JP2645211B2 - 多価リガンドを使用した高感度凝集アッセイ - Google Patents
多価リガンドを使用した高感度凝集アッセイInfo
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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Description
【０００１】
【技術分野】本発明は一般に検体中の被検体（analyt
e）を検出および／または定量するための凝集ベースの
（凝集に基づく）方法、そしてより詳細には、被検体、
担体に結合した特異結合性物質である担体試薬および凝
集剤の間の凝集反応が、該凝集剤上の同じ結合部位と特
異的に結合できる少くとも二つの結合部位を有する多価
リガンドの存在下に行われる高感度凝集アッセイに関す
る。
e）を検出および／または定量するための凝集ベースの
（凝集に基づく）方法、そしてより詳細には、被検体、
担体に結合した特異結合性物質である担体試薬および凝
集剤の間の凝集反応が、該凝集剤上の同じ結合部位と特
異的に結合できる少くとも二つの結合部位を有する多価
リガンドの存在下に行われる高感度凝集アッセイに関す
る。
【０００２】
【背景技術】凝集ベースの方法は、広範にわたる様々な
細菌、細胞表面抗原および血清タンパク質その他いくつ
かの興味深い被検体についての定性および定量アッセイ
に用いられている。周知の凝集反応の一例は様々な方法
で検出および／または測定できる凝集物を生成するため
の二価抗体の多価抗原との反応である。多エピトープ受
容体を有する化合物は、抗原または抗体で被覆された粒
子を凝集させて集塊を生成することができる。これら集
塊は次いで光散乱測定を用いて検出することができる。
細菌、細胞表面抗原および血清タンパク質その他いくつ
かの興味深い被検体についての定性および定量アッセイ
に用いられている。周知の凝集反応の一例は様々な方法
で検出および／または測定できる凝集物を生成するため
の二価抗体の多価抗原との反応である。多エピトープ受
容体を有する化合物は、抗原または抗体で被覆された粒
子を凝集させて集塊を生成することができる。これら集
塊は次いで光散乱測定を用いて検出することができる。
【０００３】二価抗体と抗原の間の凝集反応で大きな架
橋凝集物を生成させるには、それら抗原は少くとも二以
上の特異結合部位を有するべきである。一価ハプテンの
検出を望む場合はに、その反応スキームを、まず多価型
のハプテン例えばハプテン−タンパク質接合体を調製す
ることにより改変することができる。検体中に存在する
ハプテンは抗体の有効特異結合部位を求めてその多価型
と拮抗しなければならない。多価型のハプテンの既知の
調製方法は免疫原の調製の際にハプテンを担体に結合す
るのに用いられる方法を包含する。
橋凝集物を生成させるには、それら抗原は少くとも二以
上の特異結合部位を有するべきである。一価ハプテンの
検出を望む場合はに、その反応スキームを、まず多価型
のハプテン例えばハプテン−タンパク質接合体を調製す
ることにより改変することができる。検体中に存在する
ハプテンは抗体の有効特異結合部位を求めてその多価型
と拮抗しなければならない。多価型のハプテンの既知の
調製方法は免疫原の調製の際にハプテンを担体に結合す
るのに用いられる方法を包含する。
【０００４】凝集またはその阻害の視覚または機器によ
る検出および／または測定の感度を高めるために、可溶
性タンパク質またはタンパク質接合体を担体として用い
るよりはむしろ粒子を被検体の担体として用いることは
知られている。例えば粒子試薬として用いるべく粒子を
抗体に結合させるために用いられる典型的方法は適当な
吸着剤の表面への抗体吸着である。ポリスチレンベース
のラテックス粒子がこの目的に広く用いられている。
る検出および／または測定の感度を高めるために、可溶
性タンパク質またはタンパク質接合体を担体として用い
るよりはむしろ粒子を被検体の担体として用いることは
知られている。例えば粒子試薬として用いるべく粒子を
抗体に結合させるために用いられる典型的方法は適当な
吸着剤の表面への抗体吸着である。ポリスチレンベース
のラテックス粒子がこの目的に広く用いられている。
【０００５】他の選択肢として、粒子試薬は粒子表面に
被検体を共有結合的に結合させることにより調製するこ
とができる。ポリスチレン重合体が共有結合的タンパク
質結合を可能とする官能基を含むように変性されてい
る。１９７７年１２月２０日に交付された米国特許第
４,０６４,０８０号は末端アミノフェニル基を介してス
チレン重合体に共有結合したタンパク質を開示してい
る。１９８０年１月１日に交付された米国特許第４,１
８１,６３６号は、免疫活性物質に水溶性活性化剤を介
してカップリングされたカルボキシル化ラテックス重合
体およびそれらの凝集試験における診断試薬としての使
用を開示している。１９８０年７月１日に交付された米
国特許第４,２１０,７２３号は粒子表面にエポキシ基を
有する直径０.１５〜１.５μｍのシェル−コアラテック
ス重合体粒子およびこれらエポキシ基を介したタンパク
質のカップリングを記載している。１９８３年８月３０
日に交付された米国特許第４,４０１,７６５号および１
９８４年１０月３０日に交付された米国特許第４,４８
０,０４１号は共有結合的に結合された高屈折率粒子試
薬およびそれらの光散乱イムノアッセイへの使用を開示
している。１９８７年１０月２７日に交付された米国特
許第４,７０３,０１８号は、高屈折率ハロアルキル−官
能性シェル−コア重合体、および該シェル−コア重合体
が生物学的に興味ある化合物に共有結合的に結合された
イムノアッセイへのそれらの使用を開示している。
被検体を共有結合的に結合させることにより調製するこ
とができる。ポリスチレン重合体が共有結合的タンパク
質結合を可能とする官能基を含むように変性されてい
る。１９７７年１２月２０日に交付された米国特許第
４,０６４,０８０号は末端アミノフェニル基を介してス
チレン重合体に共有結合したタンパク質を開示してい
る。１９８０年１月１日に交付された米国特許第４,１
８１,６３６号は、免疫活性物質に水溶性活性化剤を介
してカップリングされたカルボキシル化ラテックス重合
体およびそれらの凝集試験における診断試薬としての使
用を開示している。１９８０年７月１日に交付された米
国特許第４,２１０,７２３号は粒子表面にエポキシ基を
有する直径０.１５〜１.５μｍのシェル−コアラテック
ス重合体粒子およびこれらエポキシ基を介したタンパク
質のカップリングを記載している。１９８３年８月３０
日に交付された米国特許第４,４０１,７６５号および１
９８４年１０月３０日に交付された米国特許第４,４８
０,０４１号は共有結合的に結合された高屈折率粒子試
薬およびそれらの光散乱イムノアッセイへの使用を開示
している。１９８７年１０月２７日に交付された米国特
許第４,７０３,０１８号は、高屈折率ハロアルキル−官
能性シェル−コア重合体、および該シェル−コア重合体
が生物学的に興味ある化合物に共有結合的に結合された
イムノアッセイへのそれらの使用を開示している。
【０００６】凝集アッセイは、典型的には、液体検体中
の存在が疑われている抗原およびハプテンを検出するた
めに阻害形式で行われる。通常、特異結合性抗原または
ハプテンで被覆された高屈折性粒子への多価抗体の結合
が試験検体中の抗原またはハプテンにより拮抗的に阻害
される（例えば、１９８３年８月３０日に交付された米
国特許第４,４０１,７６５号参照）。しかしながらこれ
らのアッセイは一般に感度が１０-7〜１０-10モル濃度
範囲の抗原およびハプテンに限られている。したがっ
て、粒子担体および結合タンパク質より成る粒子試薬は
凝集ベースのアッセイ手段を提供するが、ラテックス粒
子担体ベースのアッセイなどのアッセイはナノモル濃度
より低濃度で存在する被検体に必要な感度をしばしば与
えない。凝集ベースのイムノアッセイにおける継続的問
題は、１０-10モル濃度より低濃度では被検体を検出で
きないことである。
の存在が疑われている抗原およびハプテンを検出するた
めに阻害形式で行われる。通常、特異結合性抗原または
ハプテンで被覆された高屈折性粒子への多価抗体の結合
が試験検体中の抗原またはハプテンにより拮抗的に阻害
される（例えば、１９８３年８月３０日に交付された米
国特許第４,４０１,７６５号参照）。しかしながらこれ
らのアッセイは一般に感度が１０-7〜１０-10モル濃度
範囲の抗原およびハプテンに限られている。したがっ
て、粒子担体および結合タンパク質より成る粒子試薬は
凝集ベースのアッセイ手段を提供するが、ラテックス粒
子担体ベースのアッセイなどのアッセイはナノモル濃度
より低濃度で存在する被検体に必要な感度をしばしば与
えない。凝集ベースのイムノアッセイにおける継続的問
題は、１０-10モル濃度より低濃度では被検体を検出で
きないことである。
【０００７】１９９０年１月１１日に公開されたオース
トラリア特許出願第３７８５２／８９号は、特異結合性
物質（ＳＢＳ）を少くとも三つの受容体、すなわち相互
に結合しあえるＲ１およびＲ２、およびＳＢＳを特異的
に結合するＲ３、と共にインキュベートし、そして得ら
れる凝集を測定することを含むＳＢＳの検出方法を開示
している。Ｒ１は特異結合対（Ｐ）の一成分と、ＳＢＳ
またはそのアナローグでありそして少くとも一つのエピ
トープを共通に持つ物質との接合体であり；Ｒ２はＰに
対する少くとも二つの結合部位を有し、そしてＲ３は少
くともそのうちの一つがＳＢＳのエピトープに特異的に
結合する少くとも二つの結合部位を有する。オーストラ
リア特許出願第３７８５２／８９号は、凝集剤上の同じ
