JPS6166964A - タンパク質又は核酸の高感度検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、支持体中に電気泳動分離され九生体成分の高
感度検出方法に関する。更に詳しくは、支持体中に電気
泳動分離されたタンパク質あるいは、核酸のような生体
成分を微量でも検出可能とする方法に関する。

〔従来の技術〕

血漿、尿、脳を髄液、羊水等の体液中のタンパク質や、
Ｉ）ＮＡ、　ＲＮＡ等の核酸などの検出及び同定には、
支持体を用い九電気泳動法が広く利用されており、生化
学、生物学、及び臨床医学の分野の研究に大きな貢献ｔ
してきた。

通常、支持体としては、ゼラチン、寒天ゲル、濾紙、デ
ンプンゲル、セルロースアセテート膜、ポリアクリルア
ミドゲル、アガロースゲル等が用いられ、電気泳動法に
は、ゲル電気泳動、５ＤＥＩ電気泳動、等電点電気泳動
、免疫電気泳動等がある。ま九、二次元電気泳動により
、血漿タンパクのような複雑な組成のタンパク質混合物
からの分離も可能となった。

電気泳動分離されたタンパク質を検出する方法として、
従来色素により染色して行っていた。

最も普通に用いられている染料は、クーマツジ−ブリリ
アントブルーであり、その他に、アンドブラック、クリ
スタルバイオレット及びファヌトグリーン等が使用され
ている。ま九、電気泳動分離されたＤＮＡやＲＮＡ１ｊ
、エチジウムプロマイトによる染色が行われている。し
かし、これらの染色法では、検出感度が低いため、尿や
脳を髄液のようなタンパク質濃度の低い試料？分析する
場合には、泳動前に濃縮操作が必要であり、そのため分
析の操作が煩雑となり、また。

濃縮時に、成分の変化を伴うという欠点がある。

また、高感度検出という点から、ラジオアイソトープに
よる標ｍｔして、検出することが行われ、オートラジオ
グラフィーとして用いられているが、放射性物質？取扱
うことから、実験操作上の危険性、複雑さに加えて、ア
イソトープの廃棄の問題等容易に行える技術とは、いい
難い。

近年、電気泳動により分離されたタンパク質及び核酸等
の高感度検出方法として例えば銀染色法が開発された。

銀染色法の工程は、主に支持体中で分離されたタンパク
質あるいは核酸を固定する工程、銀イオン又は釧錯イオ
ン溶液に浸漬して、銀と結合させる工程、及び還元剤で
処理する工程からなる。その例としては、クリニカル　
ケミストリー　アクタ（Ｃｌ１ｎｉｃａ’ＩＣｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　Ａｃｔａ　’）　　第３８巻第４６５〜４６
７頁（１９７２）、アナリチカル　バイオケミスト　リ
　−（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　　’）　　第　９８　巻第２３１〜２３７頁（１
９７９）、エレクトロフオレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｒｅｓｉｓ　’）第２巻第１３５頁及び第１４１頁（
１９８１）、及び同第３巻第１７〜２３頁（１９８２）
婢の文献に記載された諸方法があり、また「生化学」第
５２巻第４１１〜４１３頁（１９８０）、「臨床検査」
第２６巻第２１３〜２２２頁（１９８２’ｌ及び「蛋白
質・核酸・酵素」第７２巻第１２７７〜１２７９頁（１
９８２）等の総説がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

これらの銀染色法は、前記の色素染色による検出方法に
比べると高感度であるが、いまだ十分な検出力があると
はいい難い。

本発明の目的は、電気泳動により分離された生体成分、
特にタンパク質及び核酸を金属染色法により染色した後
、高感度な検出を可能とする検出方法？提供することに
ある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は分離タンパク質又は核酸
の高感度検出方法に関する発明であって、電気泳動によ
り分離された支持体中のタンパク質又は核ａｔ金属染色
法により染色する工程、及び得られ念金属核に、酸化反
応により色変化を呈する物質の存在下、補力剤を作用さ
せて、該金属核上で検知可能な化合物を形成させる工程
の各工程を包含することを特徴とする。

