DE3882904T2

DE3882904T2 - Aus zwei Verzahnungen bestehendes Konjugat und Verfahren zu seiner Verwendung.

Info

Publication number: DE3882904T2
Application number: DE88309004T
Authority: DE
Inventors: Paul C Harris; Chan S Oh
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1987-09-30
Filing date: 1988-09-29
Publication date: 1993-11-18
Anticipated expiration: 2008-09-30
Also published as: EP0315317A3; EP0315317A2; EP0315317B2; EP0315317B1; AU621321B2; ATE92632T1; JP2670696B2; DE3882904D1; ES2056936T3; AU2603288A; WO1989003042A1; JPH02501410A

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Spezifische Bindungstests

Verfahren zur Messung immunchemischer oder anderer Arten spezifischer Bindungsreaktionen haben in den letzten Jahren auf dem Gebiet medizinischer Tests breiten Eingang gefunden. Allgemein gesprochen beinhaltet eine immunchemische Reaktion die Reaktion zwischen wenigstens einem Antigen und wenigstens einem Antikörper. Ein Antigen ist gewöhnlicherweise eine Substanz wie beispielsweise ein Protein oder ein Kohlehydrat, das bei Einführung in einen tierischen oder menschlichen Körper eine Immunantwort, d. h. Antikörpererzeugung, hervorzurufen vermag. Die als Folge der Immunantwort erzeugten Antikörper sind von bivalenter Natur und werden allgemein als ein "Y" dargestellt, wobei jeder Arm des "Y" zur Bindung an das Antigen, welches die Erzeugung des Antikörpers auslöste, fähig ist. Das Vorliegen eines speziellen Antigens oder Antikörpers in einer Testprobe eines Patienten kann einen Krankheitszustand oder eine körperliche Beschaffenheit, wie beispielsweise Schwangerschaft, anzeigen. Eine immunchemische Reaktion ist ein Typus einer spezifischen Bindungsreaktion.
Antikörperfragmente werden häufig zusätzlich zu oder anstelle von ganzen Antikörpern in einem Immuntest verwendet. Allgemein gibt es drei verschiedene Typen von Antikörperfragmenten. Der erste Fragmenttyp wird als entweder Fab oder F(ab) bezeichnet und ist ein einzelner Arm bzw. Schenkel des Antikörpers, der direkt von dem ganzen Antikörper abgespaltet wurde, gewöhnlicherweise durch Verdauung durch das Enzym Papain. Jedes Fab-Fragment ist jeweils monovalent und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 50.000 Dalton, verglichen mit der Größe von annähernd 150.000 Dalton des ganzen Antikörpers. Der zweite Fragmenttyp wird als F(ab')&sub2; bezeichnet und besteht aus den noch miteinander verbundenen beiden Antikörperschenkeln, jedoch ohne den Schwanz, der durch die Pepsinverdauung entfernt wird. Das divalente F(ab')&sub2;-Fragment hat ein Molekulargewicht von etwa 100.000 Dalton und kann weiter in zwei gesonderte monovalente Fab'-Fragmente (den dritten Antikörperfragmenttyp) gespalten werden, die auch als F(ab') bezeichnet werden, und deren jeder ein Molekulargewicht von etwa 50.000 Dalton besitzt.
Die Stelle auf dem Antigen, an welche ein Schenkel des Antikörpers bindet, wird als ein Epitop bezeichnet. Die meisten Antigene sind polyepitopisch, d. h. sie haben vielfache, und häufig sich wiederholende, Bindungsstellen für Antikörper. Es sind diese polyepitopische Natur der Antigene und der divalente Charakter von Antikörpern, einschließlich F(ab')&sub2;-Fragmenten, welche die Bindung großer Antikörper:Antigen-Komplexe unterschiedlicher Größe, die auch als Immunkomplexe bezeichnet werden, in einem Immuntest ermöglichen.
Ein spezieller Typ Immuntest, der von diesem Sachverhalt Gebrauch macht, ist der Sandwich-Immuntest, bei welchem ein ternärer Immunkomplex gebildet wird. Bei dem gebräuchlichsten Typ von Sandwich-Immuntest findet ein erster insolubilisierter Antikörper, gewöhnlich an einen festen Träger gebunden, und ein zweiter markierter Antikörper Anwendung. Jeder Antikörper ist jeweils spezifisch für das interessierende Antigen (d. h. den zu messenden Analyten) und bindet mit einem verschiedenen Epitop an dem Antigen. Vorzugsweise bindet der erste Antikörper an ein Epitop, das von dem Epitop, an welches der zweite Antikörper bindet, entfernt ist. Ein ternärer Komplex aus unlöslichem Antikörper:Antigen: markiertem Antikörper wird gebildet, wenn das interessierende Antigen mit dem ersten und dem zweiten Antikörper in Kontakt gebracht wird. Da jeweils jeder Antikörper nur mit einem Antigen zu binden braucht, können alle drei Antikörperfragmenttypen in diesem Verfahrenstyp verwendet werden. Das Vorhandensein oder Fehlen des interessierenden Antigens wird durch das Vorliegen oder Fehlen des markierten Antikörpers auf dem festen Träger angezeigt. Normalerweise muß die insolubilisierte Phase der Reaktion von der flüssigen Phase abgetrennt werden, um entweder den gebundenen oder den freien markierten Antikörper zu quantifizieren. Eine derartige Reaktion wird als ein heterogener Reaktionstyp bezeichnet, infolge des erforderlichen Abtrenn- oder Separierungsschrittes.
Nephelometrie und Turbidimetrie erfordern die Bildung großer Aggregate von beispielsweise Antikörper und Antigen. Da jeweils jeder Antikörper mit zwei verschiedenen Antigenmolekülen binden muß, sind die monovalenten Fab- und Fab'-Fragmente im allgemeinen in diesen Verfahren unwirksam. Die großen Aggregate bewirken eine Änderung in der Lichtstreuung der Lösung und können mit nephelometrischen oder turbidimetrischen Verfahren gemessen werden. Für diese Verfahren ist nicht die Verwendung herkömmlicher Marker, wie beispielsweise Enzyme, radioaktive Isotope oder Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzverbindungen, erforderlich, um die Menge an gebildetem Komplex nachzuweisen. Vielmehr wird bei den nephelometrischen und turbidimetrischen Methoden direkt die Menge an Komplexbildung gemessen. Da kein Abtrennungsschritt erforderlich ist, werden Nephelometrie und Turbidimetrie als homogene Immuntests bezeichnet.
Die multiepitopische Natur des Antigens und der bivalente Charakter des Antikörpers erlauben, je nach der vorliegenden Menge an Antigen und/oder Antikörper, die Bildung von Antigen:Antikörper-Komplexen, die groß genug sind, um Licht zu streuen. Normalerweise wird ein Überschuß an Antikörper in Verbindung mit einer endlichen Menge Antigen verwendet, das beispielsweise aus dem Blut, dem Serum, der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF, "cerebrospinal fluid") oder der Urinprobe eines Patienten erhalten wurde. In einem solchen Fall stellt die Menge an in der Probe vorliegendem Antigen den begrenzenden Faktor bei der Bestimmung der Menge und Größe gebildeter Antigen: Antikörper-Aggregate dar.
In der Turbidimetrie (Trübungsmessung) wird die Schwächung von durch die Suspension von Teilchen oder Aggregaten durchgelassenem Licht gemessen. Die Schwächung wird durch Reflexion, Streuung und Absorption des Lichts durch die Aggregate verursacht. In der Nephelometrie wird das Licht gemessen, das in Richtung auf einen Detektor, der nicht im direkten Lichtweg liegt, gestreut oder reflektiert wird. Sowohl bei der Turbidimetrie wie bei der Nephelometrie kann auch die Änderungsgeschwindigkeit der Lichtstreuung als eine Anzeige der Menge an vorliegendem Antigen gemessen werden.
Nephelometrische Verfahren sind ein bequemes Verfahren zur Überwachung von Antigen:Antikörper-Reaktionen in einem frühen Stadium geworden, durch Nachweis der Geschwindigkeit des Anwachsens von zur Lichtstreuung befähigten Komplexen, bevor diese Komplexe als Immunpräzipitate aus der Lösung abgetrennt werden. Das Anwachsen dieser Komplexe beginnt als ein Aufba"von Aggregaten, die schließlich genügend groß werden, um als ''Streuzentren" zu wirken. Sternberg, J. C., A Rate Nephelometer for Measuring Specific Proteins by Immunoprecipitation Reactions, Clin. Chem., 23:8, 1456-1464 (1977). Die Bildung von Streuzentren kann durch Verwendung hydrophiler nicht-ionischer Polymere, wie beispielsweise Dextran oder Polyäthylenglycol, beschleunigt werden, welche die Wahrscheinlichkeit von Protein/Protein-Wechselwirkung durch Ausschluß eines beträchtlichen Wasseranteils erhöhen. Die Verwendung von Polymeren in einem immunnephelometrischen Test erbringt auch die Vorteile erhöhter Empfindlichkeit und eines geringeren Antiserumverbrauchs.

