JP3290520B2 - 抗リン脂質抗体測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血清、血漿、脳脊髄液
などの検体中に含まれる抗リン脂質抗体を、特異的に、
高感度で、操作性よく、迅速に測定することができる抗
リン脂質抗体測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト血漿または血清中のレアギン、すな
わち「抗体様」物質の存在は梅毒性疾患を示すものであ
る。レアギン（またはレアギン性抗体）は種々の試験法
を用いて測られる。上記定量法はいずれもレアギンの検
出にカルジオライピン抗原を使用している。この抗原は
フォスファチジルコリンすなわちレシチン：カルジオラ
イピン：コレステロールの重量比２：０．３：９の混合
物である。

【０００３】最も一般的なものにＲＰＲ（Rapid Plasma
Reagin ）カード試験のようなカード綿状試験がある。
ＲＰＲカード試験は、レアギン含有血漿に晒されると綿
化する炭素粒子カルジオライピン抗原懸濁液を使用す
る。綿化は、カードの白い背景に対し黒い炭素粒子の凝
集として裸眼で認められる。他の試験、例えばＶＤＲＬ
（Venereal Disease Research Lab ）やＲＳＴ（レアギ
ンスクリーンテスト）は同じ綿化原理に基づいておりカ
ルジオライピン抗原を使用している。米国特許第４７３
８９３２号は、梅毒関連抗体用の凝集反応試験を開示し
ている。この試験は、ポリペプチド架橋を介してラテッ
クス粒子にイオン的に結合したカルジオライピン抗原の
緩衝化した水性懸濁液よりなる抗原試薬を用いている。
綿状試験は多数の標本をスクリーニングする際には労力
の集中を要し、そして結果が主観的解釈に基づいている
という限界を有する。

【０００４】多数の研究者が、カルジオライピン抗原を
酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ）タイプの操作に組み込む
ことによりレアギン試薬を改良しようと試みてきた。こ
れらのＥＬＩＳＡは学術文献に記述されており、市販の
ポリスチレンミクロタイター板へカルジオライピン、フ
ォスファチジルコリンおよびコレステロールの吸着を伴
っている。更に、レアギンＥＬＩＳＡはＡＤＩ Diagno
stics 社より市販されている。これらのＥＬＩＳＡ法は
多数の標本のスクリーニングのためにはカード試験より
優れており（例えば、より少ない労力集中）、また数値
的または半定量的結果を与える。

【０００５】しかしながら、それらはＲＰＲまたはＶＤ
ＲＬ試験ほどには特異的でも高感度でもない（すなわ
ち、偽の陽性結果をより多く与える）。例えば、ＡＤＩ
Diagnostics はＶＤＲＬ試験に比し特異性では９５．
４％、感度では８２．２％である。また、これらのＥＬ
ＩＳＡタイプのアッセイは、試験の分注、プレートの洗
浄などの煩雑な操作を要し、判定までに長時間がかかる
という欠点を有する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、血清中
の抗リン脂質抗体を測定する場合、ＲＰＲカード試験や
ＶＤＲＬテスト、ＲＳＴを利用すると、迅速性、操作性
には優れるが目視による半定量法であるため、施術者や
測定日により判定結果が異なるなど、精度的に問題があ
った。また、ＥＬＩＳＡタイプのキットは、精度的には
上記テストより優れているが、操作性、迅速性からは不
十分であった。すなわち、抗リン脂質抗体の測定を迅速
に、しかも精度よく測定できる方法がないのが現状であ
る。

【０００７】本発明は、上述の様な事情に鑑み、精度的
にも、操作性、迅速性からも申分のない抗リン脂質抗体
測定法を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段および作用】本発明者は、
上記問題を解決すべく種々検討した結果、ラテックス粒
子にリン脂質を組み合わせて固定化させ、さらに反応媒
体中に水溶性高分子重合体および／または水溶性高分子
共重合体を存在させることにより、上記ラテックス試薬
が高感度かつ高特異的に凝集することを見い出し、本発
明を完成するに到った。