本発明方法における金属染色法で用いる金属塩の例には
、硝酸銀、アンモニア性硝酸銀、シュウ酸銀、塩化第二
金酸、塩化白金酸、塩化パラジウム酸、塩化ロジウム酸
、塩化イリジウム酸、塩化銅、臭化ニッケル、塩化クロ
ム及び塩化鉄のような、銀、白金、金、パラジウム、イ
リジウム、ロジウム、ルテニウム、オスミウム、銅、ニ
ッケル、クロム及び鉄よりなる群から選択した少なくと
も１種の金属を含む水溶性金属塩がある。また、金属染
色法により染色する工程は、支持体中で分離されたタン
パク質又は核酸を固定する工程、金属塩の水溶液中に浸
漬して該金属イオンと結合させる工程、及び還元剤で処
理する工程の各工程を包含するものである。

本発明でいう酸化反応とは、酸化反応を受けてそれ自身
が色変化を呈して検知可能な物質を形成する反応のみな
らず、ある種の化合物が酸化反応を受けた後、該酸化体
が更にある種の発色剤とカップリング反応をして検知可
能な化合物を形成する反応をも包含する。本発明におい
て検知可能な化合物としての好ましい例は色素である。

し九がって以下の説明では色素を例にとって説明するが
、これらに限定されるものではない。

金属による染色後に、酸化反応により色変化を呈する物
質（以後、色素前駆体と称する。）を含浸させ、次に補
力剤を作用させると、金属核上で色素前駆体が酸化を受
け、色素が形成さ属 れ、結果として、タンパク質及び核酸を全４２ス色素に
より染色することができる。

本発明でいう補力剤の１例としては、米国特許第五６７
４．４９０号、同第ム７６５．８９０号、同第１７７６
．７５０号各明細書等に記載されている過酸化物、例え
ば、過酸化水素、過ホウ酸塩、過炭ｒｆ！塩、過硫酸塩
等の無機過酸化物及び、過酸化ベンゾイル等の有機過酸
化物が挙げられる。また、米国特許第＆７６５．８９１
号、同第４８２へ６５２号、同第五８３４．９０７号、
同第Ａ７４ａ１３８号各明細書及び特開昭５２−７７２
８号公報等に記載されているコバルト釦錯体が挙げられ
る。コバルト原子に配位している配位子としては、はと
んどすべてのルイス塩基がコバルト錯体の配位子となり
得るが、特に有用な配位子としては、エチレンジアミン
（ｏｎ）、ジエチレントリアミン（ｄｉｅｎ　）、トリ
エチレンテトラミン（ｔｒｌｅｎ）、アンミン（Ｎｕｓ
　）ナイトレート、ナイトライド、アジド、クロライド
、チオシアネート、インチオシアネート、水、カーボネ
ート、及びエチレンジアミン四酢酸等から選ばれる。例
えば、下記に示したコバルト錯体が利用できる。

［ｃｏ（ＮＨ３）ＩＩＸＯＩＸ　、　　　［Ｏｏ（Ｎｌ
（１）ｇｃＯ１］Ｘ　。

（００（ＮＨＩ）ＩＣ！ｔ］Ｘ　、　　　　（ｃｏ（ｎ
ｕ、）４ｃｏ３ＩＸ、（Ｃｏ（ｏｎ）ｓ：ＩＸ　　、　
　　　　　　　シス−［０ｏ（ｅｎ）２（Ｎｓ）１１Ｘ
　　、トランス−（Ｃｏ（ｅｎ）１０ｔ（ＮＯｆ３）Ｉ
Ｘ　　。

トランス−［Ｃｏ（ｏｎ）＊　（Ｈｓ）ｔ〕Ｘ　　、シ
ス−［０ｏ（ｏｎ）ｘ（ＮＨｓ）Ｎｓ〕！　　、　　　
シス−（Ｏｏ（ｏｎ　）ｚｏ１ｇ〕Ｘ　　。

トランス−（Ｏｏ（ｏｎ　）ｚｃｚｔ］ｘ　　、　　（
（！ｏ（ｏｎ）１（８ＯＮ）１）！　　、（Ｏｏ（ｏｎ
）２（ＮＯ８）ＩＩＸ　、　　［（！ｏ（ｔｒｉａｎ）
ｌ〕Ｘ　。