2. Nephelometrische Inhibitions-Immuntests für Haptene

Haptene stellen ein besonderes eigenartiges Problem in Immuntestverfahren dar. Haptene sind verhältnismäßig kleine monovalente Moleküle, die manchmal als unvollständige oder fragmentarische Antigene betrachtet werden. Eine geläufige Klasse von Haptenen sind Arzneimittel. Beispielsweise ist Theophyllin ein Glied dieser besonderen Unterklasse von Haptenen. Ein Hapten ist an und für sich nicht in der Lage, in einem menschlichen oder tierischen Körper eine Immunantwort zu induzieren. Und zwar deshalb, weil Haptene im allgemeinen zu klein sind, um von dem Immunsystem des Körpers erkannt zu werden. Falls sie jedoch an einen Träger wie beispielsweise ein Protein gekoppelt sind, wirkt das Hapten:Trägerprotein-Konjugat als ein Antigen, das groß genug ist, um Antikörpererzeugung zu induzieren. Auf diese Weise können Antikörper gegen ein Hapten mobilisiert werden. Im Unterschied zu den verhältnismäßig großen Antigenen ist jedoch das kleine Haptenmolekül selbst nicht multiepitopisch. Aus diesem Grunde vermögen Haptene keine großen Komplexe oder Agglomerate mit dem Antikörper zu bilden, der gegen das Hapten erzeugt wurde.
Um daher nephelometrische oder turbidimetrische Tests für Haptene durchzuführen, beispielsweise bei der therapeutischen Arzneimittelüberwachung, wurde ein als nephelometrischer Inhibitionsimmuntest (NIIA, "nephelometric inhibition immunoassay") bekanntes Verfahren entwickelt, bei welchem das Hapten als ein Inhibitor für die Komplexbildung wirkt. Bei dem herkömmlichen NIIA verwendet man ein zweites, als "Entwicklerantigen" bekanntes Konjugat zur Entwicklung von Komplexen ausreichender Größe, um eine nachweisbare Lichtstreuung hervorzurufen. Das Entwicklerantigen wird von einem zweiten Träger, üblicherweise ebenfalls ein Protein, gebildet, der ein Konjugat mit einer Vielfalt von Haptenmolekülen bildet. Auf diese Weise wirkt das Entwicklerantigen als ein "polyvalentes Hapten", das Aggregate mit mehr als einem Antikörpermolekül zu bilden vermag, um schließlich Streuzentren zu bilden. Das zweite Trägerprotein wird manchmal als der "Marker" ("label") bezeichnet. Das in einer Testprobe eines Patienten vorliegende monovalente freie Hapten bewirkt eine Inhibierung des Ausmaßes der Entwicklerantigen:Antikörper-Komplexbildung, indem es mit einem oder mit beiden Schenkeln des Antikörpermoleküls bindet, wodurch die Komplexbildung herabgesetzt und die Streulichtmenge verringert wird. Wegen der Natur des Inhibitionsimmuntests sind sowohl der Betrag als auch die Zunahmegeschwindigkeit der nachgewiesenen Lichtstreuung umgekehrt proportional zu der in der Patientenprobe vorliegenden Menge Hapten.
Bei den turbidimetrischen oder nephelometrischen Inhibitionsimmuntests nach dem Stande der Technik sind verschiedene Probleme aufgetreten. Ein Problem betrifft das Entwicklerantigenreagenz. Das herkömmliche Entwicklerantigen ist gewöhnlich unstabil und erfordert besondere Lagerungsbedingungen. Das Erfordernis besonderer Lagerbedingungen ergibt sich aus dem Umstand, daß das Trägerprotein des Entwicklerantigens, da es sich um eine natürliche eiweißartige Substanz handelt, während der Herstellung wie im Verlaufe der Lagerung degradiert. Bei Zimmertemperatur kann für ein typisches Entwicklerantigen eine Lebensdauer von nur etwa acht Stunden erwartet werden. Selbst bei Kühltemperaturen zeigen die meisten Entwicklerantigene eine Lagerfähigkeit von nur etwa sechs Monaten. Dies ist eine beträchtliche Komplizierung der Herstellungs- und Verteilungsprobleme und erhöht die Kosten derartiger Erzeugnisse. Da ferner das Trägerprotein für das Entwicklerantigen von natürlichen Quellen abgeleitet ist, tritt eine erhebliche Schwankung in den Eigenschaften dieser Proteine auf. Das herkömmliche Entwicklerantigenreagenz muß sorgfältig hergestellt, gereinigt und charakterisiert werden, um gleichförmige Reaktivität zu gewährleisten. Dieser Charakterisierungsprozeß ist der kostspieligste Aspekt der Herstellung von Entwicklerantigenen nach dem Stande der Technik.
Bei bekannten NIIA-Tests nach dem Stande der Technik hat sich auch ergeben, daß sie nur begrenzte Empfindlichkeit bezüglich anderer Immuntestarten wie beispielsweise dem Sandwich-Immuntest besitzen. Diese Empfindlichkeitsbeschränkung resultiert hauptsächlich aus der von anderen Komponenten der Serumprobe verursachten Streuung. Aus diesem Grund muß eine Testprobe vor der Zugabe zu dem Reaktionsmedium eines NIIA beträchtlich verdünnt werden, wodurch auch die Konzentration des Analyten in dem Reaktionsmedium verdünnt wird. Bei anderen Arten von Immuntests wie beispielsweise dem Sandwich-Immuntest werden etwa 100 bis 200 ul Probe typischerweise zu dem Reaktionsmedium zugesetzt. Demgegenüber wird normalerweise nur etwa 1 bis 3 ul Probe in das Reaktionsmedium für einen NIIA injiziert. Ein Verfahren, das zur Verbesserung der Empfindlichkeit vorgeschlagen wurde, sieht eine Verbesserung des Hapten:Träger-Verhältnisses des Entwicklerantigens vor, wie in der US-Patentschrift 4604365 beschrieben. Es wurde berichtet, daß hohe und niedrige Hapten:Träger-Verhältnisse eine mäßige Empfindlichkeit zur Folge haben, während eine verbesserte Empfindlichkeit bei mittleren Verhältniswerten beobachtet wird. Dieses Verfahren erbringt keine markanten Zunahmen in der NIIA-Empfindlichkeit.
Ein weiteres bei dem bekannten NIIA-Test nach dem Stande der Technik auftretendes Problem steht mit einem als "nicht- produktive Bindung" bekannten Phänomen in Zusammenhang. Eine nicht-produktive Bindung tritt beispielsweise auf, wenn die beiden bindenden Schenkel des gleichen Antikörpers an zwei Haptengruppen auf dem gleichen Entwicklerantigen binden. In einem derartigen Fall kann es keine Quervernetzung mit anderen Entwicklerantigenen geben, da es keinen freien Schenkel an dem Antikörper zur Bindung mit einem anderen Entwicklerantigen gibt. Dies resultiert in einer ineffizienten Verwendung teurer Antikörper- und Entwicklerantigen-Reagenzien.
Wegen der Einfachheit und Bequemlichkeit der homogenen turbidimetrischen und nephelometrischen Inhibitionsimmuntests für Haptene wäre es von Vorteil, über ein stabiles Entwicklerantigen zu verfügen, das in einfacher Weise mit konsistenten Eigenschaften hergestellt werden kann und eine lange Lagerlebensdauer bei Zimmertemperaturen besitzt. Es wäre auch von Vorteil, die Empfindlichkeit des NIIA zu verbessern und das Auftreten nicht-produktiver Bindung zu verringern.

