KR20150113162A - 생체 점막 유래 검체 측정 면역검정에 있어서 위음성을 억제하는 방법 - Google Patents

생체 점막 유래 검체 측정 면역검정에 있어서 위음성을 억제하는 방법 Download PDF

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Abstract

생체 점막 유래 검체에 포함되는 면역검정(immunoassay) 저해 물질의 기능을 억제하고, 피검출 물질을 정확하게, 특이적으로 검출하는 것을 과제로 한다.
생체 점막 유래 검체 중의 피검출 물질을 측정하는 면역검정에 있어서, 황산기를 2개 이상 가지는 화합물을 포함하는 검체 처리액으로 검체를 처리함으로써, 위음성(false negative)을 억제할 수 있다.

Description

생체 점막 유래 검체 측정 면역검정에 있어서 위음성을 억제하는 방법{METHOD FOR REDUCING FALSE NEGATIVES IN IMMUNOASSAY FOR ASSAYING BIOMEMBRANE-DERIVED SPECIMEN}
본 발명은, 생체 점막 유래 검체를 사용한 면역검정(immunoassay)에 있어서, 검체 중의 피검출 물질을 정확하게, 특이적으로 검출하기 위한 검체 처리액의 조성(組成) 및 전처리(前處理) 방법에 관한 것이다.
생체 유래 검체로부터 피검출 물질을 검출하는 방법으로서, Enzyme Linked I㎜uno Assay, 면역크로마토그래피법(immunochromatography), 자동 분석 장치에 의한 라텍스 비탁법 등을 예로 들 수 있다. 이들 방법에서 사용하는 검체종으로서는, 혈액, 혈청, 객담(sputum), 타액, 인두(咽頭)를 닦은 액, 비강(鼻腔)을 닦은 액, 비강 흡인액, 각결막(角結膜)을 닦은 액 검체 등이 있다.
혈액, 혈청을 제외하고, 이들 검체종의 상당수는, 생체 점막 유래의 검체이며, 점막 면역계로부터 유래하는 생체 방어 성분을 많이 포함한다. 이 성분은 면역검정에 의한 피검출 물질의 검출에 있어서, 위양성(false positive)이나 위음성(false negative)의 원인이 되는 것으로 알려져 있다(특허 문헌 1 등을 참조).
또한, 면역크로마토그래피를 원리로 하는 신속 진단약의 상당수는, 바이러스 또는 세균의 감염증을 신속·간편하게 검출하고, 치료 방침을 결정하는 하나의 수단으로서 널리 사용되고 있다.
전술한 위양성이나 위음성은, 면역크로마토그래피를 원리로 하는 신속 진단약에 있어서, 잘못된 치료를 촉진하고, 치료를 늦추어, 죽음에 이르는 경우도 있다. 특히, 위음성은 정확한 진단·치료의 방해가 되므로, 매우 커다란 문제이다.
일본공개특허 제2009-52945호 공보
생체 점막 유래 검체에 포함되는 면역검정 저해 물질의 기능을 억제하고, 피검출 물질을 정확하게, 특이적으로 검출하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 생체 점막 유래 검체를 처리하는 처리액에 2개 이상의 황산기를 가지는 분자를 가함으로써, 피검출 물질을 정확하게, 또한 특이적으로 검출할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하에 나타낸 바와 같다.
[1] 생체 점막 유래 검체 중의 피검출 물질을 측정하는 면역검정에 있어서, 황산기를 2개 이상 가지는 화합물을 포함하는 검체 처리액으로 검체를 처리하는 것을 포함하는, 위음성을 억제하는 방법.
[2] 생체 점막 유래 검체가, 객담, 타액, 인두를 닦은 액, 비강을 닦은 액, 비강 흡인액, 각결막을 닦은 액 및 분변(糞便)으로부터 선택되는 검체인, [1]의 방법.
[3] 황산기를 2개 이상 가지는 화합물이, PIPES(피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산)) 또는 덱스트란 황산염인 [1] 또는 [2]의 방법.
[4] 덱스트란 황산염이 평균 분자량 5,000∼500,000의 덱스트란 황산 나트륨인, [3]의 방법.
[5] 검체 처리액 중에 황산기를 2개 이상 가지는 화합물이 0.1∼2 (w/v)%의 농도로 포함되는, [1]∼[4] 중 어느 하나의 방법.
