(4): 1135-1138. Los fragmentos de vitronectina se refieren como Stomatomedina B, hemopexina, o dominio de unión a heparina.

La división de vitronectina en la forma de doble cadena (65 kDa + 10 kDa) es mediada mediante una mutación al residuo positivamente cargado, arginina en el aminoácido 379. Esta mutación es controlada mediante dos alelos los cuales son codominantes en poblaciones caucásicas como se describe en Akama, T., (1986), J. Biochem., 100(5): 1343-1351 y Conlan, M.

G. et al., (1988), Blood, 72(1): 185-190. El resultado es tres clases de vitronectina en caucásicos: 1-1, 1-2, y 2-2. La clase 1-1 consiste de vitronectina sin dividir (75 kDa), la clase 1-2 consiste de vitronectina dividida (65-10 kDa) y vitronectina sin dividir (75 kDa), y la clase 2-2 es vitronectina dividida (65-10 kDa). El hígado es la fuente principal de vitronectina en plasma que sugiere que puede agotarse durante la coagulación intravascular diseminada (DIC, por sus siglas en inglés), un síntoma observado en muchos casos de pacientes infectados con virus del dengue. La concentración de vitronectina en plasma fue reducida notable en algunos pacientes con DIC, especialmente en éstos con insuficiencia hepática como se describe por Conlan, M. G. et al., (1988), Blood, 72(1): 185-190. Los pacientes con niveles de vitronectina <40% normal tenían poco fibrinógeno y antitrombina III y una expresión de protrombina prolongada. El polimorfismo de vitronectina derivado de plasma con relaciones de isoformas de polipéptidos de 75 y 65 kDa de vitronectina reducida difieren en enfermedad en comparación con los controles normales como se describe en Conlan, M. G. et al., (1988), Blood, 72(1): 185-190. Una disminución significativa en niveles de VTN en plasma se observa en la enfermedad del hígado crónica como se describe por Yamada, S., et al., (1999), Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol., 104(3): 253-263 y la magnitud de la disminución parecía correlacionarse con la severidad de la enfermedad. Los niveles de vitronectina hepáticos aumentan en la enfermedad del hígado crónica, especialmente en el tejido conectivo alrededor de las venas porta y centrales y en las áreas de la necrosis fragmentaria y focal.

Varias isoformas de vitronectina pueden desempeñar un papel en el desarrollo de formas severas de dengue y la severidad del dengue puede variar entre las poblaciones. De acuerdo con la presente invención, la vitronectina es un biomarcador para la progresión de la fiebre por dengue a la fiebre por dengue severa y el mecanismo funcional de vitronectina en fiebre por dengue severa incluye todos dominios estructurales y funcionales y sus varias modificaciones a través de la glicosilación, la división, y las interacciones de proteína como se describe.

El término "vitronectina" comprende el precursor de vitronectina identificado en la presente como SEC ID NO: 1, codificado por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 2; la vitronectina madura identificada en la presente como SEC ID NO: 3, codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 4; así como homólogos y variantes de los mismos.

Los métodos y las composiciones de la presente invención no se limitan a secuencias de aminoácidos y nucleicas particulares identificadas por la SEC ID NO en la presente y los homólogos y las variantes de un ácido nucleico o de una proteína de referencia pueden ser usadas.

Los homólogos y las variantes de un ácido nucleico o de una proteína descrita en la presente son caracterizados por las propiedades funcionales conservadas comparadas con el ácido nucleico o la proteína correspondiente.

La vitronectina comprende proteínas que tienen por lo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad con la proteína que tiene la secuencia de aminoácido indicada en la SEC ID NO:1, o una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones de hibridación de alta astringencia, al ácido indicado en la SEC ID NO:2 o un complemento de la misma siempre y cuando la proteína es caracterizada por las propiedades funcionales de la proteína de la SEC ID NO:1.

La vitronectina comprende proteínas que tienen por lo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad con la proteína que tiene la secuencia de aminoácido indicada en la SEC ID NO:3, o una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones de hibridación de alta astringencia, al ácido indicado en la SEC ID NO:4 o un complemento de la misma siempre y cuando la proteína es caracterizada mediante las propiedades funcionales de la proteína de la SEC ID NO:3.

El término "vitronectina" se refiere a cualquier fragmento de una vitronectina que sea operable en el método descrito al usar el fragmento, como se entiende por el experto en la técnica. Un fragmento de vitronectina es operativo en cualquiera de los métodos inventivos descritos en la presente al usar la vitronectina.

El "ácido nucleico de vitronectina" como se usa en la presente se refiere a un ácido nucleico aislado que tiene una secuencia que tiene por lo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEC ID NO:2, o una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia que hibridiza, bajo condiciones de hibridación de alta astringencia, al ácido nucleico indicado en la SEC ID NO:2; o un complemento de la misma, siempre y cuando el ácido nucleico lleve a cabo la función descrita en el método inventivo particular que comprende el uso del ácido nucleico.

El "ácido nucleico de vitronectina" como se usa en la presente se refiere a un ácido nucleico aislado que tiene una secuencia que tiene por lo menos 80%, 85%, 90%, 91%. 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad a la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEC ID NO:4 o una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia que hibridiza, bajo condiciones de hibridación de alta astringencia, al ácido nucleico indicado en la SEC ID NO:4; o un complemento de la misma, siempre y cuando el ácido nucleico lleve a cabo la función descrita en el método inventivo particular que comprende el uso del ácido nucleico.

Un fragmento del ácido nucleico de vitronectina es cualquier fragmento de un ADN de vitronectina que sea operable en el método descrito al usar el fragmento, como se entiende por el experto en la técnica. Un fragmento del ADN de vitronectina es operativo en cualquiera de los métodos inventivos descritos en la presente al usar el ácido nucleico de vitronectina.

Los términos "complemento" y "complementario" se refiere a la base de Watson-Crick que se combina entre los nucleótidos y específicamente se refiere al hidrógeno de nucleótidos unido a otro con residuos de timina o uracilo ligados a los residuos de adenina por dos enlaces de hidrógeno y los residuos de citosina y de guanina ligados por tres enlaces de hidrógeno. En general, un ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos descrita como que tiene una "complementariedad de por ciento" a una segunda secuencia de nucleótidos especificada. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos puede tener 80%, 90%, o 100% de complementariedad a una segunda secuencia de nucleótidos especificada, lo que indica que 8 de 10, 9 de 10 o 10 de 10 nucleótidos de una secuencia son complementarios a la segunda secuencia de nucleótidos especificada. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos 3'-TCGA-5' es 100% complementaria a la secuencia de nucleótidos 5'-AGCT-3'. Además, la secuencia de nucleótidos 3'-TCGA- es 100% complementaria a una región de la secuencia de nucleótidos 5,-TTAGCTGG-3'.