3. Bifunktionale Konjugate nach dem Stande der Technik

Die britische Patentschrift 2029011 beschreibt die Insolubilisierung eines Pregnandiol-3-glucuronid/BSA/Östron-3- glucuronid-Konjugats unter Verwendung von an einer festen Phase befestigten Antikörpern. Immunochemistry (1975) 12(5), S. 379-382, beschreibt ein asymmetrisches bifunktionales Antigen mit einer maximalen Spacerlänge von 8 Å und ein symmetrisches bifunktionales Antigen mit einem Spacer von 24 Å. J. Experm. Medicine (1972) 135, S. 1228-1246, beschreibt die Verwendung eines asymmetrischen bifunktionalen Antigens mit einem Spacer von etwa 24 Å, jedoch erzeugte dieses Antigen eine Immunantwort sowohl gegenüber dem Hapten und dem Träger. Die europäische Patentschrift EP 0183901 beschreibt ein symmetrisches bifunktionales Haptenderivat.
Es gibt verschiedene andere kleinmolekulare bifunktionale Konjugate, die im Stande der Technik existieren. Unter der Bezeichnung "kleinmolekulares bifunktionales Konjugat" ist ein Konjugat zu verstehen, bei welchem zwei kleine Moleküle miteinander durch eine Spacergruppe verbunden sind. Die Spacergruppe kann so klein sein, daß sie nur eine chemische Bindung umfaßt (d. h. null Atome in dem Spacer). Allgemein haben diese Moleküle eine Größe in der Größenordnung von etwa 7000 Dalton oder kleiner. Beide Moleküle wirken als kleine Molekülliganden und sind als solche jedes zur Wechselwirkung mit einer Substanz fähig, welche eine spezifische Bindungsaffinität für das kleine Molekül besitzt, d. h. ihrem spezifischen Bindungspartner. Diese Definition schließt speziell Konjugate mit einem oder mehreren großen Molekül(en) und/oder Konjugate mit einer oder mehreren chemischen Gruppe(n), welche keine spezifischen Bindungspartner besitzen, aus. Beispielsweise wird der typische enzym-markierte Antikörper in einem Sandwich-Immuntest aus beiden Gründen ausgeschlossen; d. h. die Antikörpergruppe ist ein großes Makromolekül mit einer Größe in der Größenordnung von etwa 150.000 Dalton, und die Enzymgruppe, obwohl sie auf ein Substrat wirkt, wird im allgemeinen nicht als der spezifische Bindungspartner für das Substrat angesehen. Ausgeschlossen werden auch heterobifunktionale Quervernetzungsagenten mit zwei chemisch reaktiven Gruppen statt zwei kleinen Molekülliganden, einem an jedem Ende des Konjugats.
Es gibt zwei Klassen kleinmolekularer bifunktionaler Konjugate, die im Stande der Technik vorliegen. Die erste Klasse von Konjugaten, bekannt als das homobifunktionale Konjugat, verwendet identische chemische Gruppen an jedem Ende des Konjugats. Die homobifunktionalen Konjugate dienen allgemein dazu, die identischen spezifischen Bindungspartner, mit welchen jeweils jede chemische Gruppe wechselwirkt, zueinander zu bringen oder zu vereinigen. Falls der spezifische Bindungspartner polyvalent ist, können große Aggregate geformt werden.
Beispielsweise ist ein Bis-NAD-homobifunktionales Konjugat als Präzipitierungsmittel für Enzyme vorgeschlagen worden. Larsson, P. und Mosbach, K., Affinity Precipitation of Enzymes, Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 98:2, 333-330 (1979). Das Bis-NAD-Konjugat, welches zwei NAD- Gruppen enthält, die durch eine 17 Å Abstands-bzw. Spacergruppe getrennt sind, vermag das Enzym Lactatdehydrogenase (LDH) aus der Lösung auszufällen, durch spezifische Bindung an ein großes LDH-Molekül an beiden Enden des Bis-NAD. Da jedes große LDH- Molekül mehrfache Bindungsstellen für NAD besitzt, können große Aggregate, ähnlich wie sie in der Nephelometrie gebildet werden, erhalten werden. Diese großen Aggregate fallen aus der Lösung aus unter Mitnahme des Enzyms. Ähnliche Anwendungen von Bis- Nucleotiden mit unterschiedlichen Spacer-Längen wurden ebenfalls vorgeschlagen.
Ein anderes Beispiel eines homobifunktionalen Konjugats, das im Stande der Technik Anwendung gefunden hat, ist das zur Untersuchung der Struktur von Avidin verwendete Bis-Biotin- Konjugat. Green, N. M., Konieczny, L., Toms, E. J., und Valentine, R. C., The Use of Bifunctional Biotinyl Compounds to Determine the Arrangement of Subunits in Avidin, Biochemistry, 125, 781-791 (1971). Falls die beiden Biotingruppen des Bis-Biotin-Konjugats durch eine Spacergruppe von etwa 18 Å verbunden wurden, werden starke Komplexe oder Polymere mit dem multivalenten Makromolekül Avidin gebildet.
Die zweite Klasse von kleinmolekularen bifunktionalen Konjugaten nach dem Stande der Technik ist das heterobifunktionale Konjugat. Im Gegensatz zu dem homobifunktionalen Konjugat findet bei dem heterobifunktionalen Konjugat an den beiden Enden des Konjugats eine unterschiedliche chemische Gruppe Anwendung. Jede dieser chemischen Gruppen ist zur Wechselwirkung mit einem unterschiedlichen spezifischen Bindungspartner fähig. Diese heterobifunktionalen Konjugate nach dem Stand der Technik wurden fast ausschließlich als Modulatoren verwendet, bei welchen die Bindung eines spezifischen Bindungspartners an eine der chemischen Gruppen die gleichzeitige Bindung des entsprechenden spezifischen Bindungsparters an die andere chemische Gruppe behindert oder ausschließt. Die gleichzeitige Bindung an beiden Enden des heterobifunktionalen Konjugats wird durch sterische Behinderung ausgeschlossen, die gewöhnlich durch Verwendung kürzerer Spacer-Längen bewirkt wird, als sie zur Erzielung der gewünschten gleichzeitigen Bindung erforderlich wäre, wo homobifunktionale Konjugate wie oben beschrieben verwendet werden. Mit anderen Worten, die Bindung eines makromolekularen spezifischen Bindungspartners an die Modulatorgruppe des Konjugats verhindert sterisch die Bindung des spezifischen Bindungspartners für die chemische Gruppe, die für die Signalerzeugung verantwortlich ist.
Die heterobifunktionalen Konjugate nach dem Stande der Technik verwenden im allgemeinen einen interessierenden kleinen Molekülliganden, gewöhnlicherweise einen Analyten, als eine der chemischen Gruppen des Konjugats. Diese chemische Gruppe kann mit freiem Analyten, beispielsweise aus einer Testprobe, für eine begrenzte Menge an spezifischem Bindungspartner für den Analyten konkurrieren. Die andere chemische Gruppe des heterobifunktionalen Konjugats ist üblicherweise ein "Surrogat"-Marker, wie beispielsweise ein Enzymmodulator oder eine prosthetische Gruppe oder ein anderer Kofaktor für ein Enzym. Der Surrogatmarker moduliert die Aktivität des Indikatormarkers, gewöhnlich ein Enzym. Diese Arten von heterobifunktionalen Konjugaten nach dem Stande der Technik werden allgemein in homogenen Enzym-Immuntests verwendet, da der Aktivitätsgrad des Enzyms direkt durch die Antigen:Antikörper-Reaktion beeinflußt wird. Um das dem gebundenen Enzym zurechenbare Maß an Enzymaktivität gegenüber der dem freien Enzym zurechenbaren Aktivität zu bestimmen, ist kein Trennschritt erforderlich, wie bei heterogenen Enzym-Immuntests.
Der mit Enzym modulierte Immuntest beruht auf der Fähigkeit des heterobifunktionalen Konjugats aus dem kleinmolekularen Liganden und dem Enzymmodulator, die Aktivität des Indikatorenzyms zu beeinflussen. Vgl. beispielsweise US-Patentschrift 4134792, welche auch größere Surrogat-markierte Konjugate beschreibt. In diesem Fall ist die Spacergruppe zwischen der Ligandengruppe und der Enzymmodulatorgruppe verhältnismäßig kurz, vorzugsweise mit einer Länge in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Heteroatomen, d. h. etwa 1,3 bis etwa 14,0 Å.
Das heterobifunktionale Konjugat kleinmolekularer Ligand: Enzymmodulator steht in Konkurrenz mit Ligand aus einer Testprobe gegenüber einer begrenzten Menge Antikörper. Falls das heterobifunktionale Konjugat kleinmolekularer Ligand: Enzymmodulator an den Antikörper gebunden ist, d. h. durch die Ligandengruppe des Konjugats, kann der Enzymmodulator die Aktivität des Indikatorenzyms nicht beeinflussen. Es können Modulatoren, welche die Enzymaktivität des Indikatorenzyms erhöhen oder verringern, verwendet werden, jedoch werden üblicherweise Modulatoren verwendet, welche die Enzymaktivität verringern, d. h. Enzyminhibitoren. Bei Tests unter Verwendung eines Inhibitionsmodulators wird die beobachtete Enzymaktivität umgekehrt proportional der Konzentration des Analyten.
Ein ähnlicher Typ von homogenem Enzym-Immuntest beruht auf der Verwendung eines heterobifunktionalen Konjugats aus kleinmolekularem Liganden:Enzymkofaktor. In einem weiteren Sinn wirkt ein Enzymkofaktor als ein positiver Enzymmodulator, d. h. ein Modulator, der die Enzymaktivität erhöht. Allgemein können Enzyme in zwei Gruppen eingeteilt werden: (1) Enzyme, deren enzymatische Aktivität ausschließlich durch die Proteinnatur des Enzyms bedingt ist; und (2) Enzyme, bei denen die optimale Enzymaktivität von einer als Kofaktor bezeichneten wärmestabilen Nicht-Protein-Struktur abhängt. Immuntests unter Verwendung von Enzymen dieser zweiten Gruppe eignen sich für Modulation durch Verwendung eines heterobifunktionalen Konjugats aus kleinmolekularem Liganden: Enzymkofaktor.
Kofaktoren variieren ihrer Natur nach von einfachen anorganischen Ionen bis zu komplexeren organischen Materialien, von denen viele Derivate von Vitaminen wie beispielsweise Biotin und Flavinadenindinucleotid (FAD) sind. Die organischen Kofaktoren werden häufig als Koenzyme bezeichnet. In bestimmten Fällen, wie dies typisch bei prosthetischen Gruppen der Fall ist, ist der Kofaktor fest, gewöhnlich über eine kovalente Bindung, mit der Proteingruppe des Mutterenzyms verbunden, das ansonsten als solches einzeln als Apoenzym bezeichnet wird. In der klassischen Ausdrucksweise der Enzymologie wird der vollständige enzymatisch aktive Enzym:Kofaktor-Komplex als ein Holoenzym bezeichnet.
Reste bestimmter Kofaktoren wie beispielsweise FAD, Flavinmononucleotid (FMN), oder Häm ergeben z. B. besonders gute enzym-prosthetische Gruppen zur Verwendung in einem heterobifunktionalen Konjugat aus niedermolekularem Liganden: enzym-prosthetischer Gruppe. Vgl. beispielsweise das US- Patent Nr. 4238565, das auch größere surrogat-markierte Konjugate offenbart. In diesem Fall besitzt die Spacergruppe zwischen dem Ligandenteil und dem aus der enzym-prosthetischen Gruppe bestehenden Teil eine Länge von nicht mehr als 14 Kohlenstoffatomen und 0 bis 5 Heteroatomen, und zumeist 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Heteroatomen, d. h. eine Länge von etwa 1,3 bis etwa 14,0 Å.
Gemäß US-Patentschrift 4238565 konkurriert das heterobifunktionale Konjugat aus Ligand:prosthetischer Gruppe (beispielsweise Ligand:FAD) mit dem Liganden in einer Testprobe, bezüglich einer begrenzten Menge Antikörper. Falls das Konjugat Ligand:FAD durch den Antikörper gebunden wird, kann es nicht mehr mit dem Apoenzym unter Bildung eines enzymatisch aktiven Holoenzyms kombinieren. Die beobachtete Enzymaktivität steht in direkter Beziehung zu der Konzentration des in der Testprobe vorliegenden Analyten.
Die einzige Ausnahme von dieser modulatorartigen Anwendung des heterobifunktionalen Konjugats besteht auf dem Gebiete der säulenchromatographischen Reinigung. Eine Substanz kann durch Hindurchleiten einer die Substanz enthaltenden Lösung durch eine chromatographische Säule in einer von zwei Weisen gereinigt werden. Bei einer Reinigungsart enthält die Säule befestigte Gruppen, welche eine spezifische Bindung mit spezifischen Unreinheiten eingehen oder diese in anderer Weise aus der Lösung abziehen. Bei einer alternativen Reinigungsweise werden Gruppen, die spezifisch mit der zu reinigenden Substanz binden, auf bzw. an der Säule immobilisiert. Diese Gruppen ziehen die gewünschte Substanz aus der Lösung. Im letzteren Fall muß die Substanz später aus der Säule eluiert werden.
Die allgemeine Ligandenaffinitäts-Chromatographie folgt der letztgenannten Vorgangsweise und beruht auf dem Prinzip, daß ein einzelner immobilisierter Ligand eine Familie von Enzymen wie beispielsweise Dehydrogenasen oder Kinasen zu adsorbieren vermag, wobei das isolierte Enzym anschließend unter Bedingungen, welche eine biospezifische Eluation begünstigen, eluiert wird. Häufig wird ein Kofaktor oder ein Kofaktorfragment als der allgemeine Ligand verwendet.
Das insolubilisierte niedermolekulare heterobifunktionale Konjugat AMP-ATP ist zur Verwendung in der allgemeinen Ligandenaffinitäts-Chromatographie vorgeschlagen worden. Lee, C.-Y., Larsson, P. O., und Mosbach, K., Synthesis of the Bifunctional Dinucleotide AMP-ATP and its Application in General Ligand Affinity Chromatography, J. Solid Phase Biochem., 2 (1), 31-39 (1977). Die ATP-Gruppe (spezifisch für Kinasen) wird durch eine zuvor gebundene AMP- Gruppe (spezifisch für Dehydrogenasen) auf eine Säule von Sepharose 4B (quer vernetztes Agarose-Gel, Pharmacia, Uppsala, Schweden) aufgezogen. Es wurde berichtet, daß die ATP- und AMP-Gruppen ihr Affinitätsverhalten bezüglich Kinasen bzw. Dehydrogenasen beibehalten, selbst wenn beide durch die AMP-Gruppe an die Sepharosesäule gebunden sind. Ein Versuch zur Herstellung eines löslichen AMP-ATP-Dinucleotids hat sich als erfolglos erwiesen. Id.
Keines dieser bekannten bifunktionalen Konjugate nach dem Stande der Technik wurde auf nephelometrische oder turbidimetrische Testverfahren angewandt. Außerdem wurde überhaupt nur die Anwendung homobifunktionaler Konjugate bei der Bildung großer Komplexe angeregt, wie dies für die Nephelometrie oder Turbidimetrie erforderlich ist. Das homobifunktionale Konjugat eignet sich nur zur Verknüpfung gleicher Moleküle. Es wäre von Vorteil, über ein lösliches heterobifunktionales Konjugat zu verfügen, das zur Agglomeration ungleicher Makromoleküle befähigt wäre. Ein derartiges heterobifunktionales Konjugat wäre besonders zur Verwendung in NIIA-Tests geeignet.

