JPS63277971A - マーカー上に金属粒子を析出させるための改良方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の技術的背景 特殊な結合剤及び／又はそれに対応する被結合物質の定
性的及び／又は定量的測定に現在種々の方法が使用され
ている。これらの方法は感度、操作の容易さ及び含まれ
る化学的及び物理的原理において相互に広く相違してい
るが、一般に重要な類似性が認められている。特異的な
結合剤とそれに対応する被結合物質の間の一般的な例は
、抗原−抗体、抗体−抗原、蛋白質−蛋白質、蛋白質−
配位子、受容体−配位子又は核酸−相補性核酸型のもの
である。抗原−抗体又は免疫学的相互作用はこの点に関
して遥に最重要であり、且つ特に診断の目的にはかよう
な相互作用に基づく検出方法は今日量も広く使用されて
いる。

凝集体を検出し、及び場合によりそれを定量するために
種々な技術を使用することができる。凝集体とは特異的
な結合剤と含有される被結合物質の間に生じた複合体を
意味する。或場合には複合体化反応は凝集反応及び／又
は凝集体それ自体の沈殿の結果として直接口に見える信
号をもたらすことがある。しかしこれは常時そうである
という訳ではなく、一般にはかような結果を生じるのに
必要な結合剤及び被結合物質の濃度は遥に実用的な、且
つ有用な限界を超えていることが多い。この感度の欠如
を回避し、又は他の方法では検出できない凝集体を検出
するために、例えば補体結合法、受動的血球凝集反応法
、放射免疫測定法（Ｒ’ＩＡ）、蛍光抗体法及び酵素結
合免疫吸着剤検査法（ＥＬＩＳＡ）のような方法が開発
されている。

後者の三つの方法において、凝集体の検出は特殊な結合
剤に直接結合するか、−凍結合剤が被結合物質として作
用する二次結合剤に結合するか、或いは被結合物質のい
ずれかに結合する、容易に検出されるマーカー（ｍａｒ
ｋｅｒ）で凝集体を標識付けすることにより改善されて
いる。上記の三つの方法において、マーカーは夫々放射
性原子又は基、蛍光物質又は酵素である。かような方法
はオックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）及びニシンバラ（
Ｅ　ｄｉｎｂｕｒｇｈ）、ブラックウェル（Ｂ　ｌａｃ
ｋｗｅｌ１）科学出版（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　　Ｐ　
ｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）発行の、ワイアーズ・ハンドブ
ック・オブ・エクスペリメンタル・インムノロジー（Ｗ
ｅｉｒ’ｓ　　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆ　　Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌＩ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙＸ　ｌ’９６
７　）及び米国特許第３，６５４．０９０号（ＥＬＩＳ
Ａ）に記載されている。

最近において、特殊な結合剤及び被結合物質の間に生じ
た凝集体が、該凝集体を直接又は間接に寸法の小さい金
属粒子、特に金粒子で標識付けすることによって検出さ
れる方法が導入された。情況によって、これらの粒子は
例えば直接目視検査により、顕微鏡又は分光測定的技術
によって検出できる。特殊な応用例である“免疫全染色
（Ｉ　ＧＳ）技術”、“ゾル粒子免疫測定（Ｓ　Ｐ　Ｉ
　Ａ）技術”及びその改良法の記述は、例えば米国特許
第４，３１３．７３４号、同４，４４６．２３８号及び
４，４２０．５５８号に、ヨーロッパ特許明細書第１６
５゜６３４号に対応する米国特許出願第６２２．９２３
号に、ヨーロッパ特許明細書第１５８．７４６号に対応
する米国特許出願第６６０．８３２号に及びニューヨー
ク、ウィリー（Ｗｉｌｓｙ）社の夏ＢＲＯハンドブック
・シリーズの１９８３年、３４７−３７２頁において見
出だすことができる。

金属粒子は更に直接固体の支持体上に固定されている蛋
白質及び核酸のような受容体物質の染色に使用されてき
た。かような方法は例えばヨーロッパ特許明細書第１６
５，６３３号に対応する米国特許出願第７４４．０９１
号に記載されている。

細胞表面抗原を標識付けするための比較的未知な方法か
ら出発して、金属粒子は今日各種の検出及び／又は定量
的測定の問題において広く使用されるようになった。金
属粒子の直接目視検査の可能性、及び発生する信号が永
久的であり、迅速に分解しないという長所のために、そ
れは簡単及び迅速な検査のための興味あるマーカーとな
っている。更に金属マーカー、好適には金マーカーは放
射性同位元素マーカーよりもその作用に関連する健康に
与える危険性が非常に低いので好ましいと思われる。

ヨーロッパ特許明細書第１５８，７４６号、１０頁、１
８ないし３２行に、プロット（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）媒体
の表面に結合したコロイド状金粒子をいわゆる物理現像
法で処理することにより、コロイド状金マーカーの信号
を著しく改善する方法が記載されている。

既知技術の物理現像剤は一般に硝酸銀のような可溶性金
属塩、ハイドロキノンのような還元剤及び特定のｐＨｓ
好適には４より小さいｐＨを確保するための適当な緩衝
系を含む溶液から成っている。

最初に銀イオンの金属銀への還元が金粒子の表面で触媒
され、金粒子の部位に金属銀の特殊な析出を起こす。次
いで、かくして生成した金属銀粒子が還元を触媒し、自
触媒反応を創出する。物理現像の効果は赤い光学的な金
の信号を遥に高い強度を持つ深褐色ないし黒色の銀の信
号に変換することである。これらの既知技術に関連する
多数の欠点はあるが、この物理現像の使用によって信号
の改善がもたらされる。

大きな問題の一つは金属塩の溶解度である。実際銀イオ
ンのような金属イオンは多くの対イオンと不溶性塩を形
成することがよく知られている。

利用できる銀イオンの供給源の消耗を別にしても、これ
らの不溶性塩も銀の還元工程が同様に触媒される核を形
成し、ノイズレベルを大きく増大させる結果を招く。更
に銀イオンは臭化銀及び塩化銀のような感光性の銀塩を
形成し、これは光の影響下で自触媒現象を開始させる金
属銀に容易に還元される。従って極めて清浄な接触表面
、例えば容器、分析縁の薬品及び超純水を用いて作業す
ることが絶対に必要である。隠匿（ｉｎｃｕｂａｔｉｏ
ｎ）媒体中に存在する望ましく無いイオンを除去するた
めに、金属で標識された特異的結合剤との隠匿とマーカ
ーの物理現像との間に、多数回の洗浄工程を導入するこ
とも通常必要である。これら総ては在来の物理現像に基
づく検査法を一層複雑、高価とし、且つ誤差を招き易い
ものとする傾向がある。

在来の方法の主な欠点は物理現像それ自体の中にある。

例えば銀を基剤とした物理現像剤の場合は、還元剤は総
ての銀イオンを成程度まで還元する。適切な感度を得る
ためには、増感工程は非マーカー誘導還元（ｎｏｎ−ｍ
ａｒｋｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ　　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）
、いわゆる“自己現像核化”が現れる前に、金属マーカ
ー含有相から物理現像剤を除去することにより停止しな
ければならない。金属に特有な還元速度と自己現像核化
の速度との間の比を増大できれば、物理現像剤は一層扱
い易く且つ強力になることは明らかである。伝統的に使
用されている物理現像剤の場合、この比を大きくするこ
とはほとんど不可能である。調整できる唯一のパラメー
ターは工程の全体的な速度である；自己現像核化は金属
マーカー増感の速度を遅くすることによってのみ遅らせ
ることができる。これを行う最も明らかな方法の一つは
還元剤の濃度、性質又は環境を変化させることである。

しばしば用いられるやり方は４より低いｐＨにおけるハ
イドロキノンの使用である。ハイドロキノンの還元作用
は酸性の環境下で強く抑制される；従って物理現像剤の
使用者は自己現像核化が余り大きくノイズを起こす前に
金属マーカーの増感を停止する充分な時間的余裕がある
。しかし酸の添加は多くの場合標識付けされた特異的結
合剤とそれに対応する被結合物質の間の結合の性質と適
合性がない。大部分の単クローン系の抗体は該ｐＨでは
その抗原に対して低い又は平均的な親和性しか有してい
ない。更にマーカーの増感は自己現像核化が遅くなるの
と同程度に遅くなるので、感度の真の増幅は達成されな
い。

