DE69121849T2

DE69121849T2 - Bindung von Liganden an Gold

Info

Publication number: DE69121849T2
Application number: DE69121849T
Authority: DE
Inventors: Yung-Ao Hsieh; Brian Layne Shigekawa
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1990-12-05
Filing date: 1991-12-01
Publication date: 1997-02-06
Anticipated expiration: 2011-12-02
Also published as: FI102417B; IE75725B1; FI915727A0; GR3021262T3; EP0489465A2; ZA919526B; IE914180A1; US5294369A; KR0163790B1; KR920012918A; DE69121849D1; ES2095291T3; EP0489465A3; FI915727A; US5384073A; CA2056843A1; JPH06116602A; FI102417B1; ATE142341T1; DK0489465T3

Description

Die Erfindung betrifft mit Alkanthiol und Alkanthiolderivaten beschichtetes Gold-Sol, durch das Gruppen auf dem Sol für die Bindung oder Haftung von bindenden Anteilen, wie Antikörper, Antigene oder Liganden, an das Gold-Sol verfügbar gemacht werden. Zusätzlich erleichtert die Verwendung von an das Gold-Sol gebundenen Di- und Tri-thiol- Verbindungen die passive Adsorption dieser bindenden Antei le. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Gold-Sol, das mit thiolierten bindenden Anteilen beschichtet ist, wie Antigene, Antikörper oder Trägermoleküle, die an passende Liganden angebracht werden können. Die Erfindung beinhaltet ebenfalls das Verfahren zur Beschichtung der Gold-Solen mit den erwähnten Thiol-Verbindungen, die Verwendung von beschichteten Gold-Sole in immunologischen und immunocytologischen Diagnosetests sowie Testgarnituren, die solches beschichtetes Gold-Sol enthalten.
Die Testmethoden zur Diagnose verschiedenster Erkrankungen werden laufend verbessert. Zur Zeit gehoren immunologische Tests zu den zuverlässigsten Methoden zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern in Proben. Solche Methoden sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Immundiagnose gut bekannt. Im Allgemeinen ist ein immunologischer Test ein Test, in dem ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper verwendet wird, um ein Antigen in der Probe einzufangen und bei dem ein zweiter Antikörper mit einer Markierung, wie eine fluoriszierende Verbindung oder ein Enzym, immunchemisch mit dem Antigen-Antikörper-Komplex reagiert. Der daraus hervorgehende markierte Antikörper-Antigen-Komplex wird nachgewiesen. Variationen dieses Grundtests sind gut bekannt, wie die Verwendung von nur einem reaktionsfähigen Antikörper im Test oder die kompetitive Inhibitionsmethode oder die Verwendung von Partikeln als Markierungen, welche das Ablesen der Agglutinationsreaktion erlauben. Eine weitere Variante besteht darin, Mikropartikel, die entweder mit einem Antigen oder einem Antikörper beschichtet sind, zu verwenden, die nach der Bildung eines Komplexes mit dem Analyten und einem zweiten geeignet markierten Bindungspartner eine positive Reaktion ergeben.
Gold-Sol-Mikropartikel werden in einer Testmethode verwendet, die als Sol-Partikel-Immunassay" (SPIA) bekannt ist. In diesem Test wird eine das mit einem geeigneten Bindungspartner (entweder ein Antikörper oder ein Antigen) beschichtete Gold-Sol enthaltende Lösung mit einer Probe umgesetzt, um das Gold-Sol mit seinem Bindungspartner zu verbinden. Während diesem Verfahren bilden sich Komplexe, die nachgewiesen werden können, üblicherweise aufgrund ihrer Farbänderung Unbeschichtete Gold-Sol-Partikel, wie auch andere Kolbide, agglomerieren, wenn si? einer niedrigen Salzkonzentration ausgesetzt werden und fallen schnell aus der Lösung aus. Deshalb dient die Beschichtung von Gold-Sol mit einem geeigneten Bindungspartner zwei Funktionen. Einerseits wird eine geeignete immunologische Bindungsaktivität erreicht und andererseits findet ein Schutz vor Agglomeration statt, die in Pufferlösungen, die der Optimierung immunologischer Reaktionen dienen, unweigerlich auftreten würden. Da nicht alle Proteine oder Polymere das Gold-Sol vollständig vor salzinduzierter Agglomeration schützen können, wird üblicherweise eine Deck-Beschichtung mittels eines Proteins oder eines Polymers, das dafür bekannt ist, das Gold-Sol vollständig vor salzinduzierter Agglomeration schützen zu können, angebracht. Eine solche Deck-Beschichtungsstufe ist ein bekanntes Verfahren zur Adsorption von Antikörpern und Antigenen an Plastiksubstrate, und es ist erwiesen, dass dadurch die Stabilisierung des beschichteten Materials erhöht wird.
Die Deck-Beschichtung dient ebenfalls der Verringerung unspezifischer Interaktionen zwischen dem Gold-Sol und den Komponenten der Probe. Bei der Verwendung von mit Antikörpern beschichteten Latexpartikeln in Diagnose-Tests erweist sich diese unspezifische Interaktion als grosse Schwierigkeit und ist wahrscheinlich ein Zeichen für die unspezifische Seruminterferenz, wie sie in vielen, wenn nicht in allen immunologischen Tests, unabhängig vorn Format, auftreten. In gewissen Fällen ist es möglich, das Deck- Beschichtungs-Protein- oder Polymer auszuwechseln, um die Interferenz in spezifischen Systemen zu minimieren. Zusatzstoffe wie Guanidin-hydrochlorid oder Harnstoff im Solmedium sind nützlich. Manchmal kann "unspezifische" Interferenz einer serumsheterophilen Aktivität zugeschrieben werden und wird durch die Zugabe von ganzem Tierserum eliminiert.
Auf dem Gebiet der passiven Adsorption des gewünschten Verbindungspartners an Goldkolloid bedeutete die Tatsache, dass ein solches direktes Beschichten oft nicht erfolgreich ist, einen gravierenden Rückschlag. Die physikalischchemischen Mechanismen der passiven Polymeradsorption an Kolbide ist im allgemeinen ein wenig verstandener Vorgang. Passive Adsorption von Antikörpern an Gold-Sol kann zu einem beschichteten Sol führen, das schlecht vor salzinduzierter Agglomeration geschützt ist und durch späteres Deck-Beschichten nicht weiter geschützt werden kann. Sie kann aber auch zu einem beschichteten Sol mit geringer immunologischer Aktivität, möglicherweise infolge unrichtiger Orientierung des adsorbierten Antikörpers, oder zur antikörper-induzierten Agglomeration des Sols selbst führen. Schliesslich kann es auch ganz einfach sein, dass sich der ausgewählte Bindungspartner nicht an das Gold-Sol bindet. Aus diesen Problemen muss der klare Schluss gezogen werden, dass nur wenige in anderen diagnostischen Verfahren nützliche biologische Reagenzien auch für die Herstellung von Goldkolloidreagenzien vpn diagnostischer Qualität verwendet werden können.