4. Verwendung von Avidin und Biotin in Immuntests

Avidin und Biotin sind beide natürlich vorkommende Verbindungen. Avidin ist ein verhältnismäßig großes makromolekulares Protein und findet sich in Eiweißen. Avidin enthält vier Untereinheiten. Biotin ist ein relativ kleines, stabiles, wasserlösliches Vitamin. Jede der vier Untereinheiten eines Avidinmoleküls vermag eine spezifische Bindung mit einem Biotinmolekül einzugehen. Die Bindungsreaktion zwischen Avidin und Biotin ist sehr stark, mit einer Bindungskonstante von ca. 10¹&sup5; L/mol. Es wurde festgestellt, daß die sehr starke Natur dieser Bindung selbst dann erhalten bleibt, wenn Biotin mittels seiner Carboxylgruppe zu einer Konjugatbildung mit einem anderen Molekül gebracht wird, oder wenn Avidin an einem anderen Molekül angebracht ist. Bei Konjugatbildung von Biotin mit einem anderen Molekül wird das resultierende Konjugat gewöhnlich als eine biotinylierte Verbindung bezeichnet, beispielsweise ein biotinyliertes Protein. Ein biotinyliertes Protein kann beispielsweise rasch fest an ein entsprechendes an Avidin angebrachtes Molekül gebunden werden. Dieses Merkmal der Verkettung von biotinylierten Verbindung mit Avidinkonjugaten hat mit unterschiedlichem Erfolg Anwendung gefunden, zumeist in heterogenen Immuntests.
Zwei derartige Anwendungsfälle beziehen sich auf Sandwich- Immuntests. In einem Fall wird die Avidin:Biotin-Bindung am Markierungsende des Sandwichs angewandt. Dies ist aus der US-Patentschrift 4228237 ersichtlich, wo ein biotinylierter spezifischer Bindungspartner für den zu messenden Liganden in Konjunktion mit enzym-markiertem Avidin verwendet wird. In einem anderen Fall kann die Biotin:Avidin-Bindung am insolubilisierten Ende des in einem Sandwich-Immuntest gebildeten Sandwichs angewandt werden. So zeigt beispielsweise die US-Patentschrift 4298685 die Verwendung von insolubilisiertem Avidin, das gewöhnlich zugegeben wird, nachdem das markierte Sandwich in Lösung gebildet wurde. Falls der unmarkierte Antikörper des Sandwichs zuvor mit Biotin injiziert bzw. markiert wurde, vermag das insolubilisierte Avidin das markierte Sandwich aus der Lösung einzufangen. Diese Anwendungsfälle sind auf Nephelometrie oder Turbidimetrie nicht anwendbar. Außerdem macht der zur Herstellung von Reagenzien erforderliche zusätzliche Konjugationsschritt derartige Verfahren wirtschaftlich weniger attraktiv.
Avidin wurde auch in homogenen Immuntests als die Enzym- Modulator-Markierungskomponente eines größeren surrogatmarkierten Konjugats verwendet, das in ähnlicher Weise wie die zuvor behandelten heterobifunktionalen Konjugate aus niedermolekularem Liganden: Enzym-Modulator verwendet wird. Avidin ist der natürliche Inhibitor von biotin-haltigen Enzymen wie beispielsweise Pyruvatcarboxylase. Falls der Biotinteil dieser Enzyme blockiert ist, d. h. einen Komplex mit Avidin bildet, hört die Aktivität des Enzyms auf oder wird verringert. Dies deshalb, weil Biotin ein erforderlicher Kofaktor dieser Enzyme ist und daher, falls der Biotinteil nicht als Kofaktor zu fungieren vermag, die Enzymaktivität inhibiert wird. Avidin kann daher als eine Modulatormarkierung verwendet werden, infolge ihres Vermögens, die Aktivität von biotin-haltigen Enzymen zu modulieren oder zu steuern, was, falls es auf ein Substrat einwirken gelassen wird, ein meßbares Signal in bestimmten homogenen Immuntestsystemen liefert.
Die US-Patentschrift 4550075 beschreibt Avidin als die Modulatormarkierungskomponente eines größeren markierten Konjugats zur Anwendung in einem homogenen Immuntest. Das markierte Konjugat der US-Patentschrift 4550075 macht sich die große Molekulargröße von Avidin zunutze, das mit ca. 63000 Dalton wesentlich größer als die meisten Modulatormarkierungen, d. h. Enzyminhibitoren ist. Dies ermöglicht, daß Avidin ein Problem sterischer Behinderung vereinfacht, das typischerweise bei größeren surrogat-markierten Konjugaten auftritt. So ist beispielsweise bei Verwendung eines heterobifunktionalen Konjugats aus einem niedermolekularen Liganden: Enzym-Modulator die relativ kleine Größe des typischen niedermolekularen Enzym-Modulators vergleichbar mit der des Ligandenteils des Konjugats, und der Modulator kann daher in dem Test wirksam fungieren. Falls jedoch der Ligand viel größer als der übliche Enzym-Modulator ist, beispielsweise in Fällen, wo der Ligand ein Antigen ist, wird der typische Enzym-Modulator winzig im Vergleich zur Größe des Liganden, und die Aktivität der Modulatormarkierung wird sterisch inhibiert, selbst in Abwesenheit einer Bindung durch die Ligandenkomponente an ihren spezifischen Bindungspartner.
Dieses Problem sterischer Behinderung ist bis zu einem gewissen Grad in der zuvor genannten US-Patentschrift 4238565 behandelt, wo die Verwendung einer etwas längeren Spacer- Gruppe in Fällen angeregt wird, wo der Ligand ein größeres Molekül von relativ hohem Molekulargewicht ist. In jedem Fall dürfte die Spacer-Gruppe eine Länge von etwa 14 Kohlenstoffatomen und 0 bis 5 Heteroatomen nicht überschreiten. Das Ziel ist, daß eine sterische Behinderung nur auftreten soll, wenn die Ligandengruppe des Konjugats an ihren spezifischen Bindungspartner gebunden ist, nicht jedoch, solange die Ligandengruppe des Konjugats frei ist. Auf der anderen Seite macht die US-Patentschrift 4550075 Gebrauch von dem Unvermögen großer Liganden wie beispielsweise Antigene, die Aktivität des makromolekularen Enzym-Modulators Avidin zu behindern. Sterische Verhinderung tritt nur auf, solange die Ligandengruppe an ihren spezifischen Bindungspartner gebunden ist.
Von der Avidin:Biotin-Bindung wurde in nephelometrischen oder turbidimetrischen Verfahren kein Gebrauch gemacht, obwohl die hohe Spezifizität und die starke Natur der Bindung sie in solchen Verfahren erwünscht erscheinen ließe. Die einzige Verwendung von Avidin:Biotin in der Komplexbildung ist die zuvor erwähnte Verwendung von Bis-biotin zur Agglomeration von Avidin. Dieses Verfahren hat in der Nephelometrie oder Turbidimetrie keinen Nutzen. Es wäre daher vorteilhaft, die Avidin:Biotin-Bindung auf nephelometrische und turbidimetrische Testverfahren anzuwenden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung schafft ein neuartiges zweizähniges (bidentate) Konjugat, das sich zur Anwendung in einer Reihe verschiedener immunchemischer Verfahren zur Messung eines interessierenden Analyten eignet, insbesondere in Fällen, wo die Bildung großer Komplexe erforderlich oder erwünscht ist. Das Bidentat eignet sich besonders zur Verwendung in nephelometrischen und turbidimetrischen Verfahren. Das zweizähnige Konjugat (bidentate conjugate) der vorliegenden Erfindung ist im wesentlichen ein lösliches niedermolekulares heterobifunktionales Konjugat, das gleichzeitige Bindung und letztlich große Komplexe zu bilden vermag. Näherhin ist das zweizähnige Konjugat ("bidentate conjugate") oder Bidentat ein lösliches heterobifunktionales Konjugat mit zwei unterschiedlichen niedermolekularen Liganden, oder Bidentatgliedern, deren jedes spezifische Bindungen an ein verschiedenes Makromolekül einzugehen vermag. In Fällen, wo die Bildung großer Komplexe erwünscht ist, müssen die Makromoleküle polyvalent sein. Die Bidentatglieder sind miteinander über einen geeigneten Spacer-Abschnitt verknüpft, derart daß jeweils jedes Bidentatglied gleichzeitig eine Bindung mit seinem entsprechenden spezifischen Bindungspartner bilden kann.
In Fällen, wo das Bidentat zur Verwendung in einem nephelometrischen oder turbidimetrischen Verfahren vorgesehen ist, wird das erste Glied des Bidentats so gewählt, daß es identisch mit oder analog dem interessierenden Analyten ist. Das zweite Bidentatglied ist der niedermolekulare Ligandenteil eines Partnerpaars aus einem Liganden:spezifischen Bindungspartner. Der Ligand kann beispielsweise Biotin sein, wenn Avidin der spezifische Bindungspartner ist. In Gegenwart des spezifischen Bindungspartners für den Liganden (beispielsweise Avidin, wenn Biotin der Ligand ist) und Antikörper für den interessierenden Analyten wirkt das Bidentat als Verknüpfung zur Bildung von streuenden Komplexen. Falls Avidin der spezifische Bindungspartner ist, wird jeweils jedes Avidinmolekül vorzugsweise mit zwei Bidentaten eine Bindung über das Biotinglied jedes Bidentats eingehen, während das verbleibende Glied jedes Bidentats an Antikörper bindet.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 veranschaulicht ein Inhibitions-Immuntestverfahren unter Verwendung einer spezifischen Ausführungsform des zweizähnigen oder Bidentat-Konjugats der vorliegenden Erfindung.
Fig. 2 gibt schematisch die Synthese eines Bidentat- Konjugat-I-Homologen wieder.
Fig. 3 veranschaulicht schematisch die Synthese eines Bidentat-Konjugat-II-Homologen.
Fig. 4 veranschaulicht die Auswirkung der Spacer-Länge auf das Vermögen beider Glieder des Bidentat-Konjugats zur gleichzeitigen Bindung an ihre spezifischen Bindungspartner.
Fig. 5 veranschaulicht die Auswirkung der Spacer-Länge auf die Empfindlichkeit eines NIIA unter Verwendung eines speziellen Ausführungsbeispiels des Bidentat-Konjugats der vorliegenden Erfindung.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung sollen für die folgenden Bezeichnungen die folgenden Definitionen gelten, soweit nichts anderes angegeben:
Ligand: das kleinere Molekül in einem Komplex oder Konjugat, in welchem das kleinere Molekül eine spezifische Bindung mit einem größeren Molekül oder einer Substanz eingeht. Der Ligand kann in natürlicher Weise vorliegen, oder er kann artifiziell manipuliert sein.
Spezifischer Bindungspartner: das größere Molekül oder die Substanz in einem Komplex oder Konjugat, in welchem der spezifische Bindungspartner eine spezifische Bindung mit einem kleineren Molekül eingeht. Der spezifische Bindungspartner besitzt eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß anderer Substanzen. Der spezifische Bindungspartner kann natürlicherweise auftreten oder artifiziell manipuliert. Beispielsweise umfaßt diese Definition Antikörperfragmente.
Ligandanalog: ein Analogon des Ligandenmoleküls, das eine Bindung mit dem spezifischen Bindungspartner des Liganden bilden kann, ganz in der gleichen Weise wie der Ligand. Der Terminus "Ligand" in der hier verwendeten Weise soll allgemein Ligandanaloge und immunchemisch äquivalente Materialien umfassen.
Niedermolekularer Ligand: ein Ligand mit einer Größe von weniger als etwa 7000 Dalton. Der niedermolekulare Ligand kann ein Stück oder Fragment eines größeren Liganden wie beispielsweise eines Antigens sein. In Fällen, wo der niedermolekulare Ligand ein Antigenfragment ist, muß das Fragment von dem Antikörper zu dem Antigen mit dem gleichen oder einem ähnlichen Affinitätsgrad erkannt werden, den der Antikörper für das ganze Antigen besäße.
Makromolekül: ein größeres Molekül oder eine Substanz mit einer Größe von mehr als 10.000 Dalton.
Gleichzeitige Bindung: das Vermögen beider Bidentatglieder des gleichen Bidentats, zu gleicher Zeit an ihre spezifischen Bindungspartner gebunden zu sein. Die Bindung eines spezifischen Bindungspartners kann tatsächlich zeitlich vor der Bindung an den anderen spezifischen Bindungspartner erfolgen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neuartiges zweizähniges oder Bidentatkonjugat geschaffen. Unter der Bezeichnung zweizähniges oder Bidentatkonjugat wird ein lösliches niedermolekulares heterobifunktionales Konjugat mit zwei chemischen Gruppen oder Bidentatgliedern verstanden, welche als niedermolekulare Liganden wirken und über einen geeigneten Spacer-Abschnitt verbunden sind. Die beiden niedermolekularen Liganden vermögen jeder jeweils eine spezifische Bindung mit einem verschiedenen Makromolekül einzugehen. Spezielle Beispiele niedermolekularer Liganden, die in dem Bidentat der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen unter anderem: Hormone wie beispielsweise Insulin, Steroidhormone und Thyroidhormone; Polypeptide; Oligonucleotide; Vitamine wie beispielsweise B&sub1;&sub2;, Folsäure und Biotin; sowie Haptene wie beispielsweise 1-substituiertes-2,4-Dinitrobenzol (auch als Dinitrophenol oder DNP bekannt) sowie Arzneimittel einschließlich dem Bronchodilator Theophyllin.