従って金属を基剤とした検出及び／又は定量的測定技術
の感度及び実用性を改善する強い必要性が存在する。

本発明の詳細 な説明は、使用される物理現像剤が金属イオン、金属イ
オンに対してモル比的に過剰な錯化剤、還元剤及び必要
に応じ緩衝系及び一種又は多種の助剤から成ることによ
り、直接又は間接に金属イオンの還元を触媒するマーカ
ー上に物理現像剤から金属粒子を析出させる方法を提供
する。該方法は前記のマーカーで該凝集体の少なくとも
一つの成分を標識付けすることにより、好適には少なく
とも一種の特異的な結合剤とその対応する被結合物質と
の間の凝集体の一種又は多種の成分を、定性的及び／又
は定量的に測定するために好適に使用される。該好適な
方法は、特異的な結合剤又は対応する被結合物質を直接
又は間接的に固体の支持体上に固定し、支持体を物理現
像剤の錆金属イオンの還元を触媒するマーカーで標識付
けされた相対物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）と接触させ
、結合した又は遊離の標識付けされた成分の分離の前又
は後に物理現像剤を添加し、それにより反応の間又は適
当な反応時間後に、生成した金属粒子を試験試料及び／
又は誘導された分画中で定量的及び／又は定性的に測定
し、定量すべき成分の定性的及び／又は定量的な指標を
提供することにより適宜に実行することができる。或種
の例においては、固定された被結合物質を含む支持体を
該被結合物質に特異的な第一結合剤と接触させて凝集体
を形成させ、且つこうして形成された凝集体を保持する
支持体を引き続き該第−結合蛋白質に特異的であり、マ
ーカーで標識付けされた第二の結合蛋白質と接触させる
方が好ましいことがある。上記の方法はハプテン、抗原
及び抗体のような免疫化学的成分の測定に特に適当して
いる。

更に本発明は固体支持体上に直接固定され且つ前述のマ
ーカーと結合している蛋白質又は核酸のような受容体物
質を、定量的及び／又は定性的に測定する際にも使用で
きる。

本発明の他の態様は上記の方法を実行するのに適当した
多目的溶液及び試験用具一式を提供することである。

本発明は過剰の錯化剤（ｃｏＩｌｐｌｅｘａｎｔ）を現
像剤に添加することにより、在米の現像剤に関連した欠
点を改善している。本発明による方法において使用され
る錆化剤は物理現像剤の金属イオンと水溶性の錯体を形
成することができる任意の薬剤から成る。錯生成定数は
、一方ではマーカー上の金属粒子の成長を許容する程度
の充分な量の錯体化しない金属イオンが存在し、他方で
は錯体化しない金属イオンの濃度が前述の望ましくない
副次的効果を避ける程度に充分に低いように選択される
。

本発明による方法における有用な錯化剤は、例えばグリ
シン、ヒスチジンのようなアミノ酸及び複素環式塩基の
ような、窒素上に利用可能な非共有電子対を有する少な
くとも一つの供与体窒素原子を有する。好適な複素環式
塩基はＳｐ！混成軌道に非共有電子対を持つ、少なくと
も一つの窒素を有する随時置換された単環式又は二環式
塩基であって、例えば（ｉ）二個の環状窒素原子を有す
る五員環を含む芳香族環式部類、例えばイミダゾール、
ベンズイミダゾール、ピラゾール、プリン等で、イミダ
ゾールが最も好適であり、（ｉｆ）一個の環状窒素原子
を有する六員環を含む芳香族環式部類、例えばピリジン
、アミノピリジン曳ニコチンアミド、キノリン等である
。イミダゾール及びとリジン誘導体との銀錯体の錯生成
定数に関して、ザ・ブレチン・オブ・ザ・ケミカル・ソ
サイエティ・オブ・ジャパン（ｔｈｅ　　Ｂ　ｕｌｌｅ
ｔｉｎ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｓ
　ｏｃｉｅｔｙ　　ｏｆ　　Ｊ　ａｐａｎ）、土２，３
５９８−３６００（１９６９）が参考となる。

本発明により使用されるマーカーは、該マーカーの部位
で対応する金属粒子の析出をもたらす金属イオンの還元
を触媒することができる任意の粒子を含むことを意図し
ている。往々にしてこうして析出した金属粒子は順次還
元を触媒し、自触媒工程が生起する。

使用されるマーカーは金属、金属化合物又は直接又は間
接にその表面の金属イオンの還元を触媒することができ
る金属又は金属化合物で随時被覆又は含浸された重合体
から成る。該金属の例として金、銀、タリウム、白金、
パラジウム並びに銅、ニッケル等を挙げることができる
、金が最も好適である。金属化合物の例として前記金属
に対応する錯塩及び硫化物を挙げることができる。金属
又は金属化合物で被覆又は含浸された重合体は金属又は
金属化合物として類似の性質を有しているが、寸法、密
度及び金属含量の組み合わせを最適とすることができる
。好適な方法で使用されるために、マーカーは特異的な
結合剤又はそれと結合できる任意の被結合剤が、その結
合又は被結合の相対物との親和性を損なうことなくマー
カーに付着できるように選択する必要がある。

本発明による方法において使用するのに特に好適なマー
カーは、（ｉ）金属又は金属硫化物を含むコロイド状金
属粒子、随時ゾル：又は（ｉｔ）金属キレート、特にエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はジエチレントリ
アミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の部類を包含する金属キレー
ト；又は（ｉｉｉ）随時金属又は金属硫化物を含浸した
重合体、例えばジアミノベンジジン重合体のようにベン
ジジン誘導体の重合生成物のいずれかである。

本発明による方法において使用される還元剤は、活性部
位の近傍において物理現像剤から金属イオン、特に銀、
金、白金、パラジウム又はタリウムイオンを還元する任
意の薬剤を含むことを意味する。好適には前記還元剤は
保護された（ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）物理現像剤の一種又
は多数の成分と安定な溶液を形成する。還元剤として特
に１．２−ジヒドロキシベンゼン、１，４−ジヒドロキ
シベンゼン（ハイドロキノン）、硫酸−４−メチルアミ
ノフェノール（メトールの）、４−アミノフェノール、
１．４−ジアミノベンゼン、１．２−ジアミノベンゼン
、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）グリシン、２．４−
ジアミノフェノール、ｌ−フェニル−３−ヒドロキシピ
ラゾール（フェニドン８）又はそれらの混合物を挙げる
ことができる。保護された物理現像剤の他の成分（助剤
）として、緩衝剤、保恒剤、例えば酸化防止副文は有機
性安定剤、現像抑制剤、殺菌剤等、例えば亜硫酸ナトリ
ウム、重亜硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等を挙
げることができる。

コロイド状マーカー、特にコロイド状金粒子の製造、特
異的結合剤又はそれにより結合性となる任意の試剤に対
するマーカーの付着、及びそれらを所望の被結合物質と
直接又は間接に結合させる種々の方法論は充分周知であ
る。この点に関しては、米国特許第４．３１３，７８４
号、ヨーロッパ特許明細書第０．１５８．８３２号に対
応する米国特許出願第６６０．８３２号、ヨーロッパ特
許明細書第０．１６５．６３３号に対応する米国特許出
願第７４４．０９１号、ニューヨーク、ウィリー（Ｗｉ
　１ｅｙ）社のＩＢＲＯハンドブック・シリーズ、フェ
ロ（Ｃｕｅｌｌｏ）　Ａ　、　Ｃ、監修、イムノヒスト
ケミストリー（Ｉ　ｍ＋ｎｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、１９８３年、３４７−３７２頁及びテクニ
ックス・イン・イムノシトケミストリー（Ｉ　ｍｍｕｎ
ｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２巻、２１７−１
２８４頁（１９８３年）を参照されたい。

一般に、所望の結合剤、例えば抗体が溶解している適当
なｐＨの水性媒体と粒子を接触させることにより付着は
容易に行なわれる。粒子を試験試料の非特定の蛋白質と
の非選択的相互作用から保護するために、例えば免疫学
的に不活性な極性の高分子、例えば牛血清アルブミン（
ＢＳＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びポリエ
チレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ）のような消正（ｑｕｅ
ｎｃｈｉｎｇ）又は安定剤を添加することが適当である
。適当な時間を置いた後に、不安定な粒子及び遊離した
又は緩く結合した結合剤は繰り返し遠心及び洗浄するこ
とにより除去される。必要に応じ、ジャーナル・オブ・
七ノドバイオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏ１，　
）９旦、５３３−５３６に記載された方法に従って粒子
をサイジング（ｓｉｚｅ）することもできる。

