DE3876146T2

DE3876146T2 - Verfahren zur deponierung von metallpartikeln auf einen marker.

Info

Publication number: DE3876146T2
Application number: DE8888200416T
Authority: DE
Inventors: Frank Jozef Konings; Marcus Johannes Maria Noppe
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 1987-03-09
Filing date: 1988-03-07
Publication date: 1993-04-01
Anticipated expiration: 2008-03-08
Also published as: EP0293947A1; ES2052684T3; DE3876146D1; GR3006837T3; ATE82802T1; CA1340803C; JPS63277971A; JP2657966B2; EP0293947B1

Description

Derzeit werden verschiedene Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung spezifischer Bindungsmittel und/oder von den diesen entsprechenden, bindungsfähigen Substanzen angewendet. Obgleich sich diese Verfahren in der Empfindlichkeit, in der Leichtigkeit der Durchführung und in den daran beteiligten chemischen und physikalischen Prinzipien stark voneinander unterscheiden, wird dennoch generell das Bestehen wichtiger Ähnlichkeiten anerkannt. Typische Beispiele der Beziehung zwischen einem spezifischen Bindungsmittel und der diesem entsprechenden, bindungsfähigen Substanz bzw. Substanzen sind vom Typus Antigen-Antikörper, Antikörper-Antigen, Protein-Protein, Protein-Ligand, Rezeptor-Ligand oder Nukleinsäure-komplementäre Nukleinsäure. In diesem Zusammenhang sind Wechselwirkungen zwischen Antigen und Antikörper oder immunologische Wechselwirkungen bei weitem die wichtigsten, und insbesondere für diagnostische Zwecke sind Nachweisverfahren, die auf solchen Wechselwirkungen basieren, heutzutage die in größtem Umfang angewendeten.
Es können verschiedene Techniken angewendet werden, um die Aggregate nachzuweisen und gegebenenfalls zu quantifizieren, wobei unter "Aggregaten" die Komplexe zu verstehen sind, die zwischen den spezifischen Bindungsmitteln und den betreffenden, bindungsfähigen Substanzen gebildet worden sind. In gewissen Fällen führt die Komplexbildungsreaktion als Ergebnis der Agglutination und/oder Präzipitation des Aggregates als solchem zu einem direkt sichtbaren Signal. Dies wird jedoch nicht immer der Fall sein, und im allgemeinen wird die Konzentration des Bindungsmittels und der bindungsfähigen Substanz, die zur Erzielung eines solchen Ergebnisses notwendig ist, weit über den praktischen und nützlichen Grenzen liegen. Um diesen Mangel an Empfindlichkeit zu umgehen, oder um ansonsten nicht nachweisbare Aggregate nachzuweisen, sind bereits verschiedene Verfahren entwickelt worden, wie z.B. die Komplement-Fixierung, die passive Hämagglutination, der Radio-Immuno-Assay (RIA), der Immunfluoreszenztest und der Enzyme- Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA). Bei den drei letztgenannten Verfahren wird der Nachweis des Aggregates durch Markieren des Aggregates mit einem leicht nachweisbaren Marker verbessert, der entweder direkt an das spezifische Bindungsmittel oder an ein sekundäres Bindungsmittel, für welches das primäre Bindungsmittels als bindungsfähige Substanz fungiert, oder an die bindungsfähige Substanz gebunden ist. Bei den drei angeführten Verfahren ist der Marker respektive ein radioaktives Atom oder eine radioaktive Gruppe, ein fluoreszierende Substanz oder ein Enzym. Solche Verfahren sind u.a. in "Weir's Handbook of Experimental Immunology" (1967), Blackwell Scientific Publications, Oxford und Edinburgh, und in der US-PS Nr. 3 654 090 (ELISA) beschrieben.
Während der letzten Jahre sind Verfahren eingeführt worden, bei denen die zwischen spezifischen Bindungsmitteln und bindungsfähigen Substanzen gebildeten Aggregate durch direktes oder indirektes Markieren dieser Aggregate mit Metallteilchen einer kleinen Teilchengröße, insbesondere Goldteilchen, nachgewiesen werden. In Abhängigkeit von den jeweiligen Umständen können diese Teilchen z.B. durch direkte, visuelle Prüfung, oder durch mikroskopische oder spektrophotometrische Techniken nachgewiesen werden. Eine Beschreibung der "Immunogold Staining (IGS) Technique", oder der "Sol Particle Immuno Assay (SPIA) Technique", sowie von spezifischen Anwendungsgebieten und Verbesserungen hievon, findet sich z.B. in den US-PS'en Nrn. 4 313 734, 4 446 238 und 4 420 558, in der US-Serial No. 622 923, welche der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 165 634 entspricht, in der US-Serial No. 660 832, welche der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 158 746 entspricht, und in der IBRO-Handbuchreihe, Wiley, New York, 1983, Seiten 347 bis 372.
Metallteilchen sind weiterhin zum Anfärben von Akzeptorsubstanzen, wie z.B. von Proteinen und Nukleinsäure, verwendet worden, welche direkt auf einem festen Träger immobilisiert sind. Ein solches Verfahren ist z.B. in der US-Serial No. 744 091 beschrieben, welche der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 165 633 entspricht.
Ausgehend von einem relativ unbekannten Verfahren zum Markieren von Zelloberflächenantigenen werden Metallteilchen nunmehr bei einer Vielfalt von Problemen im Zusammenhang mit dem Nachweis und/oder der quantitativen Bestimmung von Substanzen in großem Umfang verwendet. Die Möglichkeit der direkten visuellen Prüfung von Metallteilchen und der Vorteil, welcher darin gelegen ist, daß das erzeugte Signal permanent ist und keinem raschen Abbau unterliegt, machen die Metallteilchen zu einem interessanten Marker für einfache und rasche Tests. Außerdem sind Metallmarker, und vorzugsweise Goldmarker, aufgrund der sehr geringen Gefahren für die Gesundheit, die mit einem Arbeiten mit Metallmarkern verbunden sind, gegenüber Radioisotopen als Markern offensichtlich zu bevorzugen.
In der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 158 746 ist auf Seite 10, Zeilen 18 bis 32, ein Verfahren zum signifikanten Verbessern des Signals eines kolloidalen Goldmarkers dadurch, daß man die kolloidalen Goldteilchen, die an die Oberfläche eines löschpapierartig aufsaugenden ("Blotting"-) Mediums gebunden sind, einem sogenannten Verfahren der physikalischen Entwicklung unterwirft, beschrieben.
Die nach dem Stande der Technik bekannten physikalischen Entwickler bestehen generell aus einer Lösung, welche ein lösliches Metallsalz, wie z.B. Silbernitrat, ein Reduktionsmittel, wie z.B. Hydrochinon, und ein entsprechendes Puffersystem zum Einstellen eines spezifischen pH-Wertes, vorzugsweise eines pH-Wertes von weniger als 4, enthält.
Zuerst wird die Reduktion der Silberionen zu metallischem Silber an der Oberfläche der Goldteilchen katalysiert, was zu einer spezifischen Ablagerung von metallischem Silber an der Stelle der Goldteilchen führt. Dann katalysieren die so gebildeten Teilchen aus metallischem Silber ihrerseits die Reduktion, wodurch ein autokatalytisches Verfahren geschaffen wird. Die Wirkung einer physikalischen Entwicklung besteht darin, daß das rötliche, optische Goldsignal sich in ein dunkelbraunes bis schwarzes Silbersignal mit einer viel höheren Intensität verwandelt. Die Verwendung dieser nach dem Stande der Technik bekannten physikalischen Entwickler führt zu einem verbesserten Signal, obgleich eine Anzahl von Nachteilen damit verbunden ist.
Eines der Hauptprobleme ist die Löslichkeit der Metallsalze. Es ist in der Tat wohlbekannt, daß Metallionen, wie z.B. Silberionen, mit vielen Gegenionen unlösliche Salze bilden. Abgesehen davon, daß durch diese unlöslichen Salze der Vorrat an verfügbaren Silberionen erschöpft wird, bilden diese unlöslichen Salze auch Kerne, an welchen das Reduktionsverfahren ebenfalls katalysiert wird, was zu einem ernstlich erhöhten Störpegel führt. Außerdem können Silberionen lichtempfindliche Silbersalze, wie z.B. Silberbromid und Silberchlorid bilden, welche unter der Einwirkung von Licht leicht zu metallischem Silber reduziert werden, wodurch ein autokatalytisches Verfahren begonnen wird. Es ist daher unbedingt notwendig, mit äußerst reinen Kontaktoberflächen, z.B. Gefäßen, mit Chemikalien von Analysenreinheit und mit ultrareinem Wasser zu arbeiten. Gewöhnlich ist es auch erforderlich, Mehrfachwaschstufen zwischen der Inkubation mit dem metallmarkierten spezifischen Bindungsmittel und der physikalischen Entwicklung des Markers einzuführen, um in dem Inkubationsmedium vorhandene unerwünschte Ionen zu entfernen. Alles dies tendiert dahingehend, herkömmliche Tests auf der Basis von physikalisch entwickeltem Metall komplizierter, teurer und fehleranfälliger zu machen.
Der Hauptnachteil der herkömmlichen Verfahren liegt in der eigentlichen natur des physikalischen Entwickelns. Im Falle eines physikalischen Entwicklers auf z.B. Silberbasis reduziert das Reduktionsmittel alle Silberionen mit einer bestimmten Geschwindigkeit. Zur Erzielung optimaler Empfindlichkeit muß das Verstärkungsverfahren dadurch vorzeitig abgebrochen werden, daß man den physikalischen Entwickler aus der den Metallmarker enthaltenden Phase entfernt, noch bevor die durch Nicht-Marker induzierte Reduktion, die sogenannte "Selbst-Kernbildung", in Erscheinung tritt. Es versteht sich von selbst, daß physikalische Entwickler flexibler und stärker werden, wenn das Verhältnis zwischen der Geschwindigkeit der metallspezifischen Reduktion und der Geschwindigkeit der Selbst-Kernbildung erhöht werden kann. Mit den traditionellerweise verwendeten physikalischen Entwicklern kann dieses Verhältnis kaum erhöht werden. Der einzige Parameter, der moduliert werden kann, ist die Gesamtgeschwindigkeit des Verfahrens; die Selbst-Kernbildung läßt sich nur auf Kosten einer langsameren Verstärkung des Metallmarkers hinausschieben. Einer der naheliegendsten Wege, dies zu bewerkstelligen, liegt im Verändern der Konzentration, der Natur oder der Umgebung des Reduktionsmittels. Eine häufig angewendete Methode besteht in der Verwendung von Hydrochinon bei einem pH-Wert unter 4. Die reduzierende Wirkung des Hydrochinons ist in saurer Umgebung stark gehemmt; der Benützer des physikalischen Entwicklers hat daher genügend Zeit, um die Verstärkung des Metallmarkers zu stoppen, bevor die Selbst-Kernbildung zuviel Rauschen verursacht. Säurezugaben sind jedoch in vielen Fällen mit der Natur des Bindens zwischen dem markierten spezifischen Bindungsmittel und der diesem entsprechenden bindungsfähigen Substanz nicht verträglich. Die meisten monoklonalen Antikörper haben nur eine geringe oder eine durchschnittliche Affinität für ihre Antigene bei diesem pH-Wert. Außerdem kann kein wirklicher Gewinn an Empfindlichkeit erreicht werden, weil die Verstärkung des Markers in dem gleichen Ausmaß verlangsamt wird, wie die Selbst-Kernbildung verlangsamt wird.
Es besteht daher ein großer Bedarf nach einer Verbesserung der Empfindlichkeit und der praktischen Durchführbarkeit von Techniken für den Nachweis und/oder die quantitative Bestimmung auf der Basis von Metallen.
Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zum Aufbringen von Metallteilchen auf einen Marker zur Verfügung gestellt, welcher die Reduktion von Metallionen aus einem physikalischen Entwickler katalysiert, und bei welchem Verfahren der Marker an wenigstens eine Komponente eines Aggregates gebunden ist, welches zwischen wenigstens einem spezifischen Bindungsmittel und der diesem entsprechenden, bindungsfähigen Substanz gebildet worden ist, und welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß der verwendete physikalische Entwickler eine Lösung von Metallionen, einen molaren Überschuß, in bezug auf die Metallionen, an einer heterocyclischen Base, als Komplexbildner, und ein Reduktionsmittel umfaßt.
Dieses Verfahren kann praktisch dadurch ausgeführt werden, daß man das spezifische Bindungsmittel oder die diesem entsprechende bindungsfähige Substanz direkt oder indirekt auf einem festen Träger immobilisiert, daß man den Träger mit einem mit einem Marker markierten Gegenstück in Berührung bringt, welcher Marker die Reduktion der komplex gebundenen Metallionen des physikalischen Entwicklers katalysiert, und daß man den Physikalischen Entwickler vor oder nach der Abtrennung der gebundenen von den freien, markierten Komponenten zugibt, wodurch die gebildeten Metallteilchen während der Reaktion oder nach einer angemessenen Reaktionszeit quantitativ und/oder qualitativ in der Testprobe und/oder in den davon abgeleiteten Fraktionen bestimmt werden, um eine qualitative und/oder quantitative Anzeige der zu bestimmenden Komponente(n) zu ergeben. In einigen Fällen kann es vorzuziehen sein, den die immobilisierte bindungsfähige Substanz enthaltenden Träger mit einem für diese bindungsfähige Substanz spezifischen, ersten Bindungsmittel, unter Bildung eines Aggregates mit demselben, in Berührung zu bringen, und anschließend den das so gebildete Aggregat tragenden Träger mit einem zweiten Bindungsprotein in Berührung zu bringen, welches für das erstgenannte Bindungsprotein spezifisch und mit einem Marker markiert ist. Das so beschriebene Verfahren ist besonders gut für die Bestimmung immunchemischer Komponenten, wie z.B. von Haptenen, Antigenen und Antikörpern, geeignet.
Die vorliegende Erfindung kann weiterhin auch zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung einer Akzeptorsubstanz, wie z.B. eines Proteins oder einer Nukleinsäure, angewendet werden, welche direkt auf einem festen Träger immobilisiert und an den obgenannten Marker gebunden ist.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in der Schaffung vielseitiger Lösungen und Testkits, welche für die Durchführung der obigen Verfahren geeignet sind.
Durch die vorliegende Erfindung wird dadurch Abhilfe für die mit den herkömmlichen Entwicklern verbundenen Nachteile geschaffen, daß man zu dem Entwickler einen Überschuß eines Komplexbildners zugibt. Die Komplexbildner für den Gebrauch im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen heterocyclische Basen. Bevorzugte heterocyclische Basen sind gegebenenfalls substituierte mono- oder bicyclische Basen, welche wenigstens ein Stickstoffatom aufweisen, welches ein freies Elektronenpaar in einem sp²-Hybrid-Orbital beherbergt, wie z.B. aromatische heterocyclische Ringsysteme, welche (i) einen fünfgliedrigen Ring enthalten, der zwei Ring-Stickstoffatome aufweist, wie z.B. Imidazol, Benzimidazol, Pyrazol, Purin und dgl. mehr, wobei Imidazol in höchstem Maße bevorzugt ist, und (ii) aromatische heterocyclische Ringsysteme, welche einen sechsgliedrigen Ring enthalten, der ein Ring-Stickstoffatom aufweist, wie z.B. Pyridin, Aminopyridin, Nicotinamid, Chinolin und dgl. mehr. Hinsichtlich der Bildungskonstanten von Silberkomplexen mit Imidazol und Pyridinderivaten sei auf das Bulletin of the Chemical Society of Japan, 42, 3598-3600 (1969), verwiesen.
Der für den Gebrauch in dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehene Marker soll irgendein Teilchen umfassen, welches die Reduktion von Metallionen katalysieren kann, wobei diese Reduktion zur Ablagerung der entsprechenden Metallteilchen an der Stelle des Markers führt. Häufig katalysieren die so angeordneten Metallteilchen ihrerseits die Reduktion, wodurch ein autokatalytisches Verfahren geschaffen wird.
Die zu verwendenden Marker umfassen Metalle, Metallverbindungen oder Polymere, welche Polymere gegebenenfalls mit Metallen oder Metallverbindungen überzogen oder imprägniert sind, wobei diese Metalle oder Metallverbindungen die Reduktion von Metallionen auf ihrer Oberfläche direkt oder indirekt katalysieren können. Beispiele solcher Metalle sind Gold, Silber, Thallium, Platin, Palladium sowie Kupfer und Nickel, wobei Gold bevorzugt ist. Als Beispiele von Metallverbindungen können die diesen Metallen entsprechenden Komplexe und Sulfide genannt werden. Polymere, welche mit Metallen oder Metallverbindungen überzogen oder imprägniert sind, haben ähnliche Eigenschaften wie das Metall oder die Metallverbindungen, doch können die Größe, Dichte und der Metallgehalt in optimaler Weise kombiniert werden. Für seinen Gebrauch in dem bevorzugten Verfahren sollte der Marker so ausgewählt werden, daß die spezifischen Bindungsmittel, oder irgendein Mittel, welches von denselben gebunden werden kann, an den Marker gebunden werden können, ohne daß sie ihre Affinität für ihr Bindungsgegenstück oder bindungsfähiges Gegenstück verlieren.
Besonders bevorzugte Marker für den Gebrauch in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind entweder (i) kolloidale Metallteilchen, und gegebenenfalls ein Sol, welche bzw. welches Metalle oder Metallsulfide enthalten bzw. enthält; oder (ii) Metallchelate, insbesondere solche, welche Ethylendiaminotetraessigsuaure-(EDTA)- oder Diethylentriaminopentaessigsäure-(DTPA)-Gruppen enthalten; oder (iii) Polymere, welche gegebenenfalls mit Metallen oder Metallsulfiden imprägniert sind, z.B. Polymerisationsprodukte von Benzidinderivaten, wie beispielsweise Diaminobenzidinpolymere.
Die Reduktionsmittel, die für den Gebrauch im Rahmen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, sollen irgendein Mittel umfassen, welches Metallionen, und zwar vorzugsweise Silber-, Gold-, Platin-, Palladium- oder Thalliumionen, aus einem physikalischen Entwickler in der Nähe einer aktiven Stelle reduziert. Vorzugsweise bilden diese Reduktionsmittel stabile Lösungen mit einem oder mit mehreren Bestandteilen des geschützten physikalischen Entwicklers. Als Reduktionsmittel können besonders 1,2-Dihydroxybenzol, 1,4-Dihydroxybenzol (Hydrochinon), 4-Methylaminophenolsulfat (Metol ), 4-Aminophenol, 1,4-Diaminobenzol, 1,2-Diaminobenzol, N-(4-Hydroxyphenyl)glycin, 2,4-Diaminophenol, 1-Phenyl-3-hydroxypyrazol (Phenidone ) oder Gemische hievon erwähnt werden. Als andere Bestandteile (Adjuvantien) des geschützten physikalischen Entwicklers können Puffer, Konservierungsmittel, z.B. Oxidationsinhibitoren oder organische Stabilisatoren, Geschwindigkeitsregler, Bakterizide und dgl. mehr, wie z.B. Natriumsulfit, Natriumbisulfit, Natriumcitrat und dgl. mehr, angeführt werden.
Die Herstellung von kolloidalen Markern, insbesondere von kolloidalen Goldteilchen, deren Binden an spezifische Bindungsmittel oder an irgendwelche Mittel, die von denselben gebunden werden können, und die verschiedenen Methoden des direkten oder indirekten Verbindens dieser Marker mit den gewünschten bindungsfähigen Substanzen sind hinlänglich bekannt. Diesbezüglich sei auf die US-PS Nr. 4 313 784, auf die US-Serial No. 660 832, welche der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 158 746 entspricht; auf die US-Serial No. 744 091, welche der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 165 633 entspricht; auf "Immunohistochemistry", A.C. Cuello (Hsg.), IBRO-Handbuchreihe, Wiley, New York, 1983, Seiten 347-372; und auf "Techniques in Immunocytochemistry", Bd. 2, Seiten 217-284 (1983), verwiesen.
Im allgemeinen wird das Binden leicht dadurch bewirkt, daß man die Teilchen mit einem wäßrigen Medium mit einem entsprechenden pH-Wert in Berührung bringt, in welchem Medium die gewünschten Bindungsmittel, z.B. Antikörper, gelöst sind. Um die Teilchen vor nicht-selektiven Wechselwirkungen mit nicht-spezifischen Proteinen der Testproben zu schützen, mag es angemessen sein, Löschmittel oder Stabilisatoren, wie z.B. immunchemisch inerte polare Makromoleküle, z.B. Rinderserumalbumin (BSA), Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Polyethylenglykol (PEG), zuzugeben. Nach einer geeigneten Zeitspanne werden die nicht-stabilisierten Teilchen sowie freie oder nur locker gebundene Bindungsmittel durch wiederholtes Zentrifugieren und Waschen entfernt. Gewünschtenfalls können die Teilchen auch nach einer Verfahrensweise, die in J.Cell Biol. 90, 533-536, beschrieben ist, nach Größe sortiert werden.
Alternativ können die Proteine auch nach der Verfahrensweise, die in der US-PS Nr. 3 857 931 beschreiben ist, unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimid-Kupplungsmittels kovalent an die Marker gebunden werden.
Das Binden von Metallchelaten an Bindungsmittel wie z.B. Antikörper wird leicht unter Anwendung von Methoden durchgeführt, die z.B. in Analytical Biochemistry, 142, 68-79 (1984), und in Cancer Research, 45, 5694-5699 (1985), beschreiben sind. Im allgemeinen umfassen die Reaktionen zum Kuppeln von Komplexbildnern, wie z.B. Diethylentriaminopentaessigsäure (DTPA), Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) und dgl. mehr, an Proteine ein Diazonium-Kuppeln und eine Acylierung mit aktivierten Carboxylgruppen. Die so erhaltenen, an den Komplexbildner konjugierten Proteine behalten ihre Immunreaktivität bei und können leicht mit dem gewünschten metallischen Element beladen werden.
Als Polymere, welche als Marker für den Gebrauch im Rahmen der Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, seien die Polymerisationsprodukte von Benzidinderivaten angeführt, welche gegebenenfalls mit Metallen oder Metallverbindungen beladen sind. Die Verwendung und Herstellung von Diaminobenzidinpolymeren ist z.B. in J.Histochem. Cytochem., 30, 183-184 (1982), und in Neuroscience, 13, 513-525 (1984), beschreiben.
Die gemäß dem bevorzugten Verfahren dieser Erfindung durchzuführenden Bestimmungen können homogen oder heterogen ausgeführt werden. Homogene Bestimmungen sind besonders einfach durchzuführen, sie erfordern aber eine meßbare Änderung in dem wahrgenommenen Signal, welche Änderung entweder von jenen Markern ausgeht, die in dem markierten Reagens vorliegen, oder von jenen Markern ausgeht, die in dem markierten Aggregat vorliegen, welches zwischen dem markierten Reagens und den zu bestimmenden Teilchen gebildet worden ist. In jenen Fällen, wo eine solche Unterscheidung nicht möglich ist, wird man heterogene Bestimmungen durchführen müssen.