Aus Gründen der Klarheit werden die zweizähnigen oder Bidentatglieder als ein erstes Bidentatglied und ein zweites Bidentatglied bezeichnet. Die ersten und zweiten Bidentatglieder sind gewöhnlich der Ligandenteil eines Paars niedermolekularer Ligand:spezifischer Bindungspartner. Zwei bevorzugte Paare von niedermolekularem Liganden:spezifischem Bindungspartner sind Hapten:Antikörper und Biotin:Avidin. Andere Beispiele von Paaren niedermolekularer Ligand: spezifischer Bindungspartner sind unter anderen: Hormon:Rezeptor; Polypeptid:Antikörper; Oligonucleotid: komplementäre DNA oder RNA; Vitamin&sub1;&sub2;: Intrinsicfaktor; Folat:Folat bindendes Protein; sowie Insulin:Anti-Insulin.
Es wurde überraschend gefunden, daß ein derartiges lösliches niedermolekulares heterobifunktionales Konjugat verhältnismäßig einfach synthetisiert und zur Verknüpfung von zwei ungleichen Makromolekülen verwendet werden kann. Des weiteren wurde in Fällen, wo die makromolekularen spezifischen Bindungspartner der betreffenden zweizähnigen oder Bidentatglieder jeweils polyvalent sind, die ungewöhnliche Bildung großer Komplexe, und zwar gebildet durch das niedermolekulare heterobifunktionale Konjugat, beobachtet. Die lösliche Natur des Bidentats der vorliegenden Erfindung verbessert sehr die Reaktionskinetik über ein gebundenes bifunktionales Konjugat.
In Fällen, wo das Bidentat zur Verwendung in einem nephelometrischen oder turbidimetrischen Testverfahren vorgesehen ist, wird das erste Bidentatglied so gewählt, daß es identisch oder analog einem interessierenden Analyten, gewöhnlicherweise einem Hapten, ist, der in einer Testprobe vorliegen kann. Notwendig ist dabei, daß das erste Bidentatglied mit freiem Analyten bezüglich dem gleichen spezifischen Bindungspartner, gewöhnlich einem Antikörper, zu konkurrieren vermag. Vorzugsweise ist der Analyt monovalent. Das Bidentat gemäß der vorliegenden Erfindung eignet sich besonders vorteilhaft zur Verwendung in nephelometrischen oder turbidimetrischen Inhibitions-Tests, wo der interessierende Analyt Hapten oder ein Analoges hiervon mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 100 und 1500 Dalton ist. Das zweite zweizähnige oder Bidentatglied ist der Ligandenteil eines Paars aus niedermolekularem Liganden: spezifischem Bindungspartner. Der spezifische Bindungspartner muß polyvalent sein, damit sich große Komplexe bilden. Vorzuziehen ist, daß der spezifische Bindungspartner divalent ist. Die letztgenannte Gruppe umfaßt ganze Antikörper und F(ab')&sub2;-Fragmente.
Die Synthese des Bidentats gemäß der vorliegenden Erfindung ist verhältnismäßig einfach, sobald das erste und das zweite Bidentatglied ausgewählt sind. In Fällen, wo das Bidentat zur Verwendung in einem nephelometrischen, turbidimetrischen oder anderweitigen damit konkurrierenden Typ von Testverfahren vorgesehen ist, werden die Bidentatglieder vorzugsweise wie oben angegeben gewählt. Falls anderweitige Verwendungen beabsichtigt sind, werden gewöhnlich als erstes zunächst die spezifischen Bindungspartner der Bidentatglieder gewählt. Dies sind die Substanzen, die vorzugsweise miteinander verknüpft werden sollen. Das erste und das zweite Bidentatglied werden sodann als die entsprechenden niedermolekularen Liganden gewählt, welche eine spezifische Bindung mit den zuvor gewählten größeren spezifischen Bindungspartnern eingehen.
Im Stande der Technik sind viele Verfahren zum Verknüpfen der Glieder eines bifunktionalen Konjugats durch eine Abstands- oder Spacergruppe bekannt. Vgl. beispielsweise die US-Patentschriften 4134792, US 4238565 sowie Green, N. M., Konieczny, L., Toms, E. J., und Valentine, R. C., The Use of Bifunctional Biotinyl Compounds to Determine the Arrangement of Subunits in Avidin, Biochem. J., 125, 781-791 (1971). Diese Verfahren beinhalten im allgemeinen typische Kondensations-, Additions- und Substitutionsreaktionen zwischen chemischen Gruppen, die gegebenenfalls vor derartigen Reaktionen aktiviert werden können.
In den folgenden Beispielen sind verschiedene Konjugationsverfahren angegeben. Es ist im allgemeinen zweckmäßig, wenn das angewandte Verfahren die Einfügung einer Verbindung umfaßt, die eine in einer Reihe von Homologen in einer speziellen Verbindungsklasse ist. Beispielsweise enthält die Alkandiamin- (NH&sub2;-(CH&sub2;)N-NH&sub2;)-Klasse von Verbindungen Äthandiamin (N = 2), Propandiamin (N = 3), Butandiamin (N = 4), Pentandiamin (N = 5) usw. Wo das Syntheseverfahren die Einfügung einer dieser Homologen umfaßt, können unschwer andere Homologen substituiert werden, um die Kettenlänge des die beiden Glieder des Bidentats verbindenden Abstandsglieds zu variieren.
Die jeweilige spezielle chemische Zusammensetzung der Abstandsgruppierung wird zu einem gewissen Grad von der Natur der an den betreffenden Bidentatgliedern zum Anschluß der Abstandsgruppierung verfügbaren chemischen Stellen abhängen. In der Abstandsgruppierung könnnen zusätzlich zu Kohlenstoffatomen typische Heteroatome einschließlich Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor verwendet werden. Im allgemeinen wird die Abstandsgruppierung aliphatisch sein, wenngleich aromatische Gruppen involviert sein können. In der typischen divalenten Kette, wobei Einzelbindungen unter Verwendung von Kohlenstoff, Stickstoff oder Sauerstoff in die Abstandsgruppierung eingebaut sein können, darf angenommen werden, daß jeweils jedes derartige Atom die Länge der Abstandsgruppierung um etwa 1,2 bis etwa 1,5 Å erhöht.
Das jeweilige spezielle Verfahren zur Verknüpfung der Bidentatglieder miteinander durch die Abstands-oder Spacergruppierung ist nicht kritisch. Wichtig ist, daß beide Bidentatglieder ihr Vermögen zur effektiven Bindung mit ihren spezifischen Bindungspartnern nach der Synthese des Bidentats beibehalten. Diese Überlegung kann die jeweilige spezielle für die Verbindung mit der Spacergruppierung gewählte chemische Stelle beeinflussen. Gewöhnlich ist es erwünscht, die aktive Stelle oder Stellen des speziellen Bidentatglieds, an welcher die spezifische Bindungsreaktion stattfinden kann, weitestmöglich zugänglich zu halten.
Es hat sich ergeben, daß die Länge der die Bidentatglieder verbindenden Spacergruppierung besondere Bedeutung für die Regelung des Vermögens beider Bidentatglieder zur gleichzeitigen Bindung mit ihren betreffenden spezifischen Bindungspartnern hat. Falls beispielsweise die Spacergruppierung zwischen den Bidentatgliedern verhältnismäßig kurz ist, wird sterische Behinderung die gewünschte gleichzeitige Bindung inhibieren oder sie sogar verhindern. Zu sterischer Behinderung kommt es in Fällen, wo ein bifunktionales Konjugat eine relativ kurze Abstands- bzw. Spacerlänge aufweist und die spezifischen Bindungspartner der Glieder des bifunktionalen Konjugats sehr groß sind. So hat beispielsweise, wie oben erwähnt, Avidin ein Molekulargewicht von ca. 63.000 Dalton, während der typische Antikörper ein Molekulargewicht von etwa 150.000 Dalton besitzt. Falls eines dieser Makromoleküle an ein bifunktionales Konjugat mit einer kurzen Abstandsgruppierung gebunden ist, kann möglicherweise das andere Molekül nicht gleichzeitig mit dem gleichen bifunktionalen Konjugat binden, wie dies der Fall bei bekannten modulierten Tests nach dem Stande der Technik mit heterobifunktionalen Konjugaten ist. Falls eine große Komplexbildung erwünscht ist, kann auch dies inhibiert werden.
Die erforderliche Mindestabstandslänge, um die gleichzeitige Bindung von zwei homobifunktionalen Konjugatgliedern mit ihren betreffenden spezifischen Bindungspartnern zu ermöglichen, kann nach einem von mehreren bekannten Verfahren bestimmt werden. Vgl. beispielsweise Larsson, P. O., und Mosbach, K., Affinity Precipitation of Enzymes, Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 98 (2), 333-338 (1979), und Green, N. M., Konieczny, L., Toms, E. J., und Valentine, R. C., The Use of Bifunctional Biotinyl Compounds to Determine the Arrangement of Subunits in Avidin, Biochem. J., 125, 781-791 (1971). Ähnliche Verfahren können zur Bestimmung der für die gleichzeitige Bindung zweier Bidentatglieder erforderlichen Mindestspacerlänge verwendet werden. In Fällen, wo das Bidentat gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in einem Konkurrenz-Test vorgesehen ist, wobei das Signal als Folge gleichzeitiger Bindung durch das Bidentat erzeugt wird, kann die zur Erzielung gleichzeitiger Bindung erforderliche Mindestabstandslänge unter den identischen letztlich gewünschten Testbedingungen, jedoch in Abwesenheit von freiem konkurrierendem Analyten bestimmt werden. Unter diesen Bedingungen wird die Länge der Spacergruppierung erhöht, bis erstmals ein meßbares Signal beobachtet wird. Dies ist die Mindestabstandslänge. Der bedeutsame Gesichtspunkt besteht darin, daß das angewandte Verfahren eine Möglichkeit zum Nachweis der Bindungswirkung bietet.
Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Mindestabstandslänge besteht in der Anwendung herkömmlicher nephelometrischer oder turbidimetrischer Verfahren. Diese Verfahren sind brauchbar in Fällen, wo das Bidentat zur Bildung großer Komplexe verwendet werden kann, d. h. von Komplexen, die genügend groß sind, um Streuzentren zu bilden, selbst wenn dies nicht der letztlich beabsichtigte Verwendungszweck eines speziellen Bidentats ist. Dieses Verfahren ist nur anwendbar, wenn polyvalente spezifische Bindungspartner für beide Bidentatglieder verfügbar sind. Näherhin werden Bidentate, die sich nur bezüglich ihrer Abstandslänge unterscheiden (auch als Homologe bezeichnet), in Kontakt mit ihren betreffenden multivalenten spezifischen Bindungspartnern gebracht. Eine beobachtbare Komplexbildung stellt sich mit der Mindestlänge der Abstandsgruppe ein, die noch eine gleichzeitige Bindung zuläßt. Die optimale Mindestspacerlänge wird gewöhnlich etwas größer als die minimale Spacerlänge sein. Das Ausmaß der Komplexbildung wird jedoch im allgemeinen innerhalb weniger Kohlenstoffatome oder Heteroatome von der Mindestabstands- bzw.-spacerlänge ein Plateau erreichen.
In Fällen, in denen das Bidentat gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in einem NIIA-Test vorgesehen ist, kann die Empfindlichkeit des NIIA auch leiden, falls die Spacergruppierung zwischen den Bidentatgliedern zu lange ist. Dies tritt beispielsweise in Fällen auf, wo das zweite Bidentatglied an ein Makromolekül wie beispielsweise Avidin bindet, das mehr als zwei Bindungsstellen für das zweite Bidentatglied besitzt. In einem solchen Fall kann es bei der größeren Abstandslänge dazu kommen, daß mehr als zwei Bidentate jeweils an jedes Makromolekül gebunden werden können.
Nimmt man Avidin als Beispiel, so gibt es vier verfügbare Biotinbindungsstellen an dem Avidinmolekül. Diese Bindungsstellen treten in Paaren auf, wobei jeweils beide Bindungsstellen eines Paars in relativ enger Nachbarschaft an einer Seite des Moleküls vorliegen. Falls die Spacerlänge des Bidentatkonjugats im richtigen Bereich liegt, wird das Bidentat infolge sterischer Hinderung nur mit einer Bindungsstelle des an der gleichen Seite des Avidinmoleküls vorliegenden Paars zu binden vermögen. Je größer jedoch die Abstandslänge des Bidentats ist, um so weiter entfernt wird der (an dem einen Ende des Bidentats gebundene) Antikörper von dem (am anderen Ende des Bidentats gebundenen) Avidinmolekül sein. Schließlich wird ein Punkt erreicht, wo die Spacerlänge genügend groß ist, um die Bindung eines zweiten Bidentats an eine Avidin-Bindungsstelle benachbart einem Bindungsstellenpaar, an welchem zuvor ein erstes Bidentat gebunden wurde, zu ermöglichen.