［０ｏ（ｔｒｉｅｎ）１（ｏｎ）１Ｘ　、　　［ｃｏ（
ｔｒｌｅｎ）（ｅｎ）意］Ｘ　。

〔（Ｈ，Ｎ　）、ｃｏ−ｏ−ｏ−ｃｏ　（ＮＨｓ　）ｓ
　〕ＩＸ（：ｃｏ（ｅｎ）！（ｄｉｅｎ）］Ｉ ＸここでＸは、電荷を中和するのに必要な、１個又はそ
れ以上の数のアニオンを表わす。）更に、補力剤として
は、特開昭５１−５３８２６号、同５１−９９０２２明
細公報に記載されている亜塩素酸、亜塩素酸塩、亜臭素
酸、亜臭素酸塩及び二酸化塩素水が挙げられる。また、
子を表わす）を有する化合物、例えば、Ｎ　−／・ロゲ
ンフタルイミド、Ｎ−ハロゲンスクシンイミド、Ｎ−ハ
ロゲンサッカリン、クロラミン−Ｂ及びクロラミン−Ｔ
等が挙げられる。

また、特開昭５２−７９９２８号公報に記載されている
、周期表第■）族の遷移金属錯体、例えば、Ｎａｓ［Ｖ
ｏ（Ｏ雪）（０＊０４）鵞］ＨｚＯ、Ｋｓ　（Ｖ（０＊
）ｓ（Ｃｘ　”４　）］Ｈ２０、Ｋ３［Ｎｂｏ（Ｏｔ）
ｔ（（！ｔｏ＊）ｔ］Ｈｔｏ　　等が挙けられる。また
特開昭５３−５６２６号公報に記載されているモリブデ
ン及びタングステン錯体、例えば、 Ｋ＊Ｃ１ｈＯ４（ＯｍＯ＊）鵞（ＨｘＯ）ｔ〕　、　　
Ｎ　！Ｌ霊［Ｍ　（０１）ＯＯ１４］　　、Ｋ４（ＭＯ
，（（ＯＨ富０００　）ｌＮＯＲ１ＯＨＩＮ　（（Ｅ（
Ｉ　Ｃｏｏ　）＊　）ＭＯｓ　〕（ただし、ＭＦｉ、Ｍ
Ｏ又はＷｔ−表わす。）等が挙げられる。

また、特開昭５２−７３７５１号公報に記載されている
多価コラ素化合物も利用できる。

更にまた、特開昭５２−２００２５号、同５２−５０４
３０明細公報に記載されている方法、すなわち、Ｏｏ＠
）錯体と過酸化水素とを組合せて用いてもよい。

前 他方、本発明で用いられる色す体としては、酸化反応に
より色素を生成するような有機化合物が挙げられる。例
えば、特公昭４９−４６４１９号公報に記載されている
化合物を利用することができる。すなわちアミノ及び／
又はヒドロキシ置換子り−ル化合物（例えばベンゼン系
又はナフタリン系の該化合物）、アミノ及び／又はヒド
ロキシ置換複素環式化合物（例えば、ビロール系、ピリ
ジン系、ピラゾール系、イミダゾール系、トリアゾール
系、ピリダジン系、ピリミジン系又は、ピラジン系、イ
ンドール系、インダゾール系、キナゾリン系、キノキサ
リン系、アクリジン系、フェナジン系の環ヲ有する化合
物）が挙げられる。具体的には、フェノール、アニリン
、ヒロカテコール、レゾルシノール、ヒドロキノン、ｏ
−ｌｍ−及びｐ−フェニレンジアミン、坑Ｎ−ジエチル
ーフェニレンジアミン、ｏ−ｌｍ−及びｐ−アミノフェ
ノール、ｐ−メチルアミノフェノール、２．４−ジアミ
ノフェノール、１．７−１１．５−又ｉｊ：　２．３−
ジヒドロキシナフタリン、ｔ６．７−）リヒドロキシナ
フタリン、１．２−ジアミノナフタリン、１．８−ジア
ミノナフタリン、ベンジジン、２．２−ジヒドロキシベ
ンジジン、２．４−ジアミノジフェニルアミン、五８−
ジヒドロキシキノリン、５−ヒドロキシキノリン、２−
ヒドロキシカルバゾール、１−フェニルピラゾロン等が
挙げられ、これらのアミン、ヒドロキシ、及びアミノヒ
ドロキシ化合物は、更に他の置換基を有してもよい。