又一方、米国特許第３，８５７．９３１号に記載された
方法に従い、水溶性のカップリング剤を用いて蛋白質を
マーカーに共有結合させることもできる。抗体のような
結合剤に対する金属キレートの付着は、例えばアナリチ
カル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１４２．６８−７９（１
９８４年）及びカンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　　
Ｒｅｓａｅｒｃｈ）、土５，５６９４−５６９９（１９
８５年）に記載された方法に従って容易に実施すること
ができる。一般に、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴ
ＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のよう
なキレート剤を蛋白質にカップリングする反応は、ジア
ゾニウムカップリング及び活性カルボキシル基を用いる
アシル化を含んでいる。こうして得られたキレート剤複
合蛋白質はその免疫反応性を保持しており、そして所望
の金属元素を容易に架載することができる。

本発明の方法において使用されるマーカーとして用いる
ことができる重合体として、随時金属又は金属化合物が
架載されているベンジジン誘導体の重合体生成物を挙げ
ることができる。ジアミノベンジジン重合体の用途及び
製造法は例えばジャーナル・オブ・ヒストケミストリー
・アンド・シトケミストリー（Ｊ　、　　　Ｈｉｓｔｏ
ｃｈｅａ＋、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　）３０．１８３−
１８４（１９８２年）及びニューロサイエンス（Ｎ　ｅ
ｕｒｏｓｃ　１ｅｎｃｅ）±１．５１３−５２５（１９
８４年）に記載されている。

本発明の好適な方法によって為される測定法は均質的又
は異質的に実施することができる。均質的な測定は実施
することが特に簡単であるが、標識付けされた試薬中に
存在するマーカー、又は標識付けされた試薬と定量され
るべき粒子との間に生じた標識付けされた凝集体中に存
在するマーカーのどちらからか発生する認識された信号
の測定可能な変化を必要とする。かような区別が不可能
である場合には、異質的測定が実施されるべきであろう
。

均質的測定は結合又は未結合の標識付けされた物質種を
物理的に分離ことか不必要であり、従って検査を実施す
るのに必要な工程の数を減らせるという点で有利である
。標識付けされた成分と対応する結合相対物との間の反
応により、均質測定を実施するのに必要な、標識の共有
関係の測定可能な変化又は信号発生成分の変調が生起す
る。結合及び未結合物質種の間のマーカーの分布は、該
マーカーが結合物質種中に存在する時に、現像後マーカ
ーから発する信号に影響を及ぼす能力が無くなるか又は
変更されることによって差異を生じることができる。

均質測定法は例えば競合結合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ
　　ｂｉｎｄｉｎｇ）技術のような既知技術の方法によ
って適宜実施することができる。分析物を含む試料は、
分折物の結合相対物、分析物にカップルされるマーカー
を含む標識付けされた試薬、又は特異的な結合性類似物
、及びマーカーそれ自体を信号発生成分に変換するのに
必要な物理現像剤と混和される。

又一方、試料と分析物の結合相対物を最初に組み合わせ
、その後で検出用試疑をｉ加することによる逐次的測定
法を実施することができる。

多くの場合、均質的測定法を実施することが不可能であ
る。このような場合は異質的定量法は特に魅力的な別法
である。一般に、異質的測定系は少なくとも二つの基本
的成分及び同時に又は逐次的に混和される物理現像剤、
即ち検出されるべき分析物、マーカーで標識付けされた
結合の相対物及びマーカーを信号発生成分自体に変換す
るのに必要な物理現像剤から成る。必要番；応じ適当な
隠匿期間を置いた後、標識付けされた試薬は対応する検
出されるべき被結合物質に結合するが、その際結合物質
種の非結合物質種に対する比率は、存在する分析物の量
の関数である。結合及び非結合物質種は物理的に分離さ
れ、その一方に存在する標識の量が測定される。

分離工程及び結合反応を実施する種々の手段は当該分野
で既知である。前記の分離は例えば固体相抗体又は抗原
、二次抗体、又は固体相二次抗体の使用による：又は免
疫複合体沈殿剤、吸着剤等によるような通常の方法を含
んでいる。前記結合反応は例えばいわゆる競合結合技術
、逐次飽和技術、サンドウィッチ技術等を含んでいる。

本発明の方法により為される好適な測定法は、特異的な
結合蛋白質と被結合物質との間に形成された標識付けさ
れた凝集体は、或時点において、未反応の粒子が洗い落
とされ、それにより固定された粒子が“その場で“又は
必要に応じ、それから誘導された任意の他の相に解放さ
れた後、検出されるような方式で固定されるという原理
に基づいた異質的測定法である。

特に好適な具体化においては、生の試験検体中に、又は
それから誘導された精製、又は部分的に精製された分画
中に含まれている検出すべき被結合物質が、該被結合物
質に特異的な標識付けされた結合剤と複合体をつくる前
に、適当な固定性の支持体上に固定される。

被結合物質の固定は通常の技術に従い、例えば固定用支
持体上に試験検体の一部液をスポットするか又は試験検
体中に支持体を浸漬し、引き続き乾燥し、且つ随時固定
されなかった物質を洗い落とすことによって実行するこ
とができる。これはいわゆる直接法である。この技術用
の固定化支持体として各種の材料、一般に測定に便利な
任意の、例えばシート、ビー）　（ｂｅａｔ）、窪みの
ある板、浸漬棒等の形状を取ることができる重合体材料
、例えばニトロセルロース、ジアゾベンジルオキシメチ
ル（ＤＢＨ）−及びジアゾフェニルチオエーテル（ＤＰ
Ｔ）改質セルロース紙、紙、臭化シアンで活性化された
紙又は酢酸セルロース、アガロース、ナイロン、プラス
チック等を使用することができる。

次いで結合剤と対応する被結合物質との間に凝集体が形
成される条件下で、支持体を標識付けされた結合剤と接
触させる。その結果、被結合物質が固定されている座位
（ｓｉｔｅ）で、順次固定された被結合物質の濃度に比
例する量でマーカーが固定される。

この方法の変法においては、固定された被結合物質はま
ず特異的である第一結合剤と反応し、引き続きこうして
固定された相を前記第一結合剤に特異的である第二結合
剤に付着したマーカーと接触させる。上記のように固定
方法の選択性及び特異性の欠如のために、直接法は比較
的純粋な又は精製された試験試料又は分画について通常
使用される。一層複雑な試料の場合は、大過剰の非所望
物質の非特異的固定により、測定の感度及び特異性が阻
害されるので、直接法は往々にして有用性に乏しい。

日常分析に関して重要であるこの問題を避けるために、
間接又はいわゆるサンドウィッチ法を利用することがで
きる。この技術においては、精製された又は濃縮された
一次特異的結合剤が固体支持体上に固定される。対応す
る被結合物質の複合体化を可能とする条件下で、支持体
を試験試料と接触させ、その結果それ自体が固定化され
る。試験試料の除去及び支持体の洗浄後、固定された被
結合物質の非複合座位に結合することができる二次的特
異結合剤で被覆されたマーカーの懸濁物と支持体を接触
させる。

本発明が応用される最も直接的な具体化例は、直接又は
間接的に固体相に固定されている被結合物質、及び固体
相に対して移動性の液体相から成る流動環境である。固
体相に対する液体相の流れの方向によって、この固体相
は液体透過性又は非透過性であることができる。例えば
透過性膜は膜を透過する液竺相の垂直な流れが可能であ
る固体相として使用することができる。他方、不透過性
の固体相を横方向の液体の流れと組み合わせて使用する
ことができる。

具体化の第一段階の間に、標識付けされた特異な結合剤
を含む液体相は固体根土に固定された被結合物質と接触
する。固体相に対するこの液体相の移動は連続的又は非
連続的であることができ、両相の接触時間は固定された
被結合物質と標識付けされｌ；特異的結合剤の間の結合
が起こり得るようなものでなくてはならない。しかし、
この結合過程は必ずしもその飽和点に達する必要はない
。

