JP3375739B2 - 高感度化免疫測定方法 - Google Patents
高感度化免疫測定方法Info
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- JP3375739B2 JP3375739B2 JP15034894A JP15034894A JP3375739B2 JP 3375739 B2 JP3375739 B2 JP 3375739B2 JP 15034894 A JP15034894 A JP 15034894A JP 15034894 A JP15034894 A JP 15034894A JP 3375739 B2 JP3375739 B2 JP 3375739B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヘテロジニアス免疫測
定方法に関し、更に詳しくは体液、特に血精、血漿、尿
中の特定成分を高感度に定量できる免疫測定方法に関す
るものである。体液中の特定成分としては、腫瘍マーカ
ー、ホルモン、薬物、抗体、および病原体由来抗原など
あらゆる物質が包含される。
定方法に関し、更に詳しくは体液、特に血精、血漿、尿
中の特定成分を高感度に定量できる免疫測定方法に関す
るものである。体液中の特定成分としては、腫瘍マーカ
ー、ホルモン、薬物、抗体、および病原体由来抗原など
あらゆる物質が包含される。
【０００２】
【従来の技術】免疫測定方法は、ホモジニアス法と ヘ
テロジニアス法とに大別される。ヘテロジニアス法で
は、結合型標識体と遊離型標識体を分離（Ｂ／Ｆ分離）
するため、抗原または抗体、あるいはそれらと特異的に
反応するリガンドを不溶化した固相が用いられる。固相
としては、ビーズ、試験管、マイクロプレート、マイク
ロパーティクル、ガラス繊維集合体、セルロース繊維集
合体、メンブレンフィルター等が用いられる。
テロジニアス法とに大別される。ヘテロジニアス法で
は、結合型標識体と遊離型標識体を分離（Ｂ／Ｆ分離）
するため、抗原または抗体、あるいはそれらと特異的に
反応するリガンドを不溶化した固相が用いられる。固相
としては、ビーズ、試験管、マイクロプレート、マイク
ロパーティクル、ガラス繊維集合体、セルロース繊維集
合体、メンブレンフィルター等が用いられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
ヘテロジニアス免疫測定方法においては、固相上で行わ
れる測定対象物質含有免疫複合体の生成の操作は一回限
りであり、しかも免疫反応の適正さを維持するために、
相当に希釈された検体を使用する必要上、反応生成物で
ある免疫複合体の生成量、従ってそこに含まれる測定対
象物質量が少なく、検出感度が低位とならざるを得なか
った。
ヘテロジニアス免疫測定方法においては、固相上で行わ
れる測定対象物質含有免疫複合体の生成の操作は一回限
りであり、しかも免疫反応の適正さを維持するために、
相当に希釈された検体を使用する必要上、反応生成物で
ある免疫複合体の生成量、従ってそこに含まれる測定対
象物質量が少なく、検出感度が低位とならざるを得なか
った。
【０００４】本発明者は、種々研究の結果、従来方法を
ベースとして、測定感度を顕著に改良する方法を開発す
るに至った。
ベースとして、測定感度を顕著に改良する方法を開発す
るに至った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、同一固相に保
持される免疫複合体の生成とＢ／Ｆ分離の操作を複数回
繰り返して行い、該複合体量を累増させる多段反応によ
るヘテロジニアス免疫測定方法を提示するものである。
本発明で使用する各回の免疫複合体の生成方法としては
公知の各種方法ないしプロセスを適用することができ
る。
持される免疫複合体の生成とＢ／Ｆ分離の操作を複数回
繰り返して行い、該複合体量を累増させる多段反応によ
るヘテロジニアス免疫測定方法を提示するものである。
本発明で使用する各回の免疫複合体の生成方法としては
公知の各種方法ないしプロセスを適用することができ
る。
【０００６】本発明はこれらのすべてに対応して実施す
ることができる。代表的態様を以下に列記する。尚、こ
こで「特定物質」とは測定すべき抗体または抗原を、
「免疫物質」とは該特定物質に特異的に反応する抗体ま
たは抗原を示す。
ることができる。代表的態様を以下に列記する。尚、こ
こで「特定物質」とは測定すべき抗体または抗原を、
