KR20180128972A - 황산화 다당류를 이용한 면역학적 측정법 - Google Patents

황산화 다당류를 이용한 면역학적 측정법 Download PDF

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Abstract

생체 시료 중의 측정 대상 물질 (예를 들어, sIL-2R)을 면역학적으로 검출하는 경우에, 일반적으로 많이 사용되는 다른 혈액 응고 억제제의 사용에 의한 혈청, 헤파린 추가 혈장 등 피검 시료의 종류에 관계없이, 피검 시료 중의 간섭 물질의 영향을 받지 않고 안정적이고 높은 정밀도로 측정값을 얻을 수 있는 측정 방법 및 키트를 제공한다.
측정 대상 물질과 그에 특이적으로 결합하는 항체와의 면역 복합체의 형성을 황산화 다당류의 존재 하에서 실시한다. 상기 키트는 측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 항체와 황산화 다당류를 함유하는 완충액을 포함한다.

Description

황산화 다당류를 이용한 면역학적 측정법
본 발명은, 황산화(硫酸化) 다당류를 이용한 이종 피검 시료 간(특히 혈청과 헤파린 첨가 혈장 사이)의 측정값 괴리를 억제하는 면역학적 측정법 및 키트에 관한 것이다.
항원 항체 반응에 의해 광학적으로 측정하는 면역학적 측정법에서, 채취하는 채혈관의 차이, 예를 들면, 혈청 피검 시료와 혈장 피검 시료의 측정값이 괴리되는 현상이 확인되어 문제가 되는 경우가 있다. 괴리의 원인은 측정 대상 항목에 따라 다양한데, 지금까지 알려진 지식 중 하나는 혈장 중에 포함된 피브리노겐의 불용화에 의한 혈장 피검 시료의 측정값에의 영향을 들 수 있다. 그 영향을, 계면 활성제를 포함하는 반응계에 배위수 3개 이하의 킬레이트제를 포함시킴으로써 회피하는 기술이 알려져있다(특허 문헌 1).
또한 예를 들어, 다양한 심근 트로포닌을 평가하기 위해, 혈액 시료(혈청, 혈장 또는 전혈)가 일반적으로 사용된다. 그러나, 이 선택은 사용 방법에 따라 제한될 수 있다. 예를 들어, 혈청은 심근 트로포닌의 신속한 평가를 위한 방법에 부적절한 생물학적 시료인 점, 또는 전혈은 정량적 분석의 실시를 어렵게 만드는 것으로 알려져 있기 때문이다. 헤파린 첨가 혈장 또는 헤파린 첨가 전혈을 이용하여 실시하는 면역학적 측정에서 사용하는 방법의 성능이 매우 높은 경우에도 신뢰성이 부족한 결과를 종종 얻어진다. 일반적으로, 혈장 중의 심근 트로포닌 농도가 그다지 높지 않은 경우에, 이 문제가 발생한다 (비특허 문헌 1). 실제로 혈액 시료 중의 헤파린의 존재가 다양한 면역학적 측정 사이에 간섭하여 측정 결과에 영향을 주고, 이것에 의해 의사의 임상 진단을 한정할 수 있는 것으로 알려져 있다.
지금까지 심근 트로포닌 분석에서 검체 중의 간섭 물질의 영향을 회피하는 방법에 대해서, 헤파린 함유 생물학적 시료에 대해 헥사디메트린브로마이드 (폴리부렌(ポリブレン))의 존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정법이 개시되어 있다(특허 문헌 2).
그러나 안정하게 임상 검체를 측정하기 위해서는, 아직 충분한 것은 없었다.
[특허 문헌1] 특허 제5189067호 공보 [특허 문헌2] 특개 2010-107363호 공보
[비특허 문헌1] P.O.Collison et al., Ann.Cli.Biochem., (1995), 32, pp,454-458
본 발명자들은, 후술하는 실시예에서도 상술하지만, 면역학적 방법에 의해 생체 시료(혈청 및 헤파린 추가 혈장) 중의 가용성 인터루킨2수용체 (이하 sIL-2R로 약칭하는 경우가 있다)를 측정하는 것을 시도했는데, 해당 생체 시료에서 조제된 측정용 피검 시료(이하, 검체라고 칭하는 경우가 있다)의 종류가 다름에 따라, 측정값에 차이가 생기는 것을 깨달았다.
본 발명은 생체 시료 중의 측정 대상 물질(예를 들어, sIL-2R)을 검출하는 경우에, 일반적으로 많이 사용되는, 상이한 혈액 응고 저해제의 사용에 의한 혈청, 헤파린 추가 혈장 등 피검 시료의 종류에 관계없이, 피검 시료 중의 간섭(干涉) 물질의 영향을 받지 않고 안정적이며 높은 정밀도의 측정값을 얻을 수 있는 측정 방법 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기와 같은 현상을 감안하여 예의 검토를 거듭한 결과, 혈청 및 헤파린 추가 혈장 중의 sIL-2R를 면역학적으로 측정하는 방법에 있어서, 반응액 중에 황산화 다당류가 첨가된 조건 하에서, 해당 sIL-2R를 측정함에 의해, 피검 시료의 종류에 관계없이 피검 시료 중의 간섭 물질의 영향을 받지 않고 안정적이고 높은 정밀도의 측정값을 얻을 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성했다. 특히 황산기를 갖지 않는 다당류 및 다당류를 가지지 않고 황산기를 포함하는 화합물을 공존시킨 경우에는 위와 같은 효과를 얻지 못하고, 황산화 다당류를 공존시킨 경우가 아니면 위의 높은 효과를 얻을 수 없는 것은 놀라운 일이었다. 또한 B/F 분리를 실시함과 무관하게, 황산화 다당류를 공존시키지 않으면, 피검 시료 중의 간섭 물질의 영향을 받은 것으로부터, 해당 간섭 물질이 종래 알려져 있었던 피브리노겐의 불용화나 헤모글로빈의 영향 등은 아니라고 생각되었다.