[6] 면역검정이 면역크래마토그래피법에 의한 면역검정인, [1]∼[5] 중 어느 하나의 방법.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2013-017134호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
생체 점막 유래 검체를 황산기를 2개 이상 가지는 화합물을 포함하는 검체 처리액으로 처리함으로써, 생체 점막 유래 검체를 사용한 면역검정의 위음성을 억제할 수 있고, 피검출 물질의 정확한 검출이 가능하게 된다.
이하에서, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은, 면역검정에 있어서, 위양성 및 위음성, 특히 위음성을 방지하여, 피검출 물질을 정확하게 측정하는 방법이다. 여기서, 위양성이란, 검체 중에 피검출 물질이 포함되어 있지 않음에도 불구하고, 어세이에 있어서 양성을 나타내는 시그널이 발생하는 것을 말하여, 위음성이란, 검체 중에 피검출 물질이 포함되어 있음에도 불구하고, 어세이에 있어서 양성을 나타내는 시그널이 발생하지 않는 것을 말한다. 예를 들면, 면역크로마토그래피법에 있어서는, 검체 중에 피검출 물질이 존재하는 경우, 고정화한 물질-피검출 물질-표지 시약의 복합체가 고상(固相) 지지체 상에 형성되고, 상기 복합체로부터 발하는 표지 시약의 시그널이 발생하지만, 위음성에 있어서는, 상기한 복합체가 형성되지 않은 등의 이유에 의해 시그널의 발생이 저해된다.
본 발명의 방법에 있어서, 측정 대상이 되는 생체 점막 유래 검체는, 생체의 점막 유래의 물질이 혼입되어 있는 검체를 말하여, 비인두(鼻咽頭) 점막 유래 검체나 구강 점막 유래 검체가 있으며, 구체적으로는, 객담, 타액, 인두를 닦은 액, 비강을 닦은 액, 비강 흡인액, 각결막을 닦은 액, 분변 검체 등이 포함된다. 생체 점막 유래 검체 중에는 점막 면역계에 관여하는 IgA 등의 생체 방어 성분이 포함되고, 이들 성분이 면역검정의 반응을 저해하여 위양성이나 위음성의 원인이 될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 측정 대상이 되는 피검출 물질은 면역검정, 즉 항원 항체 반응을 이용한 어세이로 측정할 수 있는 항원 또는 항체이다. 항원으로서는 항체를 제조할 수 있는 것이라면 어떤 항원이라도 되며, 예를 들면, 단백질, 다당류, 지질(脂質) 등이 있다. 이들 물질을 포함하는 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라즈마(mycoplasma), 리케차(rickettsia), 클라미디아(chlamydia), 바이러스 등 도 검출할 수 있다.
본 발명의 방법에서 위양성 및 위음성, 특히 위음성을 방지하고, 피검출 물질을 정확하게 측정하기 위한 측정계는, 측정 대상인 피검출 물질에 대한 항체를 사용하거나, 또는 측정 대상인 항체에 결합하는 항원을 사용하는 항원 항체 반응을 이용한 측정계인 면역검정이다. 이와 같은 측정계로서, ELISA, 면역크로마토그래피법, 응집법, 자동 분석 장치에 의한 라텍스 비탁법, 웨스턴 블로팅, 면역블로팅 등을 예로 들 수 있다. 이 중에서도, 점막 유래 물질의 영향을 받기 쉬운 면역크로마토그래피법이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서는, 생체 점막 유래 검체를, 1분자 중에 황산기를 2개 이상 가지는 화합물에 의해 전처리를 행한다. 여기서 1분자 중에 황산기를 2개 이상 가지는 화합물에 의한 전처리는, 채취된 생체 점막 유래 검체를 1분자 중에 황산기를 2개 이상 가지는 화합물을 포함하는 검체 처리액에 첨가하여 혼합함으로써 행할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 생체 점막 유래 검체에 전처리 액으로서의 검체 처리액을 첨가하여 혼합하고, 생체 점막 유래 검체 중의 측정 대상인 물질을 검체 처리액에 의해 처리하는 것을 생체 점막 유래 검체의 전처리라고 한다.