【０００９】すなわち、本発明による抗リン脂質抗体測
定法は、カルジオライピン、フォスファチジルコリンお
よびコレステロールをこれらの重量比がそれぞれ０．５
〜３、８〜１２および１〜５となるように溶解してなる
抗原液をラテックス懸濁液に添加して混合または放置
し、上記懸濁液に不活性な蛋白質を含む緩衝液を添加し
て混合または放置し、ラテックス粒子・カルジオライピ
ン抗原複合体を分離取得し次いで洗浄した後、得られた
ラテックス粒子・カルジオライピン抗原複合体を免疫的
に不活性な蛋白質を含む緩衝液に懸濁再分散させて調製
されたラテックス試薬を用いた抗リン脂質抗体の測定方
法であって、被検者から採取した検体を、水溶性高分子
重合体および／または水溶性共重合体を含む懸濁液によ
り希釈する第１工程と、第１工程で希釈された検体に、
上記ラテックス試薬を添加し、抗原抗体反応を行せしめ
る第２工程と、第２工程の反応液の特定波長における吸
光度の変化量を測定することで、上記検体中に含まれる
抗リン脂質抗体を検出する第３工程から成るものであ
る。

【００１０】本発明のよる抗リン脂質抗体測定法では、
互いに濃度の異なる１種以上の標準品について測定を行
うことで標準曲線を作成し、この標準曲線と本発明に基
づいて処理された試料の特定波長とを比較することで上
記試料中の抗リン脂質抗体の濃度を求める。あるいは標
準となる血清を試料と同時に測定し、得られた吸光度変
化量が該標準品より低いかまたは高いかを以て、梅毒陰
性あるいは陽性の判定を行うものである。

【００１１】本発明方法におけるラテックス試薬の調製
で使用する免疫的に不活性な蛋白質の代表例は、ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）である。

【００１２】検体は、血清、血漿または脳脊髄液であり
得る。これらの検体は通常の採取方法および処理方法に
より得られる。血清の場合には、血液が静脈穿刺により
得られ、凝結させ、そして血清が得られる。 Treponema
pallidumに感染したヒトからの血清は梅毒感作抗体
（感染の初期において損傷を受けた宿主細胞から遊離し
た脂質性物質に応答して宿主により形成され、感作カル
ジオライピンと反応する抗体の混合物）およびトレポネ
ーマ抗原に対する特異抗体を含有する。

【００１３】本発明において抗原試薬は、カルジオライ
ピン抗原をラテックス粒子に物理吸着されることにより
製造される。このラテラックスの粒子径は、普通は０．
０１〜１５μｍ、より普通には０．０５〜７μｍの範囲
とされる。より好ましいラテックスは、０．１〜０．８
μｍの粒子サイズを有する。ラテックス粒子・カルジオ
ライピン抗原複合体を製造する際に用いるために、中性
であり修飾されたラテックスが市販されている。本発明
に用いられるラテックスとしては、スチレンもしくはそ
の誘導体、またはオレフィンラテックス、アクリル酸ラ
テックス、合板ゴム系のものなどであり、特に限定はさ
れない。特に好適なのはポリスチレンラテックスであ
る。

【００１４】後述する実施例に記述の粒子の場合には、
最終容量での約１ｍｇ／ｍｌの粒子濃度が、最適である
とわかった。

【００１５】このラテックスと結合されるカルジオリピ
ンは、カルジオライピン（これは、牛の心臓部から精製
されるジホスファチジルグリセロールである）のエタノ
ール溶液の形態である。このカルジオライピンは、コレ
ステロールおよびフォスファチジルコリンまたは他の感
作試薬（これは、カルジオライピンと梅毒性感作抗体と
の反応を可能にする）と組み合わされる。

【００１６】カルジオライピン、フォスファチジルコリ
ンおよびコレステロールのエタノール溶液は、約０．０
０１〜５ｍｇ／ｍｌ、より普通には０．１〜３ｍｇ／ｍ
ｌ、最も好ましくは０．６〜０．９ｍｇ／ｍｌの範囲の
カルジオリピン、および約１．０〜２０．０ｍｇ／ｍ
ｌ、より普通には２．０〜１２．０ｍｇ／ｍｌ、最も好
ましくは４．０〜１１．０ｍｇ／ｍｌの範囲のフォスフ
ァチジルコリン（これは、卵黄、大豆に由来するかまた
は合成により得られる）、および約０．１〜１０．０ｍ
ｇ／ｍｌ、より普通には１．０〜４．０ｍｇ／ｍｌ、最
も好ましくは１．５〜２．０ｍｇ／ｍｌの範囲のコレス
テロールを含有する。