液体の流れを起こさせる、出発点及び到着点の間の液体
相の圧力降下はいくつかの方法でつくることができる。

固体相として透過性膜を使用する場合は、この膜の一方
の側を液体吸着材料と接触させ、他の側に液体相を加え
ることにより垂直の流れを起こすことができる。非透過
性固体相の場合は、ポンプにより液体相の横方向の流れ
を起こすことができる。

第二段階として本発明による保護された物理現像剤は液
体相として用いられる。該保護された物理現像剤は錯体
化した金属イオン並びに還元剤から成る。マーカーに特
異的な還元速度と自己造核の速度の間の比率を最大とす
るために、両成分は直接使用する前まで離して置いてお
く。しかし、従来技術と比較して、二種の安定な且つ液
状の成分を混合することにより、比較的安定な物理現像
剤の配合物をつくることができることが強調されるべき
である。或場合には、両者基液状成分を用い、即ち一つ
は金属イオン、金属イオンに関してモル比的に過剰な錯
化剤から成り、且つ他方は還元剤から成り、後で保護さ
れた物理現像剤を“その場”で形成することが好適であ
ることがある。

又或場合には、安定且つ液状の成分を、適当量の水を添
加することによりそれらに対応する乾燥成分から製造す
ることもできる。上記の問題を考慮すれば、物理現像剤
は使用されるマーカー、必要な感度及び固体相と液状物
理現像剤の間の接触時間に対して容易に最適化すること
ができる。

好適な貫流法の具体化においては、二種の安定な液状成
分の混合、及び得られる保護された物理現像剤の使用は
単一の処置として組み合わされなければならない。流動
する保護された物理現像剤の使用は二重の効果を有して
いる。最初に、液は第一段階の間結合しなかった又は緩
く結合した標識付けされた結合剤の残存物の総てを固体
相から洗い去る。マーカーの物理現像は徐々に進行する
工程であるから、この物質は何等かの信号が現れる前に
固体相から洗い落とされる。残留する結合した標識付け
された特異的結合剤は更に保護された物理現像剤と接触
する間に目に見える信号を発生するに至る。固体相に適
用される現像剤の流れ及び容積は、固定された標識化合
物の最適な検出に必要な程度に長く、且つ自己造核によ
り起こされる固体相の非特異的還元を回避するに必要な
程度に短い接触時間を確保するように選択される。

一般にこれらの時間は数秒ないし数分に調整することが
できる。多くの保護された物理現像剤の場合、この信号
を永久的に保つための追加旭理又は定着工程の必要はな
い。

この新規具体化の利点は、先に述べた物理現像されたコ
ロイド状金属マーカー系の総ての利点を備えるが、旧来
の物理現像に固有の前記欠点を持たないことから明らか
である。

本発明は現像剤に関してモル比的に過剰な、好適には数
倍過剰な、例えば２ないし２０倍過剰な錯化剤を添加す
ることにより、旧来の現像剤に随伴した欠点を改善する
。極めて清潔な接触表面、例えば容器、分析縁化学薬品
、超純水及び多段予備洗浄段階の必要性かをなくなるこ
と以外に、マーカーに特異的な還元速度及び自己造核の
速度の比率を数倍増大させることも可能である。平衡関
係は錯体形の方向に強く移行しているので、物理現像に
必要な遊離の金属イオンを易動化するために一段と強い
還元環境が許容される。これらの環境下で、マーカーの
触媒的効果は一段と増幅され、その結果自己造核の速度
に影響することなくマーカーに特異的な還元速度の促進
がもたらされる。

マーカーに特異的な還元速度及び自己造核の速度ができ
る。従来法と対照的に、マーカーをより長く物理現像剤
と接触させることにより感度を増加させることができ、
又はマーカーの最適現像の時機と自己造核が開始してバ
ックグラウンドが増大する時機との間の安全時間帯によ
り提供される融通性を損なうことなく、マーカーの特異
的な現像速度を増加させることができる。或場合には全
体的速度と感度の増大の両者を並行して達成することが
可能である。前記の全体的速度は還元剤の濃度、性質又
は環境を変えることにより容易に調整することができる
。最高の速度は非常に小さいマーカー、好適には５ｎｍ
以下、例えばｌないし４ｎｍの粒子を用いて得ることが
できる。金粒子が本発明により現像される場合は、この
系の速度は非常に速＜（１０−２０秒）から遅く（３０
分又はそれ以上）まで好適に調整することができる。明
らかに、従来法のいずれの方法もこのような可能性に到
達することはできなかった。普通の現像系は平均（６−
１０分）系ないし低速（１５−３０分）系のみが可能で
ある。更に小さいマーカーはマーカーの特異的還元速度
を促進するだけでなく標識付けされた試薬の拡散速度を
促進し、そして適当な結合剤へのマーカーのより効率的
な付着を可能とし、懸濁物中の標識付けされた試薬の安
定性の増大をもたらすことに注意すべきである。従来技
術との比較に際して強調されるべき他の点は、現像の間
結合対の間の結合物の安定性の増加につながる、中性的
環境（ｐＨ７）で作業する可能性に関する。

反応混合物の酸相において生成した金属粒子の検出はそ
れ自体周知である多数の方法を用いて行うことができる
。該方法は生成した金属粒子の量及び／又は物理的性質
に、好適には金属粒子の散乱及び吸収に基づいている。

これらの技術の例として、定量的測定が必要な時に好適
である濃度測定法（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）のよう
な分光測定的技術を採用することができる。しかし得ら
れる高感度からして、粒子は目視的に、随時顕微鏡を用
いて容易に観察される。

本発明による好適な方法において使用できる特異的な結
合剤は種々の性質のものであることができるが、多くの
例においては特定の抗原又はノ１ブテンに対する抗体で
ある。抗体以外の特異的な結合物質の例として随時分子
的又は細胞物質に結合するように化学的又は遺伝学的に
適応させたファージ、特異的に糖蛋白に結合するレクチ
ン、各種の動物の免疫グロブリンに特異的に結合すると
フィロコツカスパアウレウス（Ｓ　ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）蛋白質Ａ及び遺伝的同定用のＤ
ＮＡ又はＲＮＡ消息子（ｐｒｏｂｅ）を挙げることがで
きる。一般に充分な特異性及び親和性のある任意の他の
分子間相互作用を使用することができる。抗体はポリク
ローン性又は単一クローン性であることができる。

特異的結合剤及び被結合物質の結合反応はほとんどすべ
ての場合温和な条件下で進行することができる。反応混
合物は一般に任意の望ましい有機性補助溶剤が少量存在
している水性媒体である。

反応温度は隠匿期間を通じて正常の環境下で一定の水準
に保たれる。温度は一般に０ないし５０℃、。

より通常的には２０ないし４０℃の間である。好適には
反応は室温で進められる。反応混合物のｐＨは５ないし
ｌＯの間、より通常的には６ないし９の間で変えられる
。各種の試薬の濃度は試験媒体中に予想される分析物の
濃度に依存し、通常は１Ｏ−３ないし１０−”Ｍの間の
濃度とされる。パラメーターの選択は、主として究極的
に日常的な基盤で分析を実施する技術者の選択と必要性
とに対し勘考された、経験的に導かれた最適化に基づい
ている。それ故いずれのパラメーターも本発明に対し重
大な性質のものではなく、それらは総て従来法で使用さ
れた普通の範囲内にある。

その一般的性質の点から見て、本発明による方法は極め
て広い応用分野を有している。原理的に該方法は前述の
マーカーで標識付けできる任意の物質の定性的及び／又
は定量的測定に利用することができる。例えば該物質は
細胞表面及び組織の抗原、生体により分泌され又はそれ
から誘導された生物学的物質、特にだ液、りんば液、血
液のような生物学的液中に存在する生物学的物質及びそ
の誘導された分゛画、例えば血しよう及び血清、尿、脳
を髄液、羊膜液等を含むが、これらに限定されるもので
はない。検出できる物質は蛋白質、ポリペプチド、ペプ
チド、酵素様物質１．ホルモン、構造蛋白質、核酸、ビ
タミン、多糖類、毒素、アルカロイド、糖蛋白質、ハプ
テン、代謝産物、薬剤、殺虫剤、汚染物、ステロイド、
及び生体系中に特異的結合の相対物が存在するか又は合
成できる任意の他の分子を含む。

