JP4404994B2 - 免疫分析方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、とくに、通常のイムノアッセイでは測定レンジを超えるような定性項目の測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
抗原抗体反応を利用した物質の測定方法は、生体内の様々な微量な成分を検出するのに利用されている。測定対象成分としては、例えば、免疫グロブリン、補体、ホルモン、ウイルス抗原、腫瘍マーカー、炎症マーカー、あるいは薬剤等がある。これらの測定成分に標準物質が存在し、また濃度を測定することによって臨床的に有意義である場合には、検量線を使って反応量を濃度に変換することにより定量試験が可能である。しかしそのような標準物質がない場合、あるいはその測定成分の有無に意義がある場合には、検量線を使わない簡便な定性試験が実施されている。
【0003】
定性試験においては、判定は被検試料の反応量がある一定の値を超える場合に陽性、下回る場合を陰性とするのが一般的である。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、臨床検査においてはこの判定だけでなく、反応量も同時に考慮することにより、患者における被検物質の濃度の高低を半定量的に捉え、診断に役立てようとする考え方が出てきた。しかし従来の定性試験用試薬では測定レンジに関して狭いものが多く、特に高値検体において反応量が頭打ちになってしまうため、被検物質の濃度変化を追うことができない。このため定性試験であっても広い測定レンジを持った測定方法が要望されていた。
【0005】
例えばHBeAg測定では、低値検体における血中HBeAg濃度と臨床経過には相関があるが、高値においては測定法の頭打ちにより、測定できなかった。このため高値における測定レンジを拡大することにより、高値での血中HBeAg濃度の挙動が追跡できるようになり、より肝炎治療のモニタリングに役立てることができると期待されていた。しかし、従来のキットでは、反応量が頭打ちになってしまうため、高濃度領域でのHBeAg濃度の増減を調べることができなかった。
【0006】
このため、HBeAg測定では、低値検体における感度を確保したまま、高値検体の測定が可能な測定方法の開発が望まれている。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明は、1測定につき反応時間の異なる2点での測定を行うホモジニアスイムノアッセイにおいて、反応時間の短い方の測定値をT1、反応時間の長い方の測定値をT2としたとき、被検試料のT1があらかじめ設定された閾値A未満の場合は、第1の式
X1=(被検試料のT2)
で得られた値X1に基づいて反応量を求め、被検試料のT1が閾値A以上のときは第2の式
X2=(被検試料のT2)×(被検試料のT1)/A
で得られた値X2に基づいて反応量を求めることを特徴とする。
【0008】
また、前記被検試料の反応量を、別途測定した1つまたはそれ以上のコントロール物質の測定値を用いて、相対的な反応量(カットオフインデックス)に換算することもできる。
【0009】
コントロール物質としては、例えば、陰性コントロールおよびカットオフコントロールを用いることができ、以下の第3の式
【数2】
を用いて前記カットオフインデックスを算出することができる。
【0010】
【発明の実施の形態】
本発明において、陰性コントロールとは、測定対象成分を含まない溶液であり、水、緩衝液、陰性プール血清、測定対象成分の除去処理を行った血清などが挙げられる。
【0011】
また、カットオフコントロールとは、陽性判定の基準となる反応量を有する物質であり、被検試料がこのカットオフコントロールよりも大きな反応量を示す場合には、その被検試料は陽性と判定される。
【0012】
T2は反応が十分進行した時間帯での測定値を用いることが好ましい。この時間帯でのT2の測定は高感度で、低値検体の測定に適しているが、高値検体では頭打ちになってしまう。
【0013】
T1は反応が頭打ちにならない時間帯での測定値であり、反応が十分進行していない時間帯での測定値を用いることが好ましい。この時間帯でのT1の測定は低感度であるが、T2の測定で頭打ちになってしまうような高値検体でも頭打ちにならずに測定することが可能である。
【0014】
なお、あらかじめ陰性コントロールのT2とカットオフコントロールのT2を測定しておき、被検試料のT2の測定値を以下の式を用いてカットオフインデックスとして変換して相対反応量を求め、カットオフインデックスが1以上を陽性、1未満を陰性として判定することができることはすでに知られている(湯野 学、 他:ランリームHCVの概要、Sysmex J 20:39-44,1997)。
【式4】
【0015】
ところがこの変換式では、反応が頭打ちになるような高濃度試料においては、カットオフインデックス値も同様に頭打ちになってしまう。この点について、まずT2の代わりに、T1とT2の積を利用する方法を考案した。この方法は高値検体においては測定レンジの拡大に役立つが、低値検体においてはT1がばらつきを持ち、単調増加する信頼性の高いT2の測定値にばらつきを掛けてしまうことになってしまう。
【0016】