【００１７】得られたラテックス粒子・カルジオライピ
ン抗原複合体は、５〜１０、普通は５．５〜８．０、好
ましくは６．５〜７．５の範囲にｐＨ調整された水性媒
体中に懸濁される。この媒体中の複合体の濃度は、約
０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌ、普通は０．７〜１．５ｍｇ
／ｍｌ、好ましくは０．９〜１．２ｍｇ／ｍｌの範囲で
ある。トリス、グリシンおよびリン酸塩のような種々の
緩衝液が使用され得る。リン酸塩がより好ましい。緩衝
液の濃度は、一般に、約０．００５〜０．５Ｍの範囲、
より普通には約０．０１〜０．２５Ｍの範囲とされる。
この緩衝液は、塩化ナトリウムのような塩を含有してい
る。そのほか普通の免疫反応に用いられる緩衝液も当然
使用できる。

【００１８】他の添加物もまた、緩衝媒体中に存在して
いてもよい。この添加物は、個々の成分または試薬を保
存しまたは保護するために、または試薬の遂行能力を助
けるために、使用される。エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）は、１〜１００ｍＭ、より普通には１０〜８０
ｍＭ、好ましくは約３０〜６０ｍＭの濃度で使用され得
る。また塩化コリンは０．０５〜１Ｍ、より普通には
０．１〜０．８Ｍ、好ましくは０．３〜０６Ｍで使用さ
れ得る。アジ化ナトリウムは０．０１〜０．５容量％で
使用され得る。

【００１９】また、抗原抗体反応を利用した免疫測定法
では、感度の向上および測定時間の短縮などを目的とし
て、抗原抗体反応系に増感剤を添加する手法が一般的に
行われている。増感剤としてはポリエチレングリコー
ル、多糖類、多糖類の誘導体、グリコシルアルキルメタ
クリレートの重合体もしくは共重合体などの水溶性高分
子からなるものが用いられる。本発明では、特に検体希
釈用の緩衝液に添加する水溶性高分子として、ポリエチ
レングリコール（和光純薬社製、平均分子量５０万）
が、約０．０１〜２．０容量％、より普通には約０．０
５〜１．０容量％、好ましくは約０．１〜０．５容量％
の量で使用され、グルコシルエチルメタクリレートのホ
モポリマー（日本精化社製、平均分子量約３０万）が、
０．５〜２．０容量％、より普通には０．７〜１．５容
量％、好ましくは０．８〜１．２容量％の濃度で使用さ
れる。なお、上記添加物以外にも、安定化剤、非特異抑
制剤、凝集促進剤として一般的に用いられている添加剤
ももちろん使用できる。

【００２０】本発明の測定法を適用したキットは、定量
法および定性法のいずれの方法でも使用できる。すなわ
ち、定量法として使用する場合には、あらかじめ抗リン
脂質抗体濃度が既知の標準品を測定し、吸光度変化量と
抗体濃度をプロットして得られた検量線に、未知の濃度
の試料を測定して得られた吸光度変化量を外探し、抗体
濃度を算出すればよい。また定性法として使用する場合
には、カットオフ値を示す標準血清と未知の試料を同時
に測定し、標準血清より吸収光度変化量が大のものを陽
性、小のものを陰性として判定するなどの方法がある。

【００２１】

【実施例】

実施例１ （Ａ）試薬および検体の調製 ０．１Ｍ ＮａＰＢ（リン酸緩衝液）として、０．２Ｍ
Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ（２７．８ｇ／ｌ）、０．
２Ｍ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ（７１．７ｇ／ｌ）
４０５ｍｌに混合し、０．２Ｍ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・２Ｈ
₂ Ｏ（２７．８ｇ／ｌ）を６７ｍｌ添加すつことにより
ｐＨを７．４０に調整したのち、精製水で１０００ｍｌ
に増量し、これにＮａＮ₃ を０．１％（Ｗ／Ｖ）になる
ように添加したものを用いた。

【００２２】１％ＢＳＡ・ＮａＰＢとして、０．１Ｍ
ＮａＰＢにＢＳＡ（Reagent Grade,Fraction Ｖ、マイ
ルズ社製）を１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したもの
を用いた。

【００２３】カルジオライピンとして、ＣＡＲＤＩＯＬ
ＩＰＮ（Diphosphatidylglycerol Sodium Salt from Bo
vine Heart、シグマ社製、５ｍｇ／ｍｌエタノール溶
液）を用いた。

【００２４】フォスファチジルコリンとして、L-α-Pho
spatidyl Choline from Egg Yolk（９５％、ナカライ
テスク社製、ＥＸＴＲＡ ＰＵＲＥ Reagent ）を用い
た。