代表的な蛋白分析物はプロタミン、ムコ蛋白、糖蛋白、
グロブリン、アルブミン、硬蛋白、燐蛋白、ヒストン、
リポ蛋白、色素蛋白、及び核蛋白の部類を含む。特異的
蛋白の例はプレアルブミン、ａｌ−リポ蛋白、ヒト血清
アルブミン、ｆｆ１−酸糖蛋白、ａ、−抗トリプシン、
σ、−糖蛋白、トラン　　　　゛スコルチン、チロキシ
ン結合グロブリン、ハプトグロブリン、ヘモグロビン、
ミオグロビン、セルロプラスミン、α２−リポ蛋白、１
１２−マクログロブリン、β−リポ蛋白、エリスロ蛋白
、トランスフェリン、ヘモベキシン、フィブリノーゲン
、ＩｇＧが最も好適であるが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ
。

ＩｇＤｌ及びＩｇＨのような免疫グロブリン、及びそれ
らのフラグメント、例えばＦｃ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）
　”補体因子、プロラクチン、フィブリノーゲン、トロ
ンビン等のような血液凝固因子、インシュリン、メラノ
トロピン、ソマトトロピン、チロトロピン、卵胞刺激ホ
ルモン、黄体形成ホルモン、ゴナドトロピン、甲状腺刺
激ホルモン、胎盤性ラクトゲン、内因性因子（ｉｎｔｒ
ｉｎｓｉｃ　　ｆａｃｔｏｒ）、トランスコバラミン、
血清酵素、例えばアルカリ性７オスフアターゼ、乳酸デ
ヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、フォスファタ
ーゼ、コリンエステラーゼ、グルタミン酸−オキザロ静
置−トランスアミナーゼ、グルタミン酸−ピルピン酸−
トランスアミナーゼ、及びウロペプシン、エンドルフィ
ン、エンケファリン、プロタミン、組織抗原、細菌抗原
、及び肝炎関連の抗原（例えばＨＢ　ｓ　Ａ　ｇｓＨＢ
ｃＡｇ及びＨＢｅＡｇ）のようなウィルス抗原である。

代表的なハプテン分析物は医薬品、代謝産物、ホルモン
、殺虫剤、汚染物、ビタミン、及び類似の有機化合物の
一般的部類を含んでいる。ハプテンホルモンはチロキシ
ン及びトリョードチロニンを含む。ビタミンはビタミン
Ａ、Ｂ、例えばｆ３ｔｔ、Ｃ％ＤＳＥ及びに１葉酸及び
チアミンを含む。医薬品はアミノ配糖体、例えばゲンタ
マイシン、トブラマイシン、アミダシン、シソマイシン
、カナマイシン、及びネチルマイシン、ペニシリン、テ
トラサイクリン、テラマイシン、クロロマイセチン、及
びアクチノマイセチン；ヌクレオシド及びヌクレオチド
、例えばアデノシン三燐酸塩（ＡＤＰ）、アデノシン三
燐酸塩（Ａ　Ｔ　Ｐ　）、フラヴインモノヌクレオチド
（ＦＭＮ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（
Ｎ　Ａ　Ｄ　）、及びその燐酸塩誘導体（Ｎ　Ａ　Ｄ　
Ｐ　）、チミジン、グアノシン、及びアデノシン；プロ
スタグラジンス；卵胞ホルモンのようなステロイド、例
えばエストリオール及びエストラジオール、ステロイド
；及び他の、例えばフェノパルビタール、フェニトイン
、ピリミドン、エトスクシミド、カルバマゼピン、ヴア
ルプロエート、テオフィリン、カフェイン、プロプラノ
ロール、プロ力インアミド、キニジン、アミトリブチリ
ン、フルチゾール、デシプラミン、シソピラミド、ドク
セピン、ドクソルビシン、ノルトリブチリン、メトトレ
クセート、イミプラミン、リドカイン、Ｎ−アセチルー
プロ力インアミド、アンフェタミン、カテコールアミン
、及び抗ヒスタミン剤を含む。更に強心性配糖体、及び
ベンゾジアゼピン、ベンズイミダゾール、ピペリジン、
ピペラジン、イミダゾー−ル、トリアゾール、ピリダジ
ン、１．２．４−１−リアジンジオン又は２．３，５．
６−チトラヒドローイミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール
、又はアミド類の誘導体、ヒドラトロピン酸（ｈｙｄｒ
ａｔｒｏｐｉｃ　　ａｃｉｄ）誘導体又はトリアルキル
アミンが含まれる。

ベンズイミダゾールハプテンはチアベンダゾール、フペ
リダゾール、シクロベンダゾール、オキシベンダゾール
、パルベンダゾール、カムベンダゾール、メベンタソー
ル、７エンベンダゾール、フルベンダゾール、アルベン
ダゾール、オキシベンダゾール、ノコダゾール及びアス
テミゾールから成る。

ピペリジンハプテンはジフェノキシレート、フェノペリ
ジン、ハロペリドール、ハロペリドールデカノエート、
プロムペリドールデカノエート、ブロムペリドール、モ
ペロン、トリフルペリドール、ピパムペロン、ピリトラ
ミド、フェンタニル、ペンペリドール、ドロペリドール
、ベンジトラミド、トモペリトン、スフェンタニル、カ
ルフェンタニル、アル７エンタニル、デクセチミド、ミ
レンペロン、ジフェノキシン、フルスビリレン、ペンフ
ルリドール、ビモジド、ロルカイニド、ロペラミド、ア
ステミゾール、カンタセリン、レヴオカバスチン、シサ
プリド、アルタンセリン、リタンセリン、３−［２−［
４−（４−フルオロベンゾイル）−１−ピペリジニル］
エチル］−２，７−’；メチル−４８−ピリド−［１，
２−ａｌ−ピリミジン−４−オン、３−［２−［４−［
ビス（４−フルオロフェニル）メチレン］−１−ピペリ
ジニルＪ−エチル］−２−メチル−４旦−ピリド［１，
２−ａｌピリミジン−４−オン及び３−［２−［４−［
［３−（２−フラニルメチル）−３旦−イミダゾ［４，
５−ｂｌピリジン−２−イル］アミノ】−１−ピペリジ
ニル］エチル］−２−メチル−４旦−ピリド［１，２−
ａ］ピリミジン−４−オンから成る。ピペラジンハプテ
ンはアザペロン、７ルアニソン、リド７ラジン、７ルナ
リジン、ミアンセリン、オクサトミド、ミオ７ラジン、
クロシニジン及びシンナリジンを含む。

イミダゾールハプテンの例はメトロニダゾール、オルコ
ナゾール、インコナゾール、チニダゾール、インコナゾ
ール、ニモラゾール、ミコナゾール、ブリマミド、メチ
アミド、メトミデート、エニルコナゾール又はイマザリ
ル、エトミデート、エコナゾール、クロトリマゾール、
カルニダゾール、シメチジン、ドコナゾール、スルコナ
ゾール、パルコナゾール、オルコナゾール、ブトコナゾ
ール、トリアシミノール、チオコナゾール、ヴアルコナ
ゾール、フルベンダゾール、ケトコナゾール、オキシコ
ナゾール、ロンバゾール、ビフオナゾール、オクスメチ
ジン、フェンチコナゾール、ツブラゾール及び（Ｚ）−
１−［２−クロロ−２−（２，４−ジクロロフェニル）
エチニル］−１Ｈ−イミダゾールである。

トリアゾールハプテンはヴイラゾール、アザコナゾール
、エコナゾール、プロピコナゾール、ペンコナゾール、
インコナゾール及びチルコナゾールから成る。

ピリダジンハプテンは例えば３−クロロ−６−［３，６
−シヒドロー４−（３−メチルフェニル）−１（２８）
−ピリジニル］ピリダジン、３−メトキシ−６−［４−
（３−メチルフェニル）−１−ピペラジニル】ピペラジ
ン、及びヨーロッパ特許公開公報環０．１５６．４３３
号の化合物から成る。

１．２．４−トリアジンジオンは例えば２−クロロ−ａ
−（４−クロロフェニル）−４−（４，５−ジヒドロ−
３，５−ジオキソ−１，２，４−１リアジン−２（３Ｈ
）−イル）ベンゼンアセトニトリ＆。

２．６−シクロローσ−（４−クロロフェニル）−４−
（４，５−ジヒドロ−３，５−ジオキソ−１，２゜４−
トリアジン−２（３Ｈ）−イル）ベンゼンアセトニトリ
ル及びヨーロッパ特許公開公報環０．１７０．３１６号
の化合物から成る。