Es braucht also ein Verfahren zur kovalenten Bindung von Bindungspartnern - Proteinen, Kohlenhydraten oder Liganden - an das Gold-Sol, mit dem Ziel, die Unsicherheiten der Charakteristiken der passiven Adsorption oder die Notwendigkeit, für die passive Adsorption Bindungspartner und "gute Beschichtungs"-Träger-Konjugate herstellen zu müssen, zu eliminieren. Ein solches Gold-Sol wäre vor allem von viel grösserem Nutzen, wenn es sogar in Abwesenheit eines beschichteten Bindungspartners gegen salzinduzierte Agglomeration widerstandsfähig wäre. Die Fähigkeit, die physikalisch-chemischen Oberflächeneigenschaften des Sols zu ändem, würde es gleichzeitig ermöglichen, die für unspezifische Interferenzen in immunchemischen Diagnose-Tests verantwortlichen, manchmal undefinierten Probe-Sol-Interaktionen sowie Hintergrundprobleme in immuncytochemischen Tests zu minimieren.
Was es ebenfalls braucht, ist die Möglichkeit, die passive Adsorption biologischer Polymere an Gold-Sole zu erleichtern. Wie die erhöhte Resistenz gegen salzinduzierte Agglomeration gezeigt hat, kann die Thiolierung von Antikörpern und Polymeren deren Fähigkeit, sich an Gold-Sole zu binden, steigern. Diese Fähigkeit könnte sich als nützlich für jene Antikörper herausstellen, die sich zwar gut mit Gold-Solen verbinden, dabei jedoch einen grossen Teil ihrer Aktivität verlieren, sowie für Antikörper, die sich in nicht derivatisiertem Zustand einfach nicht mit Gold-Sol binden. Eine andere Möglichkeit, die physikalisch-chemischen Charaktenstiken der Sol-Oberfläche zur Erleichterung der Antikörper- Bindung zu verändern, liegt in der Sol-Beschichtung mit Dithiol- oder Trithiolverbindungen. Eine solche Zwischenbeschichtung kann die Eigenschaften der passiven Adsorption von Antikörpern an das beschichtete Sol in signifikanter Weise verändern.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Beschichtung von Gold-Sol-Mikropartikeln mittels Alkanthiolen, Alkanthiolderivaten und Di- und Trithiolverbindungen. Mit Alkanthiol oder deren Derivaten beschichtete Gold-Sole sind gegen salzinduzierte Agglomeration resistent und enthalten chemische Teile zur kovalenten Polymer- oder Liganden-Bindung. Man erhält ein spezielles hydrophobhydrophiles Gleichgewicht der Sol-Oberfläche, und unspezifische Interaktionen zwischen Sol und Proteinen werden im allgemeinen minimiert. Vor allem zum n-Alkanthiol-Teil distale chemische Gruppen, wie Methyl, Hydroxyl, Carboxyl, Amino, Sulfhydryl oder Carbonyl, sind dem Lösungsmittel ausgesetzt und dienen als kovalente Bindungsstellen und können Stellen hydrophob-hydrophilen Gleichgewichts sein.
Durch die Beschichtung des Gold-Sols mit Di- und Trithiolverbindungen von geringem Molekulargewicht wird das Sol zwar nicht vor salzinduzierter Agglomeration geschützt, jedoch wird die physikalisch-chemische Natur der beschichteten Sol-Oberfläche verändert und die passive Adsorption von Antikörper-Molekülen erleichtert.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls das beschichtete Gold-Sol. Ausserdem umfasst die Erfindung auch beschichtete Gold-Sol-Partikel, die zusätzlich an bindende Teile, wie Antikörper oder Antigene, gebunden sind, sowie die genannten Gold-Sol-Partikel enthaltende Diagnostik- Garnituren.
Schliesslich umfasst die Erfindung auch beschichtete Gold- Sole, an die durch Adsorption bindende Teile gebunden sind, sowie unbeschichtetes Gold-Sol, bei dem die Adsorption durch die Thiolierung des bindenden Teils erleichtert ist.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 zeigt die relative Beständigkeit gegen salzinduzierte Gold-Sol-Agglomeration, erhalten durch Beschichtung des Gold-Sols mit anti-gpl6o Antikörper (GC-143), in verschiedenen Konzentrationen und bei unterschiedlichen pH- Werten.
Figur 2 zeigt die relative Beständigkeit in verschiedenen Konzentrationen und bei unterschiedlichen pH-Werten gegen salzinduzierte Gold-Sol-Agglomeration, die erreicht wurde, indem ein TTC-beschichtetes Gold-Sol mit anti-gp160 Antikörper (GC-143) beschichtet wurde.
Figur 3 zeigt die Fähigkeit von GC-143, in Abwesenheit jeglichen zugegebenen Salzes eine spontane Agglomeration eines Gold-Sols hervorzurufen, in verschiedenen Konzentrationen und bei unterschiedlichen pH-Werten.
Figur 4 zeigt die Fähigkeit von GC-143, in Abwesenheit jeglichen zugegebenen Salzes eine spontane Agglomeration eines TTC-beschichteten Gold-Sols hervorzurufen, in verschiedenen Konzentrationen und bei verschiedenen pH-Werten.
Figur 5 stellt die immunologische Aktivität und Spezifität von an ein Gold-Sol adsorbiertem GC-143 in einem SPIA-Test dar.
Figur 6 stellt die immunologische Aktivität und Spezifität von GC-143, adsorbiert an ein TTC-beschichtetes Gold-Sol in einem SPIA-Test dar.
Figur 7 zeigt die Fähigkeit eines nicht derivatisierten monoklonalen anti-HIV p24-Antikörpers, der an Gold-Sol adsorbiert wurde, das Sol vor salzinduzierter Agglomeration zu schützen.
Figur 8 zeigt die Fähigkeit eines thiolierten monoklonalen anti-HIV p24 Antikörpers, der an Gold-Sol adsorbiert wurde, das Sol vor salzinduzierter Agglomeration zu schützen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das Verfahren zur Beschichtung von aus Gold-Sol bestehenden Mikropartikeln, mit dem Ziel, chemisch bindende Gruppen zu beschaffen, die die weitere Bindung anderer Gruppen erleichtern, bildet die Grundlage der vorliegenden Erfindung. Mikropartikel in der Erfindung werden im allgemeinen als kolbidales Gold-Sol definiert, das eine Grösse von ungefähr 20 nm bis etwa 200 nm oder mehr aufweist. Der bevorzugte Bereich der Mikropartikelgrösse liegt zwischen 60 nm und 80 nm. Dabei liegt die bevorzugteste Grösse zwischen 65 nm und 75 nm. Einige der verwendeten Beschichtungschemikalien, wie Alkanthiole und deren Derivate sowie Mischungen davon, schützen das Gold-Sol auch vor salzinduzierter Agglomeration und können ein spezielles hydrophob-hydrophiles Gleichgewicht der Sol-Oberfläche erzeugen, so dass unspezifizierte Interaktionen der Oberfläche mit fremden Proteinen minimiert werden.