El término "hibridación" e "hibridiza" se refiere a la combinación y la unión de ácidos nucleicos complementarios. La hibridación se produce a grados variables entre dos ácidos nucleicos que dependen de factores como el grado de complementariedad de los ácidos nucleicos, la temperatura de fusión, Tm, de los ácidos nucleicos y la astringencia de las condiciones de hibridación, como es bien conocido en la técnica. El término "astringencia de las condiciones de hibridación" se refiere a las condiciones de temperatura, la fuerza iónica, y la composición de un medio de hibridación con respecto a aditivos comunes particulares como la formamida y la solución de Denhardt. La determinación de las condiciones de hibridación particulares con relación a un ácido nucleico especificado es de rutina y es bien conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en J. Sambrook y D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3a Ed., 2001; y F.M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5a Ed., 2002. Las condiciones de hibridación de alta astringencia son aquellas que sólo permiten la hibridación de ácidos nucleicos sustancialmente complementarios. Comúnmente, los ácidos nucleicos que tienen aproximadamente 85-100% de complementariedad se consideran altamente complementarios y se hibridizan bajo condiciones de alta astringencia. Las condiciones de astringencia de los intermediarios están ejemplificadas por las condiciones bajo las cuales los ácidos nucleicos que tienen complementariedad de intermediario, aproximadamente 50-84% de complementariedad, así como las que tienen un alto grado de complementariedad, se hibridizan. En contraste, las condiciones de hibridación de baja astringencia son aquellas en las cuales los ácidos nucleicos que tienen un bajo grado de complementariedad hibridizan.

Los términos "hibridación específica" y "específicamente hibridiza" se refieren a la hibridación de un ácido nucleico particular a un ácido nucleico objetivo sin hibridación sustancial a ácidos nucleicos distintos al ácido nucleico objetivo en una muestra.

La astringencia de la hibridación y las condiciones de lavado dependen de varios factores, que incluyen la Tm de la sonda y el objetivo y la fuerza iónica de la hibridación y las condiciones de lavado, como es bien conocido para el experto en la técnica. Se describen la hibridación y las condiciones para lograr una astringencia de hibridación deseada, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; y Ausubel, F. et al., (Eds.), Short Protocols in Molecular Biology, Wiley, 2002.

Las condiciones de hibridación de altas astringencia son conocidas por el experto en la técnica. Un ejemplo de las condiciones de hibridación de alta restrictivas es la hibridación de ácidos nucleicos sobre aproximadamente 100 nucleótidos en longitud en una solución que contiene 6X SSC, una solución de Denhardt 5X, 30% de formamida, y 100 microgramos/ml de esperma de salmón desnaturalizado a 37°C durante la noche, seguido por lavado en una solución de 0.1X de SSC y 0.1% de SDS a 60°C durante 15 minutos. SSC es NaCI 0.15M/citrato de Na 0.015M. La solución de Denhardt es 0.02% de albúmina de suero bovino/0.02% de FICOLL/0.02% de polivinilpirrolidona. Bajo condiciones de alta astringencia, la SEC ID NO. 2 se hibridizará al complemento de los objetivos sustancialmente idénticos y no a las secuencias no relacionadas.

El porcentaje de identidad se determina mediante la comparación de secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, que incluye una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de referencia y una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico homóloga putativa. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse separaciones en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para la alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). Los residuos de aminoácidos o de nucleótidos a posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes se comparan después. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o de nucleótido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esta posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones superpuestas idénticas/número total de posiciones X 100%). Las dos secuencias comparadas son generalmente la misma longitud o casi la misma longitud.

La determinación de la identidad por ciento entre dos secuencias puede también ser realizada al usar un algoritmo matemático. Los algoritmos usados para la determinación de la identidad por ciento incluyen ilustrativamente los algoritmos de S. Karlin y de S. Altshul, PNAS, 90:5873-5877, 1993; T. Smith y M. Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482- 489, 1981, S. Needleman y C.

Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443-453. 1970. W. Pearson y D. Lipman, PNAS, 85:2444-2448, 1988 y otros incorporados en implementaciones automatizadas como, pero sin limitarse a, GAP, BESTFIT, FASTA, TFASTA; y BLAST, por ejemplo, incorporadas en el (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.) y públicamente disponibles del Centro Nacional para Información de Biotecnología.

Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático usado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y de AltschuI, 1990, PNAS 87:2264-2268, modificado como en Karlin y AltschuI, 1993, PNAS. 90:5873-5877. Tal algoritmo se incorpora en los programas de NBLAST y de XBLAST de AltschuI et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas del nucleótido de BLAST se realizan con los parámetros del conjunto de programa del nucleótido de NBLAST, por ejemplo, para el conteo = 100, longitud de letras: 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a moléculas de un ácido nucleico de la presente invención. Las búsquedas de la proteína de BLAST se realizan con el conjunto de parámetros del programa de XBLAST, por ejemplo, para el conteo 50, longitud de letras = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína de la presente invención. Para obtener alineamientos lineales para los propósitos de comparación, se usa BLAST lineales como se describe en AltschuI et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, se usa PSI BLAST para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre moléculas. Cuando se usa programas de BLAST, de BLAST lineal y de PSI BLAST, se usan los parámetros de defecto de los programas respectivos (por ejemplo, de XBLAST y de NBLAST). Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y de Miller, 1988, CABIOS 4:11-17. Tal algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineación de secuencia GCG. Cuando se usa el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácido, se usa una tabla de residuo de peso PAM120, una penalidad de longitud de separación de 12, y una penalidad de separación de 4.

La identidad por ciento entre dos secuencias es determinada al usar técnicas similares a las descritas antes, con o sin separaciones permitidas. En la identidad de por ciento calculada, comúnmente sólo se cuentan las coincidencias exactas.

Uno experto en la técnica reconocerá que una o más mutaciones del ácido nucleico o del aminoácido pueden ser introducidas sin la alteración de las propiedades funcionales de un ácido nucleico o una proteína dada, respectivamente. Las mutaciones se pueden introducir al usar técnicas de biología molecular estándar, como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR, para producir variantes. Por ejemplo, una o más sustituciones, adiciones, o supresiones de aminoácidos, pueden hacerse sin la alteración de las propiedades funcionales de una proteína de referencia. Similarmente, una o más sustituciones, adiciones, o supresiones del ácido nucleico, pueden hacerse sin la alteración de las propiedades funcionales de una secuencia de ácido nucleico de referencia.

Cuando se compara una proteína de referencia a un homólogo putativo, la similitud del aminoácido se puede considerar además a la identidad de aminoácidos en las posiciones correspondientes en una secuencia de aminoácido. La "similitud del aminoácido" se refiere a la identidad del aminoácido y a las sustituciones conservadoras del aminoácido en un homólogo putativo comparado a las posiciones del aminoácido correspondientes en una proteína de referencia.

Las sustituciones conservadoras del aminoácido se pueden hacer en proteínas de referencia para producir variantes.

Las sustituciones conservadoras del aminoácido son sustituciones reconocidas en la técnica de un aminoácido para otro aminoácido que tiene características similares. Por ejemplo, cada aminoácido se puede describir como que tiene una o más de las siguientes características: electropositiva, electronegativa, alifática, aromática, polar, hidrofóbica e hidrofílica. Una sustitución conservadora es una sustitución de un aminoácido que tiene una característica estructural o funcional especificada para otro aminoácido que tiene las mismas características. Los aminoácidos ácidos incluyen aspartato, glutamato; los aminoácidos básicos incluyen histidina, Usina, arginina; los aminoácidos alifáticos incluyen isoleucina, leucina y valina; los aminoácidos aromáticos incluyen fenilalanina, glicina, tirosina y triptófano; los aminoácidos polares incluyen aspartato, glutamato, histidina, Usina, asparagina, glutamina, arginina, serina, treonina y tirosina; y los aminoácidos hidrofóbicos incluyen alanina, cisteína, fenilalanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, prolina, valina y triptófano; y las sustituciones conservadoras incluyen la sustitución entre aminoácidos dentro de cada grupo. Los aminoácidos se pueden también describir en términos de tamaño relativo; alanina, cisteína, aspartato, glicina, asparagina, prolina, treonina, serina, valina son todas consideradas comúnmente como pequeñas.