「免疫物質」とは該特定物質に特異的に反応する抗体ま
たは抗原を示す。
【０００７】第１の態様では、該流体試料を、流体試料
中の該特定物質に対して特異的に反応する第１の免疫物
質を結合した固相と共にインキュベートすることによ
り、不溶化第１免疫物質−特定物質から成る免疫複合体
を形成し、該免疫複合体を保持した固相を反応混合物か
ら分離する。新たに準備した該流体試料を上記固相と共
にインキュベートすることにより、不溶化第１免疫物質
−特定物質から成る免疫複合体を新たに形成し、該免疫
複合体を保持した固相を反応混合物から分離する。この
工程を繰り返すことにより、測定対象物質を含む免疫複
合体を固相上に累増させる。
中の該特定物質に対して特異的に反応する第１の免疫物
質を結合した固相と共にインキュベートすることによ
り、不溶化第１免疫物質−特定物質から成る免疫複合体
を形成し、該免疫複合体を保持した固相を反応混合物か
ら分離する。新たに準備した該流体試料を上記固相と共
にインキュベートすることにより、不溶化第１免疫物質
−特定物質から成る免疫複合体を新たに形成し、該免疫
複合体を保持した固相を反応混合物から分離する。この
工程を繰り返すことにより、測定対象物質を含む免疫複
合体を固相上に累増させる。
【０００８】第２の態様では、該流体試料を、流体試料
中の該特定物質に対して特異的に反応する第１の免疫物
質を結合した固相、および該特定物質に対して特異的に
反応する検出可能標識物質で標識した第２の抗体と共に
インキュベートすることにより、不溶化第１免疫物質−
特定物質−標識第２免疫物質から成る免疫複合体を形成
し、該免疫複合体を保持した固相を反応混合物から分離
する。新たに準備した該流体試料および標識第２免疫物
質を上記固相と共にインキュベーションすることによ
り、不溶化第１免疫物質−特定物質−標識第２免疫物質
から成る免疫複合体を新たに形成し、該免疫複合体を保
持した固相を反応混合物から分離する。この工程を繰り
返すことにより、測定対象物質を含む免疫複合体を固相
上に累増させる。
中の該特定物質に対して特異的に反応する第１の免疫物
質を結合した固相、および該特定物質に対して特異的に
反応する検出可能標識物質で標識した第２の抗体と共に
インキュベートすることにより、不溶化第１免疫物質−
特定物質−標識第２免疫物質から成る免疫複合体を形成
し、該免疫複合体を保持した固相を反応混合物から分離
する。新たに準備した該流体試料および標識第２免疫物
質を上記固相と共にインキュベーションすることによ
り、不溶化第１免疫物質−特定物質−標識第２免疫物質
から成る免疫複合体を新たに形成し、該免疫複合体を保
持した固相を反応混合物から分離する。この工程を繰り
返すことにより、測定対象物質を含む免疫複合体を固相
上に累増させる。
【０００９】第３の態様では、該流体試料を、流体試料
中の該特定物質に対して特異的に反応する第１の免疫物
質と共にインキュベートすることにより、第１免疫物質
−特定物質から成る免疫複合体を形成し、該免疫複合体
を、第１免疫物質に対して特異的に反応するリガンドを
結合した固相と共にインキュベートすることにより、該
免疫複合体を固相上に捕捉し、該免疫複合体を保持した
固相を反応混合物から分離する。新たに準備した該流体
試料を第１免疫物質と共にインキュベートすることによ
り、第１免疫物質−特定物質から成る免疫複合体を新た
に形成し、該免疫複合体を上記固相上に捕捉し、該免疫
複合体を保持した固相を反応混合物から分離する。この
工程を繰り返すことにより、測定対象物質を含む免疫複
合体を固相上に累増させる。
中の該特定物質に対して特異的に反応する第１の免疫物
質と共にインキュベートすることにより、第１免疫物質
−特定物質から成る免疫複合体を形成し、該免疫複合体
を、第１免疫物質に対して特異的に反応するリガンドを
結合した固相と共にインキュベートすることにより、該
免疫複合体を固相上に捕捉し、該免疫複合体を保持した
固相を反応混合物から分離する。新たに準備した該流体
試料を第１免疫物質と共にインキュベートすることによ
り、第１免疫物質−特定物質から成る免疫複合体を新た
に形成し、該免疫複合体を上記固相上に捕捉し、該免疫
複合体を保持した固相を反応混合物から分離する。この
工程を繰り返すことにより、測定対象物質を含む免疫複
合体を固相上に累増させる。
【００１０】第４の態様では、該流体試料を、流体試料
中の該特定物質に対して特異的に反応する第１の免疫物