【００２５】コレステロールとして、Cholesterol （Ch
olesterin 、ナカライテスク社製、試薬特級）を用い
た。

【００２６】ＥＤＴＡとして、エチレンジアミン四酢酸
二ナトリウム二水和物（ナカライテスク社製、試薬特
級）を用いた。

【００２７】塩化コリンとして、Choline Chloride（和
光純薬社製、試薬一級）を用いた。

【００２８】ラテックス懸濁用緩衝液として、１％ＢＳ
Ａ・ＮａＰＢに０．５Ｍ、塩化コリン、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡとなるように調製したものを用いた。

【００２９】ポリエチレングリコールとして、Polyethy
leneglycol（平均分子量５０万、和光純薬社製）を用い
た。

【００３０】ｐＧＥＭＡとして、グルコシルエチルメタ
クリレートのホモポリマー（平均分子量３０万、日本精
化社製）を用いた。

【００３１】検体希釈用緩衝液（Ｇ）として、０．１Ｍ
ＮａＰＢに、０．２５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ、１．０％
（Ｗ／Ｖ）ｐＧＥＭＡとなるように調製したものを用い
た。

【００３２】検体希釈用緩衝液（Ｐ）として、０．１Ｍ
ＮａＰＢに、０．２５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ、０．２５
％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧとなるように調製したものを用い
た。

【００３３】ラテックスとして、平均粒径０．４００μ
ｍ（固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、Ｎ−４００、積水化学社
製）を用いた。

【００３４】ＲＰＲカードテスト法として、化血研（３
００回用）のものを用いた。

【００３５】梅毒患者血清として、ＴＰＨＡ法（セロク
リットＴＰ：化血研およびセロディアＴＰ：富士レビオ
の２法）、ＦＴＡ−ＡＢＳ法およびガラス板法で陽性と
判定され、かつ医師の診断により梅毒と判定された患者
の血清を用いた。

【００３６】梅毒陰性血清として、ＴＰＨＡ法、ＦＴＡ
−ＡＢＳ法およびガラス板法の３法すべてが陰性であっ
たもの１０検体を用いた。

【００３７】 （Ｂ）抗リン脂質抗体検出用ラテックス試薬の調製 １．抗原感作液の調製 カルジオライピン（以下ＣＬと略す）、フォスファチジ
ルコリン（以下ＰＣと略す）、コレステロール（以下Ｃ
ＨＯＬと略す）を各々エタノール（試薬特級）に溶解
し、それぞれ濃度を５、１０、１０ｍｇ／ｍｌに調整し
た。これらを重量比がＣＬ：ＰＣ：ＣＨＯ＝１：１０：
３となるような容量比、すなわち各々２、１０、３ｍｌ
をよく混合し、全量で１５ｍｌとしたものを調製した。
これを抗原感作液とした。

【００３８】２．抗原の固定化 ラテックス０．１ｍｌ（粒径０．４００μｍ、固形分１
０％）をマグネチックスターラーで攪拌しながら、抗原
感作液１．００ｍｌを素早く添加し、そのまま１時間攪
拌した。その後、１％ＢＳＡ・ＮａＰＢ２．０ｍｌを添
加し、続けて１．５時間攪拌した。その後、１８，００
０ｒｐｍにて３０分遠心分離した。得られた固形分すな
わちラテックス粒子・カルジオライピン抗原複合体を精
製水で洗浄し、ついでこれを１％ＢＳＡ・ＮａＰＢ５ｍ
ｌに懸濁させ、よく分散させて、固形分０．１２５％の
ラテックス試薬を調製し、これを４℃にて保存した。

【００３９】（Ｃ）抗リン脂質抗体の測定 上記（Ｂ）にて調製したラテックス試薬およびｐＧＥＭ
Ａを含む検体希釈用緩衝液を用いて、ヒト血清中の抗リ
ン脂質抗体の測定を行った。測定機器としては生化学自
動分析装置日立７０５０型（日立製作所）を用いた。

【００４０】測定条件は以下の通りである。

【００４１】検体容量 ：２０μｌ ラテックス試薬 ：５０μｌ 検体希釈用緩衝液（Ｇ）：３５０μｌ 測定波長 ：３５０ｎｍ 測定温度 ：３７℃ 測定開始後、８０秒と３２０秒の波長５７０ｎｍにおけ
る吸光度の差（ΔＯ．Ｄ．₅₇₀ ）を測定し、この吸光度
の変化量を１０⁴ 倍したものを第１表および第２表に示
した。（ｎ＝４の平均値）。

