JP3476274B2 - 免疫測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査の分野で用い
られ、測定対象物質に対する抗原または抗体の凝集反応
を利用した免疫測定法に関する。 【０００２】 【従来の技術】各種生体成分から特定の物質を検出もし
くは定量するために、抗原抗体反応が利用され、一般的
には測定対象となる抗原または抗体に対応する抗体また
は抗原を反応させる方法が用いられる。測定方法として
は、不溶性の担体を使用する方法と担体を使用せず直接
凝集を検出する方法があり、前者の方法としては、測定
する抗原に対する抗体をラテックス等を担体として担持
させ、その免疫反応により生じた凝集の度合いを測定す
ることにより、試料中の抗原を検出あるいは定量するも
のである。 【０００３】凝集の度合いを検出する方法としては、凝
集の有無を肉眼で判定する方法、反応液に光を照射して
散乱光または透過光を測定する方法があり、肉眼判定は
定性法または半定量法として用いられ、光学的な測定法
は抗原の定量法として用いられている。 【０００４】上記抗原抗体反応は、抗原と抗体の比によ
って反応性が異なるため、上記のような方法により凝集
の度合いを測定しても、その値が抗体過剰領域のものか
又は抗原過剰領域のものかを判定する必要がある。 【０００５】例えば、特開平４−２０４３７８号公報に
は、試料と反応試薬との混合溶液に対して２波長で吸光
度を測定し、さらに一定時間後に同じ２波長で測定し、
異なる時刻間での吸光度差の両波長における比を、予め
設定された基準値と比較し、抗原又は抗体の過剰領域で
あるかどうかを判定することが開示されている。しかし
ながら、抗原又は抗体の過剰領域であるかどうかの判定
はできるが、正確な濃度を求めることはできない。 【０００６】また特開昭６２−２９３１６３号公報に
は、１回目の測定を行ったあとにサンプル又は試薬中の
抗原又は抗体の量を変えて２回目の測定を行い、その測
定値の変化から抗原又は抗体過剰を判定し、濃度を求め
ることが開示されている。しかしながら、高濃度の検体
では変化量が読み取れなかったり、抗原又は抗体過剰で
あることを判定できても正しい濃度を得るために測定を
２回行わなければならない。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】本発明は上記問題点を
解決するものであり、その目的とするところは、抗原又
は抗体過剰領域においても、簡便にかつ精度よく、抗原
又は抗体の量を測定できる免疫測定法を提供することで
ある。 【０００８】 【課題を解決するための手段】試料中の特定物質の量を
測定をする際に、その対象物に対応する抗原又は抗体と
の免疫反応により生じる免疫複合体を検出する方法にお
いて、一般に行われるのは、予め凝集の度合いに対する
抗原又は抗体濃度曲線を求めておき、試料の凝集の度合
いから濃度を得る方法である。 【０００９】この濃度曲線において測定対象物が抗原で
ある場合、抗原が低濃度の領域においては、凝集の度合
いと抗原濃度は直線性を示すが、抗原濃度が高くなって
いくと一定時間における吸光度の変化、反応速度が低く
なって直線性が失われることが知られており、この現象
は一般にフック現象と呼ばれている。フック現象が起こ
ってからの濃度曲線領域は一般にプロゾーン領域あるい
は抗原過剰領域と呼ばれる。 【００１０】本発明の免疫測定法は、フック現象が起こ
るまでの領域とプロゾーン領域について２つの検量線を
作成し、そのどちらかの検量線を用いて試料中の対象物
の量を得るものであり、以下の５つの工程を包含する。 【００１１】第１の工程において、既知量の測定対象物
と該測定対象物に対応する抗原又は抗体を混合する。こ
の際抗原抗体反応によって凝集が生じるので、この凝集
の度合いＡを測定する。種々の既知量の測定対象物につ
いて上記と同様の操作を行い、それぞれ凝集の度合いＡ
を測定する。 【００１２】第２の工程において、得られた値から凝集
の度合いＡと測定対象物の量との関係を示す検量線Ｉを
作成する。この検量線Ｉは、フック現象が起こるまでの
領域で用いられる。 【００１３】第３の工程において、上記第１の工程で用
いた種々の既知量の測定対象物質に対し、該測定対象物