Gold-Sol wurde von Chlorogoldsäure mittels Hydroxylamin- Reduktion in Wasser auf Gold-Impfpartikel hergestellt. Dieses Verfahren wird in der Literatur beschrieben. (Turkevich, J. et al., Discussions of the Faraday Society, Nr. 11, S. 55-74 (1951)). Im allgemeinen wird in Wasser aufgelöste Chlorogoldsäure-Trihydrat entinonisiertern Wasser zugegeben, welchem anschliessend Hydroxylamin-Hydrochlorid zugefügt wird. Nach der Zugabe von Gold-Impfpartikeln wird die Mischung gerührt. Danach wird eine kleine Menge Aceton zugegeben und die Mischung wieder gerührt. Anschliessend wird K&sub2;CO&sub3; zugegeben bis ein pH-Wert von 7,0 erreicht ist. Der Durchmesser des Gold-Sols liegt je nach Menge der zugesetzten Goldpartikel und der verwendeten Chlorogoldsäure zwischen etwa 10 nm und etwa 150 nm, und das Gold-Sol kann nun mit Alkanthiolen oder Thiolderivaten beschichtet werden.
Alkanthiole, deren Derivate und Di- und Trithiolverbindungen sind die bevorzugten Verbindungen für die Beschichtung der Gold-Sol-Partikel und zur Bereitstellung von chemischen Teilen oder bindenden Gruppen für die kovalente Polymer- oder Ligandenbindung an das Gold-Sol oder für die Modifizierung des hydrophil-hydrophoben Gleichgewichtes. n- Alkanthiole werden noch mehr bevorzugt, während Alkanthiole der Formel CH&sub3;(CH&sub2;)nSH, worin n gleich 9 bis 23 ist, die am meisten bevorzugten Verbindungen sind. Derivate der Alkanthiole weisen im allgemeinen die Formel RCH&sub2;(CH&sub2;)nSH auf, worin R gleich OH, COOH, CHO, SH und NH&sub2; ist, und n gleich 9 bis 23 ist. Die Di- und Trithiol-Verbindungen weisen sind im allgemeinen Verbindungen mit niederem Molekulargewicht. Einige dieser Verbindungen wurden als Schwermetall-Chelatbildner erkannt. Zwei Beispiele sind 2,3- Dimercapto-bernsteinsäure und Trithiocyanursäure.
Um ein Sol mit einem n-Alkanthiol zu beschichten, werden 0,10 M des Alkanthiols und 1 % Tween-20R (ICI Americas eingetragenes Warenzeichen, Polyoxyethylen-sorbitanmonolaurat) in Alkohol, vorzugsweise Methanol, frisch zubereitet. Von diesem Gemisch wird ungefähr 1 ml zu ungefähr 100 ml des vorbereiteten Gold-Sol gegeben und gerührt. Das resultierende Gemisch wird bei Raumtemperatur während ungefähr zwei Stunden stehen gelassen. Die Beschichtung des Gold-Sols kann auch mit tieferen Konzentrationen der Beschichtungsverbindung erzielt werden, jedoch müssen die optimalen Beschichtungszeiten für jeden Fall einzeln empirisch festgestellt werden.
Das Sol-Gemisch wird durch Zentrifugation bei 2000 x g in eine ungefähr 1 mM 3-[N-Morpholino]-2-hydroxypropan-sulfonsäure (MOPSO)-Pufferlösung von pH 7 während ungefähr 15 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen und kann danach bis zum Gebrauch bei 4 º C aufbewahrt werden.
Bei der oben beschriebenen Methode handelt es sich um ein Beispiel für die Beschichtung von Gold-Sol mit einer n- Alkanthiol-Verbindung. Dieses Beschichtungsverfahren wird für die Bindung von Gemischen aus n-Alkanthiolen und n- Alkanthiolderivaten, die bindende Gruppen enthalten, zur chemischen Konjugation von Liganden oder polymeren Verbindungen modifiziert. Beispielsweise bewirkt der Einschluss eines Hydroxy-n-Alkanthiols in das Beschichtungsgemisch eine verbesserte Hydrophihe der Sol-Oberfläche und verringerte unspezifische Interaktionen des Sols mit Serumproteinen. Der Einschluss von Carboxyl-n-alkanthiol in einer Menge von 10 % der insgesamt anwesenden Thiolverbindungen reicht aus, um ein Sol mit der gewünschten Dichte der Konjugationsteile zu erzeugen. Die Länge der Kohlenstoffkette des n-Alkanthiols in diesen Mischungen kann 2 bis 4 Kohlenstoffe weniger lang sein als die Kohlenstoffkette der n- Alkanthiolderivate, damit die Konjugationsteile besser exponiert werden können, um die mit der Reaktion zwischen Makromolekülen und der Sol-Oberfläche in Zusammenhang stehende sterische Hinderung zu vermindern.
Die Beschichtungslösung von n-Alkanthiol, n-Alkanthiolderivaten oder Gemischen der beiden Gruppen wird im allgemeinen in Alkohol, vorzugsweise Methanol, mit 1 % Tween-20R zubereitet. Die gesamte Konzentration aller Thiolverbindungen liegt normalerweise nicht über 0,10 M. In gewissen Fällen beträgt der für die Beschichtung von Thiolverbindungen optimale pH-Wert nicht 7. Beispielsweise wird bei mit Trithiocyaunursäure beschichten Solen das Sol auf einen pH-Wert von 6 gebracht, bevor die Thiolverbindung zugegeben wird, um den Resistenzgrad gegen die durch ein spezielles Gemisch von Thiolverbindungen verliehene salzinduzierte Agglomeration zu optimieren.
Im allgemeinen werden die Sole in Anwesenheit des Thiolgemisches während zwei Stunden beschichten gelassen, jedoch müssen die optimalen Inkubationszeiten für jeden einzelnen Fall empirisch festgelegt werden. Dies wird erreicht, indem man die Sole mit einem spektrophotomerischen Test nach verschieden langen Inkubationszeiten auf ihre Resistenz gegen salzinduzierte Agglomeration prüft. Die Gold-Sole haben eine charakteristische violette Farbe, die äusserst empfindlich auf den Durchmesser der Solpartikel ist. Wenn eine Solpartikel-Agglomeration stattfindet, vergrössert sich die eigentliche Grösse" des Sols um einiges und das charakteristische Adsorptionsmaximum verschiebt sich von 540 nm, also violett, in die Richtung höherer Wellenlängen mit einer blauen bis farblosen Sol-Farbe.
In der Praxis wird 1 ml des beschichteten Sol-Aliquoten in ein Glasröhrchen gegeben. Dann werden dem Sol-Aliquoten unter Mischen 100 Mikroliter 10 % NaCl zugegeben. Anschliessend wird das Gemisch bei Raumtemperatur während 10 Minuten stehen gelassen und seine Absorption bei 540 nm mit einem identischen Sol-Aliquoten verglichen, dem 100 Mikroliter Wasser zugeführt worden sind. Wenn ein Testaliquot 90 % oder mehr der Absorption des Kontrollaliquoten zurückhält, gilt er als resistent gegen salzinduzierte Agglomeration.
Untersuchte Verbindungen sind in der untenstehenden Tabelle 1 aufgeführt: TABELLE 1
* ausgedrückt in % optischer Dichte bei 540 nm des Kontroll-Sol-Aliquoten ohne zugegebenes Salz