そこで、ある切り替えポイントを設定し、T1がある反応量(閾値A)未満の時には第1の式で被検試料の反応量を計算し、T1がある反応量(閾値A)以上の時には第2の式で被検試料の反応量を算出する方法を考案した。さらに、得られた被検試料の反応量を第3の式によりカットオフインデックスに変換することができる。このことによりT1が閾値Aよりも小さい低濃度試料において従来と同等の精度でカットオフインデックスを算出することが可能で、さらに高濃度試料においても、被検成分の増減を知ることが可能になる。
【0017】
ここで、閾値Aは別途定める一定値であり、T1が単調増加し始めたときの測定値を用いることができ、実験的に求めてもよいし、測定値から適当な数式を用いて算出してもよい。
【0018】
本発明の好適な実施例においては、例えば、まず陰性コントロールのT2とカットオフコントロールのT2を測定し、また閾値Aをあらかじめ決めておく。
【0019】
次に被検試料のT1及びT2を測定する。そして、T1がA未満の場合、上記の第1の式を用いて反応量を算出し、A以上の場合には上記第2の式を用いて反応量を算出する。
【0020】
次いで、第3の式を用いて、カットオフインデックスに変換する。
【0021】
なお、ホモジニアスイムノアッセイの例としては、免疫比濁法、ラテックス凝集法などが挙げられる。
【0022】
【実施例】
本発明をラテックス凝集法に適用した実施例を示す。本実施例では、全自動免疫凝集測定装置PAMIA−50(シスメックス株式会社)を使用して、HBeAgの測定を行った。
【0023】
PAMIAシリーズの測定原理は、抗原または抗体を感作したラテックス試薬と検体中の抗原または抗体との凝集反応で、未反応粒子数(M:monomer)と反応により形成された凝集塊の数(P:polymer)を半導体レーザーを用いた粒子計数装置で計数するものである。MとPの総和をT:totalとし、P/T(凝集度)を算出する。
【0024】
▲1▼HBe抗体感作ラテックス試薬の調製
HBe抗体(マウスモノクローナル抗体、市販品)60μgを含むGTA緩衝液(0.53mg/ml 3,3-ジメチルグルタル酸, 0.4mg/ml トリス, 0.35mg/ml 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール, pH4.6)950μlに、10%ポリスチレンラテックス(粒径約0.7μ, 市販品)50μlを加えて2時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、沈殿に1% 牛血清アルブミン(市販品)を含むGTA緩衝液を1ml加えて、超音波処理した。この遠心から超音波処理までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して沈殿に220mg/ml グリセリン、0.3% 牛血清アルブミンを含むGTA緩衝液(pH6.2) 1mlを加えて、超音波処理した。これをHBe抗体感作ラテックス試薬とした。
【0025】
▲2▼反応緩衝液の調製
1.6mg/ml 3,3-ジメチルグルタル酸、1.1mg/ml 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、18.18mg/ml トリス、5% 牛血清アルブミン、0.8% デキストラン(市販品)、pH6.70を調製し、反応緩衝液とした。
【0026】
▲3▼HBeAg高濃度試料の測定
被検試料として、Chemicon社RECOMBINANT HEPATITIS B"e" ANTIGENを陰性プール血清で希釈して0〜100000ng/mlのHBeAg濃度既知試料を調製し、測定を行った。なお、抗原濃度は、メーカー測定法に準じて測定した。
【0027】
全自動免疫凝集測定装置PAMIA-50を使用して、▲2▼で調製した反応緩衝液80μlと、上記で調製したHbeAg濃度既知試料10μlを混合し、▲1▼で調製したHBe抗体感作ラテックス試薬10μlを加えて反応を開始した。反応温度は45℃とした。
【0028】
反応開始後30秒後に反応液19μlを回収して、凝集度(P/T: 2個以上凝集したラテックス粒子の数 ÷ ラテックス粒子の総数 × 100)を測定し、この値をT1とした。
【0029】
反応開始後15分後に反応液19μlを回収して、同様に凝集度を測定し、この値をT2とした。
【0030】
結果を図1に示す。抗原濃度の上昇に伴い、P/Tは増加するが、抗原濃度が高すぎると、反応時間15分後のP/T(T2)は60%付近で頭打ちになる。
【0031】
一方、反応時間30秒後のP/T(T1)に着目すると、反応は頭打ちにならず、T2が頭打ちになるような抗原濃度においても、濃度とともに増加していることがわかる。
【0032】
▲4▼各コントロールの調製
5% 牛血清アルブミンを含むPBS溶液(1.7mg/ml リン酸二水素ナトリウム、8.8mg/ml 塩化ナトリウム, pH 7.0)を調製し、陰性コントロールとした。
陰性コントロールにHBeリコンビナント抗原(市販品)を4ng/mlになるように添加したものをカットオフコントロールとした。
【0033】
陰性コントロールにHBeリコンビナント抗原(市販品)を1000ng/mlになるように添加したものを陽性コントロールとした。
【0034】
▲5▼HBe強陽性検体の希釈試料の調製
まずB型肝炎スクリーニング検査(HBs抗原、HBs抗体)で陰性と確認された血清をプールして、陰性プール血清を調製した。