質に対応する抗原又は抗体を混合する際に、第１の工程
で用いたよりも過剰量の抗原又は抗体を混合する。その
後、第１の工程と同様にしてそれぞれ凝集の度合いＢを
測定する。 【００１４】過剰量の抗原又は抗体を混合する方法とし
ては、測定対象物質に、一度に過剰量の対応する抗原又
は抗体を混合してもよいし、まず過剰分の抗原又は抗体
を混合後第１の工程と同量の抗原又は抗体を混合する
等、２回以上に分けて混合してもよく、合計量が第１の
工程で用いたよりも過剰量となればよい。 【００１５】第４の工程において、上記第１及び第３の
工程で得られた凝集の度合いＡ及びＢからＡとＢの比
（以下「Ｂ／Ａ比」とする）を求め、Ｂ／Ａ比と測定対
象物の量との関係を示す検量線IIを作成する。 【００１６】上記Ｂ／Ａ比から、測定系においてフック
現象が起こる点を推定することができる。フック現象が
起こるまでの領域においてはＢ／Ａ比は低値を示すが、
フック現象が起こるとＢ／Ａ比は直線的に増大する。Ｂ
／Ａ比が直線的に増大する領域はプロゾーン領域であ
り、上記検量線IIはこの領域で用いられる。 【００１７】第５の工程において、測定対象物質を含有
する試料について、上記第１及び第３の工程を繰り返し
て凝集の度合いＡ及びＢを測定し、さらにＢ／Ａ比を求
める。この値から、上記試料がフック現象が起こるまで
の領域の濃度であれば検量線Iから、プロゾーン領域の
濃度であれば検量線IIから、試料中の測定対象物の量を
得ることができる。本発明の免疫測定法において、上記
各工程の順序は、特に制限されるものではない。 【００１８】必要に応じて試料を希釈する場合には、Ｂ
／Ａ比を求めることにより、フック現象が起こると推定
されるＢ／Ａ比に対応する濃度以下になるような希釈倍
率を選択することができる。 【００１９】上記測定対象物を含有する試料とは、抗
原、抗体等の免疫学的に活性な被測定物質を含有する試
料、特に生体試料である。生体試料としては、例えば、
血液、胸水、腹水、リンパ液等の体液、尿、便、汗等の
排泄物、及び組織の抽出物などが挙げられる。 【００２０】上記測定対象物質としては、抗原抗体反応
しうる抗原、抗体等の免疫学的に活性なあらゆる物質、
すなわち従来測定されていた物質のいずれもが包含さ
れ、例えばタンパク質、ポリペプチド、多糖類、脂質、
ステロイド等が挙げられる。上記タンパク質としては、
例えば、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、フィブ
リノーゲン分解産物（ＦＤＰ）、Ｃ反応性タンパク（Ｃ
ＲＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）等の血液
中タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢ）、Ｃ型肝炎ウ
イルス（ＨＣ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等の
感染症に対する抗原及びその抗体、レセプター、酵素な
どが挙げられる。 【００２１】上記測定対象物質に対応する抗原又は抗体
は、不溶性担体に担持されていてもよい。上記不溶性担
体としては、例えば、有機高分子粉末、無機物質粉末、
微生物、血球及び細胞膜片、プラスチック製マイクロタ
イタープレート等が挙げられる。上記有機高分子粉末と
しては、例えば、不溶性アガロース、セルロース、不溶
性デキストラン等の天然高分子粉末、メタクリル酸重合
体、アクリル酸重合体、ポリスチレン、スチレン−スチ
レンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジ
エン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレ
ン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合
体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等の合成
高分子粉末などが挙げられ、特に合成高分子粉末を均一
に懸濁させたラテックスが好ましい。 【００２２】上記無機物質粉末としては、例えば、金、
チタン、鉄、ニッケル等の金属片、シリカ、アルミナ、