Una variante puede incluir análogos de aminoácido sintético, derivados de aminoácido y/o aminoácidos no estándar, ilustrativamente que incluye, sin limitación, el ácido alfa-aminobutírico, citrulina, canavanina, cianoalanina, ácido diaminobutirico, ácido diaminopimélico, dihidroxi-fenilalanina, ácido djencólico, homoarginina , hidroxiprolina, norleucina, norvalina, 3-fosfoserina, homoserina, 5-hidroxitriptófano, 1-metilhistidina, 3-metilhistidina, y ornitina.

Con respecto a los ácidos nucleicos, será apreciada por las de la habilidad en la técnica que debido a la naturaleza degenerada del código genético, las secuencias múltiples del ácido nucleico pueden codificar una proteína particular, y que tales ácidos nucleicos alternos se pueden usar en composiciones y métodos de la presente invención.

Se proporcionan los procesos y sustratos para reconocen rápida y confiablemente la infección por virus del dengue en un sujeto humano. La presente invención proporciona métodos para rápidamente detectar el nivel de un biomarcador objetivo de la infección por virus del dengue en un sujeto.

Al usar el biomarcador objetivo de concentración comparativamente alta de la infección viral de DF o de DHF permite una rápida detección y cuantificación en ambientes de hospital o de laboratorio. La presente invención tiene utilidad como una prueba de diagnóstico la cual guía el tratamiento del paciente de la infección viral por dengue. La prueba inventiva es rápida, altamente sensible, y distingue entre DF y DHF. La presente invención también tiene utilidad como una herramienta para evaluar los elementos terapéuticos específicos comparados con los inhibidores de virus del dengue convencionales y para respuesta de la infección de supervisión para ensayos de candidatos de vacuna. La presente invención tiene utilidad en virus del dengue de supervisión. La presente invención produce un proceso para supervisar el inicio, la progresión, y la respuesta a cinética de tratamiento de la infección por virus del dengue, que incluye la efectividad de la terapéutica antiviral.

La progresión de la enfermedad de supervisión en una población de pacientes es esencial para proporcionar un tratamiento óptimo después de la exposición infecciosa al virus del dengue. A menudo distinguir una infección por virus del dengue a partir de otras enfermedades similares a la gripe o febriles es difícil, particularmente en un ambiente donde es rara la exposición al virus del dengue. La detección y la identificación tempranas del virus del dengue es un beneficio en el seguimiento de la población del mosquito de infección. Las técnicas de diagnóstico actualmente presentes empleadas para identificar la infección por virus del dengue son ineficaces a partir de 4 a 8 días después de la infección. El presente proceso inventivo emplea varios niveles de especificidad que incluye inmunoadsorbencia específica del biomarcador objetivo y los sustratos que son altamente específicos para los mismos. Así, la presente invención tiene la capacidad de detectar la infección por virus del dengue menos de 2 días después de la exposición. Se aprecia que la presente invención ofrece resultados dentro de 4 horas de obtener una muestra biológica de tal manera que las estrategias de tratamiento dirigidas pueden comenzar temprano y mejorar la supervivencia del paciente potencial.

La presente invención enseña un proceso para un ensayo del biomarcador objetivo para DF, DHF, y la diferenciación opcional entre ellos en una muestra biológica. Al usar un biomarcador objetivo para la infección por virus del dengue, todos los serotipos del virus se detectan de esta manera el superar una limitación seria de las sondas virales específicas del serotipo : convencional. El biomarcador objetivo se aisla y se concentra opcionalmente a partir de la muestra biológica. El biomarcador objetivo se hace reaccionar posteriormente con un sustrato del péptido que se dividido para producir por lo menos dos productos : de división de sustrato detectados mediante uno de varios métodos conocidos en la técnica. Como, se mide la eficacia , catalítica relativa del biomarcador objetivo.

La invención presente enseña una muestra biológica que es adquirida mediante métodos estándar conocidos en la técnica a partir de un paciente u otro sujeto de prueba ilustrativamente que incluye humanos y otros mamíferos. La muestra biológica incluye ilustrativamente sangre entera, plasma, suero, fluido extracelular, fluido citosólico, fluido pleural, o tejido.

Una forma dirigida del biomarcador objetivo se aisla y se concentra a partir de la muestra biológica en una etapa ejemplar a través de unir a las perlas conjugadas con un anticuerpo específico al biomarcador objetivo. Las perlas empleadas son opcionalmente magnéticas, de esta manera permitiendo la separación fácil y rápida desde otros componentes presentes en la muestra biológica. El sustrato de aislamiento y de purificación ocurre en un sustrato sólido u otros sustratos conocidos en la técnica. Un sustrato sólido es ilustrativamente una placa de microtitulación. Las perlas magnéticas están opcionalmente cubiertas con un anticuerpo especifico al biomarcador objetivo. Los anticuerpos operativos en la presente ilustrativamente incluyen los derivados de organismos que incluyen mamífero, ratón, conejo, mono, burro, caballo, rata, cerdos, gato, pollo, cabra, conejillo de Indias, hámster, y ovejas. El anticuerpo seleccionado se aprecia para ser monoclonal o policlonal.

La presente invención enseña varios métodos de detección, ilustrativamente que incluye espectrometría de masa, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, fluorescencia, absorción de luz, ensayo inmunoadsorbente ligado enzima, ensayo de enzima conjugada, ensayo de enzima continuo, ensayo de enzima discontinuo, citometría de flujo, FLIPR, cromatografía líquida de alto rendimiento, y ensayo colorimétrico.

Una muestra biológica se obtiene de un sujeto paciente o de prueba y se muestrea inmediatamente o alternativamente se congela para ensayo posterior en el lugar de colección o remoto desde la fuente de la muestra. Un ejemplo no limitante incluye muestras tomadas en ambientes que carecen de estado de los instrumentos de diagnóstico de la técnica. Una muestra de sangre simple se describe dentro de un Vacutainer u otros tubos conocidos en la técnica y después inmediatamente se congelan para el envío pronto. Como un resultado, una diagnosis de infección es obtenida en tan poco como 12-24 horas después que un paciente presenta síntomas de exposición al virus del dengue.

Un operativo del biomarcador objetivo humano en la presente para la detección de DF o de DHF y opcionalmente la diferenciación entre ellos incluye vitronectina , inhibidor-1 del activador de plasminógeno (PAI-1), activador de plasminógeno de tejido, urocinasa, y combinaciones de los mismos. Se aprecia que la detección simultánea de dos o más biomarcadores objetivo es provechosa en la reducción de resultados falsos. Preferiblemente un biomarcador objetivo humano usado en la presente invención es vitronectina, solo o en combinación con otros biomarcadores objetivo. Como será detallado de aquí en adelante, los niveles de vitronectina en un humano son estadísticamente capaces de distinguir saludables, DF y DHF.