Homogene Bestimmungen sind aufgrund der Tatsache vorteilhaft, daß es nicht notwendig ist, die gebundenen und ungebundenen Markierten Spezies physikalisch voneinander zu trennen, wodurch die Anzahl der für die Durchführung eines Tests erforderlichen Stufen reduziert wird. Die Reaktion zwischen der markierten Komponente und dem entsprechenden Bindungsgegenstück bewirkt die meßbare Veränderung durch Teilnahme des Markers an dem signalbildenden Rest oder durch die Modulation des signalbildenden Restes, welche Veränderung für die Durchführung einer homogenen Bestimmung notwendig ist. Die Verteilung der Marker zwischen den gebundenen und den ungebundenen Spezies kann durch die Unfähigkeit oder durch die veränderte Fähigkeit dieser Marker, das Signal zu beeinflussen, welches daraus nach der Entwicklung dann entsteht, wenn die Marker in der gebundenen Spezies vorliegen, voneinander unterschieden werden.
Eine homogene Bestimmung kann zweckmäßig gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Verfahrensweisen, wie z.B. solchen der kompetitiven Bindungsmethode, durchgeführt werden. Did den Analyten enthaltende Probe wird mit einem Bindungsgegenstück des Analyten, mit einem markierten Reagens, welches einen an den Analyten oder an ein spezifisches Bindungsanalogon desselben gekuppelten Marker umfaßt, sowie mit dem physikalischen Entwickler vereinigt, der zum Umwandeln des Markers in den eigentlichen, signalbildenden Rest erforderlich ist. Alternativ kann eine Folge-Bestimmung durchgeführt werden, wobei die Probe und das Analytenbindungsgegenstück zuerst miteinander vereinigt werden und danach das Nachweisreagens zugesetzt wird.
In vielen Fällen ist es nicht möglich, homogene Bestimmungen durchzuführen. In diesen Fällen kann eine heterogene Bestmmung eine besonders anziehende Alternative darstellen. Im allgemeinen umfaßt das System für eine heterogene Bestimmung wenigstens zwei Grundbestandteile und den physikalischen Entwickler, welche gleichzeitig oder aufeinanderfolgend miteinander vereinigt werden, nämlich den nachzuweisenden Analyten, ein mit einem Marker markiertes Bindungsgegenstück und den physikalischen Entwickler, welcher notwendig ist, um den Marker in den eigentlichen, signalbildenden Rest umzuwandeln. Erforderlichenfalls nach einer entsprechenden Inkubationsperiode bzw. nach entsprechenden Inkubationsperioden ist das markierte Reagens an die entsprechende, nachzuweisende bindungsfähige Substanz gebunden, wobei das Verhältnis der gebundenen Spezies zu der ungebundenen Spezies eine Funktion der vorhandenen Menge des Analyten ist. Die gebundene Spezies und die ungebundene Spezies werden physikalisch voneinander getrennt, und die Menge des Markers, die in einer dieser Spezies vorhanden ist, wird bestimmt.
Auf dem Fachgebiet sind verschiedene Mittel für die Durchführung der Abtrennstufe und zur Durchführung der Bindungsreaktionen bekannt. Diese Abtrennung kann herkömmliche Techniken umfassen, wie z.B. die Verwendung eines Festphasen-Antikörpers oder -Antigens, eines zweiten Antikörpers oder eines zweiten Festphasen-Antikörpers; oder die Verwendung von Mitteln zur Fällung eines Immunkomplexes, von Adsorptionsmitteln und dgl. mehr. Die genannten Bindungsreaktionen können beispielsweise die sogenannte kompetitive Bindungsmethode, die Folge-Sättigungstechnik, die Sandwich-Technik und dgl. mehr umfassen.
Die bevorzugten, nach dem Verfahren dieser Erfindung durchzuführenden Bestimmungen sind heterogene Bestimmungen, welche generell auf dem Prinzip basieren, daß das zwischen dem spezifischen Bindungsprotein und den bindungsfähigen Substanzen gebildete markierte Aggregat zu irgendeinem Zeitpunkt auf solche Art und Weise immobilisiert ist, daß etwaige nicht-umgesetzte Teilchen weggewaschen werden können, wonach die immobilisierten Teilchen "in situ" nachgewiesen werden, oder gewünschtenfalls, nachdem sie ausgekuppelt worden sind, in irgendeiner anderen, davon abgeleiteten Phase nachgewiesen werden.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die nachzuweisende Bindungssubstanz, welche in einer rohen Testprobe oder in einer daraus abgeleiteten, gereinigten oder teilweise gereinigten Fraktion enthalten sein kann, auf einem entsprechenden immobilisierenden Träger immobilisiert, bevor sie an das für diese bindungsfähige Substanz spezifische markierte Bindungsmittel komplex gebunden wird.
Die Immobilisierung der bindungsfähigen Substanz kann nach den üblichen Techniken durchgeführt werden, z.B. durch Auftüpfeln einer aliquoten Menge der Testprobe auf den immobilisierenden Träger, oder durch Eintauchen dieses letztgenannten in die Testprobe und anschließendes Trocknen und gegebenenfalls Wegwaschen des nicht-immobilisierten Materials. Dies ist die sogenannte direkte Technik. Als immobilisierende Träger für diese Technik können verschiedene Materialien, nämlich im allgemeinen Polymermaterialien, verwendet werden, wie z.B. Nitrozellulose, mit Diazobenzyloxymethyl-(DBT)- und Diazophenylthioether (DPT) modifiziertes Zellulosepapier, Papier, mit Bromcyan aktiviertes Papier oder Zelluloseacetat, Agarose, Nylon, Kunststoffe und dgl., welche Materialien irgendeine Form annehmen können, welche für das Bestimmungsverfahren zweckmäßig ist, wie z.B. die Form von Blättern, Perlen, Platten mit Vertiefungen, Eintauchstäbchen und dgl. mehr.
Der Träger wird dann mit einem markierten Bindungsmittel unter Bedingungen in Berührung gebracht, welche eine Aggregatbildung zwischen dem Bindungsmittel und den diesem entsprechenden, bindungsfähigen Substanzen zulassen. Demzufolge werden die Marker an denjenigen Stellen, wo die bindungsfähige Substanz immobilisiert ist, ihrerseits in solchen Mengen immobilisiert werden, welche zu der Konzentration der immobilisierten bindungsfähigen Substanz proportional sind.
Bei einer Variante dieses Verfahrens läßt man die immobilisierte bindungsfähige Substanz zuerst mit einem ersten Bindungsmittel reagieren, welches für diese Substanz spezifisch ist, wonach die so immobilisierte Phase in Berührung mit den Markern gebracht wird, welche an ein zweites Bindungsmittel gebunden sind, welches für das erste Bindungsmittel spezifisch ist.
Da dem oben beschriebenen Immobilisierungsverfahren sowohl Selektivität als auch Spezifität fehlen, wird das direkte Verfahren gewöhnlich mit relativ reinen oder gereinigten Testproben oder Fraktionen angewendet. Für komplexere Proben wird das direkte Verfahren oft weniger gut geeignet sein, da die nicht-spezifische Immobilisierung eines großen Überschusses von unerwünschtem Material die Empfindlichkeit und Spezifität der Bestimmung stören würde.
Um dieses Problem zu vermeiden, welches im Hinblick auf Routineanalysen von Bedeutung ist, kann eine indirekte oder sogenannte Sandwich-Technik angewendet werden. Bei dieser Technik wird ein gereinigtes oder angereichertes, primäres spezifisches Bindungsmittel auf einem festen Träger immobilisiert. Der letztgenannte wird mit der Testprobe unter Bedingungen in Berührung gebracht, welche das komplexe Binden der entsprechenden bindungsfähigen Substanzen zulassen, welche in der Folge selbst immobilisiert werden. Nach dem Entfernen der Testprobe und dem Waschen des Trägers wird der letztgenannte mit einer Suspension von Markern in Berührung gebracht, die mit sekundären spezifischen Bindungsmitteln überzogen sind, welche befähigt sind, sich an die nicht komplex gebundenen Stellen der immobilisierten bindungsfähigen Substanz zu binden.
Der einfachste Fall einer Ausführungsform, auf welche die Erfindung anwendbar ist, ist eine Durchflußumgebung, die aus einer bindungsfähigen Substanz, welche direkt oder indirekt an einer festen Phase immobilisiert ist, und aus einer relativ zu der festen Phase beweglichen flüssigen Phase besteht. In Abhängigkeit von der Richtung des Fließens der flüssigen Phase in bezug auf die feste Phase kann diese feste Phase flüssigkeitsdurchlässig oder -undurchlässig sein. Beispielsweise kann als feste Phase eine durchlässige Membran verwendet werden, welche ein senkrechtes Fließen der flüssigen Phase durch diese Membran zuläßt. Anderseits kann eine undurchlässige feste Phase in Kombination mit einem seitlichen Strömen der Flüssigkeit verwendet werden.
Während der ersten Stufe der Ausführungsform wird die das markierte spezifische Bindungsmittel enthaltende flüssige Phase in Berührung mit der auf der festen Phase immobilisierten bindungsfähigen Substanz gebracht. Die Bewegung dieser flüssigen Phase relativ zu der festen Phase kann kontinuierlich oder diskontinuierlich sein, und sie muß von solcher Art sein, daß die Berührungszeit zwischen den beiden Phasen den Vorgang des Bindens zwischen der immobilisierten bindungsfähigen Substanz und dem markierten spezifischen Bindungsmittel zuläßt. Dieses Bindungsverfahren muß jedoch nicht notwendigerweise seinen Sättigungspunkt erreichen. Der Druckabfall zwischen der Quelle und dem Ziel der flüssigen Phase, welcher Druckabfall das Strömen derselben bewirkt, kann auf mehreren Wegen aufgebaut werden. Im Falle einer durchlässigen Membran als fester Phase kann ein senkrechtes Strömen dadurch geschaffen werden, daß man eine Seite dieser Membran in Berührung mit einem fluidabsorbierenden Material bringt, und daß man die flüssige Phase auf die andere Seite aufbringt. Im Falle einer nicht-durchlässigen festen Phase kann ein seitliches Strömen der flüssigen Phase durch eine Pumpe geschaffen werden.
Für die zweite Stufe wird ein geschützter physikalischer Entwickler gemäß dieser Erfindung als flüssige Phase aufgebracht. Dieser geschützte physikalische Entwickler umfaßt komplex gebundene Metallionen sowie ein Reduktionsmittel. Um das Verhältnis zwischen der markerspezifischen Reduktionsgeschwindigkeit und der Geschwindigkeit der Selbst-Kernbildung zu maximieren, werden die beiden Komponenten bis unmittelbar vor dem Gebrauch voneinander getrennt gehalten. Es sei jedoch hervorgehoben, daß im Vergleich zum Stande der Technik relativ stabile Formulierungen des physikalischen Entwicklers dadurch angefertigt werden können, daß man zwei stabile und flüssige Komponenten miteinander vermischt. In einigen Fällen mag es vorzuziehen sein, die beiden flüssigen Komponenten, von denen die eine Metallionen und einen molaren Überschuß des Komplexbildners in bezug auf die Metallionen enthält, und von denen die andere ein Reduktionsmittel enthält, nacheinander aufzubringen, und so den geschützten physikalischen Entwickler "in situ" zu bilden. In einigen Fällen können stabile und flüssige Komponenten aus den ihnen entsprechenden Trockenbestandteilen durch Hinzufügen einer angemessenen Wassermenge hergestellt werden. Im Hinblick auf die obigen Erwägungen kann der physikalische Entwickler leicht in bezug auf den verwendeten Marker, sowie hinsichtlich der erforderlichen Empfindlichkeit und der Berührungszeit zwischen der festen Phase und dem flüssigen physikalischen Entwickler optimiert werden.