따라서, 본 발명은 이하와 같이 예시할 수 있다.
[1] 생체 시료 중의 측정 대상 물질을 면역학적으로 측정하는 방법에 있어서, 측정 대상 물질과 해당 측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 항체와의 면역 복합체의 형성을 황산화 다당류의 존재 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는, 해당 측정 대상 물질을 측정하는 방법,
[2] 생체 시료 중의 측정 대상 물질의 면역학적 측정에서, 항응고제로 헤파린을 첨가한 혈액 시료를 이용한 경우의 측정값과 혈청을 이용한 경우의 측정값 사이의 괴리를 감소시키는 방법이며, 측정 대상 물질과 해당 측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 항체와의 면역 복합체의 형성을 황산화 다당류의 존재 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는, 상기 방법,
[3] 상기 황산화 다당류가, 덱스트란 황산, β시클로덱스트린황산인, [1] 또는 [2]의 방법,
[4] 상기 황산화 다당류를 검체 희석액 및/또는 항체 용액에 함유하는, [1] ~[3]의 어느 하나의 방법,
[5] 상기 형성된 면역 복합체를 B/F 분리하는 공정을 포함하는, [1] ~ [4]의 어느 하나의 방법,
[6] 측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 제1 항체와 제2 항체를 접촉시켜, 항원항체 반응에 의해 형성된 면역 복합체를 측정하는 것인, [1] ~[5]의 어느 하나의 방법,
[7] 측정 대상 물질이, 가용성 인터루킨2수용체, 전립선 특이항원인, [1] ~[6]의 어느 하나의 방법,
[8] [1] ~[7]의 어느 하나의 방법을 위한 것으로, 측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 항체와, 황산화 다당류를 함유하는 완충액을 포함하는, 해당 측정 대상 물질 측정 키트,
［９］상기 항체로서, 자성 입자에 담지된 상기 측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, [8]의 키트,
[10] 측정 대상 물질이, 가용성 인터루킨2수용체, 전립선 특이항원인, [8] 또는 [9]의 키트.
본 발명의 방법 및 시약 키트를 사용함으로써, 생체 시료 중 측정 대상 물질(예를 들어, sIL-2R)을, 일반적으로 많이 사용되고 있는, 피검 시료 (혈청 및 헤파린 첨가 혈장)의 종류에 관계없이, 피검 시료 중의 간섭 물질의 영향을 받지 않고 안정적으로 정밀하게 측정할 수 있다.
본 발명의 생체 시료로서는, 인간 등에서 채취된 측정 대상 물질 (예를 들어, sIL-2R)을 포함할 가능성 있는 시료이다. 생체 시료로서는 전혈, 혈청, 혈장 등의 혈액 시료 등을 들 수 있지만, 특히 피검 시료에 혈청과 헤파린 첨가 혈장이 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용가능한 피험 시료(검체)로서는, 상기 생체 시료로부터 조제할 수 있는 측정용 시료이면 좋고, 예를 들면, 혈액 시료를 대상으로 한 경우에는, 혈액 응고 저해제를 사용해서 얻은 전혈, 혈청, 혈장 등의 검체를 들 수 있다. 혈액 응고 저해제로는 예를 들어, 헤파린, EDTA, 구연산 등을 이용할 수 있다. 이들은 바람직하게는 인간 등의 측정 대상에서 채혈을 할 때, 미리 채혈관 등에 첨가하여 사용할 수 있다. 특히 혈청 및 헤파린 첨가 혈장을 병렬로 하여 대상으로 하는 경우, 본 발명의 효과가 높기 때문에 바람직하다.
본 발명에서 대상으로 하는 측정 대상 물질은, 면역 측정법으로 측정 가능한 물질이면 특별히 제한은 없다. 예를 들어, 단백질, 당 단백질, 지질 단백질, 수용체, 효소, 바이러스 항원, 항바이러스 항체 등을 들 수 있고, 구체적으로는 가용성 인터루킨2수용체(sIL-2R), 전립선 특이 항원(PSA), B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg), C형 간염 바이러스(HCV) 항체 및 항원, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 항체, 인간 T세포 백혈병 바이러스-1 (HTLV-1) 항체, 매독 트레포네마(トレポネ-マ)(TP) 항체 등 각종 심근 마커 (크레아틴 키나제 (CKMB), 미오글로빈, 트로포닌), 각종 호르몬류 등을 들 수 있다. 바람직하게는 가용성 인터루킨2수용체이다. 가용성 인터루킨2수용체는 주로 면역 세포인 T세포의 막 상에 존재하고 리간드인 인터루킨2와 복합체를 형성하여 T세포 기능의 활성화를 촉진하는 등 면역 반응에 관여하는 수용체이다2). 인터루킨2수용체는 3 종류 서브타입을 가지며, 그 중 α서브 유니트는 세포막에서 분리하여 혈중에 존재하는 것으로 알려져 있다. 가용성 인터루킨2수용체는 인터루킨2와의 결합성을 유지하기 때문에, 생체의 면역 조절에도 관여하고 있는 것으로 알려져서, 임상 현장에서는 주로 급성 백혈병의 마커로 사용된다.