Un kit inventivo emplea perlas cubiertas con biomarcador anti-objetivo preempaquetadas para aislar el biomarcador desde una muestra biológica. Se proporciona una cámara de reacción para aislamiento y purificación. Los amortiguadores se incluyen opcionalmente con el kit que se usará ilustrativamente para lavar las perlas, diluir la muestra biológica, eluir las perlas, reaccionar con el sustrato del péptido, reconstituir el sustrato del péptido, almacenar las perlas, almacenar el sustrato del péptido, congelar o de otra manera almacenar el biomarcador objetivo aislado y concentrado, congelar o de otra manera almacenar los productos de división, o preparar las muestras para detección. Los amortiguadores adecuados incluyen ilustrativamente solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés), solución salina amortiguada con fosfato más Tween-20 (PBS-T, por sus siglas en inglés), solución salina amortiguada con HEPES (HBS, por sus siglas en inglés), HBS-Tween-20 (HBS-T, por sus siglas en inglés), amortiguadores de citrato-fosfato, agua, u otros amortiguadores adecuados conocidos en la técnica. La cámara de reacción se usa para la división de un sustrato del péptido. Opcionalmente, se proporciona una segunda cámara de reacción para la división de un sustrato del péptido. El biomarcador objetivo aislado se aprecia para ser favorable para la congelación y el envío para análisis remotos. Es además apreciado que los productos de división son también favorables a la congelación para la detección, la cuantificación, o el análisis posterior en una posición y tiempo remoto. Éstos u otros métodos de emplear la presente .invención se pueden usar para liberación rápida, diagnosis efectiva en una escala mundial en un marco de tiempo que no sea posible con técnicas de diagnóstico presentes.

El proceso inventivo se realiza al usar numerosas muestras biológicas ilustrativamente que incluyen sangre entera, plasma, suero, fluido extracelular, fluido citosólico, o tejido. Comúnmente, el suero es usado como una muestra biológica adecuada debido a la facilidad en la obtención de una muestra mediante una extracción de sangre venosa de un paciente. Se reconoce en la técnica que numerosas otras muestras biológicas son adecuadas en la presente invención dependiente de la aplicación deseada. A modo de ejemplo, una muestra biológica puede ser tan simple como un agente amortiguador acuoso como HBS o PBS, cualquiera de los cuales se adicionan con niveles conocidos o desconocidos del biomarcador objetivo. El medio de crecimiento celular es también adecuado como una muestra biológica para evaluar los cultivos celulares transfectados para la expresión del biomarcador objetivo activo de acuerdo con la presente invención. Se aprecia que otras muestras biológicas son usadas como una muestra de tejido homogeneizada que puede o puede no haber sido infectadas con el virus del dengue.

Tras la selección de una muestra biológica, la detección del biomarcador objetivo mediante el presente proceso inventivo implica aislar y concentrar el biomarcador objetivo en la muestra biológica. Preferiblemente, las perlas magnéticos no porosas cubiertas con anticuerpos que reconocen y unen el biomarcador objetivo se emplean para capturar el biomarcador objetivo a partir de la muestra biológica. Las perlas magnéticas tienen la ventaja de no requerir centrifugación, así permitiendo la regeneración de la perla magnética sin pérdida de capacidad de unión. Las perlas magnéticas también permiten la pérdida mínima de muestra debido al pipeteado como perlas magnéticas que emigran a los lados del tubo de reacción. Se aprecia además que las perlas magnéticas permitidas para métodos de aislamiento a pequeña escala minimizan los requerimientos de la muestra biológica. Otros tipos de perla o composiciones operativas en la presente incluyen ilustrativamente agarosa, sefarosa, níquel, u otros materiales conocidos en la técnica. Numerosas fuentes comerciales están disponibles para las perlas de purificación de proteína que incluyen New England Biolabs, Quiagen, y Bachem.

Las perlas magnéticas recubiertas adecuadas para el uso en el presente proceso inventivo se preparan y se hacen reaccionar con un anticuerpo adecuado para reconocer y unir el biomarcador objetivo. Anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, o combinaciones de los mismos son adecuados para la unión del biomarcador objetivo selectivo. Los anticuerpos se derivan fácilmente de numerosos organismos que incluyen, pero no se limitan a, un ratón, un conejo, un mono, un burro, un caballo, una rata, un cerdo, un gato, un pollo, una cabra, un conejillo de Indias, un hámster, o una oveja. Los anticuerpos específicos para el biomarcador objetivo se obtienen fácilmente a partir de numerosas fuentes comerciales. Las perlas entonces se bloquean con albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés), polietilenglicol (PEG, por sus siglas en inglés), u otros agentes de bloqueo conocidos en la técnica. Una muestra biológica se incuba con las perlas cubiertas de biomarcador anti-objetivo por suficiente tiempo para permitir que la unión de equilibrio se desarrolle, generalmente entre 1 minuto y 3 horas dependiendo de la afinidad del anticuerpo y la concentración anticipada del biomarcador objetivo en la muestra biológica. Las perlas unidas al biomarcador objetivo entonces se lavan con un amortiguador adecuado como PBS-T, HBS-PEG, u otro sistema amortiguador adecuado conocido en la técnica para eliminar cualquier proteína no unida u otros componentes de suero. Sin embargo, se reconoce en la técnica que el tiempo de incubación apropiado depende de las constantes de afinidad de sustrato, de eficacia cinética o catalítica intrínsecas al sustrato de péptido seleccionado de tal manera que una cantidad detectablemente de producto es formada en el tiempo de incubación. Tales constantes son determin'adas fácilmente mediante técnicas bien conocidas y practicadas comúnmente en la técnica.

Los sustratos del péptido operativos en el presente proceso inventivo se seleccionan basados en constantes de afinidad y cinéticas conocidas así como mediante el método de detección que se empleará bajo el método inventivo. Preferiblemente, un sustrato del péptido posee un enlace escindible potencial para simplificar la cinética de la reacción de división. El sustrato del péptido seleccionado imita el objetivo natural del biomarcador objetivo o es un ligando natural del biomarcador objetivo dependiendo del método de detección del ensayo que se empleará. Comúnmente el péptido seleccionado se comprende de entre 2 y 100 residuos de aminoácidos y preferiblemente contiene más de 10 residuos. Preferiblemente, la presente invención se practica con sustratos del péptido que imitan la secuencia de las regiones que rodean el enlace escindible en proteínas dirigidas al biomarcador objetivo naturales. Sin embargo, se aprecia que otros residuos de aminoácidos están opcionalmente sustituidos dentro de la secuencia. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de una secuencia pueden ser sustituidos por otro aminoácido de una polaridad similar que actúe como un equivalente funcional. Los sustituyentes para un aminoácido dentro de la secuencia se seleccionan ilustrativamente de otros miembros de la clase a la cual el aminoácido pertenece. Por ejemplo, los aminoácidos (hidrofóbicos) no polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina. Los aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina. Los aminoácidos (básicos) cargados positivamente incluyen arginina, Usina, e histidina. Los aminoácidos (ácidos) cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. También incluidos dentro del alcance de la presente invención están los ligandos o los fragmentos o los derivados de los mismos los cuales son diferencialmente modificados durante o después de la traducción, por ejemplo, mediante glicosilación, fosforilación, acetilación, sulfatación, unidos a una molécula del anticuerpo, u otros ligandos celulares.