質、および該特定物質に対して特異的に反応する検出可
能な標識物質で標識した第２の抗体と共にインキュベー
トすることにより、第１免疫物質−特定物質−標識第２
免疫物質から成る免疫複合体を形成し、該免疫複合体を
第１免疫物質に対して特異的に反応するリガンドを結合
した固相上に捕捉し、該免疫複合体を保持した固相を反
応混合物から分離する。新たに準備した該流体試料を、
第１免疫物質および標識第２免疫物質と共にインキュベ
ートすることにより、第１免疫物質−特定物質−標識第
２免疫物質から成る免疫複合体を新たに形成し、該免疫
複合体を前記固相上に捕捉し、該免疫複合体を保持した
固相を反応混合物から分離する。この工程を繰り返すこ
とにより、測定対象物質を含む免疫複合体を固相上に累
増させる。
中の該特定物質に対して特異的に反応する第１の免疫物
質、および該特定物質に対して特異的に反応する検出可
能な標識物質で標識した第２の抗体と共にインキュベー
トすることにより、第１免疫物質−特定物質−標識第２
免疫物質から成る免疫複合体を形成し、該免疫複合体を
第１免疫物質に対して特異的に反応するリガンドを結合
した固相上に捕捉し、該免疫複合体を保持した固相を反
応混合物から分離する。新たに準備した該流体試料を、
第１免疫物質および標識第２免疫物質と共にインキュベ
ートすることにより、第１免疫物質−特定物質−標識第
２免疫物質から成る免疫複合体を新たに形成し、該免疫
複合体を前記固相上に捕捉し、該免疫複合体を保持した
固相を反応混合物から分離する。この工程を繰り返すこ
とにより、測定対象物質を含む免疫複合体を固相上に累
増させる。
【００１１】第５の態様では、該流体試料を、流体試料
中の該特定物質に対して特異的に反応する第１の免疫物
質、および検出可能な標識物質で標識した該特定物質と
共にインキュベートすることにより、第１免疫物質−特
定物質（又は標識特定物質）から成る免疫複合体を形成
し、該免疫複合体を第１免疫物質に対して特異的反応す
るリガンドを結合した固相上に捕捉し、該免疫複合体を
保持した固相を反応混合物から分離する。新たに準備し
た該流体試料を、第１免疫物質および標識特定物質と共
にインキュベートすることにより、第１免疫物質−特定
物質（又は標識特定物質）から成る免疫複合体を新たに
形成し、該免疫複合体を前記固相上に捕捉し、該免疫複
合体を保持した固相を反応混合物から分離する。この工
程を繰り返すことにより、測定対象物質を含む免疫複合
体を固相上に累増させる。
中の該特定物質に対して特異的に反応する第１の免疫物
質、および検出可能な標識物質で標識した該特定物質と
共にインキュベートすることにより、第１免疫物質−特
定物質（又は標識特定物質）から成る免疫複合体を形成
し、該免疫複合体を第１免疫物質に対して特異的反応す
るリガンドを結合した固相上に捕捉し、該免疫複合体を
保持した固相を反応混合物から分離する。新たに準備し
た該流体試料を、第１免疫物質および標識特定物質と共
にインキュベートすることにより、第１免疫物質−特定
物質（又は標識特定物質）から成る免疫複合体を新たに
形成し、該免疫複合体を前記固相上に捕捉し、該免疫複
合体を保持した固相を反応混合物から分離する。この工
程を繰り返すことにより、測定対象物質を含む免疫複合
体を固相上に累増させる。
【００１２】かかる方法により、固相上に保持される免
疫複合体量すなわち測定対象物質の絶対量が累増するこ
とになり、検出感度が向上する。
疫複合体量すなわち測定対象物質の絶対量が累増するこ
とになり、検出感度が向上する。
【００１３】また本発明において、固相上に保持される
免疫複合体の生成とＢ／Ｆ分離の操作を繰り返す回数は
２〜５回が好適で有り、５回を超えると回数をかける割
りに感度は上昇しなくなる。
免疫複合体の生成とＢ／Ｆ分離の操作を繰り返す回数は
２〜５回が好適で有り、５回を超えると回数をかける割
りに感度は上昇しなくなる。
【００１４】さらに本発明においては、ヘテロジニアス
免疫測定方法の中でも、固相としてガラス繊維濾紙等の
繊維集合体を用いる方法において特に有用である。
免疫測定方法の中でも、固相としてガラス繊維濾紙等の
繊維集合体を用いる方法において特に有用である。
【００１５】一般的に繊維集合体は、通常の平面固相に
比べて表面積が大きくて免疫複合体をより多くトラップ
することができるため、ダイナミックレンジが格段に広
い。また、網目構造のために固相−液相間の拡散距離が
短くなり、反応速度も速い。
比べて表面積が大きくて免疫複合体をより多くトラップ