본 발명에서 사용가능한 면역학적 측정법은, 측정 대상 물질에 특이적인 항체를 사용하는 공지의 방법이면 좋다. 예를 들어, 면역 비탁법(TIA), 효소 면역 측정법(EIA), 방사 면역 측정법(RIA), 라텍스 응집 반응법, 형광 면역 측정법, 면역 크로마토법 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 반응액 중에서, 피검 시료 중의 측정 대상 물질과 해당 측정 대상 물질에 특이적인 항체와의 면역 복합체를 형성시키고, 그 형성된 것에 의한 신호를 적절하게 검출하여 해당 측정 대상 물질의 존재를 검출하는 방법이다. 측정계에 의해서 사용하는 항체는 결정할 수 있지만, 고감도로 정량적으로 측정할 때는, 2 종류 이상의 항체를 사용하는 샌드위치 면역학적 측정법(샌드위치 면역 분석법)을 선택할 수 있다. 샌드위치 면역학적 측정법의 방법은, 1 이상의 단계(2 단계, 3 단계 등)로 실시해도 좋다. 예를 들어, 측정 대상 물질과 B/F 분리용의 불용성 담체에 담지된 해당 측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 항체와의 면역 복합체를 형성시키는 공정, 해당 면역 복합체를 B/F 분리하는 공정, 분리된 해당 면역 복합체를 측정하는 공정을 포함하는 방법을 들 수 있다.
예를 들면, 생체 시료 중에 포함되는 sIL-2R을 측정 대상 물질로서, 이를 측정하는 경우에는, 전술한 바와 같이 해당 생체 시료로부터 조제된 검체를, 또한 검체 희석액으로 측정용 시료로서 조제하고, sIL-2R에 특이적으로 결합하는 항체(제1 항체)를 담지시킨 불용성 담체, 및 표지 물질로 표지화된 제1 항체와는 다른 sIL-2R에 특이적으로 결합하는 항체(제2 항체)를 혼합하여 면역 복합체를 형성시키고, 세척에 의해서 미반응 항체 및 sIL-2R을 제거(B/F 분리)한 후, 불용성 담체에 결합한 표지 물질의 양을 측정함으로써 수행할 수 있다.
상기의 불용성 담체는, 당해 기술에 있어서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있다. 불용성 담체의 재료로는, 예를 들면, 라텍스, 고무, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 스티렌-부타디엔 공중합체, 폴리염화비닐, 폴리비닐아세테이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 스티렌-메타크릴레이트 공중합체, 폴리글리시딜 메타크릴레이트, 아크롤레인(アクロレイン)-에틸렌글리콜 디메타크릴레이트 공중합체, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF), 실리콘 등의 고분자 재료; 아가로스; 젤라틴; 적혈구; 실리카겔, 유리, 불활성 알루미나, 자성체 등의 무기 재료 등을 들 수 있다. 이들의 1 종 또는 2 종 이상을 조합해도 좋다.
또한 불용성 담체의 형상으로는, 마이크로 타이터 플레이트(マイクロタイタ-プレ-ト), 시험관, 비즈, 입자, 나노 입자등을 들 수 있다. 입자로서는 자성 입자, 폴리스티렌 라텍스와 같은 소수성 입자, 입자 표면에 아미노기, 카르복실기 등의 친수기를 갖는 공중합 라텍스 입자, 적혈구, 젤라틴 입자 등을 들 수 있다. 그중에서도, 신속 간편한 B/F 분리를 실현하는 관점에서는 자성 입자가 특히 바람직하며, 구체적으로는, 예를 들어 사산화삼철(Fe3O4), 삼산화이철(Fe2O3), 각종 페라이트, 철, 망간, 니켈, 코발트, 크롬 등의 금속, 코발트, 니켈, 망간 등의 합금으로 이루어진 미립자 등의 자성 입자가 바람직하게 사용된다. 또한 이러한 자성 입자를 폴리스티렌 등의 고분자의 라텍스나, 젤라틴, 리포좀(リポソ-ム) 등의 내부에 포함된 형태로 조제하거나, 표면에 고정화한 것을 바람직하게 사용할 수 있다.
이러한 불용성 담체에 제1 항체를 고정화시키는 방법은 당해 기술에 있어서 공지되어 있다. 해당 고정화는, 예를 들어 물리적 흡착법, 공유 결합법, 이온 결합법, 이들의 조합 등에 의해 실시할 수 있다.
표지 물질은, 통상의 면역학적 측정법에서 사용할 수 있는 표지 물질이라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 효소, 형광 물질, 방사성 동위원소, 불용성 입상 물질 등을 들 수 있다. 해당 표지용 효소로서는, 알칼리포스파타제, 퍼옥시다아제, 글루코스옥시다아제, 티로시나제(チロシナ-ゼ), 산성포스파타제 등을 들 수 있다. 형광 물질로서는, 플루오레세인 이소티오시아네이트(フルオレセインイソチオシアネ-ト(IFTC)), 녹색형광 단백질(GFP), 루시페린 등을 들 수 있다. 방사성 동위 원소로는 125I, 14C, 32P 등을 들 수 있다.