炭素末などが挙げられる。上記不溶性担体の平均粒径
は、測定方法、測定機器によって異なるが、通常０．０
５〜１．０μｍ、好ましくは０．０５〜０．５μｍのも
のが用いられる。使用する不溶性担体の濃度は、光学的
観察に用いる場合には通常０．０５〜３．０ｍｇ／ｍ
ｌ、好ましくは０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌであり、目視
観察に用いる場合には通常０．５〜２０ｍｇ／ｍｌ、好
ましくは１．０〜５．０ｍｇ／ｍｌである。上記不溶性
担体に抗原又は抗体を担持させる方法としては、例え
ば、化学的または物理的結合により感作させる方法が挙
げられる。 【００２３】本発明の免疫測定法において、上記抗原抗
体反応は通常の条件で行われ、反応におけるｐＨは、通
常５〜１０、好ましくは６〜８である。使用される緩衝
液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グ
リシン緩衝液、クエン酸緩衝液、アンモニア緩衝液等が
挙げられる。反応温度は、通常０〜５０℃、好ましくは
２０〜４０℃である。反応時間は通常２０秒〜３０分、
好ましくは１〜１５分である。 【００２４】抗原抗体反応を測定する際の測定系として
は、例えば、免疫比濁法、ラテックス凝集法、血球凝集
法等が利用される。上記反応により生じた凝集の度合い
を測定する方法としては、凝集の程度を光学的に観察す
る方法あるいは目視により観察する方法等が挙げられ
る。 【００２５】光学的に観察する方法においては、上記反
応後の混合液の散乱光強度、吸光度、透過光強度または
粒子数を公知の光学機器等で検出する。測定波長は３０
０〜２４００ｎｍが使用できる。測定方法は公知の方法
に従い、用いる不溶性担体の粒径、濃度、反応時間によ
って散乱光強度、吸光度、または透過光強度の増加もし
くは減少を測定する。より短時間で測定する場合は、凝
集反応速度、吸光度の絶対値を用いることもできる。ま
たこれらの方法は単独で用いられてもよいし、併用され
てもよい。目視により観察する方法においては、凝集の
有無を判定する際に単に肉眼で判定する以外に、ビデオ
カメラで撮影し画像処理を施すことによって判定するこ
ともできる。 【００２６】上記測定系中には必要に応じて反応促進物
質を添加してもよい。反応促進物質としては、例えば、
ポリエチレングリコール、ポリグリコシルメタクリレー
ト、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロー
ス、デキストラン、プルラン等が挙げられる。 【００２７】 【実施例】本発明を実施例につき説明する。実施例にお
いては以下の試薬を用いた。 ・リン酸緩衝液（ＰＢＳ）：リン酸１ナトリウム（２水
和物）、リン酸２ナトリウム（２水和物）及び塩化ナト
リウムを、リン酸の最終濃度が０．０２Ｍ、塩化ナトリ
ウムの最終濃度が０．１５Ｍ、ｐＨが７．２となるよう
に、精製水に溶解した溶液 ・１％ＢＳＡ−ＰＢＳ：ＰＢＳ１００ｍｌに牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ、試薬特級）１ｇを溶解した溶液 ・５％ＢＳＡ−ＰＢＳ：ＰＢＳ１００ｍｌに牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ、試薬特級）５ｇを溶解した溶液 【００２８】（実施例１） ラテックス凝集法によるヒトＨＢｓ抗原（Ｂ型肝炎表面
抗原）の測定 〔抗体結合ラテックス液の調製〕抗ＨＢｓモノクローナ
ル抗体（生化学工業社製、コードNo.230853 ）をＰＢＳ
で０．５ｍｇ／ｍｌとなるように調製した液９００μｌ
と粒径０．２μｍのポリスチレンラテックス（積水化学
社製）５０μｌを混合し、４℃で一晩静置した。次いで
この液を遠心分離し、上清を除去して得られる沈殿に１
％ＢＳＡ−ＰＢＳを１ｍｌ添加し、３７℃で２時間ブロ
ッキングした。その後生理食塩水で３回洗浄し、１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳを２ｍｌ添加し、抗体結合ラテックス液を
得た。 【００２９】〔検量線の作成〕 ＨＢｓ抗原標準品（三菱化学社製、ＨＢｓ抗原標準品