これらの化合物は、数種混合して用いることにより、個
々の成分よりも、酸化時に強力な、染料生成作用を示す
ことがあり、例えば、ｏ−フェニレンジアミンとピロカ
テコールとの混合物、ＩＮ−ジエチルフエニレンジアミ
ントヒロカテコールとの混合物等である。芳香族のアミ
ノ、ヒドロキシ及び／又はアミノヒドロキシ化合物の酸
化によりキノンイミン系及びアジン系の単量体又は重合
体である染料が生ずる。また酸化により染料に変換でき
るバット染料及び無色染料化合物（ロイコ色素）も用い
ることができる。

他の化合物との一連の反応を行ったとｔ＆に、色素を形
成するような酸化可能な有機化合物も用いることができ
、一般にカップリングによ〕色素を形成する反応系が利
用できる。例えば、フェニレンジアミン系又はアミノピ
ラゾロン系のいわゆる写真用発色現像主薬が用いられる
。

この点については、例えば、Ｔ、Ｈ，ジエムス（Ｔ。

Ｈ，Ｊａｍｅｓ　）著ｒザ・セオリー・オブ・ザ・フォ
トグラフィック・プロセスＪ　（Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ
　ｏｆｔｈｅ　Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｏ　Ｐｒｏｃｅ
ｓｓ　）（第４版）２９１頁に詳しい。ま九、炭素環式
及び複素環式ヒドラジン類も適当な成分とのカップリン
グにより色素を形成することができる。

本発明に用いる写真用発色現像主薬の例としては、芳香
族第１級アミン発色現像主薬、特に、ｐ−フェニレンジ
アミン系発色現像主薬が好ましく、米国特許第４７９１
．８２７号明細書に記載されているオニウム塩を形成し
たｐ−アミノフェノール系現像主薬、米国特許第２．９
８　Ｋ　６０６号明細書に記載されている色素現像薬等
も用いることができる。ｐ−７１二レンジアミン系発色
現像主薬の具体例としては、例えば４−アミノ−＼１−
ジエチルアニリン、３−メチル−４−アミノ−Ｎ、Ｎ−
ジエチルアニリン、４−アｉ　／　−Ｂ＋−エチル−Ｎ
−β−ヒドロキシエチルアニリン、３−メチル−４−ア
ミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチルアニリン
、３−メチル−４−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタ
ンスルホンアミドエチルアニリン、３−メチル−４−７
ミ／−Ｎ−エチル−Ｎ−β−メトキシエチルアニリン、
３−β−メタンスルホンアミドエチル−４−アミノ−Ｎ
、　Ｎ−ジエチルアニリン、３−メトキシ−４−アミノ
−Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチルアニリン、３
−メトキシ−４−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−β−メトキ
シエチルアニリン、３−アセトアミド−４−アミノ−Ｍ
、Ｎ−ジエチルアニリン、４−アξノーＮ、Ｎ−ジメチ
ルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ（１Ｓ） 一β−〔β−（β−メトキクエトキシ）エトキシ〕エチ
ルー３−メチル−４−アミノアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ
−β−（β−メトキシエトキシ）エチル−３−メチル−
４−アミノアニリンやこれらの塩例えば硫酸塩、塩酸塩
、亜硫酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などである。

また、これら発色現像主薬は、特開昭５８−１２９４Ｆ
ｉｎ号公報等圧記載されるように１フ工ニドン誘導体等
の黒白現像主薬を組合せて使用してもよい。

これら写真用発色現像主薬は、金属核上で補力剤の作用
により酸化され、その酸化生成物は、あらかじめ支持体
中又は処理液中に存在させておいた写真用カプラーと反
応し、色素を形成することができる。この目的の穴めに
任意のカラーカプラーが利用でき、シアンカプラーとし
て例えばフェノール系又はナフトール系カプラーが挙げ
られ、マゼンタカプラーとして例えば、５−ピラゾロン
系カプラーが挙げられ、その他インダシロン系又はシア
ノアセチル系カップ−も挙げられる。また黄色カプラー
として例えば、開鎖ケトメチレン系カプラーが挙げられ
、更に黒色カプラーとして例えば、ｍ−アミノフェノー
ル系カプラー等が挙げられる。

本発明の検出方法においては、酸化反応により色変化を
呈する物質は支持体中に含浸させるのが好ましい。この
場合、支持体を酸化反応により色変化を呈する物質の溶
液中に浸漬させる方法、あるいは該溶液をスプレーする
方法等がある。