トリアルキルアミンは例えばジイソプロミン、プロザピ
ンである。

２．３，５．６−チトラヒドローイミダゾ［２，１−ｂ
ｌチアゾールは例えばケトラミソール又はレヴアミソー
ルから成る。

アミド類は例えばクロサンチル、アンプセトアミド、イ
ンプロバド、ウゼピドメチオダイド、デキストロモラミ
ドから成る。ヒドロトロピン酸ハプテンは例えばスプロ
７エンである。

測定の目的は多様であることができる。或使用例では特
定の物質を可視化するための単なる科学的手段として、
例えば組織学的クーペ（ｃｏｕｐｅ）に、クロマトグラ
ムに、電気泳動図、プロット（ｂｆｏｔ）法等に使用さ
れる。例えば、クロマトグラム、電気泳動図、蛋白質プ
ロット法等で種々の特異的蛋白質又は他の被結合物質に
異なった標識付けをする時に、他の蛋白質又は他の物質
を限局するために有利に使用できる基準図形が得られる
。その科学的有用性以外に、本発明の方法は例えば下記
のような広範囲の診断試験二Ｔ−リンパ球の細区分（Ｓ
ｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の検出及び特性決定；尿中
における或種のホルモン（卵膜性ゴナトドローピン）の
存在に基づく妊娠試験、カビ、細菌及び特にウィルスを
病原とする例えばＢ型肝炎、自己免疫病、例えばエリテ
マトーデス、及び免疫欠損病、例えばエイズ、りん病、
ポリオ等のような種々の感染病の診断試験；代謝、内分
泌性、及び羊膜液中の特定蛋白質の存在に基づく胎芽の
先天的な機能不全の検出のための診断を含む各種の内因
性の病気の診断等で有用性を発揮するであろう。

従って本発明の方法は現在免疫学的技術が考えらる事実
上総ての情況下で使用することができる。

更に本発明は蛋白質及び核酸のような直接支持体内又は
上に固定され、ヨーロッパ特許公開公報第０．１６５．
６３３号及びアナリティカル・バイオケミストリー１４
５．３１５−３２１（１９８５）に記載されている方法
によるコロイド状マーカーと結合する受容体物質の定量
及び／又は検出にも使用できる。上記文献を参照し参考
とされたい。

前記方法は蛋白質又は核酸支持体を一定の時間、好適に
は蛋白質又は核酸の結合を妨害しない、例えば０．１％
の非イオン性活性剤ツイーン（Ｔ　ｗｅｅｎ）２０のよ
うな活性剤を含み、且つ適当なｐＨに調整された媒体中
に懸濁された充分な量のコロイド状マーカーと接触させ
、そして物理現像剤を添加し、それにより反応の間又は
適当な反応時間後に生じた基粒子を定量的又は定性的に
測定する次の段階から成る。本発明による物理現像剤は
旧来の現像剤に付き物の欠点をもたらすことなく本法の
感度を改善する。

本発明による方法は広範囲の日常的及び実験的応用に使
用できる枠組みを提供する。その性質及び取り扱いの容
易さによって、本方法は特に簡単且つ迅速な定性的又は
半定量的分析に適合している。本方法は経験のある実験
技術者並びに技術的な訓練の無い医学従事者又は未経験
者による使用に適応させることができる。本方法は又多
数の同一な測定を行う必要がある時、例えば血液銀行及
び専門的な診療検査室において重要な因子である自動化
が容易に可能である。

本発明は更に本発明が包含する所望の検査方法を実行す
るのに必要である必須な総ての化学的要素から成る試薬
系を構成する。試薬系は試薬の相溶性によって可能な場
合は組成物又は混合物として、試験装置一式中で、又は
試験用キット、即ち必要な試薬を保有する一個又は多数
個の包装された組み合わせ物として、市販の包装形態で
提供することができる。試薬系中には標識付けされた試
薬及び信号発生反応を生じるに必要な保護された物理現
像剤を作成する溶液を必須とする、所望の結合反応系に
適当した試薬が包含される。かような結合反応試薬は標
識付けされた試薬以外に、分析物に対する結合相対等を
含むことができる。勿論、試薬系としては本分野で既知
な他の試薬、及び市販上又は使用者の観点から見て望ま
しい緩衝剤、希釈剤、標準試薬等を含むことができる。

より好適には本発明は、他の試薬の他に、好適には使用
の直前に二種の等容積物を混合することによって調合さ
れる、保護された物理現像剤から成る、マーカー上の金
属粒子の還元を触媒してマーカー上に金属粒子を析出さ
せる試験用キットから成る。

実施例　ｌ 平均直径２０ｎｍのコロイド状金ゾルオーロゾル（Ａｕ
ｒｏＳｏ１）Ｇ　２０　’をベルギーのペールス（Ｂｅ
ｅｒｓｅ）Ｂ　−２３４０のジャンセン・ライフ・サイ
エンス・・プロダクツ（Ｊ　ａｎｓｓｅｎ　　Ｌ　ｉｆ
ｅ　　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅＰ　ｒｏｄｕｃｔｓ）から購入
した。親和性精製（ａｆｆｉｎｉｔｙ　−ｐｕｒｉｆ　
１ｅｄ）　Ｌ／たヤギー抗−ヒトＩｇ抗体を、ｐＨ９，
８の５ｍＭ炭酸塩緩衝液に対して４℃で一夜透析した。

金ゾルの酸性度を水酸化カリウムでｐＨ９，０とした。

この金ゾル１００！ｌ（１を室温でビーカー中で撹拌し
た。ｌ　　１１９の透析した抗体を添加した。２分後に
ｌ　μＭの水酸化カリウムｌＯ鱈に予め溶解した牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）１９を添加した。更に２分後に、
金−抗体−ＢＳＡ混合物を４℃で１時間１５０００ｘｇ
で遠心した。

上澄みを除去した後、ベレットを１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ
及び１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ８。

２の２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液１−００１−０Ｏ中に
再分散した。この懸濁液を再度遠心し、ペレットを５２
０ｎｍの光学密度が約５．０となる容積まで同じ緩衝液
中に再分散した。

１．２　　保護された物理現像剤の製造本現像剤の二種
の液体成分を別個に製造した。

溶液Ａは１２ｇのヒスチジン、０．４９の硝酸銀及び４
ｇのクエン酸を１００ｍ１２の蒸留水中に溶解すること
により調製された。溶液Ｂは２゜８８ｇのクエン酸ナト
リウム、２ｇの亜硫酸ナトリウム、６　ｇのトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン、“０．５ｇの硫酸ｐ−
メチルアミノフェノール及（７０，２ｇの塩酸ｐ−アミ
ノフェノールを１００　ｍαの蒸留水中に溶解すること
により調製された。

１．３　　吸着性固体相の製造 正方形の白いニトロセルロース紙（１２ｘ１２＋ｌ１ｌ
Ｉ＋）を濾紙の堆積物（’４０Ｘ６０＋ｘ講、高さ１０
ｒａｒ１）の頂部に、それと近接させて取り付けた。こ
の量の濾紙は数ｒａ（ｔの水を吸収することができた。

各ニトロセルロース／濾紙堆積部をニトロセルロース膜
の側に穴（直径１０ｍ＋ｍ）を有する密な段ボール箱中
に入れた。この穴をプラスチックの円筒（直径ｉｏａｍ
、高さ７２ａｌ１）で内張すした。この円筒中に液を注
ぐとニトロセルロースの膜を通して吸収性の濾紙中に液
の流れが起こるような設計とした。

１．４　　緩衝液中におけるヒトＩ−ｇ検出の実行０．
００５％のＢＳＡを含むｐＨ８，２の５９ｍＭトリス−
塩酸緩衝液中に、種々な濃度（１０ないし２００２ｇ　
／　ｔａＱ　）のヒト１ｇ試料を調製した。

該ヒト１ｇ溶液５　μａをニトロセルロース膜の中心に
塗布し、直径約５　ｔａｒｓの湿潤スポットを残し、そ
れは数秒以内に乾燥した（抗体固定工程）。０゜５％Ｂ
ＳＡ及び０．５％ツイーン＠２０を含むｐＨ７，５の５
９ｍＭ燐酸塩緩衝液１０（１１を膜に添加した（遊離の
蛋白質結合座位の飽和工程）。この量の液は円筒を通し
て到達し得るニトロセルロース膜全体を被覆し、膜を通
って流れるのに約１５秒かかった。１００　　ｐｆｆの
コロイド状の金で標識付けされた抗−ヒトＩｇ抗体を添
加した。この容量分を膜を通して吸い取った（更に１５
秒）。１００　μａの保護された物理現像剤溶液Ａを１
００　　ｐ（ｔの溶液Ｂと小さい試験管中で混合した。