結合部位と特異結合できる少くとも二つの結合部位を有
する多価リガンドの使用は開示していない。
トラリア特許出願第３７８５２／８９号は、特異結合性
物質（ＳＢＳ）を少くとも三つの受容体、すなわち相互
に結合しあえるＲ１およびＲ２、およびＳＢＳを特異的
に結合するＲ３、と共にインキュベートし、そして得ら
れる凝集を測定することを含むＳＢＳの検出方法を開示
している。Ｒ１は特異結合対（Ｐ）の一成分と、ＳＢＳ
またはそのアナローグでありそして少くとも一つのエピ
トープを共通に持つ物質との接合体であり；Ｒ２はＰに
対する少くとも二つの結合部位を有し、そしてＲ３は少
くともそのうちの一つがＳＢＳのエピトープに特異的に
結合する少くとも二つの結合部位を有する。オーストラ
リア特許出願第３７８５２／８９号は、凝集剤上の同じ
結合部位と特異結合できる少くとも二つの結合部位を有
する多価リガンドの使用は開示していない。
【０００８】本発明は、 （Ａ）（ａ）被検体を含有すると思われる検体、 （ｂ）非粒状凝集剤と結合する特異結合性物質が結合し
た担体からなる担体試薬、 （ｃ）担体試薬に結合した特異結合性物質、被検体およ
び可溶性多価リガンドと特異的に結合する少なくとも２
つの共通結合部位を有する非粒状凝集剤、 （ｄ）前記非粒状凝集剤の共通結合部位と特異的に結合
する少なくとも２つの結合部位を有し、多価リガンドを
少なくとも２つの非粒状凝集剤と結合させることを可能
とするのに十分な長さの連結基によって結合部位が連結
されている可溶性リガンドであって、（１）担体試薬の
特異結合性物質に特異結合せず、そして（２）凝集反応
を妨害する濃度以下の濃度で存在する可溶性リガンド、 ただし、該凝集反応において被検体は、非粒状凝集剤の
共通特異結合部位に対して担体試薬と競合し、これによ
り凝集の程度を低下させるものである、 をインキュベートし； （Ｂ）生じる凝集を検出または測定し；そして （Ｃ）検体中の被検体の存在から得られる凝集阻害の程
度を被検体の存在および（または）量と関連させること
よりなる検体中の被検体の競合凝集検出および（また
は）定量方法に関する。
た担体からなる担体試薬、 （ｃ）担体試薬に結合した特異結合性物質、被検体およ
び可溶性多価リガンドと特異的に結合する少なくとも２
つの共通結合部位を有する非粒状凝集剤、 （ｄ）前記非粒状凝集剤の共通結合部位と特異的に結合
する少なくとも２つの結合部位を有し、多価リガンドを
少なくとも２つの非粒状凝集剤と結合させることを可能
とするのに十分な長さの連結基によって結合部位が連結
されている可溶性リガンドであって、（１）担体試薬の
特異結合性物質に特異結合せず、そして（２）凝集反応
を妨害する濃度以下の濃度で存在する可溶性リガンド、 ただし、該凝集反応において被検体は、非粒状凝集剤の
共通特異結合部位に対して担体試薬と競合し、これによ
り凝集の程度を低下させるものである、 をインキュベートし； （Ｂ）生じる凝集を検出または測定し；そして （Ｃ）検体中の被検体の存在から得られる凝集阻害の程
度を被検体の存在および（または）量と関連させること
よりなる検体中の被検体の競合凝集検出および（また
は）定量方法に関する。
【０００９】
【発明の開示】本発明は、被検体を含有すると思われる
検体、担体に結合された特異結合性物質である担体試
薬、担体試薬、被検体および多価リガンドと特異結合で
きる共通結合部位である少くとも二つの結合位置を有す
る凝集剤、前記凝集剤上の共通結合物質と特異結合でき
る少くとも二つの結合部位を有する多価リガンドをイン
キュベートし、そして生じる凝集増加を測定することに
より被検体の有無および／または量を検出することより
成る検体中の被検体の検出および／または定量方法に関
する。本発明は、被検体、担体試薬および多価リガンド
を特異結合できる共通結合部位である凝集剤の少くとも
二つの結合部位と特異結合できる二以上の部位を有する
多価リガンドの存在が、凝集速度の顕著な増加およびア
ッセイ感度の増加をもたらすという予想外かつ驚くべき
知見に基づくものである。
検体、担体に結合された特異結合性物質である担体試
薬、担体試薬、被検体および多価リガンドと特異結合で
きる共通結合部位である少くとも二つの結合位置を有す
る凝集剤、前記凝集剤上の共通結合物質と特異結合でき
る少くとも二つの結合部位を有する多価リガンドをイン
キュベートし、そして生じる凝集増加を測定することに
より被検体の有無および／または量を検出することより
成る検体中の被検体の検出および／または定量方法に関
する。本発明は、被検体、担体試薬および多価リガンド
を特異結合できる共通結合部位である凝集剤の少くとも
二つの結合部位と特異結合できる二以上の部位を有する
多価リガンドの存在が、凝集速度の顕著な増加およびア
ッセイ感度の増加をもたらすという予想外かつ驚くべき
知見に基づくものである。
【００１０】本発明において用いられる「被検体」とい
う用語は本発明により検出および／または定量すべき少
くとも一つの特異結合部位を有する任意の物質を意味す
る。本発明の方法を用いて測定できる被検体例は、血清
および血漿、唾液、尿または乳タンパク質中に存在する
生物学的に興味ある化合物、および各種ハプテン、薬
物、ビタミン、ホルモン、酵素、酵素基質、抗原、およ
びその他のタンパク質、ポリクローナルおよびモノクロ
ーナル抗体、抗体のアナローグ、抗体の免疫学的断片、
例えばＦ(ａｂ)2およびＦ(ａｂ′)2断片、多糖類、細
菌、原生動物、真菌、ウイルス、抗原、核酸、血中細胞
または血中液体物質、および生物細胞を包含するがそれ
らに限定されるものではない。好ましい被検体には、薬
物および病態評価に定量的測定が必要とされる物質が包
含される。被検体は一価または多価であってよく、さら
に例えばハプテン−タンパク質接合体の場合のようにリ
ンカーにより多価化された一価物質であってよい。「一
価」とは単一の特異結合部位を有する物質を意味する。
う用語は本発明により検出および／または定量すべき少
くとも一つの特異結合部位を有する任意の物質を意味す
る。本発明の方法を用いて測定できる被検体例は、血清
および血漿、唾液、尿または乳タンパク質中に存在する
生物学的に興味ある化合物、および各種ハプテン、薬
物、ビタミン、ホルモン、酵素、酵素基質、抗原、およ
びその他のタンパク質、ポリクローナルおよびモノクロ
ーナル抗体、抗体のアナローグ、抗体の免疫学的断片、
例えばＦ(ａｂ)2およびＦ(ａｂ′)2断片、多糖類、細
菌、原生動物、真菌、ウイルス、抗原、核酸、血中細胞
または血中液体物質、および生物細胞を包含するがそれ
らに限定されるものではない。好ましい被検体には、薬
物および病態評価に定量的測定が必要とされる物質が包
含される。被検体は一価または多価であってよく、さら
に例えばハプテン−タンパク質接合体の場合のようにリ
ンカーにより多価化された一価物質であってよい。「一
価」とは単一の特異結合部位を有する物質を意味する。
【００１１】本発明に用いられる「多価リガンド」とい
う用語は、凝集剤の共通結合部位を特異結合できる少く
とも二つの結合部位を有する、担体試薬以外の任意の物
質を意味し、そして前記凝集剤は被検体、担体試薬およ
び多価リガンドを特異結合できる少くとも二つの共通結
合部位を有している。すなわち、多価リガンド、被検体
および担体試薬は各々、凝集剤上の共通結合部位と特異
結合できる。多価リガンドの例には被検体の構造的アナ
ローグ、および被検体の誘導体が包含される。これらア
ナローグおよび誘導体は凝集剤上の共通結合部位に特異
結合できる少くとも二個の（二量体）またはそれより多
くの結合部位を有するものとして特徴付けることがで
き、その場合に被検体も凝集剤上の同じ共通結合部位と
特異結合することができる。かかる誘導体の例には二以
上の抗原決定基を有する抗原の誘導体および被検体の抗
体の抗イディオタイプ抗体が包含される。被検体の構造
的アナローグの一例は、ジゴキシンの構造アナローグで
あるウアバインであろう。
う用語は、凝集剤の共通結合部位を特異結合できる少く
とも二つの結合部位を有する、担体試薬以外の任意の物
質を意味し、そして前記凝集剤は被検体、担体試薬およ
び多価リガンドを特異結合できる少くとも二つの共通結
合部位を有している。すなわち、多価リガンド、被検体
および担体試薬は各々、凝集剤上の共通結合部位と特異
結合できる。多価リガンドの例には被検体の構造的アナ
ローグ、および被検体の誘導体が包含される。これらア
ナローグおよび誘導体は凝集剤上の共通結合部位に特異
結合できる少くとも二個の（二量体）またはそれより多
くの結合部位を有するものとして特徴付けることがで
き、その場合に被検体も凝集剤上の同じ共通結合部位と
特異結合することができる。かかる誘導体の例には二以
上の抗原決定基を有する抗原の誘導体および被検体の抗
体の抗イディオタイプ抗体が包含される。被検体の構造
的アナローグの一例は、ジゴキシンの構造アナローグで
あるウアバインであろう。
【００１２】多価リガンドは二以上の特異結合部位を同
じ分子に取り込むことができる任意の方法を用いて調整
することができる。二量体またはその他の多価リガンド
を作出するためにリンカーを利用して特異結合部位を連
結してもよい。多価リガンド調製のための既知の方法の
例には、リンカーとして働くリガンドの活性化カルボキ
シル誘導体を特異結合部位を有する物質上のポリアミン
基とカップリングさせる方法が包含される。同様に一つ
または二以上のアミノ基がリンカーとして働くリガンド
上に当初存在するカップリング方法も用いることができ
る。すなわち特異結合性物資をカップリングするための
任意の方法を多価リガンドの製造に用いることができ
る。一つの好ましい多価リンカーは、少くとも二つの結