Bei der bevorzugten Durchfluß-Ausführungsform sollten das Vermischen der zwei stabilen flüssigen Komponenten und das Aufbringen des so entstandenen, geschützten physikalischen Entwicklers in einem einzigen Arbeitsgang vereinigt werden. Das Aufbringen des fließenden, geschützten physikalischen Entwicklers hat eine Doppelwirkung. Zuerst wird die Flüssigkeit von der festen Phase alle verbleibenden markierten spezifischen Bindungsmittel wegwaschen, welche während der ersten Stufe überhaupt nicht oder nur locker gebunden worden sind. Da die physikalische Entwicklung des Markers ein allmählich fortschreitender Prozeß ist, wird dieses Material von der festen Phase weggewaschen worden sein, noch bevor irgendein Signal in Erscheinung tritt. Die restlichen, gebundenen markierten spezifischen Bindungsmittel bilden ein sichtbares Signal während der weiteren Berührung mit dem geschützten physikalischen Entwickler. Die Fließgeschwindigkeit und das Volumen des auf die feste Phase aufgebrachten Entwicklers können so ausgewählt werden, daß dadurch gewährleistet ist, daß die Berührungszeit für einen optimalen Nachweis der immobilisierten markierten Verbindungen lang genug ist, aber kurz genug ist, um die durch Selbst-Kernbildung verursachte, nicht-spezifische Reduktion an der festen Phase zu vermeiden. Typischerweise können diese Zeitspannen von ein paar Sekunden bis zu mehreren Minuten moduliert werden. Für die meisten geschützten physikalischen Entwickler besteht kein Bedarf nach einer zusätzlichen Behandlung oder nach einer Stufe des Fixierens, um dieses Signal permanent zu halten.
Die Vorteile dieser neuen Ausführungsform liegen auf der Hand, da dieselbe alle weiter oben beschriebenen Vorteile von physikalisch entwickelten Markersystemen auf der Basis kolloidaler Metalle, aber ohne die ebenfalls weiter oben beschriebenen, den klassischen, physikalischen Entwicklern innewohnenden Nachteile, bietet.
Durch die vorliegende Erfindung werden die mit den klassischen Entwicklern verbundenen Nachteile dadurch überwunden, daß man zu dem Entwickler einen molaren Überschuß eines Komplexbildners, vorzugsweise einen mehrfachen Überschuß, beispielsweise einen zwei- bis zwanzigfachen Überschuß, hinzufügt. Ganz abgesehen davon, daß durch die vorliegende Erfindung die Notwendigkeit sehr reiner Kontaktoberflächen, z.B. von Gefäßen, von Chemikalien mit Analysenreinheit, von ultrareinem Wasser und von Mehrfach-Vorwaschstufen eliminiert wird, wird durch die vorliegende Erfindung auch eine Erhöhung des Verhältnisses zwischen der markerspezifischen Reduktionsgeschwindigkeit und der Geschwindigkeit der Selbst-Kernbildung auf ein Mehrfaches ermöglicht. Da das Gleichgewicth stark in Richtung auf die komplexgebundene Form hin verschoben ist, ist eine stärker reduzierende Umgebung zulässig, um die für die physikalische Entwicklung notwendigen freien Metallionen zu mobilisieren. Unter diesen Umständen ist die katalytische Wirkung des Markers stärker ausgeprägt, was zu einer beschleunigten, markerspezifischen Reduktionsgeschwindigkeit führt, ohne daß dadurch die Geschwindigkeit der Selbst-Kernbildung beeinflußt würde. Das erhöhte Verhältnis zwischen der markerspezifischen Reduktionsgeschwindigkeit und der Geschwindigkeit der Selbst-Kernbildung kann auf mehreren Wegen ausgenützt werden. Im Gegensatz zum Stande der Technik kann die Empfindlichkeit dadurch erhöht werden, dßaß man den Marker länger in Berührung mit dem physikalischen Entwickler beläßt, oder es kann die Geschwindigkeit der markerspezifischen Entwicklung erhöht werden, ohne daß dadurch die Flexibilität verloren ginge, welche durch eine sichere Zeitspanne zwischen dem Zeitpunkt der optimalen Markerentwicklung und dem Zeitpunkt, zu welchen die Selbst-Kernbildung unter Ausbildung eines verstärkten Hintergrundes beginnt, geboten wird. In einigen Fällen kann eine Kombination von sowohl einer erhöhten Gesamtgeschwindigkeit als auch von einer erhöhten Empfindlichkeit durchgeführt werden. Diese Gesamtgeschwindigkeit kann leicht dadurch moduliert werden, daß man die Konzentration, Natur oder Umgebung des Reduktionsmittels verändert. Die höchstmögliche Geschwindigkeit kann man unter Verwendung sehr kleiner Marker erreichen, nämlich von Teilchen einer Größe von vorzugsweise weniger als 5 nm, z.B. von etwa 1 bis 4 nm. Für den Fall, daß gemäß der vorliegenden Erfindung Goldteilchen entwickelt werden, kann die Geschwindigkeit des Systems fehlerlos von sehr schnell (10 bis 20 s) auf langsam (30 min oder darüber) moduliert werden. Offensichtlich bietet keines der zum Stande der Technik gehörenden Verfahren solche Möglichkeiten. Die üblichen Entwicklersysteme ermöglichen nur Systeme mit durchschnittlicher (6 bis 10 min) bis niedriger Geschwindigkeit (15 bis 30 min). Bemerkt sei weiterhin, daß kleine Marker nicht nur die markerspezifische Reduktionsgeschwindigkeit erhöhen, sondern auch die Diffusionsrate der markierten Reagentien beschleunigen, und ein wirksameres Binden der Marker an die geeigneten Bindungsmittel ermögliche, was zu einer erhöhten Stabilität der markierten Reagentien in der Suspension führt.
Ein anderer Punkt, der zum Vergleich mit dem Stande der Technik noch betont werden sollte, betrifft die Möglichkeit, während der Entwicklung in einem neutralen Milieu (pH 7) zu arbeiten, was zu einer erhöhten Stabilität der zwischen den Bindungspaaren gebildeten Bindung(en) führt.
Der Nachweis der in einer bestimmten Phase des Reaktionsgemisches gebildeten Metallteilchen kann unter Anwendung zahlreicher, an sich bekannter Techniken vorgenommen werden. Diese Techniken basieren auf der Menge und/oder den physikalischen Eigenschaften der gebildeten Metallteilchen, und zwar vorzugsweise auf der Streuung und der Adsorption der Metallteilchen. Als Beispiele dieser Techniken können die spektralphotometrischen Techniken, wie z.B. die Densitometrie, angeführt werden, welche dann bevorzugt sind, wenn quantitative Bestimmungen erwünscht sind. Wegen der hohen erzielten Empfindlichkeit können die Teilchen jedoch leicht visuell, gegebenenfalls unter Verwendung eines Mikroskops, beobachtet werden.
Die spezifischen Bindungsmittel, welche bei dem bevorzugten Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden können, können von unterschiedlicher Art sein, doch werden sie in vielen Fällen Antikörper gegen spezielle Antigene oder Haptene sein. Als Beispiele für andere spezifische Bindungssubstanzen als Antikörper können Phagen erwähnt werden, welche gegebenenfalls chemisch oder genetisch zum Binden molekularer oder zellulärer Materialien adaptiert sind, Lektine, welche spezifisch Glykoproteine binden, Staphylococcus- aureus-Protein A, welches spezifisch Immunglobuline verschiedener tierischer Spezies bindet, sowie DNA- oder RNA-Sonden für die Gen-Identifizierung. Generell kann auch irgendeine andere molekulare Wechselwirkung von ausreichender Spezifität und Affinität angewendet werden. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonanl sein.
Die Bindungsreaktion zwischen dem spezifischen Bindungsmittel bzw. den spezifischen Bindungsmitteln und der bindungsfähigen Substanz bzw. den bindungsfähigen Substanzen wird man in fast allen Fällen unter milden Bedingungen ablaufen lassen. Das Reaktionsgemisch wird im allgemeinen ein wäßriges Medium sein, in welchem etwaige erwünschte organische Co-Lösungsmittel in kleinen Mengen vorliegen. Die Temperatur der Reaktion wird während der gesamten Inkubationsperiode unter normalen Umständen auf konstanter Höhe gehalten. Die Temperaturen werden im allgemeinen zwischen 0 und 50ºC, und noch üblicher zwischen 20 und 40ºC liegen. Vorzugsweise läuft die Reaktion bei Zimmertemperatur ab. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches variiert zwischen 5 und 10, und noch üblicher zwischen 6 und 9. Die Konzentration der verschiedenen Reagentien hängt von der erwarteten Analytenmenge in dem Testmedium ab, wobei diese Menge gewöhnlich zwischen 10&supmin;³ und 10&supmin;¹² M liegt. Die Auswahl der Parameter basiert in erster Linie auf einer empirisch abgeleiteten Optimierung, welche gegen die Bevorzugungen und Erfordernisse des Technikers abgeglichen wird, der letzten Endes die Tests auf Routinebasis durchführen wird. Daher ist keiner der Parameter für die vorliegende Erfindung von kritischer Natur, sondern es fallen vielmehr alle Parameter in die auf dem Fachgebiet üblicherweise angewendeten Bereiche. Wegen ihrer allgemeinen Natur haben die erfindungsgemäßen Verfahren ein äußerst breites Anwendungsgebiet. Prinzipiell können sie für die qualitative und/oder quantitative Bestimmung irgendeiner Substanz angewendet werden, welche mit dem obgenannten Marker markiert werden kann. Beispielsweise umfassen solche Substanzen, ohne Beschränkung darauf, Zelloberflächen- und Gewebeantigene von lebenden Organismen ausgeschiedene oder aus diese stammende biologische Substanzen, insbesonder biologische Substanzen, welche in biologischen Flüssigkeiten, wie z.B. Speichel, Lymphe, Blut und davon abgeleiteten Fraktionen, wie z.B. Plasma und Serum, Urin, Hirn-Rückenmarksflüssigkeit, Fruchtwasser und dgl. mehr vorkommen. Substanzen, welche nachgewiesen werden können, umfassen Proteine, Polypeptide, Peptide, wie Enzyme, Hormone, Strukturproteine, Nukleinsäuren, Vitamine, Polysaccharide, Toxine, Alkaloide, Glykoproteine, Hapten, Metaboliten, pharmakologische Mittel, Pestizide, Schadstoffe, Steroide und irgendein anderes Molekül, für welches in biologischen Systemen ein spezifisches Bindungsgegenstück vorhanden ist oder synthetisiert werden kann.