【0035】
次に市販のHBe強陽性検体(Clinical Science Laboratories社 ID:#19981001001)を陰性プール血清で順次2倍に希釈して、希釈試料の系列を調製した。
【0036】
▲6▼コントロールの測定
全自動免疫凝集測定装置PAMIA-50を使用して、▲2▼で調製した反応緩衝液80μlと、▲4▼で調製したコントロール10μlを混合し、▲1▼で調製したHBe抗体感作ラテックス試薬10μlを加えて反応を開始した。反応温度は45℃とした。
【0037】
反応開始後30秒後に反応液19μlを回収して、凝集度(P/T: 2個以上凝集したラテックス粒子の数 ÷ ラテックス粒子の総数 × 100)を測定し、この値をT1とした。
【0038】
反応開始後15分後に反応液19μlを回収して、同様に凝集度を測定し、この値をT2とした。
【0039】
この結果を表1に示す。各3回の測定結果の平均を算出し、▲7▼及び▲8▼においてカットオフインデックスの計算におけるパラメータとして利用した。
【0040】
【表1】
【0041】
▲7▼HBe強陽性検体の希釈試料の測定
▲6▼と同様の方法で、▲5▼で調製した希釈試料を測定した。この測定結果を図2に、また、▲6▼で算出したパラメータを利用して従来法の計算式(式4)に当てはめて計算したカットオフインデックス、及び判定(1.0以上を+:陽性、未満を−:陰性)、本発明の計算式(式3)に当てはめて計算したカットオフインデックス、及び判定を表2に示した。ここで本発明における切替ポイントAは任意に設定できるが、今回はT1の測定値で1.00に設定して計算した。
【0042】
【表2】
【0043】
表2において希釈倍率×16以上の試料では、T1が切替ポイント未満のため、従来法と本発明で同じカットオフインデックスを示し、判定も同じである。このことにより臨床診断において最も重要である陰性・陽性の判定においては、従来と変わらない性能を持っていることが示された。
【0044】
希釈倍率×1から×8の試料では、従来法では計算値が160程度で頭打ちになってしまうのに対して、本発明では希釈倍率に応じた計算値の伸びが見られた。
【0045】
このことを更に明瞭にするため、表2の結果を図示したものを図3に示す。希釈倍率×16以上ではカットオフインデックスの推移は直線的であり、希釈倍率と相関していることがわかる。このことはカットオフインデックスの推移が試料中のHBe抗原の濃度を反映したものであることを示している。希釈倍率×1から×8では、本発明でのみほぼ直線的な推移を示しており、この推移は×16以上の推移を直線的に伸長したものになっている。このことから、本発明によって抗原濃度を反映したカットオフインデックスの推移が高濃度側に伸長し、より高濃度の試料の測定が可能になった(測定レンジが高濃度側に拡大された)ことが示された。
【0046】
▲8▼実際の検体の測定
幾つかのHBe陽性検体についても▲6▼と同様の方法で測定した。この結果を表3に示す。T1が切替ポイント1.00に満たない検体(No.1, No.3, No.6, No.7)については従来法と同じカットオフインデックスが算出された。T1が切替ポイント1.00を超える検体のうち、特にNo.2とNo.4については、従来法でそれぞれ156.05, 166.34とほとんど近い値を示しているのに対し、本発明ではそれぞれ715.90, 1589.30と明らかな差となって表れている。
【0047】
【表3】
【0048】
このことから、▲7▼で示された測定レンジの高濃度側への拡大が、実際の検体の測定においても有効であることが示された。
【0049】
【発明の効果】
本発明によれば、従来法で反応が頭打ちになるような高値検体であっても、より高濃度まで頭打ちにならずに測定できる時間帯での測定値(T1)を組み込んで計算することで測定対象成分の増減を知ることができる。したがって、低値から高値までの幅広い反応量の変動を追跡でき、治療のモニタリングに極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図1】HBeAg抗原濃度とP/Tの関係を示したグラフである。
【図2】 HBe強陽性検体の希釈試料を測定した結果を示したグラフである。
【図3】本発明の方法と従来法で求めたカットオフインデックス値を比較したグラフである。
Claims (3)
- 1測定につき反応時間の異なる2点での測定を行うホモジニアスイムノアッセイにおいて、反応時間の短い方の測定値をT1、反応時間の長い方の測定値をT2としたとき、被検試料のT1があらかじめ設定された閾値A未満の場合は、第1の式
X1=(被検試料のT2)
で得られた値X1に基づいて反応量を求め、被検試料のT1が閾値A以上のときは第2の式
X2=(被検試料のT2)×(被検試料のT1)/A
で得られた値X2に基づいて反応量を求め、閾値Aが強陽性検体を希釈倍率を変化させて測定したT1に基づいて予め設定されることを特徴とする免疫分析方法。 - 前記被検試料の反応量を、別途測定した1つまたはそれ以上のコントロール物質の測定値を用いて、相対的な反応量(カットオフインデックス)に換算することを特徴とする請求項1記載の免疫分析方法。
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