合部位が、その多価リガンドの少くとも２単位の凝集剤
との結合を可能にするのに十分な長さのリンカー基によ
り連結された水溶性分子である。二つの結合部位を有す
る二量体多価リガンドが好ましい。
じ分子に取り込むことができる任意の方法を用いて調整
することができる。二量体またはその他の多価リガンド
を作出するためにリンカーを利用して特異結合部位を連
結してもよい。多価リガンド調製のための既知の方法の
例には、リンカーとして働くリガンドの活性化カルボキ
シル誘導体を特異結合部位を有する物質上のポリアミン
基とカップリングさせる方法が包含される。同様に一つ
または二以上のアミノ基がリンカーとして働くリガンド
上に当初存在するカップリング方法も用いることができ
る。すなわち特異結合性物資をカップリングするための
任意の方法を多価リガンドの製造に用いることができ
る。一つの好ましい多価リンカーは、少くとも二つの結
合部位が、その多価リガンドの少くとも２単位の凝集剤
との結合を可能にするのに十分な長さのリンカー基によ
り連結された水溶性分子である。二つの結合部位を有す
る二量体多価リガンドが好ましい。
【００１３】本発明に用いられる「凝集剤」という用語
は、共通結合部位である少くとも二つの結合部位を有す
る任意の多価物資である。共通結合部位とは、被検体、
担体試薬および多価リガンドと特異結合できる凝集剤上
の結合部位である。多価物資とは特異結合のための少く
とも二つの結合部位を有するものである。凝集剤の例に
は、抗原、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、
抗体のアナローグ、抗体の免疫学的断片、例えばＦ(ａ
ｂ)2およびＦ(ａｂ′)2断片、粒子などの担体に結合さ
れたまたは接合体の形で他の物資に結合された抗体また
はそれらの免疫学的断片、その他の特異結合性タンパク
質例えばチロキシン結合性タンパク質、および核酸が包
含される。一例として、凝集剤は粒子ベースの凝集剤、
例えば被検体の抗体またはその免疫学的断片が粒子に共
有結合的にまたは非共有結合的に結合した凝集剤を包含
することができる。このような粒子ベースの凝集剤は、
特異結合性物資が粒子に共有結合的に結合されて粒子ベ
ースの担体試薬を形成しているものを含め様々な凝集ア
ッセイ形態に用いることができる。好ましい凝集剤は二
価抗体または多価抗原である。粒子ベースの凝集剤とし
て用いるのに好ましい粒子は、０.１５μｍ以下の直径
のものである。しかしながらそれより大きい粒子を用い
ることもできる。
は、共通結合部位である少くとも二つの結合部位を有す
る任意の多価物資である。共通結合部位とは、被検体、
担体試薬および多価リガンドと特異結合できる凝集剤上
の結合部位である。多価物資とは特異結合のための少く
とも二つの結合部位を有するものである。凝集剤の例に
は、抗原、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、
抗体のアナローグ、抗体の免疫学的断片、例えばＦ(ａ
ｂ)2およびＦ(ａｂ′)2断片、粒子などの担体に結合さ
れたまたは接合体の形で他の物資に結合された抗体また
はそれらの免疫学的断片、その他の特異結合性タンパク
質例えばチロキシン結合性タンパク質、および核酸が包
含される。一例として、凝集剤は粒子ベースの凝集剤、
例えば被検体の抗体またはその免疫学的断片が粒子に共
有結合的にまたは非共有結合的に結合した凝集剤を包含
することができる。このような粒子ベースの凝集剤は、
特異結合性物資が粒子に共有結合的に結合されて粒子ベ
ースの担体試薬を形成しているものを含め様々な凝集ア
ッセイ形態に用いることができる。好ましい凝集剤は二
価抗体または多価抗原である。粒子ベースの凝集剤とし
て用いるのに好ましい粒子は、０.１５μｍ以下の直径
のものである。しかしながらそれより大きい粒子を用い
ることもできる。
【００１４】本発明に用いられる「特異結合性物資」と
いう用語は、凝集剤上の共通結合部位（ここで凝集剤の
共通結合部位は被検体、担体試薬および多価リガンドを
特異結合できる）と特異結合できる任意の物資を意味す
る。すなわち、特異結合性物資、被検体および多価リガ
ンドはそれぞれ凝集剤上の共通結合部位を特異的に結合
することができる。特異結合物資の例には、被検体また
はその特異結合性部分、被検体のアナローグ、および被
検体の誘導体が包含される。特異結合性物資として働き
得る被検体の特異結合性部分は、被検体が凝集剤上の共
通結合部位を特異結合できるのと同様に凝集剤上の共通
結合部位と特異結合できる任意の被検体部分を包含し、
そして例えば、抗体および他のタンパク質の特異結合部
位、抗体の免疫学的断片例えばＦ(ａｂ)2およびＦ(ａ
ｂ′)2断片、および抗原の抗原決定基を包含する。被検
体の誘導体は、例えば、一価型の被検体が例えばハプテ
ン−タンパク質接合体などの場合のようにリンカーによ
って多価されたものを包含することができる。特異結合
性物資のその他の例としては抗原、抗体、免疫学的断
片、酵素、酵素基質、生物細胞、および核酸などが挙げ
られる。特異結合性物資の重要な特徴は、それが凝集剤
上の共通結合部位を特異結合できる物資であるというこ
とである。好ましい特異結合性物資は測定対象たる被検
体である。
いう用語は、凝集剤上の共通結合部位（ここで凝集剤の
共通結合部位は被検体、担体試薬および多価リガンドを
特異結合できる）と特異結合できる任意の物資を意味す
る。すなわち、特異結合性物資、被検体および多価リガ
ンドはそれぞれ凝集剤上の共通結合部位を特異的に結合
することができる。特異結合物資の例には、被検体また
はその特異結合性部分、被検体のアナローグ、および被
検体の誘導体が包含される。特異結合性物資として働き
得る被検体の特異結合性部分は、被検体が凝集剤上の共
通結合部位を特異結合できるのと同様に凝集剤上の共通
結合部位と特異結合できる任意の被検体部分を包含し、
そして例えば、抗体および他のタンパク質の特異結合部
位、抗体の免疫学的断片例えばＦ(ａｂ)2およびＦ(ａ
ｂ′)2断片、および抗原の抗原決定基を包含する。被検
体の誘導体は、例えば、一価型の被検体が例えばハプテ
ン−タンパク質接合体などの場合のようにリンカーによ
って多価されたものを包含することができる。特異結合
性物資のその他の例としては抗原、抗体、免疫学的断
片、酵素、酵素基質、生物細胞、および核酸などが挙げ
られる。特異結合性物資の重要な特徴は、それが凝集剤
上の共通結合部位を特異結合できる物資であるというこ
とである。好ましい特異結合性物資は測定対象たる被検
体である。
【００１５】特異結合性物資は、共通結合的にまたは非
共有結合的に、リンカーを用いまたは用いないで担体に
結合させて担体試薬を形成することができる。担体試薬
の調製にあたっては、特異結合性物資は、結合後に特異
結合性物資、従って担体試薬が凝集剤を特異結合する能
力を保有するように担体に結合されなくてはならない。
本発明に用いられる「担体」という用語は特異結合性物
資が結合できる任意の物資を意味する。すなわち担体は
特異結合対の第二メンバーとの結合に対し多重の特異結
合部位（多価）のための手段を提供することにより凝集
反応を容易にする。担体例は、可溶性物質例えばタンパ
ク質、多糖類、合成水溶性重合体、合成水溶性タンパク
質を包含するほか、不溶性物質例えばラテックス粒子、
無機粒子例えば金ゾル、顔料粒子、および生物細胞例え
ばタンニン酸処理赤血球などを包含することもできる。
共有結合的に、リンカーを用いまたは用いないで担体に
結合させて担体試薬を形成することができる。担体試薬
の調製にあたっては、特異結合性物資は、結合後に特異
結合性物資、従って担体試薬が凝集剤を特異結合する能
力を保有するように担体に結合されなくてはならない。
本発明に用いられる「担体」という用語は特異結合性物
資が結合できる任意の物資を意味する。すなわち担体は
特異結合対の第二メンバーとの結合に対し多重の特異結
合部位（多価）のための手段を提供することにより凝集
反応を容易にする。担体例は、可溶性物質例えばタンパ
ク質、多糖類、合成水溶性重合体、合成水溶性タンパク
質を包含するほか、不溶性物質例えばラテックス粒子、
無機粒子例えば金ゾル、顔料粒子、および生物細胞例え
ばタンニン酸処理赤血球などを包含することもできる。
【００１６】特異結合性物質は非共有結合的手段によ
り、例えば粒子の被覆または吸着により、あるいは共有
結合的手段を介して粒子に結合させることができる。共
有結合的結合が好ましい。粒子の表面はいくつかの化学
的方法選択肢のいずれかによって共有結合的結合ができ
る表面を作出するために、いくつかの既知の方法のいず
れかによって変性することができる。例えばエポキシ基
を加水分解して臭化シアンと反応できるジオール化合物
を形成することができ、そしてその場合臭化シアンはタ
ンパク質のアミン基に対するカップリング剤として働く
ことができる。さらに、アルデヒドはアミンと直接反応
して後で還元を受けて共有結合的結合を形成し得るシッ
フ塩基を形成することができる。あるいはまた、アルデ
ヒドを酸に酸化し、そしてその後のアミンとの反応にカ
ルボジイミドを用いてアミド結合を形成することができ
る。
り、例えば粒子の被覆または吸着により、あるいは共有
結合的手段を介して粒子に結合させることができる。共
有結合的結合が好ましい。粒子の表面はいくつかの化学
的方法選択肢のいずれかによって共有結合的結合ができ
る表面を作出するために、いくつかの既知の方法のいず
れかによって変性することができる。例えばエポキシ基
を加水分解して臭化シアンと反応できるジオール化合物
を形成することができ、そしてその場合臭化シアンはタ