Repräsentative Protein-Analyten umfassen die Klassen von Protaminen, Mukoproteinen, Glykoproteinen, Globulinen, Albuminen, Skleroproteinen, Phosphoproteinen, Histonen, Lipoproteinen, Chromoproteinen und Nukleoproteinen. Beispiele von spezifischen Proteinen sind Prealbumin, α&sub1;-Lipoprotein, Human-Serum-Albumin, α&sub1;-Säureglykoprotein, α&sub1;-Antitrypsin, α&sub1;-Glykoprotein, Transcortin, Thyroxin-Bindungsglobulin, Haptoglobin, Hämoglobin, Myoglobin, Ceruloplasmin, α&sub2;-Lipoprotein, α&sub2;-Makroglobulin, β-Lipoprotein, Erythropoietin, Transferin, Hämopexin, Fibrinogen, die Immunglobuline, wie z.B. IgG, IgM, IgA, IgD und IgE, wobei IgG bevorzugt wird, und deren Fragmente wie z.B. Fc, Fab und F(ab)², Komplement-Faktoren, Prolactin, Blutgerinnungsfaktoren, wie z.B. Fibrinogen, Thrombin usw., Insulin, Melanotropin, Somototropin, Thyrotropin, Follikel-stimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon, Gonadotropin, Thyreoidea-stimulierendes Hormon, Plazenta-Laktogen (HPL), Intrinsic Factor, Transcobalamin, Serum-Enzyme, wie z.B. alkalische Phosphatase, Laktat-Dehydrogenase, Amylase, Lipase, Phosphatasen, Cholinesterase, Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, Glutamat-Pyruvat-Transaminase und Uropepsin, Endorphine, Enkephaline, Protamin, Gewebe-Antigene, bakterielle Antigene und virale Antigene, wie z.B. Hepatitis-assoziierte Antigene (z.B. HBsAg, HBCAg und HBeAg).
Repräsentative Hapten-Analyten umfassen die allgemeinen Klassen von Arzneimitteln oder Drogen, Metaboliten, Hormonen, Pestiziden, Schadstoffen, Vitaminen und dgl. organischen Verbindungen. Haptene Hormone umfassen Thyroxin und Triiodthyronin. Die Vitamine umfassen die Vitamine A, B, z.B. B&sub1;&sub2;, C, D, E und K, Folsäure und Thiamin. Die Arzneimittel umfassen Antibiotika, wie z.B. Aminoglykoside, z.B. Gentamicin, Tobramycin, Amidacin, Sisomicin, Kanamycin und Netilmicin, Penicillin, Tetracyclin, Terramycin, Chloromycetin und Actinomycetin; Nukleoside und Nukleotide, wie z.B. Adenosindiphosphat (ADP), Adenosintriphosphat (ATP), Flavinmononukleotid (FMN), Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) und dessen Phosphatderivat (NADP), Thymidin, Guanosin und Adenosin; Prostaglandine; Steroide, wie z.B. die Östrogene, z.B. Östriol und Östradiol, Steroide; und andere, wie z.B. Phenobarbital, Phenytoin, Pirimidon, Ethosuximid, Carbamazepin, Valproat, Theophyllin, Koffein, Propranolol, Procainamid, Chinidin, Amitryptilin, Cortisol, Desipramin, Disopyramid, Doxepin, Doxorubicin, Nortryptilin, Methotrexat, Imipramin, Lidocain, N-Acetyl-procainamid, Amphetamine, Katecholamine und Antihistaminika. Weiterhin Herzglykoside und Derivate von Benzodiazepin, Benzimidazol, Piperidin, Piperazin, Imidazol, Triazol, Pyridazin, 1,2,4-Triazindion oder 2,3,5,6-Tetrahydro-imidazo[2,1-b]thiazole oder Amide, Hydratropsäure, Derivate oder Trialkylamine.
Die Benzimidazol-Haptene umfassen Thiabendazol, Fuberidazol, Ciclobendazol, Oxibendazol, Parbendazol, Cambendazol, Mebendazol, Fenbendazol, Flubendazol, Albendazol, Oxfendazol, Nocodazol und Astemizol.
Die Piperidin-Haptene umfassen Diphenoxylat, Phenoperidin, Haloperidol, Haloperidoldecanoat, Bromperidoldecanoat, Bromperidol, Moperon, Trifluperidol, Pipamperon, Piritramid, Fentanyl, Benperidol, Droperidol, Benzitramid, Benzetimid, Domperidon, Sufentanil, Carfentanil, Alfentanil, Dexetimid, Milenperon, Difenoxin, Fluspirilen, Penfluridol, Pimozid, Lorcainid, Loperamid, Astemizol, Ketanserin, Levocabastin, Cisaprid, Altanserin, Ritanserin, 3-[2-[4-(4-Fluorbenzoyl)-1-piperidinyl]ethyl]-2,7-dimethyl-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-on, 3-[2-[4-[Bis(4-fluorphenyl)methylen]-1-piperindyl]ethyl]-2-methyl-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-on und 3-[2-[4-[[3-(2-Furanylmethyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-2-yl]amino]-1-piperidinyl]ethyl]-2-methyl-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-on.
Die Piperazin-Haptene umfassen Azaperon, Fluanison, Lidoflazin, Flunarizin, Mianserin, Oxatomid, Mioflazin, Clocinizin und Cinnarizin.
Beispiele für Imidazol-Haptene sind Metronidazol, Ornidazol, Ipronidazol, Tinidazol, Isoconzaol, Nimorazol, Miconazol, Burimamid, Metiamid, Metomidat, Fenilconazol oder Imazalil, Etomidat, Econazol, Clotrimazol, Carnidazol, Cimetidin, Doconazol, Sulconazol, Parconazol, Orconazol, Butoconazol, Triadiminol, Tioconazol, Valconazol, Fluotrimazol, Ketoconazol, Oxiconazol, Lombazol, Oxmetidin, Fenticonazol, Tubulazol und (Z)-1-[2-Chlor-2-(2,4-dichlorphenyl)ethenyl]-1H-imidazol.
Die Triazol-Haptene umfassen Virazol, Azaconazol, Etaconazol, Propiconazol, Penconazol, Itraconazol und Terconazol.
Die Pyridazin-Haptene umfassen z.B. 3-Chlor-6-[3,6-dihydro-4-(3-methylphenyl)-1(2H)-pyridinyl]pyridazin, 3-Methoxy-6-[4-(3-methylphenyl)-1-piperazinyl]pyridazin und die Verbindungen gemäß der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 0 156 433.
1,2,4-Triazindione umfassen z.B. 2-Chlor-α-(4-chlorphenyl)-4-(4,5-dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2(3H)-yl)benzolacetonitril, 2,6-Dichlor-α-(4-chlorphenyl)-4-(4,5-dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2(3H)-yl)benzolacetonitril und die Verbindungen gemäß der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 0 170 316.
Trialkylamine sind z.B. Diisopromin, Prozapin.
2,3,5,6-Tetrahydro-imidazo[2,1-b]thiazole umfassen z.B. Tetramisol oder Levamisol.
Amide umfassen z.B. Closantel, Ambucetamid, Isopropamid, Uzepidmetiodid, Dextromoramid. Ein Hydrotropasäure-Hapten ist z.B. Suprofen.
Die Zwecke der Bestimmungen können vielfältig sein. Für gewisse Anwendungen werden die Bestimmungen bloß als wissenschaftliches Werkzeug eingesetzt, um besondere Substanzen, z.B. auf histologischen Schnitten, auf Chromatogrammen, Elektrophoretogrammen, auf Blots usw. sichtbar zu machen. Beispielsweise wird beim Aufbringen verschiedener Marker auf verschiedene spezifische Proteine oder andere bindungsfähige Substanzen auf einem Chromatogramm, Elektrophoretogramm, Protein-Blot oder dgl. mehr ein Bezugsmuster erhalten, welches in vorteilhafter Weise zum Lokalisieren von anderen Proteinen oder von anderen Substanzen verwendet werden kann. Abgesehen von seiner wissenschaftlichen Nützlichkeit findet das erfindungsgemäße Verfahren in einer umfassenden Vielfalt von diagnostischen Tests Anwendung, wie z.B. in den folgenden: beim Nachweis und der Kennzeichnung von Subpopulationen von T-Lymphozyten; in Schwangerschaftstests, welche auf dem Vorliegen gewissen Hormone (Chloriongonatotropin, HCG) in Urin basieren; in diagnostischen Tests auf verschiedene Infektionskrankheiten, welche u.a. durch Pilze (Myzeten) verursacht bzw. bakteriellen und insbesondere viralen Ursprungs sind, wie z.B. Hepatitis B, Autoimmunkrankheiten, z.B. Lupus erythematodes, und Immundefekt-Krankheiten, wie z.B. AIDS, Gonorrhoe, Rubella (Röteln), Poliomyelitis und dgl. mehr; in der Diagnostik von Stoffwechselkrankheiten, Endokrinopathien und verschiedenen endogenen Krankheiten, einschließlich der Diagnostik für den Nachweis von angeborenen Fehlfunktionen bei Embryonen auf der Basis des Vorliegens von spezifischen Proteinen im Fruchtwasser.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher unter praktisch allen Umständen angewendet werden, für welche derzeit immunologische Techniken vorgesehen sind. Zusätzlich kann die vorliegende Erfindung auch für die Bestimmung und/oder den Nachweis von Akzeptorsubstanzen, wie z.B. Proteinen oder Nukleinsäuren, angewendet werden, welche in oder auf einem festen Träger direkt immobilisiert sind, und welche gemäß den Verfahrensweisen an einen kolloidalen Marker gebunden werden, welche Verfahrensweisen in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 165 633 und in Analytical Biochemistry, 145, 315-321 (1985), beschrieben sind, welche Veröffentlichungen durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen werden. Dieses Verfahren umfaßt die anschließenden Stufen des Inberührungbringens eines Trägers von Proteinen oder Nukleinsäuren während einer gegebenen Zeit mit einer ausreichenden Konzentration von in einem Medium suspendierten kolloidalen Markern, welches Medium vorzugsweise ein Detergens enthält, welches das Binden mit Proteinen oder Nukleinsäuren nicht stört, wie z.B. 0,1 % an dem nicht-ionischen Detergens Tween 20, und wobei der pH-Wert des Mediums auf einen entsprechenden Wert eingestellt worden ist; und des Zugebens eines physikalischen Entwicklers, wobei die gebildeten Metallteilchen während der Reaktion oder nach einer angemessenen Reaktionszeit quantitativ und/oder qualitativ bestimmt werden. Der physikalische Entwickler gemäß der vorliegenden Erfindung verbessert die Empfindlichkeit dieses Verfahrens, ohne daß dabei die mit den herkömmlichen Entwicklern verbundenen Nachteile auftreten.
Die erfindungsgemäßen Verfahren bieten einen Rahmen dar, der für eine umfassende Vielfalt von routinemäßigen und experimentellen Verwendungszwecken eingesetzt werden kann. Ihrer Natur nach, und wegen der Leichtigkeit ihrer Handhabung, sind die Verfahren besonders gut für einfache und schnelle, qualitative oder halbquantitative Tests geeignet. Diese Tests können auf einen Gebrauch durch erfahrene Laboratoriumstechniker obenso wie durch technisch nicht-geschultes, medizinisches Personal oder auch durch Laien ausgerichtet sein. Die Verfahren können auch leicht automatisiert werden, was ein wichtiger Faktor ist, wenn eine große Anzahl identischer Bestimmungen durchgeführt werden muß, wie z.B. in Blutbanken und in spezialisierten klinischen Laboratorien.
Die Erfindung umfaßt weiterhin Reagentiensysysteme, welche alle wesentlichen chemischen Elemente enthalten, die für die Durchführung einer gewünschten Testmethode im Rahmen der vorliegenden Erfindung erforderlich sind. Das Reagentiensystem kann dort, wo die Verträglichkeit der Reagentien dies zuläßt, als eine Zusammensetzung oder ein Gemisch in einer kommerziell verpackten Form dargeboten werden, oder es kann in der Konfiguration einer Testvorrichtung, oder als ein Testkit, nämlich als eine verpackte Kombination von einem oder mehreren Behältern, welche die erforderlichen Reagentien enthalten, dargeboten werden. Das Reagentiensystem kann die für das gewünschte System einer Bindungsreaktion geeigneten Reagentien enthalten, wobei dieses System ein markiertes Reagens und die den geschützten physikalischen Entwickler aufbauenden Lösungen umfaßt, welcher Entwickler für die Erzeugung der signalbildenden Reaktion benötigt wird. Solche Reagentien für die Bindungsreaktion können, zusätlich zu dem markierten Reagens, ein Bindungsgegenstück zu dem Analyten und so weiter umfassen. Selbstverständlich kann das Reagentiensystem andere, auf dem Fachgebiet bekannte Reagentien enthalten, welche vom kommerziellen Standpunkt und vom Standpunkt des Benützers aus erwünscht sein können, wie z.B. Puffer, Verdünnungsmittel, Standards usw.
In höherem Maße bevorzugt umfaßt die Erfindung Testkits zum Ablagern von Metallteilchen auf einem Marker, welcher die Reduktion von Metallteilchen auf einem Marker katalysiert, und welche Testkits, neben anderen Reagentien, einen geschützten physikalischen Entwickler enthalten, welcher vorzugsweise unmittelbar vor dem Gebrauch durch Vermischen von zwei gleichen Volumenanteilen hergestellt wird.