또한 표지 물질이 효소인 경우, 해당 효소에 대한 기질을 이용하여 발광, 형광 또는 발색 반응을 함으로써 표지 물질을 측정할 수 있다. 예를 들어, 효소가 알카리포스파타제인 경우, 기질로서는 CDP-star(등록상표)(４-클로로-３-（메톡시스피로｛１,２-디옥세탄-３，２'-(5'-클로로）트리시클로［３.３.１.１３,７］데칸｝-４-일）페닐인산2나트륨), CSPD(등록상표）(３-(４-메톡시스피로｛１，２-디옥세탄-３，２-(５'-클로로）트리시클로［３.３.１.１３,７］데칸｝-４-일）페닐인산２나트륨), AMPPD（등록상표）（아다만틸메톡시페닐포스포릴디옥시세탄(アダマンチルメトキシフェニルホスホリルジオキシセタン)), APS-5 등의 화학발광기질;４-메틸움베리페릴포스페이트（４-ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）등의 형광 기질; ｐ-니트로페닐포스페이트, BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인도릴인산), NBT(4-니토로부루-테트라졸륨클로라이드(4-ニトロブル-テトラゾリウムクロリド）), INT(요오드니트로 테트라졸륨(ヨ-ドニトロテトラゾリウム))등의 발색 기질을 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 항체는, 당업자라면 공지의 것을 적절히 선택하여 사용할 수있다. 예를 들면,sIL-2R에 특이적으로 결합하는 항체는, sIL-2R의 아미노산 배열이나 입체 구조 등을 에피토프(エピト-プ)로 인식하는 모노크로날 항체 또는 폴리크로날 항체이면 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면, 항체AM92.3 (피어스(ピア-ス)사 제품), 모노크로날 항체 7G7/B6(피어스 사 제품), MAB223(알앤디시스템즈(R & D　Systems)사 제품), MAB623(알앤디시스템즈 사 제품), MAB1020(알앤디시스템즈 사 제품), YNRhIL2R(산타쿠루즈 바이오테크놀러지(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)사 제품), IL2R.1(아브캄(アブカム)사 제품), B-B10(라이프테크놀로지스 (Lifetechnologies)사 제품), EPR6452(제네텍(Genetex)사 제품), OAPA00004(아비바 시스템 바이올로지(AVIVA system biology)사 제품), DM254-05(아크리스 안티보디즈(Acris antibodies)사 제품)을 들 수 있다.
이러한 항체는 공지의 방법에 따라서, 예를 들어 sIL-2R의 경우에는 인간 T세포에서 정제한 sIL-2R이나 in vitro에서 제작한 재조합의 sIL-2R 등을 항원으로 하여, 동물에 면역하여 제작하며, 또한, 에피토프(エピト-プ)를 결정할 수 있다. 에피토프는 항체가 인지하는 최소의 영역뿐만 아니라 항체가 인식할 수 있는 영역으로 동정(同定)된 것을 의미한다. 또한 공지의 방법으로 조제할 수 있는 Fab 등의 항체 프래그먼트여도 좋다. 또한, 이들 항체는, 젠웨이 바이오테크(Genway　Biotech)사, 디아클론(Diaclone)사, 산타 쿠르즈(Santa Cruz)사, 알앤디 시스템즈( R & D　Systems)사, 등으로부터 적절하게 구입할 수 있다.
본 발명의 측정에서 2종류의 항체를 사용하는 경우, 생체 시료 중 측정 대상 물질(예를 들어, sIL-2R)과 면역 복합체를 형성할 수 있다면, 한정하는 것은 아니지만, 제1 항체 및 제2 항체가 인식하는 에피토프가 다른 것이 바람직하다. 또한 모노크로날 항체와 폴리크로날 항체는 적절히 조합하여 사용할 수 있다. 또한 제1 항체 및 제2 항체는 각각 1 종류에 한정하지 않고 2 종류 이상을 병용할 수 있다.
본 발명의 황산화 다당류의 첨가는, 상기의 면역학적 측정법에서, 측정 대상 물질(예를 들어, sIL-2R)과 해당 측정 대상 물질(예를 들어, sIL-2R)에 특이적으로 결합하는 항체의 적어도 제1차 면역 복합체 형성 시(반응액 중)에 존재하도록 수행되면 좋다. 구체적으로는 면역 복합체 형성 시(반응액 중)에 동시에 첨가되어도 좋지만, 복합체 형성 전(상기 항체와 상기 측정 대상 물질 함유 시료가 접촉하기 전)에, 검체에 첨가되어도 좋다.
또한 첨가되는 황산화 다당류는, 공지의 완충액에 용해되어 용액으로 조제될 수 있다. 완충제외에, 단독으로 조제되어도 좋지만, 검체의 전처리나, 반응시에 필요한 공지의 물질과 함께 조제되어도 좋다. 황산화 다당류는, 상기와 같이, 적어도 면역 복합체 형성 시(반응액 중)에 첨가되어 있으면 좋으므로, 그 때에 존재시킬 수 있는 완충액 등에 함유시킬 수 있다. 면역 복합체 형성시에 존재시킬 수 있는 완충액등으로는, 사용하는 측정법이나 장치에 따라 적절하게 설정 가능하지만, 예를 들어, 검체 희석액이나 항체용액 (항체 고상 입자 용액이나 표지 항체액 등)등을 들 수 있다. 또한 복수의 완충액에 첨가시켜도 좋다.