その直後、この活性現像剤を膜に添加した。３０秒後に
現像剤は膜を通して全部吸い取られ、実験は終了した。

１．５　　級玉 膜表面上にヒトＩｇが存在することによって、試料を塗
布した側に黒い点（還元された銀）が生じた。この点の
周囲で膜は白いままであり、バックグラウンドの染色は
非常に低い水準であることを示している。５０／７９／
ｉｌｌαのヒトＩｇ５μｍ２（２５０ｎｇ）を添加した
時、現像された信号はなお明瞭に目視できた。総てのＩ
ｇがこうして吸着されるわけではないから、これは１２
ｎｇ／−よりも感度が良好であることに対応する。飽和
した膜上に抗原を固定する点から出発して、分析に要し
た時間は１分以内であった。

１２０＋１９のＤＴＰＡを２ｍＱのアセトニトリル及び
１７０　　μａのトリエチルアミンの混合物中で、撹拌
条件下に９０分間５０℃で加熱した。

室温に冷却後、１７−６５１１ｇのべ−ヒドロキシスク
シンイミド及び２４　μαのジイソプロピルカルボジイ
ミドを添加し、全体を更に９０分間室温で撹拌した。得
られるＤＴＰＡ複合体を、次ぎに、５　ｍｇ　／　ｍＱ
のｈｕｌｇ及び０．２ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７，０
のＯ，１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液と混合する。この溶
液を２０分間毎に短時間振盪して室温に６０分間保つ。

この隠匿後、試料を迅速に数分間−２０℃に冷却し、次
いで４℃に保つ。その後、ｈｕＩｇ及びＤＴＰＡ−ｈｕ
１ｇ分子を未反応のＤＴＰＡ−複合体からセファデック
ス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）■Ｇ１００カラム上でｐＨ５，
０の０．１Ｍ酢酸ナトリクム溶液でゲル濾過することに
より分離した。

２．２　銀で標識付けしたＤＴＰＡ−ｈｕｌｇの調！ ｌ　ｒａＱのＤＴＰＡ−ｈｕｌｇ（２８０ｎｍの光学密
度−１，０）をｌｏｍＭの水酸化カリウムでｐＨ１Ｏ。

７とし、０．１Ｍの硝酸銀溶液を最初の沈殿の兆候が明
らかになるまで数滴添加した。銀イオンがＤＴＰＡと結
合するのに好都合ではないことが知られている条件であ
るｐＨ５，４で硝酸銀をＤＴＰＡ−ｈｕＩｇに添加する
ことにより、対照試料を調製した。セファデックス０Ｇ
２５カラム上で燐酸塩緩衝食塩水（生理的濃度の塩化ナ
トリウムを含むｐＨ７，５の５０ｍＭ燐酸塩緩衝液）で
ゲル濾過することによりＡｇ−ＤＴＰＡ−ｈｕｌｇ及び
ＤＴＰＡ−ｈｕ１ｇ分子を遊離の銀イオンから分離する
前に、これらの混合物を室温で２４時間温隠匿た。

２．３　保護された物理現像剤の製造 本現像剤の二種の液体成分を別個に製造した。

溶液Ａは８ｇのイミダゾール、０．１８９の硝酸銀、１
．４　ｇのクエン酸ナトリウム（・２ｕｘｏ）及び３．
６ｇのクエン酸（Ｈｓｏ　）を１００　鱈の蒸留水中に
溶解することにより調製された。溶液Ｂは３．３ｇのク
エン酸ナトリウム（・２８．０）、３．６９のクエン酸
（Ｈ、ｏ　）、１．６９のハイドロキノン及び０．７５
　ｇの亜硫酸ナトリウムを１００ｍＱの蒸留水中に溶解
することにより調製された。

２．４　　Ａｇ−ＤＴＰＡ−ｈｕｌｇの可視化白いニト
ロセルロース紙（５Ｘ３０！ａｌ１）の切片を固定マト
リックスとして使用した。Ａｇ−ＤＴＰＡ−ｈｕ１ｇ溶
液（２８０ｎｍの光学密度−１，０）の１ｐＩ２二滴及
びＤＰＴＡ−ｈｕ１ｇ対照溶液（２，２参照）１　ｐＱ
二滴を、四つの異なったスポットとして各ニトロセルロ
ース紙の切片に塗布した。０゜５％ＢＳＡ（牛血清アル
ブミン）及び０．１％ツイーン＠２０を含むｐＨ７，５
の５０＋ｓＭの燐酸塩緩衝液中に５ないしｌＯ分分間用
を温置することにより、これらの切片の未飽和の蛋白質
結合座位を封鎖した。１ｉＩＱの現像剤溶液Ａと１ｍ１
２の現像剤溶液ＢをｌＱｍＱの試験管中で混合し、スポ
ットし、飽和した切片をその中に温置することにより実
際の現像を実施した。

現像は室温で３０分間並びに２４時間行なわれた。現像
後、切片を短時間蒸留水で濯ぎ、風乾した。

２．５　鼠玉 ３０分間現像後、Ａｇ−ＤＴＰＡ−ｈｕＩｇスポットは
灰色に着色したが、ＤＰＴＡ−ｈｕ１ｇ対照スポット及
びバックグラウンドは全く着色しなかった。、２４時間
現像後、対照スポット又はバックグラウンドは何も着色
せず、Ａｇ−ＤＴＰＡ−ｈｕ１ｇスポットは一段と濃く
着色した。この実施例は物理現像剤でこのマーカーを可
視化する特異性を示している。同様な実験はＡｇ−ＤＴ
ＰＡ−ｈｕＩｇ分子はｈｕ１ｇ分子自身と同じ免疫結合
的挙動を有することを示した。

３．０　ジアミノベンジジン重合体の可視化ニトロセル
ロースの切片にネズミのＩｇＧ（ｌμａスポット、２５
０μｇＩｇ／μａで開始）をスポットした。

３７℃において３０分間５％ＢＳＡで封鎖した後、ヤギ
ー抗ネズミＩｇＧペルオキシダーゼ標識物と共に切片を
６０分間温隠匿た。５９／１２のＢＳＡと０．５　ｙａ
Ｑ　／　Ｑ　ｆ）”ツイーンを含ＵｐＨ７。

５の０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液で各３分間３回洗
浄した後、切片を水で３回洗浄した。

１００Ｉ＋Ｉｇのジアミノベンジジンを４　ｗｒＱの燐
酸塩緩衝液（５，７５９ＮａｘＨＰ　０４＋　１．４８
　ｇＮａＨｘＰ　０４　２　Ｈ＊Ｏ／　１２水）４＋ｍ
ａに溶かすことにより基質溶液を調製した。この溶液０
．５ｍｇを使用前に同じ燐酸塩緩衝液２５＋ｍ（２及び
３％Ｈ！Ｏ！７５μａと混合した。切片を９分間現像し
た。洗浄後、切片を０．０３％ＨＡｕＣｌ４で６分間処
理した。各３分間３回洗浄後、切片をＮａ、Ｓの０．１
４２％溶液中にに浸漬した。水中で各３分間３回洗浄後
、“２．３”に記載したように０．５ｍ（２の溶液Ａ及
び０．５鱈の溶液Ｂをトリジョン（Ｔ　ｒｉｔｉｏｎ）
Ｘ　ｓｅａ溶液（水中０．２５％）と共に混合すること
により銀の増感を行った。