¹ das Sol wurde in Anwesenheit der Beschichtungsverbindung spontan agglomeriert
² obwohl vor salzinduzierter Agglomeration geschützt, war das Sol nach dem Abtrennen durch Zentrifugieren nicht mehr salzgeschützt
³ Molverhältnisse der in Beschichtungsgemischen verwendeten Verbindungen
n-Alkanthiole erwiesen sich bei der Beschichtung und dem Schutz des Gold-Sols vor salzinduzierter Agglomeration als die erfolgreichsten Verbindungen. N-Alkanthiolderivate, wie 12-Mercapto-1-dodecansäure, konnten keine Resistenz gegen salzinduzierte Agglomeration erzielen, jedoch wurde ein gänzlicher Schutz vor salzinduzierter Agglomeration erreicht durch die Verwendung von Gemischen aus n-Alkanthiolen und deren Derivaten, die auch zu den oben beschriebenen anderen Eigenschaften führte.
Das chemisch konjugierbare Gruppen enthaltende beschichtete Gold-Sol wird anschliessend mittels gut bekannter Verfahren an bindende Teile wie Proteine, Kohlehydrate, Antikörper, Antigene, Polymere, Monomere oder Ligande unter Verwendung der Carbodiimid-Chemie gebunden. Bindende Teile umfassen alle Gruppen, die adsorbiert oder kovalent an das beschichtete Gold-Sol gebunden werden können. In gewissen Fällen wird die Carbodiimid-Chemie auch zur Konjugierung von Linkermolekülen, wie 6-Aminocapronsäure, an das Sol, vor der indirekten Konjugierung der bindenden Partner verwendet, um räumliche Hinderungen am bindenden Partner zu vermindern und die Erkennung von und durch dessen komplementären Bindungspartner zu erleichtern. Um den Bindungspartner oder das Linkermolekül an das beschichteten Sol zu konjugieren, wird das Sol in Anwesenheit der zu kuppelnden Substanz, 1- Ethyl-3-(-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysulfosuccinimid (SNHS), bei Raumtemperatur in einer 10-25 mM Pufferlösung bei einem pH-Wert von 7,0 während zwei Stunden inkubiert. In gewissen Fällen werden weitere EDC-Aliquoten während der Konjugierungsreaktion zugegeben, um die Hydrolyse dieser Verbindung in einem wässrigen Medium zu kompensieren.
Die Wahl potentiell nützlicher Konjugierungsreaktionen wird durch die chemischen Teile auf dem Gold-Sol sowie durch den Typ des auf ein beliebiges gegebenes Linkermolekül eingeführten Teils bestimmt. Beispielsweise könnten Aminogruppen auf den an das Sol gebundene Alkanthiolderivaten oder gebundenen Linkermolekülen mittels homo- oder hetero-bifunktioneller-N-hydroxysuccinimidester-Vernetzungsmitteln an Polymere konjugiert werden. Auf die gleiche Weise könnten Sulfhydrylgruppen auf an das Sol gebundenen Alkanthioldenvaten oder Linkermolekülen mittels homo- oder heterobifunktioneller Maleinsäureimid-Vernetzungsmitteln an Polymere konjugiert werden. Der Bereich möglicher Konjugierungsschemen gleicht sehr oder ist identisch mit den zur Zeit zur Herstellung diagnostischer Immunkonjugate verwendeten chemischen Schemen. Klassische Vernetzungsmittel- Reagenzien, die mit den Teilen auf dem Sol, den Alkanthiolderivaten oder den chemischen Vernetzungsmitteln kompatibel sind, werden zur Bindung des geeigneten Bindungspartners an das Sol benötigt.
Immunologische Tests, in denen die Solpartikel-Immunassaymethode" (SPIA) angewendet wird, werden wie im US Patent 4,313,734 von J. Leuvering beschrieben durchgeführt. Zusammengefasst wird das mit einem bindenden Teil beschichtete Gold-Sol in Anwesenheit einer Testprobe inkubiert, die den Gegen-Bindungspartner enthält. Falls der Gegen-Bindungspartner in der Probe anwesend ist, wird eine Vernetzung des beschichteten Sols stattfinden, und die Absorption beim Absorptionsmaximum einzelner Gold-Solpartikel wird sich auf drastische Weise verringern. Die Adsorptionseigenschaf ten polymerer Verbindungen an Gold-Sol können durch die Thiolierung des Bindungspartners erleichtert werden.
Sowohl polyklonale wie monoklonale Antikörper wurden durch Reaktion mit N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA) thioliert. Die daraus hervorgehenden geschützten Sulfhydrylgruppen wurden mittels Reaktion der Proteine mit Hydroxylamin-Hydrochlond exponiert. Dies ist ein gut bekanntes chemisches Verfahren, um Sulfhydrylgruppen in Protein einzuführen. Die thiolierten Proteine wurden anschliessend bei pH Werten von 6, 7, 8 und 9 und bei Proteinkonzentrationen zwischen 5 µg/ml und 100 µg/ml an Gold-Sole adsorbiert. Der Resistenzgrad gegen salzinduzierte Agglomeration wurde wie oben beschrieben bestimmt. Die Thiolierung von Antikörpern nach dieser Methode verbesserte auf signifikante Weise deren Fähigkeit, Gold-Sol vor salzinduzierter Agglomeration zu schützen im Vegleich zu nicht-thiolierten Antikörpern, wie in den Figuren 7 und 8 gezeigt und in Beispiel 12 beschrieben.
Eine weitere Methode, die Adsorption von Antikörpern an Gold-Sol zu erleichtern, besteht im Einschluss einer Zwischenbeschichtung zwischen dem Gold-Sol und dem Bindungspartner, wodurch die phyiskalisch-chemischen Eigenschaften der Sol-Oberfläche so verändert werden, dass die Adsorption der Antikörper erhöht wird. Zu diesem Zweck werden Di- und Trithiole verwendet. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist Trithiocynaursäure (TTC). In einem ähnlichen Vorgang wie in der oben für die n-Alkanthiol-Verbin-dungen beschriebenen Methode, jedoch in anderen TTC- und Tween-20R- Konzentrationen wurde Gold-Sol beschichtet. Diese Konzentrationen wurde empirisch festgelegt. Die Fähigkeit des Antikörpers, dem gewaschenen Sol Resistenz gegen salzinduzierte Agglomeration zu vermitteln, wurde nach der Inkubation des Antikörpers und des beschichteten Sols bei verschiedenen pH-Werten und Proteinkonzentrationen im obigen Abschnitt bestimmt.
Die beschichteten Mikropartikel dieser Erfindung können kovalent an Antigene oder. Antikörper gebunden und in einer Testergarnitur zur Verwendung in der Immundiagnostik verkauft werden. Das Antigen oder der Antikörper wird spezifisch für den Gegen-Bindungspartner sein, der nachgewiesen werden soll, und die anderen Bestandteile der Garnitur können Verdünnungsmittel, Pufferlösungen, Markierreagenzien und Laborausrüstung umfassen, die ebenfalls für den jeweiligen auszuführenden Test spezifisch sind.