También se aprecia que una sustitución apropiada es opcionalmente empleada que aumenta la interacción entre el biomarcador objetivo y un ligando o un sustrato de la misma. Un porcentaje de homología mayor de 50 por ciento se requiere y preferiblemente mayor de 90 por ciento. El porcentaje de homología es calculado mediante métodos estándar "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis", Macromolecular Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.

Alternativamente, el sustrato del péptido para el biomarcador objetivo se etiqueta con una biotina, una avidina, una peroxidasa de rábano picante, una estreptavidina, o una molécula de digoxina. Un ejemplo no limitante incluye ilustrativamente la adición de biotina a un residuo dentro del sustrato del péptido de tal manera que tras la división de un péptido de tamaño reducido conserva las moléculas de biotina que se purifica posteriormente en una columna de avidina para caracterización o cuantificación adicional.

Alternativamente, un sustrato experimenta una reacción colorimétrica. Por ejemplo el sustrato que contiene una p-nitroanilina u otro grupo conocido en la técnica resulta en un cambio de color en la solución después de la división del sustrato mediante un biomarcador objetivo. La creación de una especie que modifique el pH de la solución es también discernible a través de la supervisión colorimétrica de un indicador de pH, o el uso de un electrodo selectivo de ion. Tal ensayo colorimétrico se puede realizar continuamente o discontinuamente y es además favorable a formatos de ensayo basados en placa similares al FRET basado u otros ensayo de fluorescencia descritos antes.

El presente método inventivo es favorable a numerosos protocolos y aparatos de detección. En una modalidad preferida una muestra del analito es analizada mediante MALDI-TOF. MALDI-TOF tiene la ventaja de reconocer productos de división particulares mediante masas del péptido resultantes. La comparación con un estándar interno fija la masa del producto de división. En una modalidad preferida un estándar interno es un péptido isotópicamente etiquetado de siete unidades de masa mayores que y que corresponden a la secuencia del péptido de división objetivo. Al usar una relación del área bajo el pico que representa el péptido objetivo y que representa el estándar interno se obtiene una cantidad relativa del péptido objetivo. Los análisis de muestras en numerosos puntos de tiempo que siguen la adición del sustrato del péptido a la cámara de reacción permiten las mediciones cinéticas de la formación del producto y la determinación de la cantidad del biomarcador objetivo presente en la muestra biológica original. Se reconoce en la técnica que numeroso otras formas de espectrometría de masa se pueden emplear como métodos de detección en la presente invención como LC/MS/MS de ionización por electropulverización, etc.

En otra la modalidad preferida la detección de productos de división se realiza al usar un fluorómetro de sobremesa simple. El empleo del sustrato del péptido etiquetado dual con un grupo fluorescente colocado ya sea en terminal N o C al enlace escindible y un grupo neutralizante colocado a una distancia apropiada desde el grupo fluorescente en el extremo opuesto del enlace escindible permite la supervisión rápida y en tiempo real de la formación del producto de reacción seguido de la división del sustrato que reduce el FRET y dando por resultado un aumento en fluorescencia observable. Opcionalmente, la reacción es neutralizada mediante la adición de 1 mM de orto-fenantrolina/10 mM de EDTA después de que una cantidad de tiempo conocida haya transcurrido después de la adición del sustrato a la cámara de reacción. Se mide la magnitud de la fluorescencia y se compara con una curva estándar para la determinación de la formación del producto por el tiempo de unidad que entonces se relaciona de nuevo con la actividad desconocida del biomarcador objetivo en la reacción. El análisis de punto final es particularmente favorable de ser realizado en el formato de placa de 96 pozos para procesamiento robótico y mejora del rendimiento de evaluación. Se reconoce en la técnica que el ensayo continuo y de punto final y los métodos de detección son favorables para la miniaturización a 384 pozos, 1096 pozos, u otros formatos de ensayo basados en placa.

La presente invención también se emplea en los protocolos de evaluación para la identificación y los ensayos de vacunas candidato al permitir la rápida observación del grado al cual los anticuerpos generados por una vacuna neutralizan los efectos de la infección por virus del dengue en cambios del biomarcador objetivo.

Como la presente invención capitaliza en la cantidad de biomarcador objetivo en una muestra biológica, es operativa para predecir la progresión de la enfermedad en humanos que se han sometido a la infección por virus del dengue que pueden o no pueden haber sido pretratados con un candidato de vacuna. Una correlación se espera entre la eficacia de una vacuna y de los niveles del biomarcador objetivo presentes en una muestra biológica de un sujeto de prueba. Como tal, el muestreo de tejidos objeto o de muestras de fluido después de la iniciación de la infección proporciona una lectura en tiempo real del progreso de la infección.

Los siguientes ejemplos no se proponen para limitar el alcance de la invención reivindicada y en lugar de proporcionar modalidades de trabajo específicas. Mientras los datos proporcionados son para la vitronectina (Vn, por sus siglas en inglés), se aprecia que otros biomarcadores objetivo se analizan fácilmente de una manera similar.

EJEMPLOS Ejemplo 1 - Análisis de ELISA.

Los niveles de la Vn endógena en suero son determinados mediante ensayo de ELISA el usar el anticuerpo de Vn policlonal como captura y el ratón monoclonal como anticuerpo de detección. Se realizó el desarrollo de color al usar Abs conjugado de peroxidasa de rábano picante anti-ratón (HRP, por sus siglas en inglés) seguido por incubación del sustrato de tetrametilbencidina (TMB, por sus siglas en inglés). Se calcularon los niveles de Vn a partir de una curva de calibración basada en estándares de vitronectina.

Ejemplo 2 - Preparación de Perlas.

Se obtuvieron perlas cubiertas con anticuerpos a partir de una fuente comercial. Se usaron 20-100 µ? de suspensión de perlas para covalentemente ligar Abs anti-Vn de 100 µ? de muestra a las perlas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para separar las perlas se colocó el tubo de reacción en un imán durante 1 min y se desechó el sobrenadante resultante mediante aspiración. Se resuspendieron las perlas en solución salina amortiguada con fosfato con 0.05% de Tween20, pH 7.3 (PBS-TW) y se almacenaron hasta que esté listo para su uso. Se realizó lavado cuidadoso al repetir las etapas de granulación magnética y resuspensión tres veces.

Ejemplo 3 - Perlas Recubiertas con Anticuerpo Anti- Vitronectina Deseado.

Se prepararon perlas magnéticas recubiertas con anti-vitronectina (Vn-MABs, por sus siglas en inglés) al usar IgG anti-Vn monoclonal de ratón que se preparó de acuerdo con el protocolo del fabricante al usar 40 pg de lgG/100 ul de suspensión de perlas magnéticas.

Ejemplo 4 - Purificación y Concentración de Vn a partir de suero.