본 발명의 황산화 다당류로서는, 황산덱스트란, β시클로덱스트린황산, N-아세틸헤파린(NAH), N-아세틸-탈-O-황산화-헤파린(NA-de-o-SH), 탈-N-황산화-헤파린(De-NSH), 탈-N-황산화-아세틸화-헤파린(De-NSAH), 과요오드- 산산화헤파린(POH), 화학적 황산화 라미나린(ラミナリン)(CSL), 화학적 황산화 알긴산 (CSAA), 화학적 황산화 펙틴(ペクチン) (CSP), 헤파린-유도올리고당(HDO), 펜트산 폴리 설페이트(ペントサンポリサルフェ-ト)(PPS) 및 후코이단(フコイダン)등을 들 수 있다. 바람직하게는, 황산덱스트란, β시클로덱스트린황산을 들 수 있다. 해당 물질이 반응액 중에서 이온으로 존재하도록 공급되면 어떤 형태로 첨가되어도 좋지만, 예를 들면, 염화 황산화 다당류, 브로마이드 황산화 다당류 등을 들 수 있고, 구체적으로는 염화 리튬, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화암모늄, 브롬화리튬, 브롬화나트륨, 브롬화칼륨, 브롬화칼슘, 브롬화마그네슘, 브롬화암모늄 등을 공존시킬 수 있는 것을 들 수 있으며, 염화나트륨이 바람직하다.
본 발명의 황산화 다당류의 농도로서는, 상기 면역 복합체 형성시의 농도로서, 0.0000004％보다 크며, 0.000004％이상, 바람직하게는 0.00004％이상, 보다 바람직하게는 0.0004％ 이상, 보다 바람직하게는 0.004％이상, 보다 바람직하게는 0.04％ 이상, 보다 바람직하게는 0.01％ 이상, 보다 바람직하게는 0.02％ 이상, 또한 1％ 이하, 바람직하게는 0.4％ 이하, 보다 바람직하게는 0.04％ 이하의 범위로부터 적절히 조합하여 선택된다. 본 발명에서는, 생체 시료 중의 황산화 다당류(예를 들면, 헤파린 첨가 혈장 중의 헤파린)의 존재에 관계없이, 반응액 중의 황산화 다당류가 상기의 농도 범위가 되도록 존재시켜 두는 것이다. 또한, 반응액 중의 황산화 다당류를 너무 높이면, 항원항체 반응이 억제(저해)되어 목적하는 측정이 정밀하게 행할 수 없게 되므로, 주의가 필요하다. 또한, 본 발명에 따라 검체의 종류에 관계없이 안정적으로 높은 정밀도로 생체 시료 중의 sIL-2R을 측정하기 위해, 검체에 포함된 측정 대상 물질 (예를 들면 sIL-2R)의 양이나 사용하는 황산화 다당류에 의해, 첨가 농도를 결정하는 것은 설계의 범위이다.
예를 들면, 덱스트란 황산(분자량 20,000)은 0.000004％ 이상 0.04％이하, 덱스트란 황산(분자량 4,000)은 0.0004％이상 0.04％이하, β시클로덱스트린 황산염은 0.02％이상 0.4％이하 등을 들 수 있다.
본 발명의 황산화 다당류의 농도나 종류는, 후술하는 실시예와 같이, 헤파린을 첨가한 혈액 시료(헤파린 첨가 혈장)와 그렇지 않은 혈액 시료(혈청)을 준비하고, 여러개의 다른 농도의 황산화 다당류의 존재 하에서, 각 혈액 시료 중의 측정 대상 물질(예를 들면 sIL-2R)을 측정하고, 양 시료의 측정값이 일치하는 황산화 다당류의 농도 범위를 파악함에 의해, 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다. 즉, 본 발명의 황산화 다당류의 농도나 종류는, 항응고제로서 헤파린을 첨가한 혈액 시료(헤파린 첨가 혈장)를 이용한 경우의 측정값과, 그것 이외에 혈액 시료(혈청)을 이용한 경우의 측정값이 일치하는 농도 범위로부터 선택할 수 있다. 측정값이 일치한다는 것은, 구체적으로는 측정값(측정 기기에서 제공된 광학 카운트나 표준 물질을 사용하여 계산된 농도 등)이 마이너스 10% ~ 플러스 10% 사이에 들어가 있는 것을 의미한다. 일반적으로, 이 사이에 들어가 있으면 임상적으로 유용하다고 할 수 있다.
본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 실시하는 데 사용될 수 있으며, 측정 대상 물질(예를 들어, sIL-2R)에 특이적으로 결합하는 항체와 황산화 다당류를 함유하는 완충액을 포함한다.
측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 항체는, 전술한 공지의 항체를 사용할 수 있으며, 모노크로날 항체 또는 폴리크로날 항체 중 어느 것도 가능하다. 또한 심근 트로포닌에 특이적 결합능을 보유하는 항체 단편, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab') 2 또는 Fv로서, 키트에 사용할 수도 있다.
또한, 상기 항체는 그대로 키트에 사용할 수도 있고, 이용하는 면역학적 방법에 기초하여 그에 적합한 형태, 예를 들어, 라텍스 응집 면역 측정법을 이용한다면 라텍스 담체에 고정한 상태에서, 자성 입자 등을 이용한 고감도 측정법을 이용한다면 자성 입자에 고정한 상태에서, 면역크로마토그래프법 등의 기판을 이용하는 방법이면 기판에 고정된 상태에서, 표지물질 (예를 들면, 효소, 형광 물질, 화학 발광 물질, 방사성 동위체, 비오틴, 아비딘)에 의한 표지의 필요가 있으면, 표지화된 상태에서 키트로 사용할 수도 있다.
상기 황산화 다당류를 포함하는 완충액으로는, 전술한 것을 참조하면 좋지만, 예를 들면, 검체 희석액이나 항체용액 (항체 고상 입자액이나 표지 항체액)등을 들 수 있다. 바람직하게는 검체 희석액으로 조제되는 것이 좋다.