することができるため、ダイナミックレンジが格段に広
い。また、網目構造のために固相−液相間の拡散距離が
短くなり、反応速度も速い。
【００１６】固相の表面積が大きいので、本発明に従っ
て反応液等の添加を繰り返しても、ダイナミックレンジ
は確保できる。固相−液相間の拡散距離が短いために反
応速度も早いので、免疫複合体を繰り返し添加し固相化
される反応も、きわめて早く進む。
て反応液等の添加を繰り返しても、ダイナミックレンジ
は確保できる。固相−液相間の拡散距離が短いために反
応速度も早いので、免疫複合体を繰り返し添加し固相化
される反応も、きわめて早く進む。
【００１７】また、本発明の「繰り返し添加・除去す
る」動作を自動化すれば、より実用性が高くなる。
る」動作を自動化すれば、より実用性が高くなる。
【００１８】
【発明の効果】本発明によって、従来の測定方法では検
出しえなかった低い濃度域までが測定可能となった。臨
床検査において、この様な濃度域まで測定できる事は、
臨床的意義や新規な測定対象項目の発見につながる可能
性もあり、本発明の意義は大きい。以下に実施例を示す
が、これにより具体的な手法は限定されない。
出しえなかった低い濃度域までが測定可能となった。臨
床検査において、この様な濃度域まで測定できる事は、
臨床的意義や新規な測定対象項目の発見につながる可能
性もあり、本発明の意義は大きい。以下に実施例を示す
が、これにより具体的な手法は限定されない。
【００１９】
１． 標識抗体の調整
１）アクリジニウムエステル標識抗体
アクリジニウム−１（同仁科化学社製）を抗ＡＦＰモノ
ローナル抗体Ａ（メディックス社製）に標識し、ゲル濾
過により精製したもの。 ２）ビオチン標識抗体 ＮＨＳ−ＬＣ−ＢＩＯＴＩＮ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を抗
ＡＦＰモノローナル抗体Ｂ（京都第一科学社製）に標識
し、透析により精製したもの。
ローナル抗体Ａ（メディックス社製）に標識し、ゲル濾
過により精製したもの。 ２）ビオチン標識抗体 ＮＨＳ−ＬＣ−ＢＩＯＴＩＮ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を抗
ＡＦＰモノローナル抗体Ｂ（京都第一科学社製）に標識
し、透析により精製したもの。
【００２０】２． 固相（アビジン結合ガラス繊維濾
紙）の調整 ガラス繊維濾紙（東洋濾紙ＧＡ−１００φ９ｍｍ）を３
−アミノプロピルトリエトキシシラン（ナカライテスク
社製）で処理し、導入したアミノ基にＮＨＳ−ＬＣ−Ｂ
ＩＯＴＩＮ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を反応させ、次いで導
入したビオチンにアビジンを結合させ、カゼイン（ブロ
ックエース（商品名）雪印社製）でブロッキングしたも
の。
紙）の調整 ガラス繊維濾紙（東洋濾紙ＧＡ−１００φ９ｍｍ）を３
−アミノプロピルトリエトキシシラン（ナカライテスク
社製）で処理し、導入したアミノ基にＮＨＳ−ＬＣ−Ｂ
ＩＯＴＩＮ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を反応させ、次いで導
入したビオチンにアビジンを結合させ、カゼイン（ブロ
ックエース（商品名）雪印社製）でブロッキングしたも
の。
【００２１】３．測定
１）抗原抗体反応
・アクリジニウム標識抗体１０μｇ／ｍｌ， １０μｌ
・ビオチン標識抗体１０μｇ／ｍｌ， １０μｌ
・検体：ＡＦＰ ０ｎｇ／ｍｌ およびＡＦＰ １ｎｇ
／ｍｌ の血精をリン緩衝化食塩水にて１０倍希釈した
もの ８０μｌ。以上の３成分を混合し、室温で１０分
間インキュベートする。 ２）固相化反応 抗原抗体反応液を６５μｌ とり、固相に点着し、室
温、５分間インキュベートする。 ３）Ｂ／Ｆ分離 ブフナー漏斗上で固相にリン酸緩衝化食塩水を添加、吸
引することにより洗浄する。 ４）多段反応 １）〜３）の操作を所定の回数だけ繰り返す。 ５）発光の計測 抗原抗体複合体が捕捉された固相上の発光を自家製のフ
ォトンカウンティング法による発光測定器により計測す
る。
／ｍｌ の血精をリン緩衝化食塩水にて１０倍希釈した
もの ８０μｌ。以上の３成分を混合し、室温で１０分
間インキュベートする。 ２）固相化反応 抗原抗体反応液を６５μｌ とり、固相に点着し、室
温、５分間インキュベートする。 ３）Ｂ／Ｆ分離 ブフナー漏斗上で固相にリン酸緩衝化食塩水を添加、吸