1분자 중에 황산기를 2개 이상 가지는 화합물로서는, PIPES(피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산)), 덱스트란 황산 나트륨(DSS) 등의 덱스트란 황산염을 예로 들 수 있다. PIPES는 C8H18N2O6S2로 표시되는 화합물이며 분자 중에 2개의 황산기를 가진다. 덱스트란 황산 나트륨은 (C11H12O28S6.6Na)n으로 표시되는 화합물이며 중합도에 따라 분자량이 상이하며 분자량은 1,000∼500,000 정도(평균 분자량 1,600∼500,000)다. 덱스트란 황산 나트륨은, 각종 평균 분자량을 가지는 것이 시판되고 있으며, 예를 들면, 평균 분자량이 약 1,600인 것, 평균 분자량이 약 5,000인 것(분자량 1,000∼9,000), 6,500∼10,000인 것, 9,000∼20,000인 것, 약 500,000인 것 등이 있다. 황산기의 수는 분자량에 의존하고 있고, 덱스트란 황산 나트륨은 거의 100% 황화되어 있으므로, 평균 분자량으로부터 황산기의 수를 산출할 수 있다. 예를 들면, 평균 분자량 약 5,000인 것(분자량 1,000∼9,000)의 황산기의 수는 약 30, 평균 분자량 6,500∼10,000인 것의 황산기의 수는 약 55, 평균 분자량 9,000∼20,000인 것의 황산기의 수는 약 94, 평균 분자량 500,000인 것의 황산기의 수는 약 3253이다. 본 발명의 1분자 중에 황산기를 2개 이상 가지는 화합물로서는, 평균 분자량 1,600∼500,000인 것, 또는 평균 분자량 5,000∼500,000인 것을 사용할 수 있다. 덱스트란 황산 나트륨의 분자량은 높을수록, 저농도에서도 위음성화를 억제할 수 있으므로, 덱스트란 황산염 중에서도 분자량 500,000인 덱스트란 황산 나트륨이 바람직하다.
본 발명의 방법에서의 전처리는, 생체 점막 유래 검체에, 1분자 중에 황산기를 2개 이상 가지는 화합물을 포함하는 검체 처리액을 첨가제로서 첨가하고, 검체를 검체 처리액 중에 부유(浮遊)시킨다. 검체 처리액에는, 완충액에 1분자 중에 황산기를 2개 이상 가지는 화합물 외에, 계면활성제, BSA(소혈청 알부민), 염 등을 포함하게 하면 된다. 완충액은 한정되지 않지만, pH 6∼9 정도의 트리스 완충액, 인산 완충액을 사용할 수 있다. 계면활성제도 한정되지 않으며, 면역검정에서 통상 사용되는, Triton X-100, Tween 20, Tween 80, Pluronic, 도데실황산 나트륨(SDS) 등을 사용할 수 있다. 그리고, 1분자 중에 황산기를 2개 이상 가지는 화합물로서, 완충 작용을 가지는 화합물을 사용할 수도 있다. 예를 들면, 상기한 PIPES는 굿 완충액의 하나이다. 이 경우에도, 트리스 완충액 등의 완충액을 완충 작용을 가지는 물질로서 첨가하면 된다.
검체 처리액 중의 1분자 중에 황산기를 2개 이상 가지는 화합물의 농도는 0.1∼2 (w/v)%, 바람직하게는 0.1∼1 (w/v)%, 더욱 바람직하게는 0.25∼0.75 (w/v)%, 특히 바람직하게는 0.4∼0.6 (w/v)%이다.
예를 들면, 검체 처리액 수백 μl, 바람직하게는 200∼800 μl에, 상기한 검체를 첨가하고, 양호하게 교반하여 검체를 부유시키면 된다. 예를 들면, 검체가 타액인 경우, 검체 채취용 면봉에 타액을 포함시키고 타액이 포함된 면봉을 검체 처리액에 침지하고, 검체를 부유시키면 된다. 또한, 검체가 인두를 닦은 액인 경우, 면봉을 사용하여 인두의 점막을 채취한 후, 면봉을 검체 처리액에 침지하고, 검체를 부유시키면 된다.