補力剤を金属核に作用させる方法としては、上記と同様
に１溶液（補力液）を用いる浸漬又はスプレー等の方法
がある。

オた、酸化反応によυ色変化を呈する物質と補力剤とを
同一溶液として、１回の操作で支持体中に含浸させるこ
ともできる。

本発明の方法において、電気泳動分離され九タンパク質
又は核酸全染色する処理工程は、通常、 （１）電気泳動工程−固定化工程−金属イオンとの結合
工程−還元工程−補力工程 （２）電気泳動工程−固定化工程−金属イオンとの結合
工程−還元・補力工程 を基本としている。更に１電気泳動後の各工程の前後に
水洗工程を設けてもよい。

色素前駆体溶液及び補力液には、苛性ソーダ、苛性カリ
、炭酸ソーダ、炭酸カリ、第三リン酸ソーダあるいはカ
リ、メタホウ酸カリ、ホウ砂等のアルカリ剤や、リン酸
水素二ナトリウムあるいはカリ、リン酸二水素ナトリウ
ムあるいはカリ、重炭酸ソーダあるいはカリ、ホウ酸、
酢酸ナトリウムあるいはカリ、硫酸ナトリウムあるいは
カリ等の種々の塩を適時選んで含有してよい。

また、補力剤全作用させる直前の工程、あるいは作用時
の工程にカプリ防止剤を添加することができる。カプリ
防止剤としては、臭化カリウム、臭化ナトリウム、ヨウ
化カリウム、ヨウ化ナトリウムのようなアルカリ金属ハ
ロゲン化物及び有機カプリ防止剤が使用できる。有機力
ブリ防止剤としては、含窒素複素環化合物（例工ば、ペ
ンツトリアソール、６−ニトロベンゾイミダゾール、５
−ニトロインインダノール、５−メチルベンツトリアゾ
ール、５−ニトロベンゾトリアゾール、５−クロロベン
ゾトリアゾールなど）、メルカプト置換複素環化合物（
例えば、１−フェニル−５−メルカプトテトラゾール　
２−メルカプトベンゾイミダゾール、２−メルカプトベ
ンゾチアゾールなど）メルカプト置換芳香族化合物（例
えばチオサリチル酸など）を挙げることができる。

添加ｉは、溶液１を当り１■〜５ｔの範囲で使用する。

また、色素前駆体溶液及び補力液には、アルカリ金属の
亜硫酸塩のような保恒剤、ベンジルアルコールやジエチ
レングリコールのような有機溶剤、ポリエチレングリコ
ール、四級アンモニウム塩、アミン類のような現像促進
剤を含有させてよい。

また、使用する水の硬度によっては、必要に応じてヘキ
サメタリン酸ソーダあるいはカリ、テトラポリリン酸ソ
ーダあるいはカリのようなポリリン酸化合物、又は、エ
チレンジアミン四酢酸、ニトリロトリ酢酸、Ｎ−ヒドロ
キシメチルエチレンジアミン三酢酸のようなアミノポリ
カルボン酸等の硬水軟化剤を含有させてよい。

また、補力液の安定化のために、特開昭５５−１９８２
９号、同５３−２６１２４明細公報に記載されている、
有機ホスホン酸類、ポリビニルピロリドン又はポリビニ
ルアルコールヲ含有させてもよく、また特開昭５３−８
１５５号公報に記載されているアミンオキシド類を含有
させてもよい。

検出方法としては、一般に、目視による検出方法が容易
であり、ま九色素濃度を測定することにより半定量的に
検出することができる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）第２２７巻第６８０頁（
１９７０）に示された方法を基に、ＳＤ８−電気泳動に
より、タンパク質の０崗１ｔを行った。

１０鳴ポリアクリルアミドゲル（１６ｃＩＲＸ１２υ）
、厚さ１■を作成して、電気泳動分離を行っり後、エレ
クトロフオレシス（Ｅ１θｃｔｒｏｐｈｏ−ｒｅｓｉｓ
　）第２巻第１４１頁（１９８１）の方法に従って、銀
染色法により染色を行った。すなわち、ゲルを５０％メ
タノール／１０％酢酸水溶液２００−に３０分間浸漬し
、次に１５係メタノール水溶液２００−に１０分ずつ３
回浸漬後、６チグルタルアルデヒド２００ｄに３０分間
浸漬、１５％メタノール水溶液浸漬、更に水洗して、メ
ルカプトエタノール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの除
去及びタンパク質の固定化全行った。次に、アンモニア
性硝酸銀溶液（α０２Ｎ　　ＮａＯＨ１６０ｍに２５％
アンモニア水６−と２０チ硝酸釧８−を加え、水で２０
０−にする）に１０分間（２５℃）浸漬し、水洗後、α
００５チクエン酸２００ｄに３７チホルマリン０．１ｓ
ｄｆｔ加えた溶液に、銀像スポットが現れる壕で約１０
分間浸漬し、水洗して銀染色したゲルを得た。