Es wird vorgezogen, jeweils nur eine Bindungsstelle jedes Bindungsstellenpaars an dem Avidinmolekül zu nutzen, d. h. insgesamt zwei Bindungen pro Avidinmolekül, um lineare Aggregate ausreichender Länge zu bilden, daß sie sich zu Streukomplexen falten. Auf diese Weise kann ein freies Analytmolekül eine Unterbrechung im Wachstum des linearen Aggregats bewirken, indem es im wesentlichen das erste Bidentatglied verdrängt, das ansonsten mit seinem polyvalenten spezifischen Bindungspartner, gewöhnlich einem Antikörper, binden würde, um schließlich Streukomplexe zu bilden. In Fällen, wo beide Bindungsstellen eines Paars an einer Seite des Avidinmoleküls besetzt sind, werden zwei freie Analytmoleküle benötigt, um die gleiche Unterbrechung im Wachstum des linearen Aggregats zu bewirken.
Im optimalen Bereich ist die Spacerlänge des Bidentats zur Verwendung in einem NIIA einerseits lang genug, um die gleichzeitige Bindung der betreffenden Bindungspartner sowohl mit den ersten wie mit den zweiten Bidentatgliedern zu ermöglichen, jedoch wiederum kurz genug, um zu verhindern, daß jeweils jedes derartige Bidentat mit mehr als zwei Bindungsstellen an einem einzigen spezifischen Bindungspartner bindet.
Das Bidentat gemäß der vorliegenden Erfindung ist den in NIIA-Tests verwendeten Entwicklerantigenen nach dem Stande der Technik überlegen. Das Bidentat ist eine gereinigte organische Chemikalie, die bei Zimmertemperatur über Jahre bestehen kann. Sie ist auch einfach herzustellen, zu reinigen und zu charakterisieren, und die Kosten einer Qualitätskontrolle sind minimal im Vergleich zu Entwicklerantigenen nach dem Stande der Technik. Das Bidentat eliminiert auch das im Stande der Technik bestehende Problem nicht-produktiver Bindung, da jedes Bidentat jeweils nur eine Haptengruppierung aufweist. Auf diese Weise kann jeweils nur ein Arm eines Antikörpers mit einem speziellen Bidentat binden.
Ein NIIA-Test unter Verwendung des Bidentats gemäß der vorliegenden Erfindung gleicht den NIIA-Tests nach dem Stande der Technik nur bezüglich des vorbereitenden Schritts der Antikörpererzeugung. In beiden Fällen werden zunächst Antikörper zu dem interessierenden Analyten erzeugt, indem man in ein Lebewesen ein mit einer Mehrzahl von Analytmolekülen konjugiertes Trägerprotein injiziert, wie in Fig. 1A veranschaulicht, wo der interessierende Analyt ein Hapten ist.
Der so gegen einen interessierenden Analyten erzeugte Antikörper wird mit dem Analyt:Ligand-Bidentat der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht, zusammen mit spezifischem Bindungspartner für den Liganden, und der Testprobe. Die Wechselwirkung zwischen diesen Reagenten kann in einem beliebigen geeigneten Reaktionsgefäß stattfinden. Falls nur wenig oder kein freier Analyt in der Testprobe vorliegt, reagiert das Bidentatkonjugat mit verfügbarem Antikörper und spezifischem Bindungspartner für das zweite Bidentatglied unter Bildung von Streukomplexen. Diese Reaktion ist in Fig. 1B veranschaulicht, wo ein Hapten der interessierende Analyt wie auch das erste Bidentatglied ist, Antikörper der spezifische Bindungspartner für das erste Bidentatglied ist, Biotin der Ligand oder das zweite Bidentatglied ist, und Avidin der spezifische Bindungspartner für das zweite Bidentatglied ist.
In Gegenwart von freiem Analyten hingegen wird das Ausmaß der Komplexbildung durch die Bindung von freiem Analyten an den verfügbaren Antikörper inhibiert, wie in Fig. 1C veranschaulicht. Und zwar kommt es hierzu, weil anders als das Analyt:Ligand-Bidentatkonjugat freier Analyt nicht mit dem spezifischen Bindungspartner für den Liganden zu binden vermag, um die Verknüpfung mit Antikörper zur Bildung von Streukomplexen herbeizuführen. Die Signalmenge, gemessen als Anzeige des Grads der Streukomplexbildung, ist umgekehrt proportional zu der in einer Testprobe vorliegenden Menge an freiem Analyten.
Aus Gründen der Klarheit wird eine detaillierte Diskussion nur bezüglich der Synthese und Anwendung verschiedener Theophyllin-Biotin-Bidentate gegeben. Selbstverständlich erkennt man, daß ähnliche Syntheseverfahren und NIIA-Verfahren für andere Haptene als Theophyllin bei Vorgangsweise nach dem gleichen allgemeinen Verfahren ebenso gut funktionieren. Beispiele von Arzneimitteln, die in einem NIIA unter Verwendung des Bidentats gemäß der vorliegenden Erfindung wirksam getestet werden können, sind unter anderem therapeutische Arzneimittel wie beispielsweise Digoxin, Disopyramid, Lidocain, Procainamid, Propanolol, Quinidin, Amykamycin, Chloramphenicol, Gentamicin, Kanamycin, Netilmycin, Tobramycin, trizyklische Antidepressiva, Äthosuximid, Phenobarbital, Phenytoin, Primidon, Valproinsäure, Acetaminophen, Acetylsalicylsäure, Methotrexat, Morphin, Codein und Heroin und ihre Stoffwechselprodukte. Beispiele anderer Haptene, die unter Verwendung des Bidentatkonjugats getestet werden können, sind unter anderem DNP, 1-substituiertes-4-Hydroxy-2- nitrobenzol und 4-substituierte-2-Nitrotrialkylanilinium- Salze. Der interessierende Analyt wird vorzugsweise als eines der Bidentatglieder verwendet, während das andere Bidentatglied ein davon verschiedener niedermolekularer Ligand wie beispielsweise Biotin ist.
Zur Veranschaulichung der Wirkung der Länge der Spacergruppierung wurden (in jeder Hinsicht bis auf die Spacergruppenlänge identische) Homologe von zwei verschiedenen Theophyllin-Biotin-Bidentatkonjugaten synthetisiert und unter nephelometrischen Bedingungen ausgewertet. Der Übersichtlichkeit halber werden die beiden Bidentatkonjugate im folgenden als Bidentatkonjugat I und Bidentatkonjugat II bezeichnet. Das Bidentatkonjugat II unterscheidet sich von dem Bidentatkonjugat I dadurch, daß es benachbart der Theophyllingruppierung ein Kohlenstoffatom besitzt, statt dem der Theophyllingruppe benachbarten Stickstoffatom im Bidentatkonjugat I. Die Synthese beider Konjugate beinhaltet die Einfügung eines Diamins zwischen der Theophyllingruppierung (erstes Bidentatglied) und der Biotingruppierung (zweites Bidentatglied) des Bidentats. Die Kettenlänge der Abstandsgruppierung des Bidentats kann durch Wahl eines speziellen Diamins für den Syntheseprozeß variiert werden. Im speziellen Fall wird die Abstandslänge von der biologisch aktiven alizyklischen Ringstruktur von Biotin aus gemessen, wobei der 5 Kohlenstoffe umfassende aliphatische Schwanz in den Spacer-bzw. Abstandsteil einbezogen wird. Ein ähnliches Syntheseverfahren kann zur Herstellung anderer Bidentate, einschließlich anderer Hapten-Biotin-Bidentate, verwendet werden.
Zunächst können primäre Aminderivate von Theophyllin aus im Handel verfügbaren Ausgangs-Theophyllinderivaten hergestellt werden, als erster Schritt in dem Syntheseverfahren. Andere Verfahren können zur Herstellung primärer Aminderivate anderer Haptene verwendet werden. Für die Herstellung des Bidentatkonjugats I wird ein Überschuß eines Diamins im Rückfluß mit dem Ausgangsderivat 8-Bromtheophyllin reagiert. Dies findet im allgemeinen unter einer Stickstoffatmosphäre während einer Zeitdauer von 2 bis 72 Stunden statt, je nach dem speziellen gewählten Diamin, und führt zu dem Produkt I.
Zur Herstellung des Bidentatkonjugats II müssen Carbonyldiimidazol (CDI) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) verwendet werden, zur Aktivierung der Carboxylgruppe des Ausgangsderivats Theophyllin-8-buttersäure, bevor das gewählte Diamin eingeführt werden kann. Die Aktivierung wird in der Weise ausgeführt, daß man Theophyllin-8-buttersäure in wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) auflöst, mit nachfolgender Erhitzung auf etwa 70 C und nachfolgender Zugabe einer äquimolaren Menge CDI. Die Reaktionstemperatur muß, üblicherweise etwa 15 Minuten lang, bei etwa 70 C gehalten werden, bevor sie auf Zimmertemperatur zurückgekühlt wird. Anschließend wird eine äquimolare Menge NHS zu dem abgekühlten Reaktionsgemisch zugegeben und über Nacht bei Zimmertemperatur umgerührt. Zu dem aktivierten Reaktionsgemisch kann ein Überschuß Diamin zugegeben werden. Hierdurch wird das Produkt II erhalten.
Der Abschluß der das erforderliche Primäraminderivat ergebenden Reaktion kann durch eine Dünnschichtchromatographie- (TLC)-Analyse des Reaktionsgemischs I oder des Reaktionsgemischs II bestimmt werden, unter Verwendung von mit Silicagel und einem UV-Indikator überzogenen TLC-Platten.
Die Reaktionsgemische müssen sodann unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft werden, wobei die konzentrierten Reaktionsgemische mittels herkömmlicher Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung eines Chloroform:Methanol- Gradientengemischs gereinigt werden. Die die reinen primären Aminderivate von Theophyllin enthaltenden Eluatfraktionen werden vereinigt und in einem Rotations-Eindampfer zur Trockene eingedampft. Die bei der Eindampfung erhaltenen weiß-gelblichen kristallinen Festsubstanzen können ohne weitere Reinigung für die nächste Reaktion verwendet werden. Theophyllinmonoaminderivate haben ein molares Absorptionsvermögen von etwa 1,9 x 10³ bei 295 nm in Methanol.
Zur Herstellung des Biotin-Theophyllin-Konjugats I löst man die die primären Aminderivate von Theophyllin aus dem Reaktionsgemisch I enthaltenden kristallinen Festsubstanzen in wasserfreiem DMF und mischt sie sodann in dem aktivierten N-Hydroxysuccinimidester von Caproamidobiotin (Biotin-X-NHS), wie schematisch in Fig. 2 veranschaulicht ist. Primäre Aminderivate anderer Haptene können in ähnlicher Weise mit Biotin-X-NHS oder einer anderweitigen, eine verfügbare aktivierte Carboxylgruppe enthaltenden chemischen Gruppierung kondensiert werden. Diese Lösung wird ebenfalls über Nacht bei Zimmertemperatur umgerührt. Das Biotin-Theophyllin- Konjugat II wird in ähnlicher Weise hergestellt, mit dem Unterschied, daß die die primären Aminderivate von Theophyllin aus dem Reaktionsgemisch II enthaltenden kristallinen Feststoffe mit dem N-Hydroxysuccinimidester von Biotin (Biotin- NHS) gemischt werden, wie in Fig. 3 veranschaulicht. In beiden Fällen scheiden sich die gewünschten Produkte gewöhnlich aus DMF als weiße, flockige Feststoffe ab. Das Produkt kann auf Filterpapier gesammelt und in einem TLC-Test entweder mittels präparativer Dünnschichtchromatographie oder Säulenchromatographie auf einen einzigen Fleck gereinigt werden.
Die Bidentatkonjugat-Homologen können in der Nephelometrie oder unter anderweitigen Testbedingungen zur Bestimmung optimaler Abstandslänge verwendet werden. Die optimale Mindestabstandslänge variiert nicht nennenswert mit unterschiedlichen Anteilen von Bidentat, Avidin und Biotin. Ferner gelten im allgemeinen die gleichen Mindestabstandslängendaten in Fällen, wo andere Haptene als Theophyllin als eines der Glieder eines Hapten-Biotin-Bidentatkonjugats verwendet werden, wenngleich eine gewisse kleine Variation beobachtet werden kann, infolge der größeren Variation in Größe und Form der spezifischen Bindungspartner dieser Liganden, verglichen mit Avidin. Bei Einbau anderer niedermolekularer Liganden als Biotin als eines der Bidentatglieder kann ein etwas größeres Maß von Schwankung erwartet werden. Nichtsdestoweniger ergibt eine Untersuchung des Theophyllin-Biotin-Bidentats ausreichende Daten betreffend die Mindestspacerlänge, um als Ausgangsbasis für die Synthese einer beliebigen Anzahl von Bidentaten zu dienen.