キット）を、５％ＢＳＡ−ＰＢＳで５００Ｕ／ｍｌとな
るように調製し、次いでこれを順次希釈し、４００、３
００、２００、１００、５０、０（５％ＢＳＡ−ＰＢＳ
のみ）Ｕ／ｍｌの標準品を調製した。 【００３０】上記各標準品１００μｌを１ｍｌの１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳに添加し、混合した。次いでこれに上記抗
体結合ラテックス液２００μｌを添加し、生化学自動分
析装置（日立Ｕ−３２００型、日立製作所社製）によ
り、光路長１ｃｍのセルを用い、測定波長５７０ｎｍで
５分間の吸光度変化量Ａを測定し（表１）、標準品濃度
と吸光度変化量Ａの関係を示すグラフ（図１）を作成し
た。 【００３１】抗ＨＢｓモノクローナル抗体を０．１μ
ｇ／ｍｌとなるように１％ＢＳＡ−ＰＢＳで調製した液
１ｍｌと、上記５００、４００、３００、２００、１０
０、５０、０Ｕ／ｍｌの標準品１００μｌを混合した。
次いでこれに上記抗体結合ラテックス液２００μｌを添
加し、生化学自動分析装置（日立Ｕ−３２００型、日立
製作所社製）により、光路長１ｃｍのセルを用い、測定
波長５７０ｎｍで５分間の吸光度変化量Ｂを測定した
（表１）。 【００３２】上記Ａ及びＢから、Ｂ／Ａ×１００を求
めた（表１）。この値から、また上記で作成した図１
に示すグラフからも、３００Ｕ／ｍｌ以上でフック現象
が起こっていると考えられるため、０〜２００Ｕ／ｍｌ
の測定値Ａから、標準品濃度と吸光度変化量Ａの関係を
示す検量線Ｉ（図２）を作成し（y=0.15x +3.4, r=0.9
9）、３００〜５００Ｕ／ｍｌについては、標準品濃度
とＢ／Ａ×１００の関係を示す検量線II（図３）を作成
した（y=8.6x +114.4, r=0.99 ）。この測定系において
は、Ｂ／Ａ×１００が１０以下のものについては検量線
Ｉを用い、１０を超えるものについては検量線IIを用い
ることとした。 【００３３】 【表１】 【００３４】〔検体の測定〕ＨＢｓ抗原陽性と判定され
た検体について、上記及びと同様にして吸光度を測
定し、各検体についてＡ、Ｂ及びＢ／Ａ×１００を求め
た。検体１及び３はＢ／Ａが１０以下であるため検量線
Ｉから、検体２及び４はＢ／Ａ×１００が１０を超えて
いるため検量線IIから、検体中の抗原濃度を求めた。結
果を表２に示す。 【００３５】また検体２及び４について、１０倍に希釈
し再度上記及びと同様にして吸光度を測定し、各検
体についてＡ’、Ｂ’及びＢ’／Ａ’×１００を求め、
検量線Ｉから検体中の抗体濃度を求めた。結果を表２に
示す。この値は、上記で得た値とほぼ一致し、本発明の
方法によると高濃度の検体についても、希釈して再度測
定する必要がない。 【００３６】 【表２】 【００３７】（実施例２） 免疫比濁法によるヒトＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白）の測定 〔測定用抗体液の調製〕抗ＣＲＰ抗体（ヒツジに免疫、
生化学工業社製、コードNo.370443 ）を０．１ｍｇ／ｍ
ｌとなるように１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、測定用抗
体液を調製した。 【００３８】〔検量線の作成〕 ＣＲＰ標準品（デンカ生研社製、ＣＲＰ標準液）２０
ｍｇ／ｄｌを、５％ＢＳＡ−ＰＢＳで順次希釈し、１
５、１０、５、２、１、０（５％ＢＳＡ−ＰＢＳのみ）
ｍｇ／ｄｌの標準品を調製した。 【００３９】上記各標準品１００μｌと１％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ１ｍｌを混合した。次いでこれに上記測定用抗体液
３００μｌを添加し、生化学自動分析装置（日立Ｕ−３
２００型、日立製作所社製）により、光路長１ｃｍのセ
ルを用い、測定波長３４０ｎｍで５分間の吸光度変化量
Ａを測定した（表３）。 【００４０】抗ＣＲＰ抗体が０．５μｇ／ｍｌとなる
ように１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、添加用抗体液を調
製した。この添加用抗体液１ｍｌと、上記２０、１５、
１０、５、２、１、０ｍｇ／ｄｌの標準品１００μｌを