ンパク質のアミン基に対するカップリング剤として働く
ことができる。さらに、アルデヒドはアミンと直接反応
して後で還元を受けて共有結合的結合を形成し得るシッ
フ塩基を形成することができる。あるいはまた、アルデ
ヒドを酸に酸化し、そしてその後のアミンとの反応にカ
ルボジイミドを用いてアミド結合を形成することができ
る。
【００１７】特異結合性物質は、リンカーを介して粒子
に共有結合的に結合することができる。例えばハプテン
をタンパク質に結合することができ、次いで生成接合体
を粒子に結合することができる。あるいはまた、タンパ
ク質をまず粒子に結合し次いでハプテンをそのタンパク
質に結合させることができる。例えばハプテンまたはタ
ンパク質性物質を重合体粒子表面に吸着させた後、官能
基例えばエポキシド基を適当なpH条件の下でハプテンま
たはタンパク質性物質の相補的(complementary）官能基
と反応させることができる。
に共有結合的に結合することができる。例えばハプテン
をタンパク質に結合することができ、次いで生成接合体
を粒子に結合することができる。あるいはまた、タンパ
ク質をまず粒子に結合し次いでハプテンをそのタンパク
質に結合させることができる。例えばハプテンまたはタ
ンパク質性物質を重合体粒子表面に吸着させた後、官能
基例えばエポキシド基を適当なpH条件の下でハプテンま
たはタンパク質性物質の相補的(complementary）官能基
と反応させることができる。
【００１８】好ましい担体はリンカーが共有結合的に結
合できる光散乱性粒子である。担体として用いるのに好
ましい粒子は０.１５μｍ以下の直径を有するものであ
る。しかしながら０.８μｍ以上の粒子を用いることも
できる。好ましくはそれら粒子は水とは著しく異なる屈
折率を有する。本発明の実施に使用できる粒子の例は、
ラテックス粒子、金ゾル粒子、その他の無機粒子、およ
び生物細胞を包含する。本発明において担体として用い
るのに好ましい粒子は、コアの高屈折率が光散乱測定に
対する高感度を生じそしてシェルがリガンドが共有結合
的に結合できる官能基を含んでいる高屈折率コア−シェ
ル重合体である。
合できる光散乱性粒子である。担体として用いるのに好
ましい粒子は０.１５μｍ以下の直径を有するものであ
る。しかしながら０.８μｍ以上の粒子を用いることも
できる。好ましくはそれら粒子は水とは著しく異なる屈
折率を有する。本発明の実施に使用できる粒子の例は、
ラテックス粒子、金ゾル粒子、その他の無機粒子、およ
び生物細胞を包含する。本発明において担体として用い
るのに好ましい粒子は、コアの高屈折率が光散乱測定に
対する高感度を生じそしてシェルがリガンドが共有結合
的に結合できる官能基を含んでいる高屈折率コア−シェ
ル重合体である。
【００１９】本発明の好ましい粒子試薬およびそれらへ
のタンパク質の共有結合的結合は１９８３年８月３０日
に交付された米国特許第４,４０１,７６５号および１９
８７年１０月２７日に交付された米国特許第４,７０３,
０１８号に開示されているところ、それらの開示を引用
により本発明の開示に含める。本発明に用いる「高屈折
率シェル−コア重合体粒子」という用語は、米国特許第
４,４０１,７６５号および米国特許第４,７０３,０１８
号に開示されそして後述される粒子を意味する。１９８
３年８月３０日に交付された米国特許第４,４０１,７６
５号は、高屈折率重合体コアと、タンパク質を共有結合
的にカップリングさせるための反応性エポキシ、カルボ
キシル、アミノ、ヒドロキシルまたはホルミル基を含む
重合体シェルとを有するシェルコアラテックス粒子より
成る高屈折率シェルコア重合体を開示している。０.１
５μｍ以下の直径を有しそして高屈折率重合体コアと反
応性エポキシ基を含有する重合体シェルとを有するシェ
ルコアラテックス粒子より成る高屈折率シェルコア重合
体が好ましい。これらのラテックスは光散乱効率を最大
にする高屈折率コアを提供すると共にハプテンおよびタ
ンパク質を反応性シェル上に固定するための選択された
官能基も提供する。１９８７年１０月２７日に交付され
た米国特許第４,７０３,０１８号は、コアシェル粒子表
面に反応性ハライド基を提供する点で米国特許第４,４
０１,７６５号に開示された粒子より改良されている粒
子を開示している。
のタンパク質の共有結合的結合は１９８３年８月３０日
に交付された米国特許第４,４０１,７６５号および１９
８７年１０月２７日に交付された米国特許第４,７０３,
０１８号に開示されているところ、それらの開示を引用
により本発明の開示に含める。本発明に用いる「高屈折
率シェル−コア重合体粒子」という用語は、米国特許第
４,４０１,７６５号および米国特許第４,７０３,０１８
号に開示されそして後述される粒子を意味する。１９８
３年８月３０日に交付された米国特許第４,４０１,７６
５号は、高屈折率重合体コアと、タンパク質を共有結合
的にカップリングさせるための反応性エポキシ、カルボ
キシル、アミノ、ヒドロキシルまたはホルミル基を含む
重合体シェルとを有するシェルコアラテックス粒子より
成る高屈折率シェルコア重合体を開示している。０.１
５μｍ以下の直径を有しそして高屈折率重合体コアと反
応性エポキシ基を含有する重合体シェルとを有するシェ
ルコアラテックス粒子より成る高屈折率シェルコア重合
体が好ましい。これらのラテックスは光散乱効率を最大
にする高屈折率コアを提供すると共にハプテンおよびタ
ンパク質を反応性シェル上に固定するための選択された
官能基も提供する。１９８７年１０月２７日に交付され
た米国特許第４,７０３,０１８号は、コアシェル粒子表
面に反応性ハライド基を提供する点で米国特許第４,４
０１,７６５号に開示された粒子より改良されている粒
子を開示している。
【００２０】本発明の凝集ベースの反応における担体と
して用いられる粒子に望まれる性質は使用される光散乱
検出手段のタイプに依存する。粒子懸濁液の光散乱特性
は、粒度、コアおよび懸濁液媒質の屈折率、および測定
に用いられる光の波長を含むいくつかの変数に依存す
る。すなわち、粒子コア物質、粒度、コア物質と懸濁液
媒質の屈折率および測定に用いられる光の波長はすべて
アッセイ感度を至適化する上で重要である。これらの因
子は使用される光散乱検出手段のタイプにより決定する
ことができる。１９８７年１０月２７日に付与する米国
特許第４,７０３,０１８号は、様々な光散乱測定、およ
び使用される光散乱測定のタイプに応じて粒子の光散乱
特性を至適化する上で有用ないくつかの因子を開示し、
そしてさらに、本発明の好ましい粒子試薬を開示してい
る。視覚による検出のほか、本発明に使用できる凝集反
応の様々な既知タイプの散乱測定には、濁度測定（turb
idimetric）、比濁（nephelometric）、粒子計数、準弾
性光散乱、自己相関分光法および粒子のジスシンメトリ
ー（dissymmetry）またはポラリゼーションの測定が包
含される。
して用いられる粒子に望まれる性質は使用される光散乱
検出手段のタイプに依存する。粒子懸濁液の光散乱特性
は、粒度、コアおよび懸濁液媒質の屈折率、および測定
に用いられる光の波長を含むいくつかの変数に依存す
る。すなわち、粒子コア物質、粒度、コア物質と懸濁液
媒質の屈折率および測定に用いられる光の波長はすべて
アッセイ感度を至適化する上で重要である。これらの因
子は使用される光散乱検出手段のタイプにより決定する
ことができる。１９８７年１０月２７日に付与する米国
特許第４,７０３,０１８号は、様々な光散乱測定、およ
び使用される光散乱測定のタイプに応じて粒子の光散乱
特性を至適化する上で有用ないくつかの因子を開示し、
そしてさらに、本発明の好ましい粒子試薬を開示してい
る。視覚による検出のほか、本発明に使用できる凝集反
応の様々な既知タイプの散乱測定には、濁度測定（turb
idimetric）、比濁（nephelometric）、粒子計数、準弾
性光散乱、自己相関分光法および粒子のジスシンメトリ
ー（dissymmetry）またはポラリゼーションの測定が包
含される。
【００２１】免疫学的凝集反応には濁度測定が分光光度
計以外に特別な装置を必要としないことから好ましい。
その分光光度計は凝集反応によって生じる粒度増加によ
る増加した吸光度を測定する。この増加した吸光度は被
検体により生じた凝集の直接の尺度、または被検体によ
り生じた凝集阻害の間接の尺度である。凝集した反応混
合物を光が通過する際に入射方射エネルギーの一部は、
吸収、反射および屈折により散逸し、その残りが透過す
る。透過光強度を分散相の濃度の関数として測定するこ
とが濁度分析の基礎である。濁度測定による検出には、
高い屈折率および短波長検出（都合のよい波長は３２０
nmを超えるものである）の約０.０３〜０.１マイクロメ
ーターの小粒子が高感度とするのに好ましい。
計以外に特別な装置を必要としないことから好ましい。
その分光光度計は凝集反応によって生じる粒度増加によ
る増加した吸光度を測定する。この増加した吸光度は被
検体により生じた凝集の直接の尺度、または被検体によ
り生じた凝集阻害の間接の尺度である。凝集した反応混
合物を光が通過する際に入射方射エネルギーの一部は、
吸収、反射および屈折により散逸し、その残りが透過す
る。透過光強度を分散相の濃度の関数として測定するこ
とが濁度分析の基礎である。濁度測定による検出には、
高い屈折率および短波長検出（都合のよい波長は３２０
nmを超えるものである）の約０.０３〜０.１マイクロメ
ーターの小粒子が高感度とするのに好ましい。
【００２２】本発明は被検体のタイプと必要な感度に応
じていか様にも設計できる広範にわたる様々な凝集ベー
スのアッセイ方式に用いることができる。例えば、比較
的高濃度の被検体、例えばある種の血清タンパク質に対