Beispiel I

Synthese des Bidentatkonjugats I

Die Synthese des Bidentatkonjugats I unter Verwendung von Hexandiamin (N = 6) als Variable zur Einfügung in den Abstandsteil ist schematisch in Fig. 2 veranschaulicht. Das N=6-Homologe des Bidentatkonjugats I wurde in der folgenden Weise hergestellt:
Ein Überschuß von Hexandiamin (NH&sub2;-(CH&sub2;)&sub6;-NH&sub2;) wurde im Rückfluß mit 8-Bromtheophyllin unter einer Stickstoffatmosphäre 24 Stunden lang behandelt. Das Ende der Rückflußreaktion wurde durch TLC-Analyse des Reaktionsgemischs bestimmt, unter Verwendung von mit Silicagel und einem UV-Indikator überzogenen TLC-Platten.
Das Reaktionsgemisch wurde sodann unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft. Das konzentrierte Reaktionsgemisch wurde mit einer kleinen Menge Silicagel gemischt und auf einer heißen Platte getrocknet; sodann wurde das Silicagel- Proben-Gemisch sorgfältig auf das obere Ende einer Silicagel-Säule aufgegeben, unter Verwendung von Chloroform als Ausgangseluant. Die Säule wurde mit unterschiedliche Mengen Methanol in Chloroform enthaltendem Lösungsmittel eluiert. Sobald die Gradientenzusammensetzung 20 % Methanol in Chloroform erreichte, wurde die Säule mit einem 20 % Methanol, 4 % Ammoniak und 76 % Chloroform enthaltenden Gemisch eluiert. Die das reine N-(8-Theophyllin)-6-aminohexylamin enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und in einem Rotations-Eindampfer zur Trockene eingedampft. Die weiß-gelblichen kristallinen Feststoffe wurden ohne weitere Reinigung für die nächste Reaktion verwendet.
Äquimolare Mengen des N-(8-Theophyllin)-6-aminohexylamin in Form kristalliner Festsubstanzen wurden in wasserfreiem DMF gelöst, sodann mit der entsprechenden molaren Menge von Biotin-X-NHS gemischt und bei Zimmertemperatur etwa 24 Stunden lang in Umrührung gehalten. Die gewünschten Produkte schieden sich als weiße flockige Festsubstanz aus DMF ab und wurden auf Filterpapier gesammelt und in einem TLC-Test durch Säulenchromatographie auf einen einzigen Fleck gereinigt.
Die Kettenlänge der Spacergruppierung wird durch das zur Verwendung in der Synthese des Bidentats gewählte Diamin (NH&sub2;-(CH&sub2;)N-NH&sub2;) bestimmt. Wenn beispielsweise Hexandiamin für den ersten Syntheseschritt gewählt wurde, so ergibt dies einen Beitrag von 6 Kohlenstoffatomen zu der Kettenlänge der Abstandsgruppe, wie in Fig. 2 veranschaulicht. In diesem Fall beträgt die ungefähre Länge der Spacergruppierung 26,0 Å. Die durch Einfügung unterschiedlicher Diamine in das Spacerglied des Bidentatkonjugats I erhaltene Kettenlinie, bei Anwendung eines ähnlichen Verfahrens wie zur Herstellung des N=6-Homologen, ist in der Tabelle I gezeigt. Tabelle I Länge der Abstandsgruppe in Bidentatkonjugat-I- Homologen Diamin Gesamtzahl von Atomen in dem Spacerglied Ungefähre Spacergliedlänge (Å)

Beispiel 2

Abschätzung der Wirkung der Abstandsgruppe auf die Wirksamkeit des Bidentatkonjugats

Nach Herstellung der in der Tabelle I angegebenen Reihe von Bidentatkonjugaten wurden die Konjugate unter nephelometrischen Bedingungen abgeschätzt, um die Wirkung der Abstands-bzw. Spacerlänge auf die durch ein bestimmtes Bidentatkonjugat erzeugte Signalgröße zu bestimmen.

A. Mindest-Abstandsgliedlänge

Die minimale Abstandsgliedlänge wurde durch Messung der Größe (Änderungsgeschwindigkeit) des jeweils von jedem der in Tabelle I aufgeführten Konjugate in Gegenwart von Anti- Theophyllin-Antikörper und Avidin erzeugten Signals bestimmt. Dies ist die gleiche Reaktion wie in Fig. 1B veranschaulicht. Hierbei wurde kein freies Theophyllin zur Inhibierung von Komplexbildung zugegeben, wie dies in einem wie in Fig. 1C veranschaulichten NIIA der Fall wäre. Zweck dieser Messungen war einfach die Bestimmung der minimalen Abstandsgliedlänge für eine optimale Bindung bei stöchiometrischen Anteilen von Bidentat, Antikörper und Avidin.
Die Reagenten wurden wie folgt hergestellt: Monoklonaler Antikörper gegen Theophyllin wurde im Verhältnis 1:13:3 in ICS-Verdünnungsmittel (Beckman Instruments, ICS Reagent) verdünnt. Von der Firma Böhringer Mannheim erhältliches Avidin wurde in ICS-Verdünnungsmittel bei einer Konzentration von 0,13 mg/ml gelöst. Unterschiedlich verdünnte Lösungen der einzelnen in Tabelle I aufgeführten Bidentatkonjugate wurden in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 5,5, gelöst.
Nephelometrische Messungen wurden an einem ICS-Nephelometer (Beckman Instruments) vorgenommen, indem 600 ul ICS-Puffer (Beckman Instruments, ICS Reagent) in eine ICS-Viole (Beckman Instruments) eingebracht und 42 ul Antikörperlösung und 42 ul Avidinlösung injiziert wurden. Nach Abklingen des Injektions-Stoßes und Erreichen der Basislinie wurden 42 ul des Bidentatkonjugats zugegeben und das Instrument zur Registrierung des Spitzen-Änderungsgeschwindigkeitssignals ausgelöst.
Die Ergebnisse für N = 2 bis N = 8 sind in Fig. 4 wiedergegeben. In Fig. 4 entsprechen die Einheiten auf der horizontalen Achse der Bidentatkonzentration, auf der Grundlage des Absorptionsvermögens bei 295 nm. Die Einheiten auf der vertikalen Achse sind ICS-Änderungsgeschwindigkeitseinheiten, wie sie unter Verwendung der ICS Manual Mode Card M 33 (Beckman Instruments) erhalten wurden. Für hohe Änderungsgeschwindigkeitssignale oberhalb 2000 Einheiten wurde die ICS-Karte mit niedrigerer Verstärkung verwendet und die Ergebnisse für Verstärkung M33 berechnet.
Wie aus Fig. 4 ersichtlich, ergab das niedrigste Homologe des Bidentatkonjugats I (N = 2) mit 17 Bindungen (16 Atomen) zwischen dem Theophyllinringkohlenstoff und dem alizyklischen Ringkohlenstoff von Biotin keine meßbare Komplexbildung. Das nächsthöhere Homologe (Bidentatkonjugat I, N = 3) begann eine meßbare Komplexbildung zu zeigen. Die höheren Homologen (N = 4 bis N = 8) erzeugten entsprechend höhere Signale, bis bei N = 8 ein Plateau erreicht war. Dies zeigt, daß eine Mindestabstands-bzw.-spacerlänge von etwa 22,2 Å erforderlich ist, um ein Signal zu erlangen, wenn Theophyllin als erstes Bidentatglied und Biotin als das zweite Bidentatglied verwendet wird. Optimalerweise sollte die Abstandsgliedlänge wenigstens etwa 23,5 Å (Bidentatkonjugat I, N = 4) betragen.

B. Maximale Abstandsgliedlänge

Die maximale Abstands-bzw.Spacergliedlänge wurde durch Messung der Größe (Änderungsgeschwindigkeit) des von den in Tabelle I aufgeführten Bidentatkonjugat-I-Homologen mit N = 4 bis N = 8 erzeugten Signals bestimmt, unter den lnhibitionsbedingungen, wie sie typischerweise in einem NIIA auftreten.
Das Testverfahren wurde in ähnlicher Weise wie oben in Teil A von Beispiel 2 dargelegt durchgeführt, mit dem Unterschied, daß die Konzentrationen der Bidentatkonjugate konstant gehalten wurden, statt die Konzentrationen jedes Bidentatkonjugats jeweils zu variieren, wie dies in Teil A zur Bestimmung der Mindestspacergliedlänge geschah. Die einzelnen Bidentatkonjugate wurden jeweils in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, gelöst und weiter so verdünnt, daß ihr Absorptionsvermögen bei 295 nm 0,136 betrug. Der Wert 0,136 des Absorptionsvermögens wurde aus Teil A von Beispiel 2 gewählt, als bei oder nahe dem Punkt, bei welchem ein maximales Änderungsgeschwindigkeitssignal beobachtet wurde; d. h. die Bidentatkonzentration, bei welcher maximale Komplexbildung auftrat. Statt fester wurden veränderliche Mengen freies Theophyllin zugegeben, um die schematisch in Fig. 1C dargestellte Inhibition zu bewirken.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Fig. 5 dargestellt. Jeder Punkt auf der in Fig. 5 gezeigten Kurve gibt die Spitzenänderungsgeschwindigkeit wieder, wie sie für ein jeweiliges spezielles Bidentatkonjugat-Homologes in Gegenwart von Anti-Theophyllin-Antikörper, Avidin und einer gegebenen Menge Theophyllin erhalten wurde. Die höchste Spitzenänderungsgeschwindigkeit wurde in Abwesenheit des Analyten, d. h. in anderen Worten bei 0,00 ug/ml Theophyllin erhalten. Die in Abwesenheit von Analyt erhaltene Spitzenänderungsgeschwindigkeit ist die unter den Parametern des Tests maximal erzielbare Spitzenänderungsgeschwindigkeit und wird als 100 % des Spitzenänderungsgeschwindigkeitssignals gesetzt. In Gegenwart von freiem Analyten wird die Spitzenänderungsgeschwindigkeit inhibiert. Mit zunehmenden Mengen freiem Hapten oder Analyt nimmt das Ausmaß der Inhibierung zu und das Spitzenänderungsgeschwindigkeitssignal ab.
Die größte Empfindlichkeit des Theophyllin-NIIA wurde bei Verwendung des Bidentatkonjugat-I-Homologen mit N = 4 erhalten. Die Empfindlichkeit entspricht dem Ausmaß der Änderung im Spitzenänderungsgeschwindigkeitssignal, wie sie durch eine gegebene Konzentration an freiem Analyten bewirkt wurde. Eine Konzentration von 0,10 ug/ml freiem Theophyllin vermochte bei Verwendung des N=4-Homologen einen Abfall von ca. 50 % in dem maximalen Spitzenänderungsgeschwindigkeitssignal hervorzurufen. Bei Verwendung der Homologen mit N = 5 oder N = 6 wurde ein 50-%iger Abfall in dem maximalen Spitzenänderungsgeschwindigkeitssignal erst bei Zugabe einer Konzentration von ca. 0,30 ug/ml freiem Theophyllin zu dem System erreicht. Die Homologen entsprechend N = 7 und N = 8 zeigten eine Empfindlichkeit vergleichbar der von NIIA-Tests nach dem Stande der Technik unter Verwendung herkömmlicher Entwicklerantigene, d. h. es mußten ca. 0,50 ug/ml Theophyllin dem System zugesetzt werden, bevor eine 50-%ige Signalabnahme gemessen wurde. Es wurde gefunden, daß sämtliche Bidentatkonjugat-I-Homologen mit N = 4 bis N = 8 in einem NIIA unter den in diesem Experiment untersuchten Testbedingungen zufriedenstellend arbeiteten, jedoch erwies sich das Homologe mit N = 4 als überlegen hinsichtlich Empfindlichkeit und zeigte eine ausgeprägte Verbesserung gegenüber der Empfindlichkeit von NIIA-Tests nach dem Stande der Technik. Die Homologen entsprechend N = 5 und N = 6 ergaben ebenfalls überlegene Ergebnisse. Es wird angenommen, daß bei Anwendung unterschiedlicher Anteile von Bidentat, Antikörper und Avidin sowie bei Variierung anderer Testbedingungen eine gewisse geringfügige Änderung in der festgestellten optimalen maximalen Abstandsgliedlänge auftreten wird.