Beispiel 1

1.1 Herstellung von mit kolloidalem Gold markierten Anti-Human- Immunglobulin-(Ig)-Antikörpern

Von der Firma Janssen Life Sciences Products, B-2340 Beerse, Belgien, wurde ein Sol von kolloidalem Gold mit einem mittleren Durchmesser von 20 nm, nämlich AuroSol G20 , käuflich erworben. Durch Affinitätschromatographie gereinigte Ziegen-Anti-Human-Ig-Antikörper wurden über Nacht bei 4ºC gegen einen 5 mM Carbonat-Puffer vom pH 9,8 dialysiert. Die Acidität des Goldsols wurde mit Kaliumhydroxid auf einen pH-Wert von 9,0 gebracht. 100 ml dieses Goldsols wurden in einem Becher bei Zimmertemperatur gerührt. 1 mg der dialysierten Antikörper wurde zugegeben. Nach 2 min wurde 1 g Rinderserumalbumin (BSA) zugegeben, welches zuvor in 10 ml von 1 uM Kaliumhydroxid aufgelöst worden war. Nach weiteren 2 min wurde das Gold-Antikörper-BSA-Gemisch bei 4ºC während 1 h bei 15.000 x g zentrifugiert. Nach dem Entfernen des Überstandes wurde das Pellet erneut in 100 ml von 20 mM Tris-HCl-Puffer vom pH 8,2 mit einem Gehalt von 1 % (Gew./Vol.) BSA und 150 mM Natriumchlorid suspendiert. Diese Suspension wurde wiederum zentrifugiert, und das Pellet wurde erneut in dem gleichen Puffer auf ein Volumen suspendiert, bei welchem die optische Dichte bei 520 nm etwa 5,0 betrug.