次に、この銀染色したゲルを用いて、色素形成による高
感度染色を行った。

捷ず、下記の組成の液（１）に、ゲル？、２分間（室温
）浸漬し、色素前駆体を含浸させた。

液組成（１）（使用直前に調製した） １　′水を加えて、２００−とする。

次にゲルを室温で１分間水洗し、下記の組成の液（２）
に浸漬した。

液組成（２） 浸漬後、すぐに発色し始め、数分で終了し九。

タンパク質としてオボアルプミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ
　）を使用し、段階希釈して濃縮ゲルの溝（、それぞれ
１０ｎ？、５ｎｆ、　　１ｎｆ、α５ｎｙ、ｃＬｌｎｆ
　ｆ加え、５Ｄ８−電気泳動後、銀染色処理をした。そ
の結果、１ｎ２のオボアルブミンは検出できたが、［Ｌ
５ｎｆ　のものは検出できなめｊった。

次に、銀染色ゲルで本発明による処理を行ったところ、
［１１ｎｒ　のオボアルブミンを検出することができた
。

同様に、ホスホリラーゼＢ　（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａ
ｓｅＢ）１に用いて検出を行ったところ、目視により銀
染色法では、５ｎｆのホスホリラーゼＢしか検出できな
かったが、本発明による処理を加えることにより、α５
ｎｆのホスホリラーゼＢを検出することができた。

また、液（１）と液（２）ｔ−等量混合した液を用いて
、銀染色後のゲルを処理したところ、同様の結果が得ら
れ、１回の処理によっても、高感度な検出を行うことが
できた。

このようにして本発明により、従来の銀染色後に、簡単
な処理操作を付加することにより、タンパク質を高感度
検出することができた。

実施例２ 血漿タンパク質を、一次元目を等電点電気泳動（４５％
ポリアクリルアミドゲル、Ｐ”グラジェント五５〜９５
）分離し、二次元口を、８ＤＳ電気泳動（１０チポリア
クリルアミドゲル、ゲル厚１■）分離した。このゲルを
実施例１で用いた銀染色法に従って、染色を行つ九。

こうして得られた銀染色ゲルを、下記の組成の液（３）
に室温で２分間浸漬した。

液組成（３）（使用山前に調製した。）次にゲルを室温
で１分間水洗し、下記の組成の液（４）に浸漬した。

液組成（４） 浸漬後、すぐに発色し始め、数分で終了した。

このように、二次元電気泳動においても、高感度染色を
行うことができた。

実施例３ ８嗟ポリアクリルアミドゲル（厚さ０．７　ｗｓ　）を
作成し、バクテリオファージλ（ＣＩ８５７Ｈａｍ　７
　）のＤＮＡ　１ｔＢｃＱＲ工制限酵紫で処理したＤＮ
Ａ断片を、量を変えて電気泳動法により展開し、実施例
１で示した銀染色法により染色を行つ念。

次に、下記の組成の液（５）に室温で２分間浸漬した。

液組成（５）（使用直前に調製した。）次に、ゲルを室
温で１分間水洗し、実施例１で用いた過酸化水素液（２
）に浸漬した。浸漬後、すぐに発色し始め、数分で終了
した。

ＩＩＮム断片の１００ｎｆ、５０ｎｆ、１０ｎｆ、５ｎ
ｆ、１ｎｆｔ−電気泳動により展開した後、目視で銀染
色後では、１０ｎｆ　のＤＮＡ断片しか検出できなかっ
たが、本発明による処理を加えると、５ｎｆ　のＩ）ｌ
断片を検出することができた。