BEISPIELE

Beispiel 1 - Herstellung von Gold-Sol

Für die Herstellung des in der End-Gold-Sol-Herstellung verwendeten Impf-Sols wurden 10 ml 1% HAuCL&sub4;-Trihydrat zu 900 ml Wasser gegeben und gut gerührt. Anschliessend wurden 10 ml 1 % Natriumcitrat zum Gemisch zugegeben und gut gerührt. Unter starkem Rühren wurden 10 ml 0,075 % Natriumborhydrid (das durch Auflösen von Natriumborhydrid in der Natriumcitrat-Lösung hergestellt wurde) zugegeben und während 5 Minuten gut gerührt. Danach wurde das Gemisch durch einen 0,22 Mikron-Filter filtriert und bei 4 C aufbewahrt. Das Sol sollte vor Gebrauch mindestens 24 Stunden stehen gelassen werden.
Zur Herstellung des End-Gold-Sols wurden 8 ml 2 % HAuCL&sub4;- Trihydrat (in Wasser) zu 900 ml Wasser zugegeben. Unter ständigem Rühren wurden 4 ml frisch hergestelltes 5 %- igeshydroxylamin-Hydrochlorid (in Wasser) zugegeben. Gleich danach wurden 22,33 Mikroliter Impf-Sol zugegeben und während 30 Minuten kräftig gerührt. Für jeden Milliliter hergestellten Sols wurde 1 Mikroliter Aceton zugegeben und während 10 Minuten weitergerührt. 0,2 M K&sub2;KCO&sub3; wurden zugegeben, bis der gewünschte pH-Wert erreicht war.
Das geeignete Impf-Sol-Volumen wurde durch das folgende Verhältnis festgelegt: für die gewünschte Sol-Grösse benötigtes Impfvolumen = benötigtes Impfvolumen für ein Sol gegebener Grösse multipliziert mit der Kubikwurzel von (Durchmesser des Sols erhalten aus einer gegebenen Menge von Impf-Sol dividiert durch den Durchmesser des gewünschten Partikels).

Beispiel 2 - Gold-Sol-Beschichtung mit n-Alkanthiol

Gold-Sol wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Eine Lösung von 0,1 M 1-Dodecanthiol in Methanol und 1 % Tween-20R wurde frisch zubereitet. Pro 100 ml des zu beschichtenden Gold-Sols wurde jeweils 1 ml der Thiol- Methanol-Lösung tropfenweise unter Rühren dem Gold-Sol zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden unter gelegentlichem Rühren sich setzen gelassen. Das beschichtete Gold-Sol wurde gewonnen durch Zentrifugieren bei 2000 x g währen4 15 Minuten bei Raumtemperatur und anschliessender Resuspendierung in 1 mM MOPSO, pH 7,0. Dieses Zentrifugieren und Resuspendieren wurden 3 mal wiederholt. Das erhaltene Sol wurde in der gleichen Pufferlösung resuspendiert und bis zum Gebrauch bei 4 º C aufbewahrt.

Beispiel 3 - Mit einer Mischung aus n-Alkanthiol und n-Alkanthiol-Derivat beschichtetes Gold-Sol

Gold-Sol wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Eine Lösung von 0,09 M 1-Dodecanthiol, 0,01 M 12-Mercapto-1-dodecansäure in Methanol und 1 % Tween-20R wurde frisch hergestellt. Pro 100 ml des zu beschichtenden Gold-Sols wurde je 1 ml der Thiolgemisch-Methanollösung tropfenweise unter Rühren dem Gold-Sol zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Rühren während zwei Stunden sich setzen gelassen. Das beschichtete Gold-Sol wurde durch die gleiche Methode wie im vorgehenden Beispiel gewonnen.

Beispiel 4 - Gold-Sol-Beschichtung mit n-Alkanthiol-Derivat und anschliessender fehlender Schutz vor salzinduzierter Agglomeration

Gold-Sol wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und mit K&sub2;CO&sub3; auf einen pH-Wert von 7 gebracht. Eine Lösung von 0,10 M 12-Mercapto-1-dodecansäure und 1 % Tween-20R in Methanol wurde frisch zubereitet. Pro 100 ml des zu beschichtenden Gold-Sols wurde 1 ml der Thiol-Methanollösung tropfenweise unter Rühren dem Gold-Sol zugegeben. Danach wurde das Gemisch bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Rühren während einer Stunde sich setzen gelassen. Um 1 ml Gold-Sol-Aliquote zu verdoppeln, wurden entweder 100 µl Wasser oder 10 % NaCl zugegeben. Die Aliquote, der Wasser zugegeben worden war, diente als Kontrolle. Die Aliquote, der 10 % NaCl zugegeben worden war, hatte nach 10 Minuten 54 % ihrer optischen Dichte verloren. Diese Tatsache wird als Beweis dafür bewertet, dass das Gold-Sol durch Beschichtung mit der 12-Mercapto-1-dodecansäure nicht vor salzinduzierter Agglomeration geschützt wurde.

Beispiel 5 - Herstellung eines mit einem Gemisch aus n- Alkantbiol und n-Alkanthiol-Derivaten beschichteten Gold- Sols

Gold-Sol wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und mit K&sub2;CO&sub3; auf einen pH-Wert von 7 gebracht. Eine Lösung von 0,004 M N-Decanthiol, 0,0005 M 11-Mercapto-1-undecanol, 0,0005 M 12-Mercapto-1-dodecansäure, 0,08 M NaCl und 1 % Tween-20R in Methanol wurde frisch hergestellt. Pro 100 ml des zu beschichtenden Sols wurde 1 ml der Thiol-Thiolderivat-Lösung tropfen weise unter Rühren beigegeben und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur sich setzen gelassen.
Das beschichtete Sol wurde wie in Beispiel 4 beschrieben auf Schutz vor salzinduzierter Agglomeration überprüft.
Das beschichtete Gold-Sol behielt nach Zugabe von 10 % NaCl 100 % seiner optischen Dichte bei 540 nm. Dies wird als Hinweis darauf ausgelegt, dass das beschichtete Sol vollumfänglich vor salzinduzierter Agglomeration geschützt ist.