しては、適切な抗体粒子試薬を直接濁度測定免疫沈降法
に用いることができる。さらに本発明は、後述の如き阻
害アッセイ方式を用いて実施することもできる。図１
は、被検体（４）を検出および／または定量するための
本発明の概要図である。凝集反応は、多価凝集剤（１）
例えば抗体が担体試薬（２）を連結合体して凝集複合体
（５）を形成する際に生起する。凝集反応は、その多価
リガンドが凝集剤の共通結合部位と特異結合できる少く
とも二つの結合部位を含有するように少くとも二量体で
ある多価リガンド（３）の存在下に行われる。多価リガ
ンドの濃度は、多価リガンドが凝集反応に干渉して凝集
速度を下げてしまうような濃度より低くすべきである。
好ましくは、多価リガンドの濃度範囲は、凝集剤濃度と
同程度の範囲である。
じていか様にも設計できる広範にわたる様々な凝集ベー
スのアッセイ方式に用いることができる。例えば、比較
的高濃度の被検体、例えばある種の血清タンパク質に対
しては、適切な抗体粒子試薬を直接濁度測定免疫沈降法
に用いることができる。さらに本発明は、後述の如き阻
害アッセイ方式を用いて実施することもできる。図１
は、被検体（４）を検出および／または定量するための
本発明の概要図である。凝集反応は、多価凝集剤（１）
例えば抗体が担体試薬（２）を連結合体して凝集複合体
（５）を形成する際に生起する。凝集反応は、その多価
リガンドが凝集剤の共通結合部位と特異結合できる少く
とも二つの結合部位を含有するように少くとも二量体で
ある多価リガンド（３）の存在下に行われる。多価リガ
ンドの濃度は、多価リガンドが凝集反応に干渉して凝集
速度を下げてしまうような濃度より低くすべきである。
好ましくは、多価リガンドの濃度範囲は、凝集剤濃度と
同程度の範囲である。
【００２３】被検体を含むと思われる検体、多価リガン
ド、凝集剤および担体試薬は、任意の順序で添加した後
にインキュベートすることができる。例えば凝集剤、多
価リガンドおよび検体を含む容器に担体試薬を添加でき
（図２）、あるいは多価リガンド、担体試薬および被検
体を含む容器に凝集剤を添加することができる(図３)。
好ましくは、凝集剤、多価リガンドおよび検体を一緒に
混合した後で担体を添加する（図２）。
ド、凝集剤および担体試薬は、任意の順序で添加した後
にインキュベートすることができる。例えば凝集剤、多
価リガンドおよび検体を含む容器に担体試薬を添加でき
（図２）、あるいは多価リガンド、担体試薬および被検
体を含む容器に凝集剤を添加することができる(図３)。
好ましくは、凝集剤、多価リガンドおよび検体を一緒に
混合した後で担体を添加する（図２）。
【００２４】本発明の好ましい態様は、担体が被検体で
ある特異結合性物質が共有結合的に結合したラテックス
粒子であり、被検体が抗原またはハプテン例えば薬物で
あり、そして多価リガンドが、被検体、担体試薬および
多価リガンドを特異結合できる凝集剤例えば抗体上の共
通結合部位を特異結合できる二つの結合部位をリンカー
を介してカップリングさせた二量体物質である拮抗的粒
子増感濁度測定阻害型イムノアッセイである。阻害方式
においては被検体が凝集剤上の共通特異結合部位を求め
て担体試薬と拮抗し、そのために凝集度が低下する。
ある特異結合性物質が共有結合的に結合したラテックス
粒子であり、被検体が抗原またはハプテン例えば薬物で
あり、そして多価リガンドが、被検体、担体試薬および
多価リガンドを特異結合できる凝集剤例えば抗体上の共
通結合部位を特異結合できる二つの結合部位をリンカー
を介してカップリングさせた二量体物質である拮抗的粒
子増感濁度測定阻害型イムノアッセイである。阻害方式
においては被検体が凝集剤上の共通特異結合部位を求め
て担体試薬と拮抗し、そのために凝集度が低下する。
【００２５】ハプテンなどの薬物被検体の測定には、い
くつかの異なるアッセイ形態を用いることができる。一
つのこのような形態においては、担体試薬として働く抗
原性粒子試薬は、ハプテンまたはハプテン−タンパク質
接合体を重合体粒子に結合させてハプテン−粒子または
ハプテン−タンパク質−粒子試薬を形成することにより
調製することができる。次いで、これら粒子試薬と適切
な抗体上の特異結合部位との間の凝集反応のハプテンに
よる阻害を測定することができる。凝集反応は、抗体を
求めて粒子担体試薬と検体ハプテンとを直接拮抗させる
ことにより、またはハプテンを抗体と反応させた後粒子
試薬を添加することにより行うことができる。
くつかの異なるアッセイ形態を用いることができる。一
つのこのような形態においては、担体試薬として働く抗
原性粒子試薬は、ハプテンまたはハプテン−タンパク質
接合体を重合体粒子に結合させてハプテン−粒子または
ハプテン−タンパク質−粒子試薬を形成することにより
調製することができる。次いで、これら粒子試薬と適切
な抗体上の特異結合部位との間の凝集反応のハプテンに
よる阻害を測定することができる。凝集反応は、抗体を
求めて粒子担体試薬と検体ハプテンとを直接拮抗させる
ことにより、またはハプテンを抗体と反応させた後粒子
試薬を添加することにより行うことができる。
【００２６】次に実施例を挙げて本発明を例説する。
（Ａ） フェニトイン（ＰＴＮ）二量体多価リガンド合
成用ＰＴＮリンカーの中間体の合成 カルボキシルブチルジフェニルヒ（ＣＢＤＨ）はRubens
teinらの米国特許第３,９０５,８７１号（その開示を引
用により本発明の開示に含める）に記載の手順と実質的
に類似した手順を用いてエチルブロモペンタノエートを
アルキル化することにより合成された。次いで下記に示
すようにＣＢＤＨをＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルに転化しそして水溶性ジアミンリンカーに接合し
た：
成用ＰＴＮリンカーの中間体の合成 カルボキシルブチルジフェニルヒ（ＣＢＤＨ）はRubens
teinらの米国特許第３,９０５,８７１号（その開示を引
用により本発明の開示に含める）に記載の手順と実質的
に類似した手順を用いてエチルブロモペンタノエートを
アルキル化することにより合成された。次いで下記に示
すようにＣＢＤＨをＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルに転化しそして水溶性ジアミンリンカーに接合し
た：
【００２７】
【化１】
【００２８】磁気撹拌棒を備えそして乾燥雰囲気下に維
持された丸形、３００ml、一口フラスコ内で、３５２４
mg（１０.００モル）のＣＢＤＨと２８１８mg（１１.０
０ミリモル）のジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳ
Ｃ）を５０mlの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）と混
合した。約１５分間混合後（ＤＳＣの一部は溶解されず
に残った）１３９４μｌ（１０.００ミリモル）のトリ
エチルアミン(ＴＥＡ）をそのフラスコに添加し、そし
てその混合物をさらに１.５時間撹拌したところ、その
間にＤＳＣは徐々に完全に溶解していくのが観察され
た。次いで溶媒を回転蒸発器を用いて反応混合物から除
去した後、残留物を２５０mlの氷水と共に磨砕し、濾過
しそして真空乾燥した。粗製生成物収量は４４０８ｍｇ
（９８％）であった。次に粗製生成物を２５０mlのイソ
プロパノールから再結晶し、濾過しそして真空乾燥し
た。１８５〜１８６℃の融点を有するものと測定された
精製生成物の回収率は９０％を超えた。
持された丸形、３００ml、一口フラスコ内で、３５２４
mg（１０.００モル）のＣＢＤＨと２８１８mg（１１.０
０ミリモル）のジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳ
Ｃ）を５０mlの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）と混
合した。約１５分間混合後（ＤＳＣの一部は溶解されず
に残った）１３９４μｌ（１０.００ミリモル）のトリ
エチルアミン(ＴＥＡ）をそのフラスコに添加し、そし
てその混合物をさらに１.５時間撹拌したところ、その
間にＤＳＣは徐々に完全に溶解していくのが観察され
た。次いで溶媒を回転蒸発器を用いて反応混合物から除
去した後、残留物を２５０mlの氷水と共に磨砕し、濾過
しそして真空乾燥した。粗製生成物収量は４４０８ｍｇ
（９８％）であった。次に粗製生成物を２５０mlのイソ
プロパノールから再結晶し、濾過しそして真空乾燥し
た。１８５〜１８６℃の融点を有するものと測定された
精製生成物の回収率は９０％を超えた。
【００２９】（Ｂ） ラテックス粒子と共有結合的に結
合させるためのＣＢＤＨ／ＤＡ−１０接合体の合成 ＣＢＤＨ ＤＡ−１０接合体を下記に示される反応スキ
ームを用いて合成した。
合させるためのＣＢＤＨ／ＤＡ−１０接合体の合成 ＣＢＤＨ ＤＡ−１０接合体を下記に示される反応スキ
ームを用いて合成した。
【化２】
【００３０】０.６mlのエチレンジオキシジエチルアミ
ン（以下、１０原子のジアミンリンカーであることにち
なみＤＡ−１０と記す）の５mlのＤＭＳＯ中の溶液を５
分間室温で激しく撹拌しながら５ml中の４５０mgのＣＢ
ＤＨ／ＮＨＳエステルに添加した。得られたＣＢＤＨ／
ＤＡ−１０を次いでラテックス粒子表面に共有結合的に
結合させるために用いた。ＣＢＤＨ／ＤＡ−１０接合体
は、米国特許第４,４０１,７６５号（その開示を引用に
より本発明の開示に含める）に開示された粒子および手
順を用いて粒子に共有結合させた。ここで用いた粒子
は、約０.０６〜０.０７μｍの直径を有しさらに高屈折