1.2 Herstellung des geschützten physikalischen Entwicklers

Zwei flüssige Komponenten dieses Entwicklers wurden getrennt hergestellt. Die Lösung A wurde durch Auflösen von 12 g Histidin, 0,4 g Silbernitrat und 4 g Zitronensäure in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt. Die Lösung B wurde durch Auflösen von 2,88 g Natriumcitrat, 2 g Natriumsulfit, 6 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 0,5 g p-Methylaminphenolsulfat und 0,2 g p-Aminophenol.Hydrochlorid in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt.

1.3 Herstellung der adsorbierenden festen Phase

Quadrate von weißem Nitrozellulosepapier (12 x 12 mm) wurden auf Stapeln von Filtepapier (40 x 60 mm, 10 mm hoch) und in naher Berührung mit diesen Stapeln montiert. Diese Menge des FIlterpapiers war befähigt, einige ml Wasser zu absorbieren. Jeder Stapel aus Nitrozellulose-/Filterpapier wurde in eine dichte Pappschachtel mit einem Loch (Durchmesser 10 mm) an der Stelle der Nitrozellulosemembran gelegt. Dieses Loch war mit einem Kunststoffzylinder (Durchmesser 10 mm, 7 mm hoch) ausgekleidet. Die Konstruktion war eine solche, daß beim Eingießen einer Flüssigkeit in diesen Zylinder ein Strömen durch die Nitrozellulosemembran in das absorbierende Filterpapier geschaffen wurde.

1.4 Durchführung eines Nachweises von Human-Ig in einem Puffer

Es wurden Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen (10 bis 200 ug/ml) von Human-Ig in 50 mM Tris-HCl-Puffer vom pH 8.2 und mit einem Gehalt von 0,005 % BSA hergestellt. 5 ul einer solchen Lösung von Human-Ig wurden auf die Mitte der Nitrozellulosemembran aufgebracht, wobei ein nasser Fleck mit einem Durchmesser von etwa 5 mm zurückblieb, der innerhalb weniger Sekunden trocknete (Stufe der Antigen-Immobilisierung). Zu der Membran wurden 100 ul eines 50 mM Phosphat-Puffers vom pH 7,5 und mit einem Gehalt von 0,5 % BSA und 0,5 % Tween 20 zugegeben (Stufe der Säüttigung von freien Protein-Bindungsstellen). Diese Flüssigkeitsmenge bedeckte die gesamte Oberfläche der Nitrozellulosemembran, welche durch den Zylinder zugänglich war, und sie brauchte etwa 15 s, um durch die Membran zu fließen. Es wurden 100 ul der mit dem kolloidalen Gold markierten Anti-Human-Ig-Antikörper zugegeben. Nachdem dieses Volumen durch die Membran gesaugt worden war (was weitere 15 s brauchte), wurden 100 ul der Lösung A des geschützten physikalischen Entwicklers mit 100 ul der Lösung B in einem kleinen Röhrchen vermischt. Unmittelbar danach wurde dieser aktivierte Entwickler zu der Membran zugegeben. 30 s später war der Entwickler zur Gänze durch die Membran hindurchgesaugt, und der Versuch war beendet.

1.5 Ergebnisse

Das Vorliegen von Human-Ig auf der Membranoberfläche führte zu einem schwarzen Fleck (aus reduziertem Silber) an der Stelle, wo die Probe aufgebracht worden war. Rund um diesen Fleck herum blieb die Membran weiß, was das sehr niedrige Ausmaß von Hintergrundfärbung anzeigt. Wurden 5 ul der Lösung von 50 ug/ml von Human-Ig (250 ng) zugegeben, dann war das entwickelte Signal noch immer klar sichtbar. Da nicht das gesamte Ig auf diese Art und Weise adsorbiert wird, entspricht dies einer besseren Empfindlichtkeit als 12 ng/mm². Ausgehend von dem immobiliserten Antigen auf der gesättigten Membran hat die Testzeit weniger als 1 min ausgemacht.

Beispiel 2

2.1 Herstellung von an DTPA-gekuppelten Human-Immunglobulinen (huIg)

120 mg DTPA wurden während 90 min unter Bedingungen eines Umrührens in einem Gemisch aus 2 ml Acetonitril und 170 ul Triethylemin auf 50ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wurden 17,65 mg N-Hydroxysuccinimid und 24 ul Diisopropylcarbodiimid zugegeben, und das Ganze wurde während weiterer 90 min bei Zimmertemperatur gerührt. 1 ml des so entstandenen DTPA-Konjugates wurde dann mit 5 ml einer 0,1M Natriumhydrogencarbonatlösung vom pH 7,0 und mit einem Gehalt von 5 mg/ml huIg und 0,2 mM EDTA vermischt. Dieses Gemisch wurde während 60 min auf Zimmertemperatur gehalten, wobei nach jeweils 20 min ein kurzes Schütteln vorgenommen wurde. Nach dieser Inkubation wurde die Probe rasch, während einiger min, -20ºC abgekühlt und dann auf 4ºC gehalten. Anschließend wurden die huIg- und die DTPA-huIg-Moleküle von dem nicht-umgesetzten DTPA-Konjugat durch Gelfiltration auf einer Sephadex -G100-Säule mit einer 0,1M Natriumacetatlösung vom pH 5,0 abgetrennt.

2.2 Herstellung von mit Silber markiertem DTPA-huIg

1 ml von DTPA-huIg (optische Dichte bei 280 nm = 1,0) wurde mit 10 mM Kaliumhydroxid auf einen pH-Wert von 10,7 gebracht, und Tropfen einer 0,1M Silbernitratlösung wurden so lange zugesetzt, bis die ersten Anzeichen eines Niederschlages offensichtlich wurden. Eine Kontrollprobe wurde durch Zugabe von Silbernitrat zu DTAP-huIg bei einem pH-Wert von 5,4 hergestellt, nämlich unter Bedinungen , von denen bekannt ist, daß sie für das Binden von Silberionen durch DTPA ungünstig sind. Diese Gemische wurden bei Zimmertemperatur während 24 h inkubiert, bevor die Abtrennung der Ag-DTPA-huIg- und DTPA-huIg-Moleküle von den freien Silberionen durch Gelfiltration auf einer Sephadex -G25-Säule mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (50 mM Phosphatpuffer vom pH 7,5 mit einem Gehalt an einer physiologischen Konzentration an Natriumchlorid) vorgenommen wurde.

2.3 Herstellung des geschützten physkalischen Entwicklers

Zwei flüssige Komponenten dieses Entwicklers wurden getrennt hergestellt. Die Lösung A wurde durch Auflösen von 8 g Imidazol, 0,18 g Silbernitrat, 1,4 g Natriumcitrat (.2H&sub2;O) und 3,6 g Zitronensäure (H&sub2;O) in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt. Die Lösung B wurde durch Auflösen von 3,3 g Natriumcitrat (.2H&sub2;O), 1,5 g Zitronensäure (H&sub2;O), 1,6 g Hydrochinon und 0,75 g Natriumsulfit in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt.

2.4 Sichbarmachen von Ag-DTPA-huIg

Als Immobilisierungsmatrix wurden Streifen aus weißem Nitrozellulosepapier (5 x 30 mm) verwendet. Zwei 1 ul-Tropfen von Ag-DTPA-huIg-Lösung (optische Dichte bei 280 nm = 1,0) und zwei 1 ul-Tropfen von DTPA-huIg-Kontrollösung (siehe 2.2) wurden auf jeden Nitrozellulosestreifen als vier verschiedene Flecken aufgebracht. Die ungesättigten Protein-Bindungsstellen dieser Streifen wurden durch Inkubieren der Streifen während 5 bis 10 min in einem 50 mM-Phosphatpuffer vom pH 7,5 und mit einem Gehalt von 0,5 % BSA (Rinderserumalbumin) und 0,1 % Tween 20 blockiert. Die tatsächliche Entwicklung wurde durch Vermischen von 1 ml der Entwickerlösung A mit 1 ml der Entwicklerlösung B in einem 10 ml-Proberöhrchen und Inkubieren des betüpfelten und gesättigten Streifens darin vorgenommen. Die Entwicklungsarbeitsgänge wurden bei Zimmertemperatur währernd 30 min sowie während 24 h vorgenommen. Nach der Entwicklung wurden die Streifen kurz mit destilliertem Wasser gespült und an der Luft getrocknet.

2.5 Ergebnisse

Nach einem 30-minütigen Entwickeln waren die Ag-DTPA-huIg-Flecken grau gefärbt, während die DTPA-huIg-Kontroll-Flecken und der Hintergrund überhaupt nicht gefärbt waren. Nach einem 24-stündigen Entwickeln waren die Ag-DTPA-huIg-Flecken viel intensiver gefärbt, während die Kontrollflecken oder der Hintergrund überhaupt nicht gefärbt waren. Dieses Beispiel zeigt die Spezifität des Sichtbarmachens dieses Markers mit einem physikalischen Entwickler. Ähnliche Versuche zeigten, daß die Ag-DTPA-huIg-Moleküle das gleiche Immunbindungsverhalten wie die huIg-Moleküle selbst aufweisen.