３．１紋玉　　。

８分間の増感後、強い暗色（黒色）の信号が得られた。

この実施例は本発明による保護された物理現像剤が旧来
の現像剤よりも使用が非常に簡単であることを明らかに
示している。旧来の現像剤で類似の結果を得るためには
、数回の追加工程を必要とし、旧来の現像剤の使用につ
いて知られている注意事項、即ち極めて純粋な水、ガラ
ス器具類等に対し著しく用心しなければならない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）使用される物理現像剤が金属イオン、金属イオンに
   対してモル過剰な錯化剤及び還元剤の溶液を含有して成
   ることを特徴とする金属イオンの還元を触媒するマーカ
   ー上に物理現像剤から金属粒子を析出させる方法。 ２）使用されるマーカーが金属、金属化合物或いは金属
   又は金属化合物で随時被覆又は含浸されていてもよい重
   合体である特許請求の範囲１項記載の方法。 ３）使用されるマーカーがコロイド状の金、銀、タリウ
   ム、白金又はパラジウム粒子；キレート状の金、銀、タ
   リウム、白金又はパラジウムイオン；又は随時金属又は
   金属化合物で含浸されていてもよいベンジジン誘導体の
   重合生成物のいずれかである特許請求の範囲２項記載の
   方法。 ４）該錯化剤が、水性媒体に可溶でありそしてマーカー
   上での金属粒子の成長が許容されるに充分な量の未錯化
   金属イオンが存在し且つ未錯化金属イオンの濃度が望ま
   しくない３次的効果を避けるに充分に低いように錯生成
   定数が選択されている、物理現像剤の金属イオンとの錯
   体を形成することができる任意の薬剤である特許請求の
   範囲１項記載の方法。 ５）該錯化剤が一個又は多数個の窒素供与体原子を有す
   る特許請求の範囲４項記載の方法。 ６）該錯化剤が二個の環状窒素原子を有する５員環又は
   一個の環状窒素原子を有する６員環のいずれかを含む芳
   香族塩基である特許請求の範囲５項記載の方法。 ７）該錯化剤がヒスチジン、イミダゾール、ベンズイミ
   ダゾール、ピラゾール、ピリジン、アミノピリジン、ニ
   コチンアミド、キノリン又はプリンである特許請求の範
   囲６項記載の方法。 ８）該物理現像剤の金属イオンが金、銀、白金、パラジ
   ウム又はタリウムイオンである特許請求の範囲１項記載
   の方法。 ９）該物理現像剤の還元剤が１，２−ジヒドロキシベン
   ゼン、１，４−ジヒドロキシベンゼン、硫酸−４−メチ
   ルアミノフェノール、４−アミノフェノール、１，４−
   ジアミノベンゼン、１，２−ジアミノベンゼン、￥Ｎ￥
   −（４−ヒドロキシフェニル）グリシン、２，４−ジア
   ミノフェノール、１−フェニル−３−ヒドロキシピラゾ
   ール又はそれらの混合物である特許請求の範囲１項記載
   の方法。 １０）該物理現像剤が ａ）還元剤及び必要に応じ緩衝系及び一種又は多種の助
   剤を含有して成る溶液；及び ｂ）金属イオン、金属イオンに対し過剰の錯化剤及び必
   要に応じ緩衝系及び一種又は多種の助剤を含有して成る
   溶液 を混合することにより得られる特許請求の範囲１項記載
   の方法。 １１）該マーカーが少なくとも一つの特異的結合剤及び
   その対応する被結合物質との間に形成された凝集体の少
   なくとも一つの成分に結合される特許請求の範囲１項記
   載の方法。 １２）該マーカーが固体状支持体の内又は上に直接固定
   されている受容体物質に結合される特許請求の範囲１項
   記載の方法。 １３）少なくとも一種の特異的結合剤及びその対応する
   被結合物質との間に形成した凝集体の少なくとも一つの
   成分をマーカーで標識付けし、該凝集体を物理現像剤と
   接触させ、それによってマーカーの影響下に定性的又は
   定量的に測定できる金属粒子が生成することから成る該
   凝集体の一種又は多種の成分を定性的及び／又は定量的
   に測定する方法であつて、使用される物理現像剤が金属
   イオン、金属イオンに対してモル過剰な錯化剤及び還元
   剤の溶液から成ることを特徴とする方法。 １４）特異的結合剤及び対応する被結合物質の間の反応
   の成分が抗体、ハプテン又は抗原である特許請求の範囲
   １３項記載の方法。 １５）下記の： ａ）特異的結合剤又は対応する被結合物質を固体支持体
   上に直接又は間接的に固定し； ｂ）支持体を物理現像剤から錯体化した金属イオンの還
   元を触媒するマーカーで標識付けされた特異的結合剤又
   は対応する被結合物質夫々の相対物と接触させ； ｃ）結合した及び遊離の標識付けされた成分を随時分離
   した後に物理現像剤を添加し、それにより反応の間又は
   適当な反応時間の後生成した金属粒子を試験試料及び／
   又は誘導された分画中で定量的及び／又は定性的に測定
   し、測定すべき成分又は多種成分の定性的及び／又は定
   量的指標を提供する； 工程を含有する特許請求の範囲１３項記載の方法。 １６）固体支持体上に固定されている特異的結合剤によ
   り被結合物質を結合させることによって被結合物質が固
   体支持体上に固定されることを特徴とする特許請求の範
   囲１５項記載の方法。 １７）マーカーで標識付けされた相対物及び物理現像剤
   が固体相に対し移動性である液相の一部であることを特
   徴とする特許請求の範囲１５項記載の方法。 １８）下記の： ａ）特異的結合剤又は対応する被結合物質を固体支持体
   上に直接又は間接的に固定し； ｂ）固定された被結合物質を含む支持体を該被結合物質
   に対し特異的である第一の結合剤と接触させて両者で凝
   集体を形成させ； ｃ）こうして形成された凝集体を保持する支持体を、物
   理現像剤から錯体化された金属イオンの還元を触媒する
   マーカーで標識付けされた前記第一の結合蛋白質に特異
   的である第二の結合蛋白質と接触させ；且つ ｄ）結合した及び遊離の標識付けされた成分を随時分離
   した後に物理現像剤を添加し、それにより反応の間又は
   適当な反応時間の後生成した金属粒子を試験試料及び／
   又は誘導された分画中で定量的及び／又は定性的に測定
   し、測定すべき成分又は多種成分の定性的及び／又は定
   量的指標を提供する； 工程を含有する特許請求の範囲１３項記載の方法。 １９）第一の結合剤、マーカーで標識付けされた第二の
   結合蛋白質及び物理現像剤が該固体相に対し移動性であ
   る液相の一部である特許請求の範囲１８項記載の方法。 ２０）受容体物質をマーカーと結合させ、且つ該マーカ
   ーを物理現像剤と接触させ、それによってマーカーの影
   響下に定性的又は定量的に測定できる金属粒子が生成す
   ることから成る、固体支持体の上又は内に直接固定され
   ている受容体物質を定性的及び／又は定量的に測定する
   方法であつて、使用される物理現像剤が金属イオン、金
   属イオンに対してモル過剰な錯化剤及び還元剤の溶液か
   ら成ることを特徴とする方法。 ２１）下記の： ａ）受容体物質を固体支持体上に固定し； ｂ）該支持体をコロイド状マーカー、及び受容体物質に
   対するマーカーの結合を促進する少なくとも一種の物質
   の溶液から成る懸濁物と接触させ； ｃ）物理現像剤を添加し、それにより反応の間又は適当
   な反応時間後生成した粒子を定量的及び／又は定性的に
   測定する； 工程を含有する特許請求の範囲２０項記載の方法。 ２２）物理現像剤が金属イオン、金属イオンに対してモ
   ル過剰な錯化剤及び還元剤の溶液から成ることを特徴と
   する物理現像剤から金属イオンの還元を触媒するマーカ
   ー上に金属粒子を析出させる試験用キット。 ２３）特許請求の範囲１０記載の方法において使用する
   ための特許請求の範囲２２項記載の試験用キット。 ２４）特許請求の範囲１７記載の方法において使用する
   ための特許請求の範囲２２項記載の試験用キット。 ２５）特許請求の範囲１９記載の方法において使用する
   ための特許請求の範囲２２項記載の試験用キット。 ２６）特許請求の範囲２１記載の方法において使用する
   ための特許請求の範囲２２項記載の試験用キット。 ２７）金属イオン、金属イオンに対してモル比的に過剰
   な錯化剤及び還元剤から成ることを特徴とするマーカー
   上に金属粒子を析出させるための溶液。 ２８）特許請求の範囲６記載の方法において使用するた
   めの特許請求の範囲２７項記載の溶液。 ２９）特許請求の範囲８記載の方法において使用するた
   めの特許請求の範囲２７項記載の溶液。 ３０）特許請求の範囲９記載の方法において使用するた
   めの特許請求の範囲２７項記載の溶液。