Beispiel 3

Bidentatkonjugat I in NIIA auf Theophyllin

Es wurde ein typischer NIIA-Test auf Theophyllin unter Verwendung des Bidentatkonjugat-I-Homologen mit N = 6 durchgeführt. Der Test wurde unter ähnlichen Bedingungen wie in Teil B von Beispiel 2 durchgeführt.
Die Reagenten wurden wie folgt hergestellt: Monoklonaler Antikörper gegen Theophyllin wurde im Verhältnis 1:13,3 in ICS-Diluent (Beckman Instruments, ICS Reagent) verdünnt. Von der Firma Böhringer Mannheim erhältliches Avidin wurde in ICS-Verdünnungsmittel mit einer Konzentration von 0,13 mg/ml gelöst. Das Bidentatkonjugat wurde in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 5,5, gelöst und dann weiter so verdünnt, daß seine optische Dichte bei 295 nm 0,136 betrug. ICS Drug Calibrator (Beckman Instruments, ICS Reagent) mit einem Gehalt von 10 ug/ml Theophyllin wurde in ICS-Verdünnungsmittel in Verhältnissen von 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:60, 1:80, 1:100, 1:200, 1:400, 1:600 und 1:1000 verdünnt.
An einem ICS-Nephelometer (Beckman Instruments) wurden nephelometrische Messungen vorgenommen, indem man 600 ul ICS-Puffer (Beckman Instruments, ICS Reagent) in eine ICS- Viole (Beckman Instruments) einbrachte und 42 ul Drug Calibrator oder Blankprobe, 42 ul Antikörperlösung und 42 ul Avidinlösung injizierte. Es wurde eine Instrumentverstärkungseinstellung gemäß Manual Mode M33 angewandt. Nach Abklingen des Injektionsstoßes und Erreichen der Basislinie wurden 42 ul des Bidentatkonjugats zugegeben und das Instrument zur Aufzeichnung des Spitzenänderungsgeschwindigkeitssignals ausgelöst. Die Ergebnisse sind in Tabelle II wiedergegeben. Tabelle II Drug Calibrator Änderungsgeschwindigkeitseinheiten (Mittelwert aus 3 Messungen) Prozent der maximalen Spitzenänderungsgeschwindigkeit Verdünnung Konzentration (ug/ml) Blank

Beispiel 4

Synthese von Bidentatkonjugat II

Zur Bestätigung der mit dem Bidentatkonjugat I erhaltenen Ergebnisse und zur Veranschaulichung eines alternativen Syntheseverfahrens wurde ein zweites Bidentatkonjugat hergestellt. Die Synthese von Bidentatkonjugat II unter Verwendung von Hexandiamin als Variable zur Einfügung in das Abstands- bzw.-Spacerglied ist schematisch in Fig. 3 veranschaulicht. Das N=6-Homologe von Bidentatkonjugat II wurde in der folgenden Weise hergestellt:
Theophyllin-8-buttersäure wurde in wasserfreiem DMF gelöst, sodann auf etwa 70 C erhitzt, mit anschließender Zugabe einer äquimolaren Menge von CDI. Die Reaktionstemperatur wurde etwa 15 Minuten lang bei etwa 70 C gehalten und sodann auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen. Zu dem abgekühlten Reaktionsgemisch wurde eine äquimolare Menge NHS zugesetzt und bei Zimmertemperatur über Nacht in Umrührung gehalten. Sodann wurde zu dem Reaktionsgemisch ein ca. drei- bis sechsmolarer Überschuß von Hexandiamin (H&sub2;N-(CH&sub2;)&sub6;-NH&sub2;) zugegeben. Der Abschluß der Reaktion wurde mittels TLC-Analyse des Reaktionsgemischs bestimmt, unter Verwendung von mit Silicagel und einem UV- Indikator überzogenen TLC-Platten.
Das Reaktionsgemisch wurde sodann unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft. Das konzentrierte Reaktionsgemisch wurde mit einer kleinen Menge Silicagel gemischt und auf einer heißen Platte getrocknet, worauf das Silicagel-Probengemisch sodann sorgfältig auf das obere Ende einer Silicagel-Säule aufgegeben wurde, unter Verwendung von Chloroform als Anfangseluant.Die Säule wurde mit unterschiedliche Mengen Methanol in Chloroform enthaltendem Lösungsmittel eluiert. Sobald die Gradientenzusammensetzung 20 % Methanol in Chloroform erreichte, wurde die Säule mit einem 20 % Methanol, 4 % Ammoniak und 76 % Chloroform enthaltenden Gemisch eluiert. Die das reine 6-(8'-Theophyllinbuttersäurecarboxamido)-hexylamin enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und in einem Rotations-Eindampfer zur Trockene eingedampft. Weiß-gelbliche kristalline Feststoffe wurden ohne weitere Reinigung für die nächste Reaktion verwendet.
Eine äquimolare Menge des 6-(8'-Theophyllinbuttersäurecarboxamido)-hexylamin wurde in wasserfreiem DMF gelöst, sodann mit der entsprechenden molaren Menge Biotin-NHS gemischt und bei Zimmertemperatur etwa 24 Stunden lang in Umrührung gehalten. Die gewünschten Produkte wurden aus dem DMF als weiße, flockige Feststoffe abgetrennt, auf Filterpapier gesammelt und in einem TLC-Test mittels präparativer Dünnschichtchromatographie zu einem einzigen Fleck gereinigt.
Das Homologe mit N = 5 des Bidentatkonjugats II wurde nach dem gleichen Verfahren hergestellt, mit dem Unterschied, daß anstelle von Hexandiamin Pentandiamin verwendet wurde. Die Spacergliedlängen für diese beiden Homologen sind in der Tabelle III wiedergegeben. Tabelle III Länge der Abstandsgruppierung in der Homologreihe des Bidentatkonjugats II Diamin Gesamtzahl von Atomen im Spacerglied Ungefähre Spacergliedlänge (Å)
Das N=2-Homologe von Bidentatkonjugat I ist äquivalent dem N=5-Homologen von Bidentatkonjugat II (21,0 Å). Die N=3- und N=6-Homologen von Bidentatkonjugat I bzw. II sind ebenfalls äquivalent (22,2 Å). Das N=5-Homologe der zweiten Reihe ergab wie das N=2-Homologe der ersten Reihe keine meßbare Komplexbildung. Vergleichbare Signale wurden jedoch für das N=6-Homologe von Bidentatkonjugat II und das N=3-Homologe von Bidentatkonjugat I erhalten. Dies bekräftigt, daß eine Abstandsgruppe von wenigstens 22,2 Å erforderlich ist, um eine gleichzeitige Bindung beider Bidentatglieder mit ihren spezifischen Bindungspartnern zu erzielen, wenn Theophyllin und Biotin als das erste bzw. zweite Bidentatglied gewählt werden.
Andere Typen von Bidentatkonjugaten mit anderen Bidentatgliedern und unterschiedlichen Atomen und Atomsequenzen in der Abstandsgruppierung werden als im Rahmen der Erfindung liegend angesehen und sind für den Fachmann ersichtlich. Das Bidentat gemäß der vorliegenden Erfindung eignet sich zur Anwendung in jedem Test oder Verfahren, wo die gleichzeitige Bindung beider Bidentatglieder erforderlich oder erwünscht ist. Die optimale Länge der Abstandsgruppierung kann in einfacher Weise unter Verwendung nephelometrischer oder turbidimetrischer Verfahren bestimmt werden, falls multivalente spezifische Bindungspartner verfügbar sind.

Claims

1. Lösliches zweizähniges (bidentate) Konjugat, das ein erstes zweizähniges Glied aufweist, welches über einen Abstandsabschnitt bzw. eine Abstandsgruppe mit einem zweiten zweizähnigen Glied verbunden ist, wobei:

(a) das genannte erste zweizähnige Glied ein Ligand von weniger als 7000 Dalton ist, der eine spezifische Bindung mit wenigstens einem löslichen Bindungspartner zu bilden vermag; das genannte zweite zweizähnige Glied ein Ligand von weniger als 7000 Dalton ist, der eine spezifische Bindung mit wenigstens einem löslichen, nicht-immunologischen Bindungspartner einzugehen vermag, wobei das erste zweizähnige Glied von dem zweiten zweizähnigen Glied verschieden ist;

und

(b) der genannte Abstandsabschnitt bzw. -gruppe eine Länge von wenigstens etwa 22 Å besitzt.

2. Zweizähniges Konjugat nach Anspruch 1, wobei das genannte erste zweizähnige Glied eine Bindung mit wenigstens einem löslichen, nicht-immunologischen Bindungspartner zu bilden vermag.

3. Zweizähniges Konjugat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei welchem das genannte erste zweizähnige Glied identisch mit oder analog einem interessierenden Analyten ist.

4. Zweizähniges Konjugat nach Anspruch 3, bei welchem der genannte interessierende Analyt aus Haptenen, Hormonen, Polypeptiden, Oligonucleotiden und Vitaminen gewählt ist.

5. Zweizähniges Konjugat nach Anspruch 1, bei welchem das genannte erste zweizähnige Glied ein Hapten mit einem Molekulargewicht von 100 bis 1.500 Dalton ist.

6. Zweizähniges Konjugat nach Anspruch 5, bei welchem das genannte Hapten gewählt ist aus Theophyllin, Digoxin, Disopyramid, Lidocain (Lignocain), Procainamid, Propanolol, Quinidin, Amykamycin, Chloramphenicol, Gentamicin, Kanamycin, Netilmycin, Tobramycin, tricyclische Antidepressiva, Äthosuximid, Phenobarbital, Phenytoin, Primidon, Valproinsäure, Acetoaminophen, Acetylsalicylsäure, Methotrexat, Morphin, Codein, Heroin oder die Metaboliten von Morphin, Codein und Heroin, Dinitrophenol (DNP), ein 1-substituiertes-4-Hydroxy-2-Nitrobenzol, oder ein 4-substituiertes-2-Nitrotrialkyl-Anilinsalz.

7. Zweizähniges Konjugat nach Anspruch 1, wobei das genannte zweite zweizähnige Glied aus Haptenen, Hormonen, Polypeptiden, Oligonucleotiden und Vitaminen gewählt ist.

8. Zweizähniges Konjugat nach Anspruch 1, wobei das genannte erste zweizähnige Glied ein Vitamin ist.

9. Zweizähniges Konjugat nach Anspruch 1, wobei das genannte erste zweizähnige Glied ein Hapten und das genannte zweite zweizähnige Glied aus Hormonen, Polypeptiden, Oligonucleotiden und Vitaminen gewählt ist.

10. Zweizähniges Konjugat nach Anspruch 9, wobei das genannte erste zweizähnige Glied Theophyllin ist.

11. Zweizähniges Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das genannte zweite zweizähnige Glied Biotin ist.

12. Zweizähniges Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei von dem genannten ersten oder zweiten zweizähnigen Glied eines mit einem löslichen divalenten spezifischen Bindungspartner gebunden ist.

13. Reagenz zur Verwendung in einem turbidimetrischen oder nephelometrischen Inhibitions-Immun-Testverfahren umfassend einen Antikörper für einen interessierenden Analyten und ein zweizähniges Konjugat wie in einem der Ansprüche 1 bis 12 definiert.

14. Reagenz nach Anspruch 13, wobei von dem genannten ersten oder zweiten zweizähnigen Glied eines mit einem löslichen divalenten spezifischen Bindungspartner gebunden ist.

15. Reagenz nach Anspruch 14, wobei in dem zweizähnigen Konjugat das zweite Glied Biotin ist und das genannte Reagenz des weiteren Avidin enthält.

16. Reagenz nach Anspruch 15, wobei in dem zweizähnigen Konjugat das erste Glied Theophillin ist und das genannte Reagenz des weiteren Anti-Theophillin-Antikörper aufweist.

17. Inhibitions-Immun-Testverfahren umfassend:

(a) Kontaktieren einer Testprobe mit einem vermuteten Gehalt an einem interessierenden Analyten, mit einem zweizähnigen Konjugat wie in einem der Ansprüche 2 bis 12 definiert; einem spezifischen Bindungspartner für den genannten interessierenden Analyten; sowie einem zweiten löslichen spezifischen Bindungspartner;

und

(b) Nachweis von Komplexbildung zur Bestimmung des Vorliegens des genannten Analyten in der genannten Testprobe.

18. Verfahren nach Anspruch 17, bei welchem das genannte zweizähnige Konjugat das zweizähnige Konjugat aus Anspruch 12, der genannte erste spezifische Bindungspartner ein Antikörper, und der genannte zweite spezifische Bindungspartner Avidin sind.