또한, 본 발명의 키트에는, 본 발명의 키트를 사용하는 면역학적 측정법의 실시 절차에 대한 설명, 키트 자체의 보존·취급 등에 대한 주의 사항 등이 기재된 설명서를 포함할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
《참고예１: 가용성 인터루킨２수용체 측정용 시약의 제작과 측정》
참고예1-1: 가용성 인터루킨2수용체 측정용 시약의 제작과 피검 시료의 조제
가용성 인터루킨２수용체(sIL-2R)의 측정용의 시료를 제작했다.
·검체 희석액: 0.1 mol/L　HEPES(8.0), 0.15 mol/L　NaCl, 0.05％　Tween20을 함유하는 완충액을 사용했다.
·제１항체 용액: 자성라텍스 입자(JSR사)에 sIL-2R을 인식하는 마우스 모노크로날항체(R & D Systems 사 제품)을 결합한 자성 입자 용액을 사용했다.
·제２항체 용액:sIL-2R을 인식하는 다른 마우스 모노크로날항체(R & D Systems 사 제품)을 말레이미드(マレイミド)법에 의해 알칼리포스파타제(ALP) 표지 한 표지 항체 용액을 사용하였다.
·발광 기질 용액:CDP-star(어플라이드 바이오스시템(アプライドバイオシステム)사 제품)을 사용했다.
·B/F 세정액: 0.01 mol/L　MOPS(7.5), 0.15 mol/L　NaCl, 0.05％ Triton X-100을 포함한 완충액을 사용했다.
·피검시료(검체)는, 통상의 방법에 따라서, 건강한 정상인에서 얻은 혈청, 헤파린 첨가 혈장을 사용했다.
참고예1-2: 가용성 인터루킨2수용체 측정용 시약에 의한 측정
전자동 임상검사 시스템（STACIA：LSI메디엔스(メディエンス)사 제품)에 의한 측정
STACIA전용 병(ボトル)에, 조제한 검체 희석액, 제1 항체 용액 (자성 라텍스 시약), 제2항체 용액(효소 표지 항체 시약)을 각각 충전하고, 장치에 세트했다. 이하, 상기 장치의 운전 방법에 따라서 측정했다.
구체적으로는, 검체 5μL에 검체 희석액 50μＬ을 가하고, 37℃에서 3.5분간 가온한 후, 제1항체 용액(자성 라텍스 시약)25μＬ을 첨가하고, 37℃에서 4.2분간 가온했다. 검체중의 sIL-2R은 제1항체(자성 라텍스)와 반응하고, 자성라텍스-sIL-2R복합체를 형성했다. 이어서, 제2항체 용액(효소 표지 항체 시약) 50μＬ를 첨가하고, 37℃에서 4.4분간 가온했다. 제2항체 용액(ＡＬＰ표지 항체)를 첨가하면, ＡＬＰ표지 항체는 자성라텍스-sIL-2R복합체와 반응하여, 자성라텍스-sIL-2R-ALP표지 항체 복합체를 형성했다. 세정에 의해서 미반응의 항체 및 sIL-2R을 제거(B/F분리)한 후, 발광기질액 100μＬ를 첨가하고, 37℃에서 2.7분간 반응후에 발광량을 측정했다. CDP-star를 첨가하면, CDP-star는 복합체중의 ALP에 의해 가수분해되어 발광한다. 검출은, 광전자 증배관(PMT)에 의해 검출되는 화학 발광 기질의 발광 카운트를 측정한 결과로 했다.
《실시예1: 반응액에 황산화 다당류 또는 황산기를 가지지 않는 다당류 또는 다당류를 가지지 않고 황산기를 포함하는 화합물을 첨가함에 의한 sIL-2R의 반응성에 미치는 영향》
황산화 다당류 또는 황산기를 가지지 않는 다당류 또는 다당류를 가지지 않고 황산기를 포함하는 화합물을 반응액 중에 아래의 농도가 되도록 검체 희석액에 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 1에 따라서 수행했다.
· 황산화 다당류: 덱스트란 황산염 (분자량 4000)을, 0.04 %가 되도록 검체 희석액에 첨가하였다. β시클로덱스트린 황산염을 0.04 %가 되도록 검체 희석액에 첨가하였다.
·황산기를 가지지 않는 다당류: 덱스트란을, 0.04％가 되도록 검체 희석액에 첨가했다. 시클로덱스트린을, 0.04％가 되도록 검체 희석액에 첨가했다.
·다당류를 가지지 않고 황산기를 포함하는 화합물: CHAPSO을, 0.04％가 되도록 검체 희석액에 첨가했다. 옥탄산 나트륨을 0.04％가 되도록 검체 희석액에 첨가했다. 그 외에는 참고예1에 따라서 수행했다.
그 결과를 표 1에 나타낸다. 헤파린 첨가 혈장 카운트를 혈청 카운트로 나눈 후 100을 곱한 값을, 헤파린 첨가 혈장/혈청으로 보여주었다. 첨가없는 경우에는, 혈청 및 헤파린 첨가 혈장에서는, 가용성 인터루킨2수용체의 반응성이 다른 것으로 나타났다. 또한, 덱스트란 황산염(분자량 4000)과 β시클로덱스트린 황산염 등의 황산기를 갖는 다당류(황산화 다당류)에서는, 혈청과 헤파린 첨가 혈장의 반응성이 일치하는 것(헤파린 첨가 혈장/혈청 99 % 또는 100 %)이, 덱스트란이나 시클로덱스트린 등의 황산기를 가지지 않는 다당류 혹은 CHAPSO나 옥탄산나트륨 등의 다당류를 가지지 않고 황산기를 포함하는 화합물만으로는 혈청과 헤파린 첨가 혈장의 반응성은 일치하지 않았다(헤파린 첨가 혈장/혈청이 130 % ~ 138 %). 혈청과 헤파린 첨가 혈장의 반응성을 일치시키려면, 황산기를 갖는 다당류의 첨가가 필요한 것을 보여줬다.