생체 점막 유래 검체를 검체 처리액에 부유시키고, 검체를 부유시킨 검체 처리액을 검체로 하여 항원 항체 반응을 이용한 측정계에서 피검출 물질을 측정하면 된다. 검체를 검체 처리액에 혼합하고 양호하게 교반하여 부유시키면 바로 어세이에 사용할 수 있다. 예를 들면, 면역크로마토그래피법에 있어서는, 니트로셀룰로오스막 등의 적절한 고상 지지체 상에 항체 등의 피검출 물질과 결합할 수 있는 물질을 고정화하고, 상기 고상 지지체에 모세관 현상을 이용하여, 착색 폴리스티렌 입자나 금 콜로이드 등의 적절한 표지 물질로 표지한 피검출 물질(표지 시약)과 결합할 수 있는 물질과 피검출 물질의 복합체를 전개 이동시킨다. 그 결과, 고정화한 물질-피검출 물질-표지 시약의 복합체가 고상 지지체 상에 형성되고, 상기 복합체로부터 발하는 표지 시약의 시그널(금 콜로이드의 경우에는, 피검출 물질과 결합할 수 있는 물질을 고정화한 고상 지지체 부분이 적색으로 됨)을 검출함으로써, 피검출 물질을 검출할 수 있다.
면역검정은, 5∼35 ℃, 바람직하게는 실온에서 행할 수 있고, 생체 점막 유래 검체의 검체 처리액에 의한 처리도 이 온도 범위 내에서 행하면 된다.
또한, 본 발명은 1분자 중에 황산기를 2개 이상 가지는 화합물을 포함하는 검체 처리액으로서, 생체 점막 유래 검체를 측정하는 면역검정에 있어서 위음성을 억제하기 위한 검체 처리액을 포함하고, 또한 상기 검체 처리액을 포함하는, 생체 점막 유래 검체를 측정하는 면역검정에 있어서 위음성을 억제하기 위한 면역검정 키트도 포함한다. 상기 면역검정 키트는, 예를 들면, 면역크로마토그래피법을 행하기 위한 시약을 포함한 면역크로마토그래피용 디바이스 등을 포함한다.
[실시예]
본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
조제예
1. 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 모노클로날 항체의 제작
B형 인플루엔자 바이러스 항원을 BALB/c 마우스에 면역하고, 일정 기간 사육한 마우스로부터 비장을 적출하고, 콜러 등의 방법(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))에 의해 마우스 골수종(myeloma) 세포(P3×63)와 융합했다. 얻어진 융합 세포(하이브리도마(hybridoma))를, 37℃ 인큐베이터 중에서 유지하고, B형 인플루엔자 바이러스 NP 항원을 고상한 플레이트를 사용한 ELISA에 의해 상청액의 항체 활성을 확인하면서 세포의 순화(純化)(단클론화)를 행하였다. 취득한 상기 세포 2주를 각각 프리스탄(pristane) 처리한 BALB/c 마우스에 복강 투여하고, 약 2주일 후, 항체 함유 복수(腹水)를 채취하였다.
얻어진 복수로부터 프로틴 A 컬럼을 사용한 친화성 크로마토그래피법(affinity chromatography)에 의해, 각각 IgG를 정제하고, 2종류의 정제 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체를 얻었다.
2. 항B형 인플루엔자 바이러스 항체의 니트로셀룰로오스 멤브레인(membrane)으로의 고정화
정제한 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체를 1.0 mg/mL가 되도록 정제수로 희석한 액을 PET 필름으로 백킹(backing)된 니트로셀룰로오스 멤브레인의 소정의 위치에 선형으로 도포하고, 45℃, 30분간 건조시켜, 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 고정화 멤브레인을 얻었다(이하, 항체 고정화 멤브레인이라고 함).
3. 항B형 인플루엔자 바이러스 항체의 착색 폴리스티렌 입자로의 고정화
니트로셀룰로오스 멤브레인으로의 고정화에 사용하지 않았던 다른 하나의 정제한 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체를 1.0 mg/mL로 되도록 정제수로 희석하고, 여기에 착색 폴리스티렌 입자(Thermo scientific사 제조)를 0.1(w/v)%로 되도록 가하고, 교반한 후, 카르보디이미드를 1(w/v)%로 되도록 가하고, 더욱 교반한다. 원심 분리 조작에 의해 상청액을 제거하고, 50 mM Tris(pH 9.0), 3(w/v)% BSA에 재부유하여, 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 결합 착색 폴리스티렌 입자를 얻었다.
4. 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 결합 착색 폴리스티렌 입자의 도포·건조
3.에서 얻은 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 결합 착색 폴리스티렌 입자를 유리 섬유 부직포에 소정량 1.0μg을 도포하고, 45℃, 30분간 건조시켰다.