Beispiel 6 - Koniupierung von Rinderserumalbumin (ESA) an beschichtetes Gold-Sol

4 ml des in Beispiel 3 beschriebenen Gold-Sols mit einer optischen Dichte von 25,0 bei 540 nm wurden mit 4,3 ml 10 mM MOPSO, pH-Wert 7,0, gemischt. Diesem Gemisch wurden unter Rühren nacheinander 0,2 ml 25 mg/ml BSA, 1,0 ml 30 nm SNHS und 0,5 ml 0,1 M EDC zugegeben. BSA, SNHS und EDS wurden in 10 mM MOPSO, pH 7,0, hergestellt. Die Reaktion wurde während zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach der Zugabe von 1 ml 1,0 M Ethanolarnin (mit HCl auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt), pH 7,0 in 10 mM MOPSO, wurde die Reaktion durch eine weitere Stunde Schüttelns beendet. Ein gleiches Volumen 10 mM MOPSO, 0,15 NaCl, 0,5 % Tween-20R, 1,0 mg/ml Casein, bei einem pH-Wert von 7,0 wurde dem Reaktionsgemisch zugegeben und das Gemisch während 1 Stunde sich setzen gelassen. Diese Blockierung- oder Überbeschichtungsstufe schützt die nicht umgesetzten, blossen Stellen der Gold-Sol-Oberfläche vor unspezifischer Interaktion mit anderen Biopolymeren. Das mit BSA konjugierte beschichtete Sol wurde durch Zentrifugieren bei 2000 x g bei Raumtemperatur während 15 Minuten und durch nachfolgendes Resuspendieren in der gleichen Pufferlösung gewonnen. Dieses Zentrifugieren und Waschen wurde dreimal wiederholt. Das Sol wurde wie oben zentrifugiert und in 10 mM MOPSO, pH 7,0 resuspendiert. Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt. Vor Gebrauch wurde das mit BSA konjugierte beschichtete Sol bei 4 º C aufbewährt.

Beispiel 7 - SPIA des mit BSA konlugierten beschichteten Gold-Sols

Das mit BSA konjugierte beschichtete Gold-Sol aus Beispiel 5 wurde mit 0,1 M MOPSO, 0,15 M NaCl, 1,0 % Polyethylenglycol 8000, pH 7,0, verdünnt, um eine optische Dichte bei 540 nm von 1,0 zu ergeben. Polyklonale anti-BSA Antikörper und normales Kaninchen-Immunglobulin (IGG) wurden mit 10 mM MOPSO, pH 7,0, zu 12 Mikroliter/ml verdünnt. Um 1 ml Ahquote des mit BSA konjugierten Sols abzutrennen, wurden 100 Mikroliter des verdünnten anti-BSA oder normalen Kaninchen IgG oder 10 mM MOPSO-Pufferlösung unter Mischen zugegeben. Die Gemische wurden in Küvetten gegeben, die optischen Dichten bei 540 nm während einer Zeit überwacht und in Tabeile 2 dargestellt.
Die Resultate in Tabelle 2 zeigen, dass sich auf der Sol- Oberfläche immunologisch erkennbares BSA befindet, und dass die verringerte optische Dichte nicht auf unspezifische Interaktion zwischen dem Kaninchenserum und dem Sol zurückzuführen ist.

Beisdiel 8 - SPIA des mit BSA koniugierten Gold-Sols mit negativer Kontrolle

Ein mit BSA konjugiertes Sol mit negativer Kontrolle wurde genau wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass der Konjugationsreaktion kein EDC zugesetzt wurde. Stattdessen wurde ein identisches Volumen von 10 mM MOPSO Pufferlösung, pH 7,0, zugegeben. Das Ziel dieses Schrittes war es, mit diesem Sol in SPIA-Tests zu beweisen, dass die beobachtete BSA-Aktivität in ihrer Natur kovalent war. Der Vergleich der Resultate aus den Tabellen 2 und 3 zeigt, dass obwohl ein bedeutender Teil der BSA-Aktivität auf diesen Solen passiv adsorbiert sein kann, ein gleich hoher Teil kovalent gebunden ist. TABELLE 2 TABELLE 3

Beisdiel 9 - Verbesserte Beschichtungseigenschaften von Antikördern auf TTC-beschichtetem Gold-Sol

Gold-Sol wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, mit dem Unterschied, dass es mit K&sub2;CO&sub3; auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt wurde. Eine gesättigte Lösung von TTC in Methanol wurde frisch hergestellt. Eine Lösung von 10 % Tween-20 in Methanol wurde zugegeben bis die Endkonzentration des Tween 20R 2,5 % betrug. 4 ml dieser Lösung wurden zu 200 ml des obigen Sols unter Rühren zugegeben und die Mischung während 2 Stunden unter gelegentlichem Rühren bei Raumtemperatur sich setzen gelassen. Das beschichtete Sol wurde wie in Beispiel 2 gewonnen. Einzelne Aliquote wurden bis zu einer optischen Dichte von 2,0 verdünnt und gleichzeitig mit 10 mM (2-ethansulfonsäure) (MES), 10 mM MOPSO, 10 mM (N-[2-Hydroxyethyl]-piperazin-N-[3- propansulfonsäure]) (EPPS) und 10 mM (2-[N-Cyclohexylamin]-ethansulfonsäure) (CHES) auf einen pH-Wert von 6 bzw. 7, 8 und 9 eingestellt. In einem parallelen Versuch wurde Gold-Sol wie in Beispiel 1 hergestellt und einzelne Aliquote mit K&sub2;CO&sub3; auf einen pH-Wert von 6, 7, 8 und 9 eingestellt. Ein gereinigter menschlicher anti-HIV polyklonaler Antikörper wurde in jeder der oben genannten Pufferlösungen auf 1,0, 0,5, 0,25, 0,10 und 0,05 mg/ml verdünnt. Parallelen 1,0 ml Aliquoten von jedem der obigen Sole und jedem pH-Wert wurden bei entsprechendem pH-Wert unter Mischen 100 µl der Antikörper-Lösung zugegeben. Danach wurden die Gemische während 30 Minuten bei Raumtemperatur sich setzen gelassen. Jedem Sol-Gemisch wurden 100 ul 10 % NaCl unter Schütteln zugegeben. Nach weiteren 10 Minuten wurde die optische Dichte von jedem Gemisch 540 nm gemessen, wie in Figuren 1 bis 4 dargestellt.
Das Ergebnis der Antikörper-Adsorption auf dem TTC- beschichteten Sol war ein breiter pH-Bereich, bei dem ein Schutz vor salzinduzierter Agglomeration auftrat. Der Schutz vor salzinduzierter Agglomeration fand auch bei tieferen Antikörper-Konzentrationen auf dem TTC-beschichteten Sol statt. Ohne die Zugabe von NaCl rief der Antikörper spontane Agglomeration des unbeschichteten Sols hervor. Die antikörperinduzierte spontane Agglomeration war auf dem TTC-beschichteten Sol viel weniger offensichtlich.
Gesamthaft gesehen zeigen diese Beobachtungen, dass die Adsorption dieses Antikörpers auf TTC-beschichtetem Gold-Sol grösser ist als auf unbeschichtetem Sol.