率重合体コアと反応性エポキシ基を含有する重合体シェ
ルとを有するシェル−コアラテックス粒子より成る高屈
折率シェルコア重合体であった。
ン（以下、１０原子のジアミンリンカーであることにち
なみＤＡ−１０と記す）の５mlのＤＭＳＯ中の溶液を５
分間室温で激しく撹拌しながら５ml中の４５０mgのＣＢ
ＤＨ／ＮＨＳエステルに添加した。得られたＣＢＤＨ／
ＤＡ−１０を次いでラテックス粒子表面に共有結合的に
結合させるために用いた。ＣＢＤＨ／ＤＡ−１０接合体
は、米国特許第４,４０１,７６５号（その開示を引用に
より本発明の開示に含める）に開示された粒子および手
順を用いて粒子に共有結合させた。ここで用いた粒子
は、約０.０６〜０.０７μｍの直径を有しさらに高屈折
率重合体コアと反応性エポキシ基を含有する重合体シェ
ルとを有するシェル−コアラテックス粒子より成る高屈
折率シェルコア重合体であった。
【００３１】（Ｃ） 多価リガンドとして用いるための
ＰＴＮ二量体の合成 ＰＴＮ二量体を（Ａ）に記載されたフェニトインＰＴＮ
−リンカー中間体を用い下記に示される如くに調製し
た：
ＰＴＮ二量体の合成 ＰＴＮ二量体を（Ａ）に記載されたフェニトインＰＴＮ
−リンカー中間体を用い下記に示される如くに調製し
た：
【化３】
【００３２】９８１μｌの乾燥ＤＭＳＯ、３.７mlのＤ
Ａ−１０および７.２μｌの乾燥トリエチルアミンの混
合物を２２.５mgのＣＢＤＨ／ＮＨＳエステルの乾燥Ｄ
ＭＳＯ９９７μｌ中の溶液と混合してＣＢＤＨ二量体の
最終濃度を２５mMとした（結合濃度として６.３mg／ml
のＰＴＮストックに相当）。
Ａ−１０および７.２μｌの乾燥トリエチルアミンの混
合物を２２.５mgのＣＢＤＨ／ＮＨＳエステルの乾燥Ｄ
ＭＳＯ９９７μｌ中の溶液と混合してＣＢＤＨ二量体の
最終濃度を２５mMとした（結合濃度として６.３mg／ml
のＰＴＮストックに相当）。
【００３３】（Ｄ） ＰＴＮ粒子試薬の調製 （米国特許第４,４０１,７６５号に記載されているよう
な）約０.０６〜０.０７μｍの直径を有しさらに高屈折
率重合体コアと反応性エポキシ基を含有する重合体シェ
ルとを有するシェルコアラテックス粒子より成る高屈折
率シェルコア重合体である２mlの濃縮ポリスチレン／ポ
リグリシジルメタクリレートラテックス粒子を０.１２
％ＧＡＦＡＣ ＲＥ６１０（ＧＡＦＡＣ）洗剤の混合物
（Rhone-Poulenc, Inc.（Monmouth Junction, N.J. 088
52）からRhodofacとして市販されている）に添加した。
０.２mlのＣＢＤＨ／リンカーアミン接合体（前記
（Ｃ）に記載）を添加しそしてその混合物のpHを０.１
Ｎ ＮａＯＨでpH１０.０に調節した。次にその混合物を
７０℃で２時間加熱した。２時間後に、ＰＴＮ活性を有
する未反応化合物をすべて遠心分離を繰り返すことによ
り除去した。次にその混合物を１％ＧＡＴＡＣ含有３０
mM pH７リン酸ナトリウム緩衝液で希釈し、そしてラテ
ックス粒子を遠心分離した。そのペレットを同一緩衝液
中に再懸濁させそして遠心操作をさらに３回繰り返し
た。
な）約０.０６〜０.０７μｍの直径を有しさらに高屈折
率重合体コアと反応性エポキシ基を含有する重合体シェ
ルとを有するシェルコアラテックス粒子より成る高屈折
率シェルコア重合体である２mlの濃縮ポリスチレン／ポ
リグリシジルメタクリレートラテックス粒子を０.１２
％ＧＡＦＡＣ ＲＥ６１０（ＧＡＦＡＣ）洗剤の混合物
（Rhone-Poulenc, Inc.（Monmouth Junction, N.J. 088
52）からRhodofacとして市販されている）に添加した。
０.２mlのＣＢＤＨ／リンカーアミン接合体（前記
（Ｃ）に記載）を添加しそしてその混合物のpHを０.１
Ｎ ＮａＯＨでpH１０.０に調節した。次にその混合物を
７０℃で２時間加熱した。２時間後に、ＰＴＮ活性を有
する未反応化合物をすべて遠心分離を繰り返すことによ
り除去した。次にその混合物を１％ＧＡＴＡＣ含有３０
mM pH７リン酸ナトリウム緩衝液で希釈し、そしてラテ
ックス粒子を遠心分離した。そのペレットを同一緩衝液
中に再懸濁させそして遠心操作をさらに３回繰り返し
た。
【００３４】（Ｅ） フェニトインアッセイ Cobas BioR遠心アナライザー（Roche Analytical Instr
uments, Inc., Nutley, New Jersey）を用いて３７℃で
アッセイを行った。使用した検体は被検体としてフェニ
トインを含有しそして市販のキャリブレーターをDu Pon
t acaR Clinical Chemistry System (E. I. du Pont de
Nemours and Company, Wilmington, Delaware）と共に
用いた。試薬緩衝液を調製した。ＤＭＳＯ中の１２.５m
M ＰＴＮ二量体溶液をステップ（Ｃ）に記載の方法を用
いて調製した。この溶液をpH７.０に調節された１３０m
M二塩基性リン酸ナトリウム中の０.２５％ＧＡＦＡＣよ
り成る緩衝液で希釈して１０.００μＭ ＰＴＮ二量体溶
液を作った。この１０.００μＭ溶液をさらに希釈して
表２および３に示されるようなＰＴＮ二量体濃度を有す
る試薬緩衝液の最終ストックとした。この試薬緩衝液は
後述の如く凝集剤（セクションＦ参照）または担体試薬
（セクションＧ参照）を含有した。３００μｌ量の試薬
緩衝液を各アッセイに用いて行った。pH７に調節された
１３０mM二塩基性リン酸ナトリウム中の０.２５％ＧＡ
ＦＡＣより成る緩衝液を含み、そして後述の如く担体試
薬（セクションＦ参照）または凝集剤（セクションＧ参
照）を含む開始試薬を調製した。２０μｌ量の開始試薬
を各アッセイに用いて行った。
uments, Inc., Nutley, New Jersey）を用いて３７℃で
アッセイを行った。使用した検体は被検体としてフェニ
トインを含有しそして市販のキャリブレーターをDu Pon
t acaR Clinical Chemistry System (E. I. du Pont de
Nemours and Company, Wilmington, Delaware）と共に
用いた。試薬緩衝液を調製した。ＤＭＳＯ中の１２.５m
M ＰＴＮ二量体溶液をステップ（Ｃ）に記載の方法を用
いて調製した。この溶液をpH７.０に調節された１３０m
M二塩基性リン酸ナトリウム中の０.２５％ＧＡＦＡＣよ
り成る緩衝液で希釈して１０.００μＭ ＰＴＮ二量体溶
液を作った。この１０.００μＭ溶液をさらに希釈して
表２および３に示されるようなＰＴＮ二量体濃度を有す
る試薬緩衝液の最終ストックとした。この試薬緩衝液は
後述の如く凝集剤（セクションＦ参照）または担体試薬
（セクションＧ参照）を含有した。３００μｌ量の試薬
緩衝液を各アッセイに用いて行った。pH７に調節された
１３０mM二塩基性リン酸ナトリウム中の０.２５％ＧＡ
ＦＡＣより成る緩衝液を含み、そして後述の如く担体試
薬（セクションＦ参照）または凝集剤（セクションＧ参
照）を含む開始試薬を調製した。２０μｌ量の開始試薬
を各アッセイに用いて行った。
【００３５】（Ｆ）に記載の手順において、試薬緩衝液
は凝集剤を含有し、そして開始試薬は担体試薬を含有し
た。（Ｇ）に記載の手順においては、試薬緩衝液は担体
試薬を含有しそして開始試薬は凝集剤を含有した。後述
の（Ｆ）および（Ｇ）のいずれの手順においても、粒子
試薬の使用量は実験的に決定された。粒子濃度はアッセ
イにおいて約０.８５ＡＵの光学密度を与えるように調
節された。３μｌの検体を各アッセイに用いて行った。
比較として、３μｌの５μｇ／mlフェニトイン検体キャ
リブレーターをCobasR遠心アナライザーを用いて測定す
ると得られるフェニトイン濃度は０.１６５μＭであ
る。
は凝集剤を含有し、そして開始試薬は担体試薬を含有し
た。（Ｇ）に記載の手順においては、試薬緩衝液は担体
試薬を含有しそして開始試薬は凝集剤を含有した。後述
の（Ｆ）および（Ｇ）のいずれの手順においても、粒子
試薬の使用量は実験的に決定された。粒子濃度はアッセ
イにおいて約０.８５ＡＵの光学密度を与えるように調
節された。３μｌの検体を各アッセイに用いて行った。
比較として、３μｌの５μｇ／mlフェニトイン検体キャ
リブレーターをCobasR遠心アナライザーを用いて測定す
ると得られるフェニトイン濃度は０.１６５μＭであ
る。
【００３６】使用した凝集剤はフェニトインに対するモ
ノクローナル抗体のペプシン消化により調製された抗−
フェニトインモノクローナル抗体Ｆ(ａｂ′)2断片であ
った。その抗−フェニトインモノクローナル抗体は、モ
ノクローナル抗体調製手順、例えばKohlerおよびMilste
in, Nature, 第２５６巻, ４９５〜４９７（１９７５年
８月７日）（その開示を引用により本発明の開示に含め
る）に記載の利点を用いて調製した。凝集剤として働く
ことのできる任意の抗体またはその断片、すなわちその
共通結合部位を通して被検体のフェニトイン、担体試薬
および多価リガンドＰＴＮ二量体と特異結合できるもの
を本発明の方法に用いることができる。
ノクローナル抗体のペプシン消化により調製された抗−
フェニトインモノクローナル抗体Ｆ(ａｂ′)2断片であ
った。その抗−フェニトインモノクローナル抗体は、モ
ノクローナル抗体調製手順、例えばKohlerおよびMilste
in, Nature, 第２５６巻, ４９５〜４９７（１９７５年
８月７日）（その開示を引用により本発明の開示に含め
る）に記載の利点を用いて調製した。凝集剤として働く
ことのできる任意の抗体またはその断片、すなわちその
共通結合部位を通して被検体のフェニトイン、担体試薬
および多価リガンドＰＴＮ二量体と特異結合できるもの