5. 고정화 멤브레인, 건조 패드, 다른 부재와의 접합
2. 및 4.에서 조제한 항체 고정화 멤브레인과 건조 패드를 다른 부재(백킹 시트, 흡수대(샘플 패드))와 접착하고 5 ㎜ 폭으로 절단하고, 인플루엔자 바이러스 B형 시험편으로 하였다.
6. 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 모노클로날 항체의 제조
A형 인플루엔자 바이러스 항원을 BALB/c 마우스에 면역하고, 일정 기간 사육한 마우스로부터 비장을 적출하고, 콜러 등의 방법(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))에 의해 마우스 골수종 세포(P3×63)와 융합했다. 얻어진 융합 세포(하이브리도마)를, 37℃ 인큐베이터 중에서 유지하고, A형 인플루엔자 바이러스 NP 항원을 고상한 플레이트를 사용한 ELISA에 의해 상청액의 항체 활성을 확인하면서 세포의 순화(단클론화)를 행하였다. 취득한 상기 세포 2주를 각각 프리스탄 처리한 BALB/c 마우스에 복강 투여하고, 약 2주일 후, 항체 함유 복수를 채취하였다.
얻어진 복수로부터 프로틴 A 컬럼을 사용한 친화성 크로마토그래피법에 의해, 각각 IgG를 정제하여, 2종류의 정제 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체를 얻었다.
7. 항A형 인플루엔자 바이러스 항체의 니트로셀룰로오스 멤브레인으로의 고정화
정제한 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체를 1.0 mg/mL로 되도록 정제수로 희석한 액을 PET 필름으로 백킹된 니트로셀룰로오스 멤브레인의 소정의 위치에 선형으로 도포하고, 45℃, 30분간 건조시켜, 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 고정화 멤브레인을 얻었다(이하, 항체 고정화 멤브레인이라고 함).
8. 항A형 인플루엔자 바이러스 항체의 착색 폴리스티렌 입자로의 고정화
니트로셀룰로오스 멤브레인으로의 고정화에 사용하지 않았던 다른 하나의 정제한 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체를 1.0 mg/mL로 되도록 정제수로 희석하고, 여기에 착색 폴리스티렌 입자를 0.1(w/v)%로 되도록 가하고, 교반한 후, 카르보디이미드를 1(w/v)%로 되도록 가하고, 더욱 교반한다. 원심 분리 조작에 의해 상청액을 제거하고, 50 mM Tris(pH 9.0), 3(w/v)% BSA에 재부유하여, 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 결합 착색 폴리스티렌 입자를 얻었다.
9. 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 결합 착색 폴리스티렌 입자의 도포·건조
8.에서 얻은 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 결합 착색 폴리스티렌 입자를 유리 섬유 부직포에 소정량 1.0μg을 도포하고, 45℃, 30분간 건조시켰다.
10. 고정화 멤브레인, 건조 패드, 다른 부재와의 접합
7. 및 9.에서 조제한 항체 고정화 멤브레인과 건조 패드를 다른 부재, 배킹 시트, 흡수대, 샘플 패드와 접착하고 5 ㎜ 폭으로 절단하여, 인플루엔자 바이러스 A형 시험편으로 하였다.
실시예 1 B형 인플루엔자 바이러스 항원 검출 면역크로마토그래피법에서의 타액 검체에 의한 위음성화 억제 효과의 검증
10 mM Tris(pH 7.0), 3(w/v)% BSA, 0.2(w/v)% Triton X-100을 대조군으로 하고, 황산기를 가지는 첨가제로서, 1분자당 황산기를 1개 가지는 완충액인 MES, 황산기를 2개 가지는 완충액인 PIPES, 음이온성 계면활성제인 도데실황산 나트륨(이하 SDS, 황산기 1개/분자), 디옥시콜산 나트륨(이하 DOC, 황산기 0/분자), 음이온성 폴리머인 폴리아크릴산 나트륨(이하 SPA, 황산기 0/분자), 덱스트란 황산 나트륨(이하 DSS, 황산기는 덱스트란 분자량에 의존함), 대조군으로서 덱스트란(이하 DEX, 황산기 0/분자)에 대하여 검증을 행하도록, 각각의 조성의 검체 처리액을 조제하였다(상세한 것은 표 1 참조). 황산기를 가지는 첨가제는 완충액에 0.5(w/v)%첨가하였다. 표 1의 6∼9의 덱스트란 황산 나트륨은 SIGMA사로부터 입수했다(카탈로그 번호는, 각각, D8906, D6921, D4911 및 D7037이다).