Se obtuvieron suero, plasma, fluido pleural, u otra muestra biológica a partir de un paciente. Se diluyó la muestra en 500 µ? de PBS-TW y se mezcló suavemente con 20 pl de Vn-MABs durante 1 hora. Se recuperaron las perlas con Vn unido, se lavaron tres veces en PBS-TW, después se reconstituyeron en PBS-TW para análisis adicionales mediante espectrometría de masa.

Ejemplo 5 - Prueba de Muestra.

Se recolectaron las muestras en Puerto Rico a partir de 30 pacientes adultos con DHF, 30 pacientes adultos con DF, y muestras negativas de virus del dengue a partir de pacientes adultos que presentan una enfermedad febril (DV-). El estándar usado en el ensayo es un conjunto de más de 100 donantes de plasma normal y se asignó un valor de 100%. Se proporcionaron los resultados para los niveles de vitronectina detectados mediante ELISA para los grupos en el diagrama de la Figura 3. En transferencia de tipo Western, se observaron las muestras de DHF para estar casi desprovistas de la isoforma madura de 75 kilodalton de vitronectina en comparación con las muestras de DF. Se observaron las muestras de DHF para incluir altos niveles de la forma de precursor de 55 kilodalton a partir de la vitronectina.

La Figura 4 muestra el resultado del análisis de las isoformas de vitronectina en las muestras de Puerto Rico (PR, por sus siglas en inglés) reunidas de 2° de infecciones de virus del dengue mediante análisis de transferencia de tipo Western. Los controles consistieron de la muestra de virus del dengue (-) a partir de PR y una muestra de OFI de Tailandia. Banda 1, conjunto de muestras de PR de virus del dengue (-); banda 2, conjunto de muestras de PR de fiebre por dengue; banda 3, conjunto de muestras de PR de fiebre hemorrágica por dengue (DHF, por sus siglas en inglés); banda 4, muestra de Tailandia de OFI. Las muestras de la forma más severa de la enfermedad, DHF, expresan más de la isoforma 54kDa cuando se comparan con las muestras de DF y expresan menos de la isoforma 75kDa comparada con las muestras de PR de DF y de Tailandia de OFI.

Se realizó el análisis de ELISA con las muestras de suero para pacientes que tiene grados variados de DF o de DHF con las muestras que venían de Tailandia. Como se muestra en la Figura 5, los pacientes con DHF expresan y exhiben niveles significativamente inferiores de vitronectina en plasma comparado con pacientes con DF. Los niveles de vitronectina de pacientes con DF en el grupo de muestra de Tailandia de acuerdo con el estudio de Puerto Rico en donde los niveles de vitronectina de pacientes con DF exceden los de sujetos sanos. En la Figura 5, además de trazar los sujetos con CIQ (sanos) que son equivalentes al virus del dengue en la Figura 3, los pacientes que sufren de niveles de vitronectina de hepatitis C también se trazan como un control positivo.

Ejemplo 6 - Ensayo de Flujo Lateral De acuerdo con las modalidades de la presente invención, la vitronectina es un biomarcador usado como diagnóstico de pronóstico para la severidad de la infección por virus del dengue. Un ensayo de flujo lateral se usa de acuerdo con las modalidades para determinar los niveles de vitronectina. Se optimizó el ensayo de flujo lateral y se desarrolló basado en el amortiguador usado para el flujo, los anticuerpos conjugados y los anticuerpos de captura para la vitronectina.

La etiqueta detectable usada en este ejemplo es un conjugado de oro de 40 nm, OD10. Esta etiqueta detectable se une a un anticuerpo de IgM anti-vitronectina obtenido comercialmente de Sigma, V7881. El anticuerpo de IgM anti-vitronectina se usa en una concentración de 12 ug/ml. Esta etiqueta detectable también se une a un anticuerpo de IgG anti-vitronectina obtenido comercialmente de Innovative Research, IHVN1H820. El anticuerpo de IgG anti-vitronectina se usa en una concentración de 10 ug/ml (IgG) de anti-VTN, Innovative Research, IHVN1H820.

Se probaron tiras de varios soportes porosos sólidos o semisólidos para el uso en los ensayo de flujo lateral para cuantificar la vitronectina. Las tiras son piezas de 60 mm x 5 mm de membrana de nitrocelulosa: HF180, Millipore, SHF1800425; HF090, Millipore, SHF0900225; CN140, Sartorius, 1 UN14AR050025; o AE99, Whatman 10548081.

La zona de detección de prueba es una línea de prueba aplicada a la membrana de nitrocelulosa como una aplicación de una sola pasada 0.7 mg/ml en 10 mM de fosfato de sodio, pH 7.7, o como una aplicación de doble pasada dando por resultado la deposición de 1.4 mg/ml de IgG. Se aplicó un punto de 1 microlitro de 0.5 mg/ml de IgM en 10 mM de Fosfato de Sodio, pH 7.7 como un control negativo.

La zona de detección de control es una línea de control de 0.5 mg/ml de IgG anti-ratón de cabra (GAM, por sus siglas en inglés) en 1XPBS, Quad Five, 4010101 aplicados a la membrana.

Se bloqueó la membrana de nitrocelulosa con 10 mM de fosfato de sodio, 0.1% de sucrosa, 0.1% de albúminas de suero bovino, 0.25% de polivinilpirrolidona (MW 40,000) (PVP-40), pH 7.2.

La almohadilla de conjugado es una almohadilla de conjugado de fibra de vidrio, comercialmente disponible como G041, Millipore, o GF33, Whatman, una almohadilla de conjugado de fibra de vidrio unida comercialmente disponible como Standard 17, Whatman, o una almohadilla de conjugado de poliéster comercialmente disponible como Ahlstrom 6615, Ahlstrom.

Se bloqueó la almohadilla de conjugado con 10 mM de borato, 3% de BSA, 1% de PVP-40, 25% de Tritón x-100, pH 8.

Una almohadilla absorbente de fibra de celulosa usada está comercialmente disponible como C083, Millipore.

Un soporte estructural usado es la tarjeta de soporte comercialmente disponible como MIBA-020.

Se probaron varios diluyentes de muestra para optimizar el ensayo de flujo lateral que incluye 1) "PBS + " el cual es 1X Solución Salina Amortiguada con Fosfato (PBS), 0.01% de Tween-20, 0.1% de BSA, 0.01% de azida sódica; Amortiguador de Análisis HIV el cual es 25 mM de Tris.1% de tripolifosfato de pentasodio, 0.1% de azida sódica, 0.1% de Tritón X-405, 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en inglés), 0.5% de caseína, pH 8; Amortiguador de Análisis A el cual es 10 mM de fosfato de sodio, 0.1% de sucrosa, 0.1% de gel de pescado, 0.25% de PVP-40; Amortiguador de Análisis B el cual es 200 mM de borato, 150 mM de cloruro de sodio (NaCI), 1% de caseína, 0.1% de Tween-20, pH 8.3; y Amortiguador de Análisis C el cual es 1X PBS, 0.1% de Tween-20.

El analito objetivo es vitronectina y se usan las muestras de suero del paciente y se comparan con una virtonectina estándar comercialmente obtenida, Sigma, V8379.