Beispiel 10 - Verbesserte SPIA-Aktivität von auf TTC- beschichtetem Gold-Sol adsorbiertem Antikörper

100 ml Gold-Sol wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und der pH-Wert auf 9,0 eingestellt. Danach wurden 2,5 ml von 2mg/ml des menschlichen anti-HIV (GC-143) in 10 mM CHES, pH 9,0, unter Rühren zugegeben und das Gemisch unter gelegentlichem Rühren bei Raumtemperatur während ungefähr 2 Stunden sich setzen gelassen. Dem Gemisch wurden unter Rühren 5 ml 1 mg/ml entfettende Trockenmilch zugegeben und dieses Gemisch während einer weiteren Stunde bei Raumtemperatur sich setzen gelassen. Das beschichtete Sol wurde während 15 Minuten bei Raumtemperatur bei 2000 x g zentrifugiert und anschliessend in 10 mM CHES, 0,5 % BSA, 300 mM Manit, 0,01 % Natriumazid bei einem pH-Wert von 9,0 resuspendiert. Die Zentrifugier- sowie die Resuspensionsstufe wurden dreimal wiederholt. Das Sol wurde schliesslich im selben Puffer resuspendiert und bis zum Gebrauch bei 4 aufbewahrt. Ein wie in Beispiel 9 beschrieben hergestelltes TTC-beschichtetes Sol wurde mit 10 mM CHES bei einem pH- Wert von 9,0 verdünnt, um 60 ml Sol mit einer optischen Dichte von 2,0 zu erhalten, was ungefähr der gleichen optischen Dichte wie der des in Beispiel 1 hergestellten Gold- Sols entspricht. Danach wurden unter Rühren 6 ml von in 10 mM CHES aufgelöstem 0,5 mg/ml menschlichen anti-HIVs bei einem pH-Wert von 9,0 zugegeben und das Gemisch während einer Stunde bei Raumtemperatur und danach bei 4 º C über Nacht sich setzen gelassen. Anschliessend wurden 6 ml 1 mg/ml entfettende Trockenmilch unter Rühren zugegeben und das Gemisch während einer Stunde bei Raumtemperatur sich setzen gelassen. Das beschichtete Sol wurde wie oben beschrieben gewonnen und auf die gleiche Art aufbewahrt.
Von jedem Sol wurden Aliquote mit 0,1 M MOPSO, 0,15 M NaCl, 1 % PEG 8000, 0,25 % BSA, bei einem pH-Wert von 7,0 zu einer optischen Dichte von 2,0 bei 540 nm verdünnt. Zu wiederholten Aliquoten von jedem verdünnten Sol wurden a) 100 ul Pufferlösung, b)100 ul 10 ul/ml HIV gp160 oder c) 100 ul eines Gemisches aus 5 ug/ml HIV gp160 und 5 ug/ml menschlichem anti-HIV, welches während 90 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert worden war, zugesetzt, wie Figur 5 und 6 zeigen.
Es ist offensichtlich, dass das GC-143-TTC-beschichtete Sol immunologisch aktiver ist als sein unbeschichtetes Sol- Gegenstück, und dass seine Verwendung im SPIA-Test zu einem empfindlicheren Test führt. Deshalb schneidet das GC-143- TTC-beschich-tete Sol auch in funktioneller Hinsicht besser ab als sein unbeschichtetes Sol-Gegenstück.

Beispiel 11 - Thiolierung von monoklonalem Anti-HIV p24 unter Verwendung von N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA)

1 ml des monoklonalen anti-HIV p24 bei 1,46 mglml in 50 mM NaPO&sub4;, 1 mM Ethylendiamin-tetraessigsäure (EDTA), pH 7,5, wurde mit 0,02 ml 5 mg/ml SATA in Dimethylsulfoxid (DMSO) vermischt und bei Raumtemperatur während zwei Stunden reagieren gelassen. Der umgesetzte Antikörper wurde über Gelfiltration durch eine entsalzende Säule in der gleichen Pufferlösung von den Reaktionskomponenten getrennt. ¼ mg des umgesetzten gelfiltrierten Antikörpers wurde mit der gleichen Pufferlösung auf 1 ml verdünnt, wonach ihm unter Rühren 100 ul 0,05 M NAPO&sub4;, 25 mM EDTA, 0,5 NH&sub2;OH.HCl, bei einem pH-Wert von 7,5 zugegeben wurden. Die Reaktion wurde während 1,5 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der ungeschütze Antikörper wurde über eine entsalzende Säule in die Ausgangspufferlösung gelfiltriert, um nicht umgesetzte Reagenzien zu entfernen.

Beispiel 12 - Verbesserte Beschichtungseigenschaften bei thioliertem monoklonalem Anti-HIV p24

Gold-Sol wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass einzelne Aliquote des Sols mit K&sub2;CO&sub3; auf pH-Werte von 6, 7, 8 und 9 eingestellt wurden. In einem parallelen Schritt wurden einzelne Aliqugte von underivatisiertem und derivatisiertem monoklonalem Anti-HIV p24 (siehe Beispiel 11) auf 250, 200, 150, 100 und 50 µg/ml eingestellt. Für jede der beschriebenen Proben wurde die relative Fähigkeit von derivatisierten und underivatisierten Antikörpern, Gold-Sol vor salzinduzierter Agglomeration zu schützen, genau wie in Beispiel 9 beschrieben festgestellt (siehe Figuren 7 und 8).
Aus den Figuren 7 und 8 geht klar hervor, dass die Thiolierung dieses monoklonalen Antikörpers die Beschichtungseigenschaften verbesserte, wie begutachtet durch a) die Tatsache, dass der derivatisierte Antikörper nicht spontan mit dem Sol agglomerierte, b) die Abhängigkeit vom Antikörperschutz vor Sol-Agglomeration von pH herabgesetzt war und c) die niedrigeren benötigten relativen Mengen an derivatisiertem Antikörper im Vergleich zu underivatisiertem Antikörper, um das Sol in Anwesenheit von Salz vor salzinduzierter Agglomeration zu schützen.

Claims

1. Mikropartikel mit Gold-Sol, die mit mindestens einer Verbindung der aus folgenden Stoffen bestehenden Gruppe be- schichtet sind

Alkanthiol, Alkanthiolderivate, Dithiol- und Trithiol- Verbindungen mit geringem Molekulargewicht.