【００４２】なお検体として、梅毒陽性患者血清１０検
体、および梅毒陰性患者血清１０検体を用いた。

【００４３】実施例２ カルジオライピン：フォスファチジルコリン：コレステ
ロールの重量比が１：１２：３となるように抗原液を調
製した以外はすべて実施例１と同様の操作を行った。

【００４４】実施例３ 検体希釈用緩衝液としてｐＧＥＭＡの代わりに、ＰＥＧ
を含む０．２５％ＢＳＡ／０．１Ｍ ＮａＰＢを用いた
以外はすべて実施例１と同様の操作を行った。

【００４５】実施例４ 検体希釈用緩衝液としてｐＧＥＭＡの代わりに、ＰＥＧ
を含む０．２５％ＢＳＡ／０．１Ｍ ＮａＰＢを用いた
以外はすべて実施例２と同様の操作を行った。

【００４６】比較例１ 実施例１〜４で用いたラテックス試薬の代わりに、市販
品のＲＰＲカードテストを用いて、同一の検体について
測定を実施した。

【００４７】比較例２ カルジオライピン：フォスファチジルコリン：コレステ
ロールの重量比が２：０．３：９となるように抗原液を
調製してラテックス試薬化した以外はすべて実施例１と
同様の操作を行った。

【００４８】比較例３ 検体希釈用緩衝液としてｐＧＥＭＡを除いた０．２５％
ＢＳＡ／０．１Ｍ ＮａＰＢを用いた以外はすべて実施
例１と同様の操作を行った。

【００４９】（Ｄ）結果 梅毒陽性患者血清１０検体についての実施例１〜４、比
較例１〜３の結果を第１表に示す。また、梅毒陰性患者
血清１０検体についての実施例１〜４、比較例１〜３の
結果を第２表に示す。

【００５０】

【表１】

【表２】 表１から明らかなように、市販品であるＲＰＲ法では梅
毒陽性患者血清１０検体中２検体が±という偽陰性を呈
した。これに対して実施例ではすべての検体について吸
光度変化量が４００．０以上を示した。また、表２に示
すように、梅毒陰性患者血清の吸光度変化量はすべて７
０．０以下を示し、カットオフ値を１００．０付近に設
定した場合、陽性血清との判定が明瞭に行える可能性が
示唆された。これに対してＲＰＲ法では、１０検体中２
検体が±という偽陽性を呈した。従来のいわゆるレアギ
ン様抗原を用いて試薬化した比較例２では、表２に示し
たように非特異反応が大であり、ラテックス試薬に適し
た抗原組成ではないと考えられた。また、水溶性高分子
を含まない緩衝液を用いた比較例３では陽性血清の測定
に関して十分な感度が得られなかった。

【００５１】上記結果から明らかなように、本発明は抗
リン脂質抗体の検出法において、従来のＲＰＲ法と比較
して、高感度および高特異的に抗リン脂質抗体を測定す
ることが可能である。また、該抗体の濃度が連続した数
値で得られるため、ＲＰＲ法の倍々希釈による半定量法
と比較して、より高精度に抗体を測定することが可能と
なる。

【００５２】

【発明の効果】本発明による抗リン脂質抗体測定法ほ以
上の通り構成されているので、血清、血漿、脳脊髄液な
どの検体中に含まれる抗リン脂質抗体を、高感度で、特
異的に、操作性よく、迅速に測定することができる。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カルジオライピン、フォスファチジルコ
   リンおよびコレステロールをこれらの重量比がそれぞれ
   ０．５〜３、８〜１２および１〜５となるように溶解し
   てなる抗原液をラテックス懸濁液に添加して混合または
   放置し、上記懸濁液に不活性な蛋白質を含む緩衝液を添
   加して混合または放置し、ラテックス粒子・カルジオラ
   イピン抗原複合体を分離取得し次いで洗浄した後、得ら
   れたラテックス粒子・カルジオライピン抗原複合体を免
   疫的に不活性な蛋白質を含む緩衝液に懸濁再分散させて
   調製されたラテックス試薬を用いた抗リン脂質抗体の測
   定方法であって、 被検者から採取した検体を、水溶性高分子重合体および
   ／または水溶性共重合体を含む懸濁液により希釈する第
   １工程と、 第１工程で希釈された検体に、上記ラテックス試薬を添
   加し、抗原抗体反応を行せしめる第２工程と、 第２工程の反応液の特定波長における吸光度の変化量を
   測定することで、上記検体中に含まれる抗リン脂質抗体
   を検出する第３工程から成る、 抗リン脂質抗体の測定方法。