Se usó la prueba de Dipstick con conjugado de oro mojado para ensayar la vitronectina en muestras de suero del paciente en este ejemplo. Se colocaron los tubos de cultivo (VWR, 60818-306) verticalmente en un estante de tubo de prueba. En cada tubo, se agregaron 150 microlitros del control positivo o negativo. Para el suero de prueba, se mezclaron 10 microlitros de suero con 140 microlitros de amortiguador. Los tubos de prueba pueden ser agitados suavemente o una pipeta se puede usar para mezclar bien. Se pipetearon cinco microlitros de conjugado sobre el centro de la almohadilla de conjugado. Se redujo una sola tira en cada tubo de prueba durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se observaron el flujo de la muestra y el conjugado, el color de la membrana, y la formación de las líneas de prueba y de control. La muestra positiva debe producir líneas de color rosa en los reactivo de prueba y de control. La muestra negativa debe solamente producir color en el reactivo de control. La muestra que fluye encima de la tira debe alcanzar visiblemente el fieltro, y el fondo de membrana se debe quedar de color blanco. Se retira la tira del tubo, se desprendió la almohadilla absorbente, y se eliminó la almohadilla de conjugado. Los resultados se evaluaron visualmente al usar la escala de clasificación de DCN. La Tabla I muestra las condiciones usadas en ensayo de flujo lateral en este ejemplo.

El anticuerpo de captura IgG anti-vitronectina en la membrana de nitrocelulosa combinada con un conjugado del anticuerpo detector de IgM anti-vitronectina a pozos de trabajos de oro coloidal en este ensayo de flujo lateral. El ensayo es funcional con el Amortiguador de análisis B y el Amortiguador de análisis de VIH. El sistema constantemente detecta el analito objetivo en suero sin la descoloración del fondo o la unión no específica, y distingue entre las varias concentraciones.

Varias modificaciones de la presente invención, además de las mostradas y descritas en la presente, serán evidentes a los expertos en la técnica de la descripción anterior. Tales modificaciones también se proponen para caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Ejemplo 7 La Figura 6 es una gráfica que muestra las diferencias dependientes de la edad en concentraciones de vitronectina total (VTN, por sus siglas en inglés) en muestras de suero humano. Se realizó el ELISA de VTN cuantitativo a n =27 de fiebre por dengue (DF, por sus siglas en inglés) y n = 25 de fiebre hemorrágica por dengue (DHF, por sus siglas en inglés) a partir del Proyecto de Supervisión Mejorada de Puerto Rico localizado en Guayama. Se subdividieron las muestras por el estado de edad y de enfermedad (<15 años y 15-19 años; DF y DHF). Se diluyeron las muestras 1:50,000 y se determinaron las concentraciones de Vn al usar el cálculo de trasero de los valores de O.D. al usar la curva estándar. Se usaron controles de adultos sanos normales (>16 años de edad pero no de edad coincidente) en el ensayo. Los resultados indicaron que los individuos de <15 años de edad no tienen diferencias medibles en VTN entre el DF y DHF comparadas con pacientes de 15-19 años de edad. Los resultados de pacientes de 15-19 son también representativos de los resultados en adultos más viejos de 19 años de edad.

Secuencias SEC ID N0:1 precursor de vitronectina humana - Secuencia de Referencia de NCBI: NP_00Q629.3 - 478 aa iyLAPLRPLLILALLAWVALADQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVF TMPEDEYTVYDDGEEK NATVHEQVGGPSLTSDLQAQSKGNPEQTPVLKPEEEAPAPEVGASKPEGID SRPETLHPGRPQPPAEEELCSGKPFDAFTDLK GSLFAFRGQYCYELDE AVRPGYPKLIRDVWGIEG PIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRFEDGVLDPDYPR ISDGFDGIPDNVDAALALPAHSYSGRERVY FFKGKQYWEYQFQHQPSQEECEGSSLSAVFEHFAMMQRDSWEDIFELLF GRTSAGTRQPQFISRD H GVPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLA KQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRPSRATWLSLFSSE ESNLGAM YDDYRMDWLVPATCEPIQSVFFFSGDKYYRV LRTRRVDTVDPPYPRSIAQYWLGCPAPG HL SEC ID NO: 2 - Secuencia de ácido nucleico que codifica el precursor de vitronectina humana - 1434 nucleótidos atggcacccctgagaccccttctcatactggccctgctggcatgggttgctctggctgaccaagagtc atgcaagggccgctgcactgagggcttcaacgtggacaagaagtgccagtgtgacgagctctgctctt actaccagagctgctgcacagactatacggctgagtgcaagccccaagtgactcgcggggatgtg tc actatgccggaggatgagtacacggtctatgacgatggcgaggagaaaaacaatgccactgtccatga acaggtggggggcccctccctgacctctgacctccaggcccagtccaaagggaatcctgagcagacac ctgttctgaaacctgaggaagaggcccctgcgcctgaggtgggcgcctctaagcctgaggggatagac tcaaggcctgagacccttcatccagggagacctcagcccccagcagaggaggagctgtgcagtgggaa gcccttcgacgccttcaccgacctcaagaacggttccctctttgccttccgagggcagtactgctatg aactggacgaaaaggcagtgaggcctgggtaccccaagctcatccgagatgtctggggcatcgagggc cccatcgatgccgcc cacccgcatcaactgtcaggggaagacctacctcttcaagggtagtcagta ctggcgctttgaggatggtgtcctggaccctgattacccccgaaatatctctgacggcttcgatggca tcccggacaacgtggatgcagccttggccctccctgcccatagctacagtggccgggagcgggtctac ttcttcaaggggaaacagtactgggagtaccagttccagcaccagcccagtcaggaggagtgtgaagg cagctccctgtcggctgtgtttgaacactttgccatgatgcagcgggacagctgggaggacatcttcg agcttctcttctggggcagaacctctgctggtaccagacagccccagttcattagccgggactggcac ggtgtgccagggcaagtggacgcagccatggctggccgcatctacatctcaggcatggcaccccgccc ctcettggccaagaaacaaaggtttaggcatcgcaaccgcaaaggctaccgttcacaacgaggccaca gccgtggccgcaaccagaactcccgccggccatcccgcgccacgtggctgtccttgttctccagtgag gagagcaacttgggagccaacaactatgatgactacaggatggactggcttgtgcctgccacctgtga acccatccagagtgtcttct cttctctggagacaagtactaccgagtcaatcttcgcacacggcgag tggacactgtggaccctccctacccacgctccatcgctcagtactggctgggctgcccagctcctggc catetg SEC ID NO: 3 Vitronectina humana madura - 459 aa DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFT PEDEYTVYDDGEE NNA TVHEQVGGPSLTSDLQAQSKGNPEQTPVL PEEEAPAPEVGASKPEGIDSRPETLHPGRPQPPAEEEL CSGKPFDAFTDLKNGSLFAFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLIRDVWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFK GSQYWRFEDGVLDPDYPRNISDGFDGIPDNVDAALALPAHSYSGRERVYFFKGKQYWEYQFQHQPSQE ECEGSSLSAVFEHFAMMQRDBWEDIFELLFWGRTSAGTRQPQFISRDWHGVPGQVDAAMAGRIYISG APRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRPSRATWLSLFSSEESNLGA NYDDYR DWLVP ATCEPIQSVFFFSGDKYYRVNLRTRRVDTVDPPYPRSIAQY LGCPAPGHL SEC ID NO: 4 - Secuencia de ácido nucleico que codifica la vitronectina humana madura - 1377 nucleótidos gaccaagagtcatgcaagggccgctgcactgagggcttcaacgtggacaagaagtgccagtgtgacga gctctgctcttactaccagagctgctgcacagactatacggctgagtgcaagccccaagtgactcgcg gggatgtgttcactatgccggaggatgagtacacggtctatgacgatggcgaggagaaaaacaatgcc actgtccatgaacaggtggggggcccctccctgacctctgacctccaggcccagtccaaagggaatcc tgagcagacacctgttctgaaacctgaggaagaggcccctgcgcctgaggtgggcgcctctaagcctg aggggatagactcaaggcctgagacccttcatccagggagacctcagcccccagcagaggaggagctg tgcagtgggaagcccttcgacgccttcaccgacctcaagaacggttccctctttgccttccgagggca gtactgctatgaactggacgaaaaggcagtgaggcctgggtaccccaagctcatccgagatgtctggg gcatcgagggccccatcgatgccgccttcacccgcatcaactgtcaggggaagacctacctcttcaag ggtagtcagtactggcgctttgaggatggtgtcctggaccctgattacccccgaaatatctctgacgg cttcgatggcatcccggacaacgtggatgcagccttggccctccctgcccatagctacagtggccggg agcgggtctacttcttcaaggggaaacagtactgggagtaccagttccagcaccagcccagtcaggag gagtgtgaaggcagctccctgtcggctgtgtttgaacactttgccatgatgcagcgggacagctggga ggacatcttcgagcttctcttctggggcagaacctctgctggtaccagacagccccagttcat agcc gggactggcacggtgtgccagggcaagtggacgcagccatggctggccgcatctacatctcaggcatg gcaccccgcccctccttggccaagaaacaaaggtttaggcatcgcaaccgcaaaggctaccgttcaca acgaggccacagccgtggccgcaaccagaactcccgccggccatcccgcgccacgtggctgtccttgt tctccagtgaggagagcaacttgggagccaacaactatgatgactacaggatggactggcttgtgcct gccacctgtgaacccatccagagtgtcttcttcttctctggagacaagtactaccgagtcaatcttcg cacacggcgagtggacactgtggaccctccctacccacgctccatcgctcagtactggctgggctgcc cagctcctggccatctg Las patentes y las publicaciones mencionadas en la especificación son indicativas de los niveles de los expertos en la técnica a quienes la invención pertenece. Estas patentes y publicaciones se incorporan en la presente por referencia al ; mismo grado como si cada solicitud o publicación individual fuera incorporada específicamente e individualmente en la presente por referencia.