[표 1]
Figure pct00001
《실시예2: 반응액에 각종 황산화 다당류를 첨가함에 의한 가용성 인터루킨2수용체의 반응성에 미치는 영향》
이하에서 기재한 것 이외는, 참고례1의 방법에 따라 수행했다.
·검체 희석액: 0.1mol/L　HEPES(8.0), 0.15mol/L　NaCl, 0.05％　Tween20, 0.4 mmol/L　에틸렌디아민 테트라아세트산을 포함하는 완충액을 사용했다.
·덱스트란황산（분자량 20,000)을, 반응액 중에 각 농도(0.0000004, 0.000004, 0.00004, 0.0004, 0.004, 0.04％)가 되도록 검체 희석액에 첨가했다.
·덱스트란황산（분자량 4,000)을, 반응액 중에 각 농도(0.000004, 0.00004, 0.0004, 0.004, 0.04％)가 되도록 검체 희석액에 첨가했다.
·β시클로덱스트린황산염을, 반응액 중에 각 농도（0.004, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.2, 0.4％)가 되도록 검체 희석액에 첨가했다.
·표준품: 재편성한 sIL-2R을 100000, 40000, 2500, 500, 0Ｕ/mL가 되도록 희석한 것을 사용했다. 희석하기 위해서는 0.05 mol/L　PBS(7.4), 0.05％　Tween20, 0.1％　BSA, 0.05％아지화나트륨(アジ化ナトリウム)을 포함하는 완충액을 사용했다. 해당 표준품을 사용하여 공지된 방법에 따라 발광 카운트로부터 각 농도(U/mL)를 산출했다.
그 결과를 표 2에 나타낸다. 헤파린 첨가 혈장의 농도를 혈청의 농도로 나눈 후 100을 곱한 값을 헤파린 첨가 혈장/혈청으로 보여주었다. 첨가없는 예이면, 혈청 및 헤파린 첨가 혈장에서는, 가용성 인터루킨 2 수용체의 반응성이 다른 것으로 나타났다.
그 결과, 일치하는 것으로 보는 범위를 마이너스 10 % ~ 플러스 10 %로 하면, 덱스트란 황산염(분자량 20,000)은 0.000004 % 이상, 덱스트란 황산(분자량 4,000)는 0.0004 % 이상, β시클로덱스트린 황산염은 0.004 % 이상 첨가됨에 의해, 혈청 및 헤파린 첨가 혈장의 가용성 인터루킨2수용체의 반응성이 일치하는 것으로 확인되었다.
[표 2]
Figure pct00002
《비교예 1: 반응액에 황산기를 가지지 않는 다당류 및 다당류를 가지지 않으며 황산기를 포함하는 화합물을 첨가함에 의한 sIL-2R의 반응성에 미치는 영향》
황산화 다당류와 유사한 반응이 될까, 황산기를 가지지 않는 다당류 및 다당류를 가지지 않고 황산기를 포함하는 화합물을, 동시에 반응액 중에 첨가하여 검토하였다. 황산기를 가지지 않는 다당류 및 다당류를 가지지 않고 황산기를 포함하는 화합물을 아래의 농도가 되도록 검체 희석액에 첨가한 것을 제외하고는 참고예 1에 따라서 수행했다.
·다당류를 가지지 않고 황산기를 포함하는 화합물: NDSB-195, NDSB-201, NDSB-256를, 각각 0.385 mmol/L, 3.85 mmol/L가 되도록 검체 희석액에 첨가했다.
·다당류를 가지지 않고 황산기를 포함하는 화합물 및 황산기를 가지지 않는 다당류의 혼합:NDSB-195를 3.85 mmol/L, 및 덱스트란(분자량 2000)을 0.19％가 되도록 검체 희석액에 첨가했다.
그 결과를 표 3에 나타낸다. 헤파린 첨가 혈장의 카운트를 혈청의 카운트로 나눈 후 100을 곱한 값을, 헤파린 첨가 혈장/혈청으로 보여주었다. 그 결과, 다당류를 가지지 않고 황산기를 포함하는 화합물은 혈청과 헤파린 첨가 혈장의 측정값이 일치하지 않는 것으로, 또한, 황산기를 가지지 않는 다당류를 첨가한 상태에서도 측정값이 일치하지 않는 것을 알았다.
황산기를 가지지 않는 다당류 및 다당류를 가지지 않고 황산기를 포함하는 화합물을 공존시킨 경우에는, 실시예 1, 2의 황산기를 갖는 다당류와 같은 효과를 얻을 수 없으며, 황산기를 가진 다당류를 공존시킨 경우가 아니면 이 높은 효과를 얻을 수 없다는 것은, 황산기와 다당류의 존재에 의한 것이 아니라는 점으로부터, 의외의 결과였다.
　[표 3]
Figure pct00003
《실시예 3: 반응액에 황산화 다당류를 첨가함에 의한 total　PSA의 반응성에 미치는 영향》
실시예 3-1:total PSA 측정용 시약의 제작과 피검 시료의 조제
total PSA의 측적용 시약을 제작했다.
·검체 희석액: 0.1 mol/L　HEPES(8.0), 0.15 mol/L　NaCl, 0.05％　Tween20를 함유한 완충액을 사용했다.