混合した。次いでこれに上記測定用抗体液３００μｌを
添加し、生化学自動分析装置（日立Ｕ−３２００型、日
立製作所社製）により、光路長１ｃｍのセルを用い、測
定波長３４０ｎｍで５分間の吸光度変化量Ｂを測定した
（表３）。 【００４１】上記Ａ及びＢからＢ／Ａ×１００を求め
た（表３）。この値から、１０ｍｇ／ｄｌ以上でフック
現象が起こっていると考えられるため、０〜５ｍｇ／ｄ
ｌの測定値Ａから、標準品濃度と吸光度変化量Ａの関係
を示す検量線Ｉ（図４）を作成し（y=0.0028x -0.047,
r=0.99）、１０〜２０ｍｇ／ｄｌについては、標準品濃
度とＢ／Ａ×１００の関係を示す検量線II（図５）を作
成した（y=0.87x +5.3,r=0.99）。この測定系において
は、Ｂ／Ａ×１００が５以下のものについては検量線Ｉ
を用い、５を超えるものについては検量線IIを用いるこ
ととした。 【００４２】 【表３】 【００４３】〔検体の測定〕ＣＲＰ陽性と判定された検
体について、上記及びと同様にして吸光度を測定
し、各検体についてＡ、Ｂ及びＢ／Ａ×１００を求め
た。検体１、２及び４はＢ／Ａ×１００が５以下である
ため検量線Ｉから、検体３及び５はＢ／Ａが５を超えて
いるため検量線IIから、検体中のＣＲＰ濃度を求めた。
結果を表４に示す。 【００４４】またＢ／Ａ×１００が５を超える検体３及
び５について、１０倍に希釈し再度上記及びと同様
にして吸光度を測定し、各検体についてＡ’、Ｂ’及び
Ｂ’／Ａ’×１００を求め、検量線Ｉから検体中のＣＲ
Ｐ濃度を求めた。結果を表４に示す。この値は、上記で
得た値とほぼ一致し、本発明の方法によると高濃度の検
体についても、希釈して再度測定する必要がない。 【００４５】 【表４】 【００４６】 【発明の効果】本発明の免疫測定法は、上述のとおりで
あり、簡便にかつ精度よく、対象物質の量を測定でき、
抗原又は抗体過剰領域の濃度の試料においても、希釈し
て再度測定する必要がない。また試料を希釈する必要が
ある場合でも、適切な希釈倍率を容易に得ることができ
る。

【図面の簡単な説明】 【図１】実施例１における標準品濃度と抗原抗体反応に
よって生じる凝集の度合いの関係を示したグラフであ
る。縦軸は吸光度変化量Ａ（ｍＡＢＳ×１０）を、横軸
はＨＢｓ濃度（Ｕ／ｍｌ）を示す。 【図２】実施例１のフック現象が起こるまでの領域にお
ける検量線Ｉである。縦軸はＨＢｓ濃度（Ｕ／ｍｌ）
を、横軸は吸光度変化量Ａ（ｍＡＢＳ×１０）を示す。 【図３】実施例１のプロゾーン領域における検量線IIで
ある。縦軸はＨＢｓ濃度（Ｕ／ｍｌ）を、横軸はＢ／Ａ
×１００を示す。 【図４】実施例２のフック現象が起こるまでの領域にお
ける検量線Ｉである。縦軸はＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）
を、横軸は吸光度変化量Ａ（ｍＡＢＳ×１０）を示す。 【図５】実施例２のプロゾーン領域における検量線IIで
ある。縦軸はＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）を、横軸はＢ／
Ａ×１００を示す。

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 〔１〕測定対象物と該測定対象物に対応
   する抗原又は抗体を混合し、抗原抗体反応によって生じ
   る凝集の度合いＡを測定する工程； 〔２〕上記凝集の度合いＡと測定対象物の量との関係を
   示す検量線Iを作成する工程； 〔３〕測定対象物と、上記工程〔１〕において用いたよ
   りも過剰の上記測定対象物に対応する抗原又は抗体を混
   合し、抗原抗体反応によって生じる凝集の度合いＢを測
   定する工程； 〔４〕上記凝集の度合いＡ及びＢからＡとＢの比を求
   め、ＡとＢの比と測定対象物の量との関係を示す検量線
   IIを作成する工程； 〔５〕測定対象物を含有する試料について、上記〔１〕
   及び〔３〕の工程を繰り返してＡ、Ｂ及びＡとＢの比を
   求め、上記試料がフック現象が起こるまでの領域の濃度
   であれば検量線Iから、上記試料がプロゾーン領域の濃
   度であれば検量線IIから、試料中の測定対象物の量を得
   る工程； を包含することを特徴とする免疫測定法。