면봉(Ex 스와브 001; 덴카세이켄사 제조)을 입에 넣어, 타액을 양호하게 흡수시키고, 이것을 각각의 조성의 검체 처리액 400μL에 각각 부유하였다. 여기에 불활화(不活化) B형 인플루엔자 바이러스를 30μL 가하고, 혼합하였다. 혼합액 50μL를 인플루엔자 바이러스 B형 시험편의 샘플 패드 부분에 적가(滴加)하고, 10분 후에 육안으로 판정을 행하였다. B형 테스트 라인 상에 시그널을 확인할 수 있었던 것을 ＋로 하고, 시그널이 명확하게 약한 것을 ＋weak, 시그널이 있는지의 여부가 판단하기 어려운 경우를 ±, 시그널을 확인할 수 없었던 것을 －로 하였다. 또한, 동시에 타액 없음에 대해서도 시험을 실시하고, 처리액의 조성에 의한 반응계에 대한 영향을 확인하였다.
[표 1] 검체 처리액 조성과 검정하는 분자당의 황산기 수
Figure pct00001
결과로서, 대조군이 타액에 의해 위음성화되는 것에 대하여, 황산기를 가지는 완충액인 MES, PIPES는 위음성화를 억제할 수 있으며, 특히 2개의 황산기를 가지는 PIPES에서 효과가 높았다. 음이온성 계면활성제에서는, 타액을 가하지 않은 계에 있어서, 반응을 저해하는 경향이 관찰되었고, SDS에 대해서는, 타액에 의한 위음성화를 약간 억제할 수 있지만, 현저한 감도 저하가 인정되었다. 이들 계면활성제는 니트로셀룰로오스에 고정화한 항체의 탈리(脫離)를 초래하거나, 또는 그 변성 효과에 의하여, B형 인플루엔자 바이러스 NP 항원 또는 항B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체를 변성시키고 있을 가능성이 있다. 음이온성 폴리머에서는, 카르복실기를 가지는 폴리아크릴산 나트륨에서 효과가 없는 데 비해, 황산기를 가지는 덱스트란 황산 나트륨에서는 위음성화를 거의 완전히 억제할 수 있다. 덱스트란 황산 나트륨의 대조군인 덱스트란에서는 효과는 없었다.
이상의 결과로부터, 황산기를 2개 이상 가지는 분자를 처리액에 가함으로써 타액 검체에 의한 위음성화를 억제할 수 있는 것이 증명되었다. 여기에 데이터는 나타내고 있지 않지만, 덱스트란 황산 나트륨의 분자량은 높을수록, 저농도에서도 위음성화를 억제할 수 있고, 저분자량에서는 고농도로 사용할 필요가 있었다. 따라서, 실시예 2 이후에서는 평균 분자량이 500,000인 덱스트란 황산 나트륨을 사용하여 검증하기로 했다.
얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2] 황산기를 가지는 분자의 타액 검체의 의한 위음성 억제 효과(인플루엔자 바이러스 B형)
Figure pct00002
실시예 2 A형 인플루엔자 바이러스 항원 검출 면역크로마토그래피법에서의 타액 검체에 의한 위음성화 억제 효과의 검증
실시예 1에서 가장 효과가 높았던 검체 처리액 No.6을 사용하여, A형 인플루엔자 바이러스 항원 검출 면역크로마토그래피법에서의 타액에 의한 위음성화 억제 효과의 검증을 행하였다.
면봉(Ex 스와브 001; 덴카세이켄사 제조)을 입에 넣고, 타액을 양호하게 흡수시키고, 이것을 각각의 조성의 검체 처리액 400μL에 각각 부유하였다. 여기에 불활화 A형 인플루엔자 바이러스를 30μL 가하고, 혼합하였다. 혼합액 50μL를 인플루엔자 바이러스 A형 시험편의 샘플 패드 부분에 적가하고, 10분 후에 육안으로 판정을 행하였다.
그 결과, 실시예 1과 마찬가지로 검체 처리액 No.6을 사용함으로써, 타액에 의한 위음성화를 억제할 수 있었다(표 3에 정리하여 나타냄).