2. Mikropartikel gemäss Anspruch 1, worin die genannte Verbindung mindestens ein Alkanthiol ist.

3. Mikropartikel gemäss Anspruch 1, worin die genannte Verbindung eines Gemisches aus mindestens einem Alkanthiol und mindestens einem Alkanthiolderivat ist.

4. Mikropartikel gemäss Anspruch 1, worin das genannte Alkanthiol ein n-Alkanthiol der Formel CH&sub3;(CH&sub2;)nSH ist und n eine Ganzzahl von 9 bis und mit 23 ist.

5. Mikropartikel gemäss Anspruch 1, worin das genannte Alkanthiolderivat die Formel RCH&sub2;(CH&sub2;)nSH umfasst, in der R aus der aus OH, COOH, CHO, SH und NH&sub2; bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und n eine Ganzzahl von 9 bis 23 ist.

6. Mikropartikel gemäss Anspruch 1, worin die genannte Verbindung eine Dithiol-Verbindung mit geringem Molekulargewicht ist.

7. Mikropartikel gemäss Anspruch 1, worin die genannte Verbindung eine Trithiol-Verbindung mit geringem Molekulargewicht ist.

8. Mikropartikel gemäss Anspruch 1, worin das genannte Gold-Sol einen Durchmesser von 10 nm bis 150 nm aufweist.

9. Mikropartikel gemäss Anspruch 1, die gegen salzinduzierte Agglomeratbildung resistent ist, wobei in Anwesenheit von 1,0 % NaCl nach 10 Minuten nicht mehr als 10 % der optischen Dichte bei 540 nm einer Suspension des genannten Sols verloren geht.

10. Mikropartikel gemäss Anspruch 1, worin die genannten Mikropartikel kovalent mit einem Verbindungsteil verbunden sind.

11. Mikropartikel gemäss Anspruch 10, worin das Verbindungsteil aus einer aus Proteinen, Kohlenhydraten, Antigenen, Antikörpern, Liganden, Polymeren und Monomeren bestehenden Gruppe ausgewählt wird.

12. Mikropartikel gemäss Anspruch 1, die zusätzlich eine Brückenverbindung umfassen, die kovalent mit der genannten Verbindung verbunden und an die kovalent ein Verbindungsteil gebunden ist.

13. Mikropartikel gemäss Anspruch 1, worin zusätzlich ein Verbindungsteil passiv adsorbiert wird.

14. Verfahren zur Beschichtung von Gold-Sol-Mikropartikeln umfassend:

a) Mischen von Gold-Sol-Mikropartikeln mit einer Alkohol- lösung bestehend aus mindestens einer Verbindung, die aus einer aus Alkanthiol, Alkanthiolderivaten, Di- hiol- und Trithiol-Verbindungen mit geringem Moleku- largewicht bestehenden Gruppe ausgewählt wird, wodurch beschichtete Gold-Sol-Mikropartikel hergestellt wer-. den;

b) Zentrifugation des genannten beschichteten Sols; und

c) Resuspendierung des beschichteten Gold-Sols in Pufferlösung.

15. Verfahren zur Beschichtung von Gold-Sol-Mikropartikeln gemäss Anspruch 14, worin die genannte Alkohollösung zusätzlich einen oberflächenaktiven Stoff enthält.

16. Verfahren zur Beschichtung von Gold-Sol-Mikropartikeln gemäss Anspruch 15, worin die genannte Verbindung einer Mischung von Alkanthiol und Alkanthiolderivaten ist.

17. Verfahren zur Bindung eines Verbindungsteils an Gold- Sol-Mikropartikel, umfassend:

a) Beschichtung des genannten Gold-Sols gemäss Anspruch 14, um beschichtetes Gold-Sol herzustellen;

b) Inkubieren des genannten Gold-Sols und des Verbindungsteils, um das Verbindungsteil an das genannte beschichtete Sol zu binden;

c) Blockieren nichtspezifischer Stellen auf dem beschichteten Gold-Sol von Schritt b);

d) Zentrifugieren des unter Schritt c) genannten be- schichteten Gold-Sols;

e) Resuspendieren in einer Pufferlösung des in Schritt d) genannten beschichteten Gold-Sols.

18. Verfahren zur Bindung eines Verbindunqsteils an Gold- Sol-Mikropartikel, umfassend:

a) Beschichten von Gold-Sol gemäss Verfahren unter Anspruch 15;

b) Inkubieren einer Mischung des Gold-Sols, eines geeigneten chemischen Vernetzungsmittels und des Verbindungsteils, um das Verbindungsteil an das beschichtete Gold-Sol zu binden;

c) Abschrecken der genannten Mischung;

d) Blockieren nichtspezifischer Stellen auf dem beschichteten Gold-Sol von Schritt b);

e) Zentrifugieren des unter Schritt d genannten beschichteten Gold-Sols; und

f) Resuspendierung in einer Pufferlösung

19. Verfahren zur Bindung eines Verbindungsteils an Gold- Sol-Mikropartikel, umfassend:

a) Beschichtung von Gold-Sol-Mikropartikeln gemäss Verfahren unter Anspruch 16;

b) Inkubieren einer Mischung des genannten beschichteten Gold-Sols, eines geeigneten chemischen Vernetzungsmittels und eines Verbindungsteils, um das Verbindungsteil an das beschichtete Gold-Sol zu binden;

c) Abschrecken der genannten Mischung;

d) Blockieren nichtspezifischer Stellen auf dem genannten Gold-Sol von Schritt b);

e) Zentrifugieren des unter Schritt d) genannten Gold- Sols; und

f) Resuspendierung in einer Pufferlösung

20. Verfahren zur Bindung eines Verbindungsteils an Gold Sol-Mikropartikel, umfassend:

a) Beschichten von Gold-Sol-Mikropartikeln Verfahren unter Anspruch 15;

b) Inkubieren des genannten beschichteten Gold-Sols mit einem Verbindungsteil;

c) Blockieren nichtspezifischer Stellen auf dem unter Schritt b) genannten beschichteten Gold-Sol;

d) Zentrifugieren des unter Schritt c) genannten beschichteten Gold-Sols;

e) Resuspendierung des unter Schritt d) genannten beschichteten Gold-Sols in einer Pufferlösung

21. Verfahren zur Bindung eines Verbindungsteils an Gold- Sol-Mikropartikel, umfassend:

a) Verändern des genannten Verbindungsteils durch chemische Thiolierung;

b) Inkubieren des in Schritt a) genannten thiolierten Verbindungsteils mit Gold-Sol-Mikropartikeln;

c) Blockieren nichtspezifischer Stellen auf dem in Schritt b) genannten Gold-Sol;

d) Zetrifugieren des unter Schritt c) genannten Gold- Sols; und

e) Resuspendierung in einer Pufferlösung des unter Schritt d) genannten Gold-Sols.

22. Ein Diagnostik-Set für Immunassays umfassend Mikropartikel gemäss Anspruch 1 sowie eine Pufferlösung.