La descripción anterior es ilustrativa de las modalidades particulares de la invención, pero no se entiende para ser una limitación sobre la práctica de la misma. Las siguientes reivindicaciones, que incluye todos los equivalentes de las ; mismas, se proponen para definir el alcance de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano que comprende: obtener una muestra biológica del sujeto humano; y cuantificar la vitronectina en la muestra, donde la cantidad de vitronectina presente en la muestra es indicativa de la severidad de la infección por virus del dengue en el sujeto humano.

2. El proceso de la reivindicación 1, donde la cuantificación de vitronectina comprende inmunoensayo y/o espectrometría de masa.

3. El proceso de la reivindicación 1, donde la muestra biológica es seleccionada del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero, fluido extracelular, fluido citosólico, y tejido.

4. El proceso de la reivindicación 1, adicionalmente comprende purificar la vitronectina a partir de la muestra biológica antes de cuantificar la vitronectina.

5. El proceso de la reivindicación 2, donde el inmunoensayo es un ELISA o un ensayo de captura del antígeno.

6. El proceso de la reivindicación 5, donde el ensayo de : captura del antígeno es un ensayo de flujo lateral.

7. Un proceso para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano que comprende: obtener una primera muestra biológica del sujeto humano en un primer momento durante la fase febril aguda de infección por virus del dengue; obtener una segunda muestra biológica del sujeto humano en un segundo momento después del primer momento durante la fase febril aguda o la fase crítica de infección por virus del dengue; cuantificar la vitronectina en la primera muestra biológica para obtener un primer nivel de vitronectina; cuantificar la vitronectina en la segunda muestra biológica para obtener un segundo nivel de vitronectina; y comparar el primer nivel de vitronectina y el segundo nivel de vitronectina para evaluar la infección por virus del dengue en el sujeto humano, donde una disminución en el segundo nivel de vitronectina comparado al primer nivel de vitronectina indica que la infección por virus del dengue está progresando de la fiebre por dengue a la fiebre hemorrágica por dengue.

8. El proceso de la reivindicación 7, donde la cuantificación de vitronectina comprende inmunoensayo y/o espectrometría de masa.

9. El proceso de la reivindicación 7, donde la primera muestra biológica y la segunda muestra biológica se seleccionan del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero, fluido extracelular, fluido citosólico, y tejido.

10. El proceso de la reivindicación 7, adicionalmente comprende purificar la vitronectina a partir de la primera muestra biológica y de la segunda muestra biológica antes de cuantificar la vitronectina.

11. El proceso de la reivindicación 8, donde el inmunoensayo es un ensayo de ELISA o un ensayo de captura del antígeno.

12. El proceso de la reivindicación 11, donde el ensayo de captura del antígeno es un ensayo de flujo lateral.

13. Un dispositivo de inmunoensayo de vitronectina, que comprende: un soporte poroso sólido o semisólido que comprende un agente de unión capaz de unirse específicamente a un primer epítopo de vitronectina.

14. El dispositivo de inmunoensayo de vitronectina de la reivindicación 13, adicionalmente comprende una almohadilla de conjugado que comprende un agente de unión detectablemente etiquetado capaz de unirse específicamente a un segundo epítopo de vitronectina.

15. El dispositivo de inmunoensayo de vitronectina de la reivindicación 13, adicionalmente comprende una almohadilla de conjugado que comprende una vitronectina detectablemente etiquetada.

16. El dispositivo de inmunoensayo de vitronectina de la reivindicación 14 o 15, adicionalmente comprende una almohadilla absorbente.

17. El dispositivo de inmunoensayo de vitronectina de cualquiera de reivindicaciones 13-16, adicionalmente comprende un alojamiento que al menos parcialmente encierra la almohadilla de conjugado, el soporte poroso sólido o semisólido, y/o la almohadilla absorbente.

18. Un proceso para evaluar una enfermedad febril en un sujeto humano que comprende: obtener una muestra de suero, de plasma o de sangre entera del sujeto humano; cuantificar la vitronectina en la muestra para determinar el nivel de vitronectina en la muestra; y comparar el nivel de vitronectina con un estándar o un control para diferenciar la fiebre por dengue o la otra enfermedad febril a partir de dengue severo.

19. Un proceso para evaluar la infección por virus del dengue en un sujeto humano sustancialmente como se describe en la presente.

20. Un dispositivo de inmunoensayo para cuantificar la vitronectina sustancialmente como se describe en la presente.