実施例４ 実施例１で示したのと同様の方法で、８Ｄ８−電気泳動
後鍋染色したゲルを作成した。次にとの銀染色したゲル
を用いて、下記の組成の液（６）にゲルを２分間（室温
）浸漬し、色素を形成させた。

液組成（６）（使用直前に調製した） 浸漬後発色し始め、高感度に染色することができた。

タンパク質としてオボアルブミンを使用し、段階希釈し
て濃縮ゲルの溝に１それぞれ１゜ｎｆ、　　５　ｎｔ、
　　１　ｎｆ、　　α５ｎｒ、α１　ｎｆ　１を加え、
５ＤＳ−電気泳動後、銀染色処理倉した。その結果、１
ｎｆ　　のオボアルブミンは検出できたが、α５　ｎｆ
　のものは検出で！なかった。

次に１銀染色ゲルで本発明による処理を行ったところ、
ＣＬｌｎｆ　のオボアルブミンヲ検出することができた
。

同様に、ホスホリラーゼＢｔ−用いて検出を行ったとと
る、目視により銀染色法では、５ｎｆのホスホリラーゼ
Ｂしか検出できなかったが、本発明による処理を加える
ことＫより、α５ｎｆのホスホリラーゼＢｉ検出するこ
とができた。

このようにして本発明により従来の銀染色後に簡単な処
理操作を付加することによりタンパク質を高感度検出す
ることができた。

実施例５ 実施例２と同様にして、二次元電気泳動後、銀染色した
ゲルを作成した。次に、この銀染色したゲルを用いて、
下記の組成の液（７）にゲルを２分間（室温）浸漬し、
色素を形成させた。

液組成（７）（使用直前罠調製した） 浸漬後、すぐに発色し始め、数分で終了した。

このようにして、二次元電気泳動において高感度染色を
行うことができ念。

実施例６ 実施例１で示したのと同様の方法で、ＥＩＤＳ−電気泳
動後、銀染色したゲルを作成し念。次に、この銀染色し
たゲルを用いて、下記の組成の液（８）に、ゲルを２分
間（室温）浸漬し、色素を形成させた。

液組成（８）（使用直前に調製し念） 浸漬後発色し始め、高感度に染色できた。

実施例７ 実施例１で示したのと同様の方法で、８ＤＳ−電気泳動
後、銀染色したゲルを作成した。次に、この銀染色した
ゲルを用いて、下記の組成の液（９１Ｋ　、ゲルを２分
間（室温）浸漬し、色素前駆体を含浸させた。

液組成（９）（使用直前に調製した） 次に、ゲルを３０秒間水洗し、下記の組成の液（Ｉｌｌ
に浸漬し穴。

液組成０ｔ＃（使用直前に調製した） 浸漬後発色し始め、高感度に染色することができ九。

実施例８ ８チポリアクリルアミドゲル（厚さα７−）を作成し、
バタテリオファージλ（ＣＩ８５７Ｓａｍ　７　）のＤ
ＮＡを１！１ｃｏＲ工制限酵素で処理したＤＮＡ断片を
、量を変えて電気泳動法により展開し、実施例４で示し
た鎖染色法により染色を行った。

次に、下記の組成の液αＩＫ室温で２分間浸漬した。

液組成（１１）は実施例４の液（６）で１−フェニル−
３−メチル−５−ピラゾロンｔ−１−ナフトール１、２
　ｆ　Ｋ代えた以外は液組成は同じである。

ＤＩＩＡ断片の１０　Ｏｎ？、５０ｎｆ、１０ｎｒ、５
ｎｆ、１ｎｆｌ電気泳動により展開し、銀染色後では、
１０ｎｌ　のＤＩＮム断片しか検出できなかつたが、本
発明による処理を加えると、５ｎ２のＤＮＡ断片を検出
することができた。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明の方法によれば、金属染色
法による染色法に色素形成の簡単な操作を付加すること
によって、電気泳動分離されたタンパク質及び核酸の染
色濃度が増強されて、高感度の染色を行うことができた
。また、金属染色法では可視化できない微量の上記成分
の検−出が可能となった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、電気泳動により分離された支持体中のタンパク質又
   は核酸を金属染色法により染色する工程、及び得られた
   金属核に、酸化反応により色変化を呈する物質の存在下
   、補力剤を作用させて、該金属核上で検知可能な化合物
   を形成させる工程の各工程を包含することを特徴とする
   分離タンパク質又は核酸の高感度検出方法。