[표 3] 황산기를 가지는 분자의 타액 검체의 의한 위음성 억제 효과(인플루엔자 바이러스 A형)
Figure pct00003
실시예 3 A형 및 B형 인플루엔자 바이러스 항원 검출 면역크로마토그래피법에서의 비인두를 닦은 검체에 의한 위음성화 억제 효과의 검증
실시예 1에서 가장 효과가 높았던 검체 처리액 No.6을 사용하여, A형 및 B형 인플루엔자 바이러스 항원 검출 면역크로마토그래피법에서의 비인두를 닦은 액 검체에 의한 위음성화 억제 효과의 검증을 행하였다.
면봉(Ex 스와브 002; 덴카세이켄사 제조)을 사용하여, 비인두를 닦은 액 검체를 채취하고, 이것을 각각의 조성의 검체 처리액 400μL에 각각 부유하였다. 여기에 불활화 A형 인플루엔자 바이러스 또는 불활화 B형 인플루엔자 바이러스를 30μL 가하고, 혼합하였다. 혼합액 50μL를 각 시험편의 샘플 패드 부분에 적가하고, 10분 후에 육안으로 판정을 행하였다.
그 결과, 실시예 1, 2와 마찬가지로 검체 처리액 No.6을 사용함으로써, 비인두를 닦은 액 검체에 의한 위음성화를 억제할 수 있었다(표 4에 정리하여 나타냄).
[표 4] 황산기를 가지는 분자의 비인두를 닦은 검체액에 의한 위음성 억제 효과(인플루엔자 바이러스 A형 및 B형)
Figure pct00004
이상의 결과로부터, 본 발명의 황산기를 가지는 분자(특히 2개 이상의 황산기를 가지는 폴리머)를 포함하는 검체 처리액을 사용함으로써, 비인두 점막 유래 검체, 타액 검체(구강 점막 유래 검체)에 의한 면역검정에서의 위음성화를 억제할 수 있는 것을 발견하였다.
[산업상 이용가능성]
본 발명에 의해, 위음성을 억제하고, 정확한 측정이 가능한 면역검정계의 구축이 가능하다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에서 원용한다.

Claims (6)

  1. 생체 점막 유래 검체 중의 피검출 물질을 측정하는 면역검정(immunoassay)에 있어서, 황산기를 2개 이상 가지는 화합물을 포함하는 검체 처리액으로 검체를 처리하는 것을 포함하는, 위음성(false negative)을 억제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    생체 점막 유래 검체가, 객담(sputum), 타액, 인두(咽頭)를 닦은 액, 비강(鼻腔)을 닦은 액, 비강 흡인액, 각결막(角結膜)을 닦은 액 및 분변(糞便)으로부터 선택되는 검체인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    황산기를 2개 이상 가지는 화합물이, PIPES(피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산)) 또는 덱스트란 황산염인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    덱스트란 황산염이 평균 분자량 5,000∼500,000의 덱스트란 황산 나트륨인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    검체 처리액 중에, 황산기를 2개 이상 가지는 화합물이 0.1∼2 (w/v)%의 농도로 포함되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역검정이 면역크로마토그래피법(immunochromatography)에 의한 면역검정인, 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180128972A (ko) * 2016-04-13 2018-12-04 가부시키가이샤 엘에스아이 메디엔스 황산화 다당류를 이용한 면역학적 측정법

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6675834B2 (ja) 2015-05-21 2020-04-08 デンカ生研株式会社 イムノクロマト試験片及びそれを用いたイムノクロマト法
JP6651794B2 (ja) * 2015-11-05 2020-02-19 富士レビオ株式会社 心筋トロポニンｉ測定試薬及び方法
CN106053792B (zh) * 2016-05-07 2018-05-08 昆山迪安医学检验实验室有限公司 免疫层析检测试纸以及试剂盒
KR102154806B1 (ko) 2017-03-27 2020-09-10 닛뽄하무가부시키가이샤 체액에 의한 항원항체 반응 저해를 방지하는 물질
WO2021202992A2 (en) * 2020-04-03 2021-10-07 Lawrence Loomis Rapid point of care assay for the detection of the asymptomatic carrier state of covid-19
JP2022045047A (ja) 2020-09-08 2022-03-18 デンカ株式会社 偽陰性の抑制により特異性を改善した検査試薬
CN113671170A (zh) * 2021-09-09 2021-11-19 郑州安图生物工程股份有限公司 样本稀释液及其制备方法和消除新鲜样本检测异常的免疫分析方法
CN114966018B (zh) * 2022-05-30 2022-11-08 上海交通大学医学院附属第九人民医院 能监测采样的病毒抗原检测试纸及其试剂盒

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR880001533A (ko) * 1986-07-29 1988-04-23 오라프 프젤드 센드 쥬니어 유동 액체의 자기처리장치