を本発明の方法に用いることができる。
【００３７】前記CobasR遠心アナライザーのプログラム
を組んで３μｌの検体、希釈剤として用いられる２０μ
ｌの水および３００μｌの試薬緩衝液を混合しそしてそ
れらを３７℃で２分間インキュベートした。この時間の
後、２０μｌの開始試薬（下記手順ＦおよびＧ参照）を
添加しそして最終添加後１０秒おきに光学密度を測定し
た。光学密度の経時変化はｍＡＵ／分として報告され、
また下記の如く測定された。
を組んで３μｌの検体、希釈剤として用いられる２０μ
ｌの水および３００μｌの試薬緩衝液を混合しそしてそ
れらを３７℃で２分間インキュベートした。この時間の
後、２０μｌの開始試薬（下記手順ＦおよびＧ参照）を
添加しそして最終添加後１０秒おきに光学密度を測定し
た。光学密度の経時変化はｍＡＵ／分として報告され、
また下記の如く測定された。
【００３８】（Ｆ） 抗体試薬の添加により開始される
フェニトイン凝集反応 このアッセイ方式では、試薬緩衝液は凝集剤を最終凝集
剤濃度が約３０〜６０μｇ／mlとなるように含有した。
反応は粒子ベースの担体試薬の添加により開始された。
抗体試薬は前記（Ｂ）の記載と同様にして調製した。下
記表１では、反応開始後５０から６０秒の吸光度変化を
６倍することにより得られたアッセイ応答がｍＡＵ／分
単位で記録されている。
フェニトイン凝集反応 このアッセイ方式では、試薬緩衝液は凝集剤を最終凝集
剤濃度が約３０〜６０μｇ／mlとなるように含有した。
反応は粒子ベースの担体試薬の添加により開始された。
抗体試薬は前記（Ｂ）の記載と同様にして調製した。下
記表１では、反応開始後５０から６０秒の吸光度変化を
６倍することにより得られたアッセイ応答がｍＡＵ／分
単位で記録されている。
【表１】
【００３９】ＰＴＮ二量体が存在しないとアッセイが満
足できる標準曲線を与えないことが表１からわかる。
０.４２μＭ二量体の存在下ではアッセイはフェニトイ
ンに対して極めて鋭敏であり、また濁度変化率により測
定される凝集は比較的速やかである。より高い二量体濃
度では、アッセイ性能はさほど鋭敏でも速やかでもな
い。図２は、前記表１に示された結果をグラフで示した
ものである。凝集はCobasBioR遠心アナライザー（Roche
Analytical Instruments, Inc., Nutley, New Jerse
y）を用いて測定され、凝集反応は担体試薬の添加時に
開始された。ｍＡＵ／分で示されるアッセイ応答は、反
応開始後５０から６０秒の間にみられる吸光度変化から
測定された。
足できる標準曲線を与えないことが表１からわかる。
０.４２μＭ二量体の存在下ではアッセイはフェニトイ
ンに対して極めて鋭敏であり、また濁度変化率により測
定される凝集は比較的速やかである。より高い二量体濃
度では、アッセイ性能はさほど鋭敏でも速やかでもな
い。図２は、前記表１に示された結果をグラフで示した
ものである。凝集はCobasBioR遠心アナライザー（Roche
Analytical Instruments, Inc., Nutley, New Jerse
y）を用いて測定され、凝集反応は担体試薬の添加時に
開始された。ｍＡＵ／分で示されるアッセイ応答は、反
応開始後５０から６０秒の間にみられる吸光度変化から
測定された。
【００４０】（Ｇ） 凝集剤の添加により開始されるフ
ェニトイン凝集反応 このアッセイ方式では、試薬緩衝液は担体試薬を、粒子
濃度がアッセイにおいて約０.８５ＡＵの光学密度を与
えるように調節されるように含有した。反応はアッセイ
濃度が（Ｆ）の場合と同じとなるような濃度の凝集剤サ
ンプルを用いて開始させた。下記表２には、凝集反応開
始後０から６０秒の吸光度変化から得られたアッセイ応
答がｍＡＵ／分単位で記録されている。
ェニトイン凝集反応 このアッセイ方式では、試薬緩衝液は担体試薬を、粒子
濃度がアッセイにおいて約０.８５ＡＵの光学密度を与
えるように調節されるように含有した。反応はアッセイ
濃度が（Ｆ）の場合と同じとなるような濃度の凝集剤サ
ンプルを用いて開始させた。下記表２には、凝集反応開
始後０から６０秒の吸光度変化から得られたアッセイ応
答がｍＡＵ／分単位で記録されている。
【表２】
【００４１】ＰＴＮ二量体が存在しないとアッセイが満
足できる標準曲線を与えないことが表２からわかる。
０.８４μＭ二量体の存在下では、アッセイはフェニト
インに対しより鋭敏となり、また濁度変化率により測定
される凝集は比較的速やかである。より高いＰＴＮ二量
体濃度ではアッセイ性能はさほどよくない。図３は前記
表２に示される結果をグラフで示したものである。凝集
はCobas BioR遠心アナライザー(Roche Analytical Inst
ruments, Inc. Nutley, New Jersey）を用いて測定さ
れ、凝集反応は凝集剤の添加時に開始された。ｍＡＵ／
分で示されるアッセイ応答は凝集反応開始後０から６０
秒の間にみられる吸光度変化から測定された。
足できる標準曲線を与えないことが表２からわかる。
０.８４μＭ二量体の存在下では、アッセイはフェニト
インに対しより鋭敏となり、また濁度変化率により測定
される凝集は比較的速やかである。より高いＰＴＮ二量
体濃度ではアッセイ性能はさほどよくない。図３は前記
表２に示される結果をグラフで示したものである。凝集
はCobas BioR遠心アナライザー(Roche Analytical Inst
ruments, Inc. Nutley, New Jersey）を用いて測定さ
れ、凝集反応は凝集剤の添加時に開始された。ｍＡＵ／
分で示されるアッセイ応答は凝集反応開始後０から６０
秒の間にみられる吸光度変化から測定された。
【図１】被検体を検出および／または定量するための本
発明の概要図。
発明の概要図。
【図２】各種濃度のフェニトイン二量体の存在下に行わ
れたフェニトインアッセイ結果を示した図。
れたフェニトインアッセイ結果を示した図。
【図３】各種濃度のフェニトイン二量体の存在下に行わ
れたフェニトインアッセイ結果を示した図。
れたフェニトインアッセイ結果を示した図。
Claims (4)
- 【請求項１】 （Ａ）（ａ）被検体を含有すると思われ
る検体、 （ｂ）非粒状凝集剤と結合する特異結合性物質が結合し
た担体からなる担体試薬、 （ｃ）担体試薬に結合した特異結合性物質、被検体およ
び可溶性多価リガンドと特異的に結合する少なくとも２
つの共通結合部位を有する非粒状凝集剤、 （ｄ）前記非粒状凝集剤の共通結合部位と特異的に結合
する少なくとも２つの結合部位を有し、多価リガンドを
少なくとも２つの非粒状凝集剤と結合させることを可能
とするのに十分な長さの連結基によって結合部位が連結
されている可溶性リガンドであって、（１）担体試薬の
特異結合性物質に特異結合せず、そして（２）凝集反応
を妨害する濃度以下の濃度で存在する可溶性リガンド、 ただし、該凝集反応において被検体は、非粒状凝集剤の
共通特異結合部位に対して担体試薬と競合し、これによ
り凝集の程度を低下させるものである、 をインキュベートし； （Ｂ）生じる凝集を検出または測定し；そして （Ｃ）検体中の被検体の存在から得られる凝集阻害の程
度を被検体の存在および（または）量と関連させること
よりなる検体中の被検体の競合凝集検出および（また
は）定量方法。 - 【請求項２】 凝集剤が抗原、抗体またはその免疫学的
断片、酵素、酵素基質、生物細胞および核酸より成る群
より選択される請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 特異結合性物質が抗原、抗体、免疫学的
断片、ハプテン、酵素、酵素基質、生物細胞および核酸
より成る群より選択される請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 多価リガンドが被検体の構造アナロー
グ、被検体の誘導体、および被検体の抗体の抗−イディ
オタイプ抗体より成る群より選択される請求項１記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US96431292A | 1992-10-21 | 1992-10-21 | |
| US964312 | 1992-10-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06207937A JPH06207937A (ja) | 1994-07-26 |
| JP2645211B2 true JP2645211B2 (ja) | 1997-08-25 |
Family
ID=25508390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5262226A Expired - Fee Related JP2645211B2 (ja) | 1992-10-21 | 1993-10-20 | 多価リガンドを使用した高感度凝集アッセイ |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5401636A (ja) |
| EP (1) | EP0593956B1 (ja) |
| JP (1) | JP2645211B2 (ja) |
| CA (1) | CA2108439A1 (ja) |
| DE (1) | DE69331570T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5583004A (en) * | 1994-12-23 | 1996-12-10 | Pincus; Mathew R. | Direct detection of unexpected alloantibodies in the serum of prospective transfusion recipients using a new hemagglutination inhibition assay |