·제1항체 용액: 자성라텍스 입자(JSR 사)에 PSA를 인식하는 마우스 모노크로날 항체(Biospacific사 제품)을 결합한 자성 입자 용액을 사용했다. 　
·제2항체 용액:PSA를 인식하는 다른 마우스 모노크로날 항체（Biospacific사 제품)을 말레이미드법에 의해 알칼리 포스파타제(ALP) 표지한 표지 항체 용액을 사용했다.
·발광기질용액:CDP-star(어플라이드바이오시스템사 제품)을 사용했다.
·B/F 세정액:0.01 mol/L　MOPS(7.5), 0.15 mol/L NaCl, 0.05％　Triton X-100을 포함하는 완충액을 사용했다.
·β시클로덱스트린 황산염을, 반응액 중에 각 농도(0.002, 0.004, 0.008, 0.031％)가 되도록 검체 희석액에 첨가했다.
·피검시료(검체)는, 통상의 방법에 따라서, 건강한 정상인으로부터 얻은 혈청, 헤파린 첨가 혈장을 사용했다.
·표준품: 재구성 PSA를 100, 50, 10, 1, 0 ng/mL가 되도록 희석한 것을 사용했다. 희석에는 0.01 mol/L　MOPS(7.0), 0.15 mol/L　NaCl, 0.05％　Triton X, 0.05％　Proclin300을 포함하는 완충액을 사용했다. 해당 표준품을 사용하여, 공지의 방법에 따라서, 발광 카운트로부터 각 농도(ng/mL)를 산출했다.
실시예3-2: total PSA측정용 시약에 의한 측정과 결과
측정 대상을 total PSA로 한 것 이외는, 참고례1-2와 동일하게 실시했다.
그 결과를 표 4에 나타낸다. 헤파린 첨가 혈장의 농도를 혈청의 농도로 나눈 후 100을 곱한 것을, 헤파린 첨가 혈장/혈청으로 나타냈다. 첨가없는 예이면, 혈청 및 헤파린 추가 혈장에서는, total PSA의 반응성이 다른 것을 알았다. 더욱이, 일치로 보는 범위를 마이너스 10％～플러스 10％로 하면, β시클로덱스트린 황산염은 0.002％이상 첨가됨에 의해, 혈청 및 헤파린 첨가 혈장의 total PSA의 반응성이 일치하는 것을 확인했다.
[표 4]
Figure pct00004
본 발명은, 측정 대상 물질(예를 들면, sIL-2R)을 검출하는 경우에, 특히 일반적으로 사용하는 검체의 종류(혈청 및 헤파린 첨가 혈장)에 관계없이, 검체 중의 간섭 물질의 영향을 받지 않고 안정하고 높은 정밀도로 측정 결과를 얻을 수 있다. 임상 검사는, 간편·신속하게 측정될 필요가 있으며, 검사실 뿐만 아니라 POCT 분야 등에서도 측정된다. 예를 들어, 혈액 시료를 대상으로 하면, 다양한 상황에서 측정될 수 있는 가능성을 고려하면, 해당 시료의 채취에 사용되는 용기는 다양하기 때문에, 얻어진 검체의 종류에 관계없이, 특히 일반적으로 사용되는 혈청이나 헤파린 첨가 혈장을 사용하는데 있어서 안정적이며 높은 정밀도로 측정 결과를 얻을 수 있게 되는 본 발명은 특히 유용하다.
이상, 본 발명을 특정 실시예에 따라 설명했지만, 당업자에게 자명한 변법과 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (10)

  1. 생체 시료 중의 측정 대상 물질을 면역학적으로 측정하는 방법에 있어서, 측정 대상물질과 해당 측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 항체와의 면역 복합체의 형성을 황산화 다당류의 존재하에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 해당 측정 대상 물질을 측정하는 방법.
  2. 생체 시료 중의 측정 대상 물질의 면역학적 측정에 있어서, 항응고제로서 헤파린을 첨가한 혈액 시료를 이용한 경우의 측정값과, 혈청을 이용한 경우의 측정값과의 사이의 괴리를 감소시키는 방법이며, 측정 대상 물질과 해당 측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 항체와의 면역 복합체의 형성을 황산화 다당류의 존재하에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 황산화 다당류가, 덱스트란 황산, β시클로덱스트린 황산인, 상기 방법.
  4. 청구항 1 ~3의 어느 한 항에 있어서, 상기 황산화 다당류를 검체 희석액 및/또는 항체 용액에 함유하는 것인, 상기 방법.
  5. 청구항 1~4의 어느 한 항에 있어서, 상기 형성된 면역 복합체를 B/F 분리하는 공정을 포함하는 것인, 상기 방법.
  6. 청구항 1~5의 어느 한 항에 있어서, 측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 제1 항체와 제2 항체를 접촉시켜, 항원항체반응에 의해 형성된 면역 복합체를 측정하는 것인, 상기 방법.
  7. 청구항 1~6의 어느 한 항에 있어서, 측정 대상 물질이, 가용성 인터루킨2수용체, 전립선특이항원인 것인, 상기 방법.
  8. 청구항 1~7 중 어느 한 항에 기재된 방법을 위한 것으로, 측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 항체와, 황산화 다당류를 함유하는 완충액을 포함하는, 해당 측정 대상 물질 측정 키트.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 항체로서, 자성입자에 담지된 상기 측정 대상 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인, 상기 키트.
  10. 청구항 8 또는 9에 있어서, 측정 대상 물질이 가용성 인터루킨2수용체, 전립선특이항원인 것인, 상기 키트.
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