3.0 Sichtbarmachung von Diaminobenzidinpolymeren

Streifen aus Nitrozellulose wurden mit Mäuse-IgG betüpfelt (1 ul-Tupfen, ausgehend von 250 ug Ig/ul).
Nach einem 30-minütigen Blockieren bei 37ºC mit 5%igem BSA wurden die Streifen während 60 min mit mit Peroxidase markiertem Ziegen-Anti-Mäuse-IgG inkubiert. Nach drei jeweils 3 min dauernden Waschvorgängen mit 0,05M Natriumphosphatpuffer vom pH 7,5 und mit einem Gehalt von 5 g/l BSA - 0,5 ml/l Tween, wurden die Streifen dreimal mit Wasser gewaschen.
Eine Substratlösung wurde durch Auflösen von 100 mg Diaminobenzidin in 4 ml eines Phosphatpuffers (5,75 g Na&sub2;HPO&sub4; + 1,48 g NaH&sub2;PO&sub4;.2H&sub2;O/l Wasser) hergestellt. 0,5 ml dieser Lösung wurden vor dem Gebrauch mit 25 ml des gleichen Phosphatpuffers und 75 ul 3%igem H&sub2;O&sub2; vermischt. Die Streifen wurden während 9 min entwickelt. Nach dem Waschen wurden die Streifen während 6 min mit einer 0,03%igen HAuCl&sub4;-Lösung behandelt. Nach drei jeweils 3-minütigen Waschvorgängen wurden die Streifen in einer 0,142%igen Lösung von Na&sub2;S eingeweicht. Nach drei jeweils 3-minütigen Waschvorgängen in Wasser wurde die Silberverstärkung durch Vermischen von 0,5 ml der Lösung A und 0,5 ml der Lösung B, welche oben unter Punkt 2.3 beschrieben sind, mit 1 ml einer (0,25%igen) Lösung von Triton X-100 (in Wasser) vorgenommen.

3.1 Ergebnisse

Nach einer 8-minütigen Verstärkung wurde ein starkes, dunkles (schwarzes) Signal erhalten. Dieses Beispiel zeigt deutlich, daß der geschützte physikalische Entwickler gemäß der vorliegenden Erfindung viel einfacher als die klassischen Entwickler zu gebrauchen ist. Um ähnliche Ergebnisse mit klassischen Entwicklern zu erzielen, braucht man mehrere Zugabestufen, und man muß die äußerste strengen Vorkehrungen treffen, die im Zusammenhang mit dem Gebrauch von klassischen Entwicklern bekannt sind, nämlich z.B. ein ultrareines Glasgeschirr verwenden.

Claims

1. Verfahren zum Aufbringen von Metallteilchen auf einen Marker, welcher die Reduktion von Metallionen aus einem physikalischen Entwickler katalysiert, und bei welchem Verfahren der Marker an wenigstens eine Komponente eines Aggregates gebunden ist, welches zwischen wenigstens einem spezifischen Bindungsmittel und der diesem entsprechenden, bindungsfähigen Substanz gebildet worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete physikalische Entwickler eine Lösung von Metallionen, einen molaren Überschuß, in bezug auf die Metallionen, an einer heterocyclischen Base, als Komplexbildner, und ein Reduktionsmittel umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei dieses Aggregat mit einem physikalischen Entwickler in Berührung gebracht wird, wodurch unter dem Einfluß des Markers ein Metallteilchen ausgebildet wird, welches qualitativ oder quantitativ bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Akzeptorsubstanz auf oder in einem festen Träger direkt immobilisiert wird, und wobei die Akzeptorsubstanz mit einem Marker markiert ist, und wobei dieser Marker mit einem physikalischen Entwickler in Berührung gebracht wird, wodurch unter dem Einfluß des Markers ein Metallteilchen ausgebildet wird, welches qualitativ oder quantitativ bestimmt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die verwendeten Marker Metalle, Metallverbindungen oder Polymere sind, welche gegebenenfalls mit Metallen oder Metallverbindungen überzogen oder imprägniert sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die verwendeten Marker entweder kolloidale Gold-, Silber-, Thallium-, Platin- oder Palladiumteilchen; komplexe Gold-, Silber-, Thallium-, Platin- oder Palladiumionen; oder Polymerisationsprodukte von Benzidinderivaten sind, welche gegebenenfalls mit Metallen oder Metallverbindungen imprägniert sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Komplexbildner Histidin, Imidazol, Benzimidazol, Pyrazol, Pyridin, Aminopyridin, Nicotinamid, Chinolin oder Purin ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Metallionen der physikalischen Entwickler Silber-, Gold-, Platin-, Palladium- oder Thalliumionen sind.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Reduktionsmittel des physikalischen Entwicklers 1,2-Dihydroxybenzol, 1,4-Dihydroxybenzol, 4-Methylaminophenolsulfat, 4-Aminophenol, 1,4-Diaminobenzol, 1,2-Diaminobenzol, N-(4-hydroxyphenyl)glycin, 2,4-Diaminophenol, 1-Phenyl-3-hydroxypyrazol oder ein Gemisch aus zweien oder mehreren dieser Komponenten ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der physikalische Entwickler durch Vermischen von:

a) einer Lösung, welche ein Reduktionsmittel und gewünschtenfalls ein Puffersystem und ein oder mehrere Adjuvantien enthält; und

b) einer Lösung, welche Metallionen, einen Überschuß, in bezug auf die Metallionen, an einer heterocyclischen Base, als Komplexbildner, und gewünschtenfalls ein Puffersystem und ein oder mehrere Adjuvantien enthält; erhalten worden ist.

10. Verfahren nach Ansprüche 1, wobei die Kompenenten der Reaktion zwischen einem spezifischen Bindungsmittel und der entsprechenden bindungsfähigen Substanz Antikörper, Haptene oder Antigene sind.

11. Verfahren nach Anspruch 2, welches die folgenden Stufen umfaßt:

a) direktes oder indirektes Immobilisieren des spezifischen Bindungsmittels oder der entsprechenden bindungsfähigen Substanz auf einem festen Träger;

b) Inberührungbringen des Trägers mit dem jeweiligen Gegenstück zu dem spezifischen Bindungsmittel oder zu der entsprechenden bindungsfähigen Substanz, welches Gegenstück mit einem Marker markiert ist, der die Reduktion der in der Form eines Komplexes vorliegenden Metallionen aus dem physikalischen Entwickler katalysiert; und

c) Zugabe des physikalischen Entwicklers, gegebenenfalls nach Auftrennen der gebundenen und freien, markierten Komponenten, wodurch während der Reaktion oder nach einer angemessenen Reaktionszeit die gebildeten Metallteilchen in der Testprobe und/oder in den davon abgeleiteten Fraktionen quantitativ und/oder qualitativ bestimmt werden, un eine qualitative und/oder quantitative Anzeige der zu bestimmenden Komponente(n) zu ergeben.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die bindungsfähige Substanz dadurch auf dem festen Träger immobilisiert wird, daß man die bindungsfähige Substanz von einem spezifischen Bindungsmittel, welche auf dem festen Träger immobilisiert ist, binden läßt.

13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das mit einem Marker markierte Gegenstück und der physikalische Entwickler Teil einer flüssigen Phase sind, welche relativ zu der festen Phase beweglich ist.

14. Verfahren nach Anspruch 2, welches die folgenden Stufen umfaßt:

b) Inberührungbringen des Trägers, welcher die immobilisierte, bindungsfähige Substanz enthält, mit einem für diese bindungsfähige Substanz spezifischen, ersten Bindungsmittel, zur Bildung eines Aggregates mit dieser bindungsfähigen Substanz;

c) Inberühungbringen des Trägers, welcher das so gebildete Aggregat trägt, mit einem zweiten Bindungsprotein, welches mit einem Marker markiert ist, der die Reduktion der in der Form eines Komplexes vorliegenden Metallionen aus dem physikalischen Entwickler katalysiert, und welches zweite Bindungsprotein spezifisch für das erste Bindungsprotein ist; und

d) Zugabe des physikalischen Entwicklers, gegebenenfalls nach Auftrennen der gebundenen und freien, markierten Komponenten, wodurch während der Reaktion oder nach einer angemessen Reaktionszeit die gebildeten Metallteilchen in der Testprobe und/oder in den davon abgeleiteten Fraktionen quantitativ und/oder qualitativ bestimmt werden, um eine qualitative und/oder quantitative Anzeige der zu bestimmenden Komponente(n) zu ergeben.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das erste Bindungsmittel, das zweite, mit einem Marker markierte Bindungsprotein und der physikalische Entwickler Teil einer flüssigen Phase sind, die relativ zu der festen Phase mobil ist.

16. Verfahren nach Anspruch 3, welches die folgenden Stufen umfaßt:

a) Immobilisieren der Akzeptorsubstanz auf einem festen Träger;

b) Inberührungbringen des Trägers mit einer Suspension, welche eine Lösung von kolloidalen Markern enthält, und welche wenigstens eine Substanz enthält, welche das Binden des Markers an die Akzeptorsubstanz fördert;

c) Zugabe des physikalischen Entwicklers, wodurch während der Reaktion oder nach einer angemessene Reaktionszeit die gebildeten Teilchen quantitativ und/oder qualitativ bestimmt werden.

17. Testkit zum Aufbringen von Metallteilchen auf einen Marker, welcher die Reduktion von Metallionen aus einem physikalischen Entwickler katalysiert, nach dem in einem der Ansprüche 1 bis 6 beanspruchten Verfahren, und welcher Testkit dadurch gekennzeichnet ist, daß der physikalische Entwickler eine Lösung umfaßt, welche Metallionen, einen Überschuß, in bezug auf die Metallionen, an einer heterocyclischen Base, als Komplexbildner, und ein Reduktionsmittel enthält.

18. Lösung zum Aufbringen von Metallteilchen auf einen Marker, welcher die Reduktion von Metallionen aus einem physikalischen Entwickler nach dem in einem der Ansprüche 1 bis 16 beanspruchten Verfahren katalysiert, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung Metallionen, einen molaren Überschuß, in bezug auf die Metallionen, an einer heterocyclischen Base, als Komplexbildner, und ein Reduktionsmittel enthält.