| US5981294A (en) * | 1995-11-29 | 1999-11-09 | Metrika, Inc. | Device for blood separation in a diagnostic device |
| IL126544A (en) * | 1996-04-25 | 2004-08-31 | Genicon Sciences Inc | Test for component detection using detectable particles in diffused light |
| US20060019404A1 (en) * | 1998-05-06 | 2006-01-26 | Blatt Joel M | Quantitative assay with extended dynamic range |
| DK1320387T3 (da) * | 2000-09-13 | 2012-07-16 | Glaxosmithkline Llc | Farmaceutiske sammensætninger til vedvarende afgivelse af peptider |
| US6656694B2 (en) | 2001-01-11 | 2003-12-02 | Theravance, Inc. | Method for identifying a ligand for a biological substrate |
| US20030003602A1 (en) * | 2001-03-07 | 2003-01-02 | Bernd Vogt | Homogeneous immunoassay method |
| US7939283B2 (en) * | 2001-11-01 | 2011-05-10 | Fisher Scientific Company L.L.C. | Analyte binding turbidity assay |
| US7150995B2 (en) * | 2004-01-16 | 2006-12-19 | Metrika, Inc. | Methods and systems for point of care bodily fluid analysis |
| US20050227370A1 (en) * | 2004-03-08 | 2005-10-13 | Ramel Urs A | Body fluid analyte meter & cartridge system for performing combined general chemical and specific binding assays |
| JP2010053118A (ja) * | 2008-07-28 | 2010-03-11 | Fujifilm Corp | ビオチン化チロキシン |
| JP2010101703A (ja) * | 2008-10-22 | 2010-05-06 | Alfresa Pharma Corp | 免疫学的測定方法および測定用試薬キット |
| CN102680712A (zh) * | 2012-06-18 | 2012-09-19 | 王钊 | 竞争法胶乳颗粒增强免疫比浊bnp检测试剂盒及其制备方法 |
| WO2020030954A1 (en) | 2018-08-09 | 2020-02-13 | Integrative Medicine Clinic, Sia | Theranostics-like protein sanps conjugated to integrin and pmsa targeting peptides and therapy of prostate cancer |
| CN113866406B (zh) * | 2021-10-18 | 2022-09-27 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种特异性检测糖缺失性转铁蛋白的试剂盒 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4210723A (en) * | 1976-07-23 | 1980-07-01 | The Dow Chemical Company | Method of coupling a protein to an epoxylated latex |
| CA1101330A (en) * | 1977-09-19 | 1981-05-19 | Ernst A. Fischer | Immunological material bonded to carboxylated latex polymer and process for making it |
| US4194048A (en) * | 1978-04-25 | 1980-03-18 | Miles Laboratories, Inc. | Diphenylhydantoin derivatives |
| US4427781A (en) * | 1981-03-16 | 1984-01-24 | International Institute Of Cellular And Molecular Pathology | Particle agglutination immunoassay with agglutinator for determining haptens; PACIA |
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| DE3586314D1 (de) * | 1984-11-27 | 1992-08-13 | Behringwerke Ag | Bifunktionelle haptene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung. |
| US4703018A (en) * | 1985-02-20 | 1987-10-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | High refractive index haloalkyl-functional shell-core polymers and their use in light scattering immunoassays |
| US4772550A (en) * | 1986-02-10 | 1988-09-20 | Miles Inc. | Heterogeneous specific binding assay employing an aggregatable binding reagent |
| US4829011A (en) * | 1987-08-27 | 1989-05-09 | Biotrack, Inc. | Agglutination assay |
| DE3882904T2 (de) * | 1987-09-30 | 1993-11-18 | Beckman Instruments Inc | Aus zwei Verzahnungen bestehendes Konjugat und Verfahren zu seiner Verwendung. |
| US4968742A (en) * | 1987-11-09 | 1990-11-06 | Miles Inc. | Preparation of ligand-polymer conjugate having a controlled number of introduced ligands |
| DE3822750A1 (de) * | 1988-07-05 | 1990-01-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
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1993
- 1993-09-30 DE DE69331570T patent/DE69331570T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-30 EP EP93115776A patent/EP0593956B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-14 CA CA002108439A patent/CA2108439A1/en not_active Abandoned
- 1993-10-20 JP JP5262226A patent/JP2645211B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
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| CA2108439A1 (en) | 1994-04-22 |
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| JPH06207937A (ja) | 1994-07-26 |
| DE69331570T2 (de) | 2002-10-02 |
| EP0593956A3 (en) | 1995-04-12 |
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