引することにより洗浄する。 ４）多段反応 １）〜３）の操作を所定の回数だけ繰り返す。 ５）発光の計測 抗原抗体複合体が捕捉された固相上の発光を自家製のフ
ォトンカウンティング法による発光測定器により計測す
る。
【００２２】４． 結果
表１にＡＦＰ ０ｎｇ／ｍｌ の発光量、表２にＡＦＰ
１ｎｇ／ｍｌの発光量、表３にＳＮ比を示す。尚、Ｓ
Ｎ比は、次式により算出する。 ＳＮ比＝（ ＡＦＰ １ｎｇ／ｍｌの発光量−ＡＦＰ
０ｎｇ／ｍｌ の発光量）／ＡＦＰ ０ｎｇ／ｍｌ の
発光量 また、それぞれの発光量およびＳＮ比と多段反応回数と
の関係を表４に示す。
１ｎｇ／ｍｌの発光量、表３にＳＮ比を示す。尚、Ｓ
Ｎ比は、次式により算出する。 ＳＮ比＝（ ＡＦＰ １ｎｇ／ｍｌの発光量−ＡＦＰ
０ｎｇ／ｍｌ の発光量）／ＡＦＰ ０ｎｇ／ｍｌ の
発光量 また、それぞれの発光量およびＳＮ比と多段反応回数と
の関係を表４に示す。
【００２３】結果から判る様に、多段反応を繰り返すこ
とによって、シグナル成分は比例的に明らかに上昇し、
ＳＮは向上する。
とによって、シグナル成分は比例的に明らかに上昇し、
ＳＮは向上する。
【００２４】
【表１】 ＡＦＰ ０ｎｇ／ｍｌ
【００２５】
【表２】 ＡＦＰ １ｎｇ／ｍｌ
【００２６】
【表３】 ＳＮ比
【００２７】
【表４】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平４−235350（ＪＰ，Ａ)
特開 平４−203968（ＪＰ，Ａ)
特開 平７−333229（ＪＰ，Ａ)
特開 平１−317389（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/50 - 33/98
Claims (5)
- 【請求項１】 ヘテロジニアス免疫測定方法において、
同一固相に保持される測定対象物質含有免疫複合体の生
成とＢ／Ｆ分離の操作を複数回くり返して行い、該複合
体量を累増させることを特徴とする多段反応による高感
度化免疫測定方法 - 【請求項２】 繰り返し回数が２〜５回である請求項
１記載の高感度化免疫測定方法 - 【請求項３】 固相がガラス繊維集合体を担体とする
固相であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載
の高感度化免疫測定方法 - 【請求項４】 免疫複合体用標識物質として、アクリジ
ニウムエステルを用いる請求項３記載の高感度化免疫測
定方法 - 【請求項５】 免疫複合体を構成する抗体が、ビオチン
で標識されており、固相に結合するリガンドとしてアビ
ジンを用いる、請求項１から４のいずれかに記載の高感
度化免疫測定方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15034894A JP3375739B2 (ja) | 1994-06-07 | 1994-06-07 | 高感度化免疫測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15034894A JP3375739B2 (ja) | 1994-06-07 | 1994-06-07 | 高感度化免疫測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07333225A JPH07333225A (ja) | 1995-12-22 |
| JP3375739B2 true JP3375739B2 (ja) | 2003-02-10 |
Family
ID=15495033
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15034894A Expired - Fee Related JP3375739B2 (ja) | 1994-06-07 | 1994-06-07 | 高感度化免疫測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3375739B2 (ja) |
-
1994
- 1994-06-07 JP JP15034894A patent/JP3375739B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07333225A (ja) | 1995-12-22 |
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