JPH10185920A (ja) * 1996-12-20 1998-07-14 Nippon Kayaku Co Ltd アッセイ装置およびそれを用いるアッセイ方法
US20040018556A1 (en) * 2002-07-29 2004-01-29 Cantor Thomas L. Reagent and method for determination of a substance using an immunoaggregator
US20080160508A1 (en) * 2006-12-28 2008-07-03 Sysmex Corporation Assay method and assay kit for virus respiratory infection
JP2009052945A (ja) 2007-08-24 2009-03-12 Sunstar Inc 免疫クロマト検査における口腔内由来検体の処理方法
JP2012037253A (ja) * 2010-08-03 2012-02-23 Tanaka Kikinzoku Kogyo Kk イムノクロマトグラフィー用試薬組成物およびそれを用いた測定方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57182169A (en) * 1981-05-02 1982-11-09 Mitsubishi Chem Ind Ltd Measuring method for antigen-antibody reaction
JP3886639B2 (ja) * 1998-06-01 2007-02-28 栄研化学株式会社 免疫学的凝集反応試薬およびこれを用いたプロゾーン現象の抑制方法
JP4157748B2 (ja) * 2002-10-03 2008-10-01 富士フイルム株式会社 酵素標識抗体の保存方法
JP4580180B2 (ja) * 2004-02-26 2010-11-10 デンカ生研株式会社 免疫測定法用測定値低下抑制剤及びそれを用いた免疫測定法
JP4877578B2 (ja) * 2006-02-10 2012-02-15 日東紡績株式会社 抗原の測定法およびそれに用いるキット
JP4976068B2 (ja) * 2006-07-05 2012-07-18 デンカ生研株式会社 簡易イムノアッセイ用検体浮遊液およびアッセイ方法
JP5323328B2 (ja) * 2007-08-08 2013-10-23 アルフレッサファーマ株式会社 検体に含まれる被測定物質の測定方法および該測定方法に用いられる試薬キット
JP2010127922A (ja) * 2008-11-28 2010-06-10 Morinaga & Co Ltd イムノクロマトグラフィー測定用プロゾーン現象抑制剤及び食品検査測定時のプロゾーン現象抑制方法並びにプロゾーン現象が抑制されたイムノクロマトグラフィー測定キット
US20110195402A1 (en) * 2010-02-10 2011-08-11 Selinfreund Richard H Systems and methods for detecting drug use
JP2013017134A (ja) 2011-07-06 2013-01-24 Murata Mach Ltd 画像読取装置、キャリブレーション方法、及びキャリブレーションプログラム
TW201346040A (zh) * 2012-03-30 2013-11-16 Tanaka Precious Metal Ind 流行性感冒ａ型病毒檢驗用套組

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR880001533A (ko) * 1986-07-29 1988-04-23 오라프 프젤드 센드 쥬니어 유동 액체의 자기처리장치
JPH10185920A (ja) * 1996-12-20 1998-07-14 Nippon Kayaku Co Ltd アッセイ装置およびそれを用いるアッセイ方法
US20040018556A1 (en) * 2002-07-29 2004-01-29 Cantor Thomas L. Reagent and method for determination of a substance using an immunoaggregator
US20080160508A1 (en) * 2006-12-28 2008-07-03 Sysmex Corporation Assay method and assay kit for virus respiratory infection
JP2009052945A (ja) 2007-08-24 2009-03-12 Sunstar Inc 免疫クロマト検査における口腔内由来検体の処理方法
JP2012037253A (ja) * 2010-08-03 2012-02-23 Tanaka Kikinzoku Kogyo Kk イムノクロマトグラフィー用試薬組成物およびそれを用いた測定方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180128972A (ko) * 2016-04-13 2018-12-04 가부시키가이샤 엘에스아이 메디엔스 황산화 다당류를 이용한 면역학적 측정법

Also Published As

Publication number Publication date
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JP2014149189A (ja) 2014-08-21
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