JPS6117958A - 蛋白質及び核酸の染色法 - Google Patents
蛋白質及び核酸の染色法Info
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- JPS6117958A JPS6117958A JP60124992A JP12499285A JPS6117958A JP S6117958 A JPS6117958 A JP S6117958A JP 60124992 A JP60124992 A JP 60124992A JP 12499285 A JP12499285 A JP 12499285A JP S6117958 A JPS6117958 A JP S6117958A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、蛋白質及び核酸の染色法及びそのためのキッ
トに関する。
トに関する。
ゲル電気泳動法は、ポリペプチド及び核酸の錯体混合物
を分析するための本質的な方法である。
を分析するための本質的な方法である。
これらの技術の高分離能は、蛋白質に適用され、抗体、
レクチン及び種々の蛋白質の、そのような混合物の特異
的成分への結合活性を試験するためにも利用されている
。そのような分析法は、オーバーレイ分析（ｏｖｅｒｌ
ｅｙ ａｓｓａｙｓ）と呼ばれる。それらは好ましくは
固定化マトリックス例えばニトロセルロース又はナイロ
ンに基づく膜（蛋白質又は核酸プロット）に移された電
気泳動図において行なわれる。蛋白質の場合、この主題
は最近ゲルショ＝ （Ｇ ｅｒｓｈｏｒｉ）及びバレー
ト（Ｐ ａｌａｄｅ）（アナル・ビオヘム（Ａｎａｌ
・Ｂ １ｏｅｈｏｕ、１９８３．１３１．１〜１５）に
より紹介されている。種々のオーバーレイ法の感度は非
常に高く、ナノグラム量以下まで分析できる。これは全
電気泳動図とオーバーレイ中の検出されるバンドとの間
の直接的な関係を可能にするために、感度の良い着色法
の必要性を提起した。クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
）青、アミド黒及び堅牢性縁のような着色剤は、オーバ
ーレイ法の高感度には適さない。ナイロンに基づく膜例
えばゼータ−プローブ（Ｚ ｅｔａ−ｐｒｏｂｅ） （
ビオ−ラッド（Ｂ １ｏ−Ｒｅｄ） ）に対しては、有
用な着色法が存在していない。通常行なわれているのは
、複製のポリアクリル−アミドゲル中の分離された蛋白
質を銀着色法で着色することである。しかしながら、ゲ
ルがプロッティング緩衝液中で収縮す４．〔、タウビン
（Ｔｏｗｂ ｉ ｎ ）ら、ブロク・ナルト・アカド・
サイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、・Ａｃａｄ、 Ｓｅｉ、
）１９７９、Ｌ６ 、４３５０−４３５４ ）ために
、ブＣ１？ト（ｂｌ。
レクチン及び種々の蛋白質の、そのような混合物の特異
的成分への結合活性を試験するためにも利用されている
。そのような分析法は、オーバーレイ分析（ｏｖｅｒｌ
ｅｙ ａｓｓａｙｓ）と呼ばれる。それらは好ましくは
固定化マトリックス例えばニトロセルロース又はナイロ
ンに基づく膜（蛋白質又は核酸プロット）に移された電
気泳動図において行なわれる。蛋白質の場合、この主題
は最近ゲルショ＝ （Ｇ ｅｒｓｈｏｒｉ）及びバレー
ト（Ｐ ａｌａｄｅ）（アナル・ビオヘム（Ａｎａｌ
・Ｂ １ｏｅｈｏｕ、１９８３．１３１．１〜１５）に
より紹介されている。種々のオーバーレイ法の感度は非
常に高く、ナノグラム量以下まで分析できる。これは全
電気泳動図とオーバーレイ中の検出されるバンドとの間
の直接的な関係を可能にするために、感度の良い着色法
の必要性を提起した。クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
）青、アミド黒及び堅牢性縁のような着色剤は、オーバ
ーレイ法の高感度には適さない。ナイロンに基づく膜例
えばゼータ−プローブ（Ｚ ｅｔａ−ｐｒｏｂｅ） （
ビオ−ラッド（Ｂ １ｏ−Ｒｅｄ） ）に対しては、有
用な着色法が存在していない。通常行なわれているのは
、複製のポリアクリル−アミドゲル中の分離された蛋白
質を銀着色法で着色することである。しかしながら、ゲ
ルがプロッティング緩衝液中で収縮す４．〔、タウビン
（Ｔｏｗｂ ｉ ｎ ）ら、ブロク・ナルト・アカド・
サイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、・Ａｃａｄ、 Ｓｅｉ、
）１９７９、Ｌ６ 、４３５０−４３５４ ）ために
、ブＣ１？ト（ｂｌ。
ｔ）の寸法やゲルが着色後に異なるようになり、上述の
ような直接的な関連を困難にする。更に重要なことに、
それはある種の蛋白質に対して問題となるかも知れない
プロッティングめ精度及び効率に関する情報を与えない
、インド・インキでの着色法〔ハンコック（Ｈａｎｃｏ
ｃｋ）及びツアング（’Ｉ”ｓｕｎ−ｇ）、アナル・ビ
オヘム（Ａｎａｌ−ｒ３１ｏｃｌ＋ｅｍ、 ）、１９８
３．１３３．１５７〜１６２〕は、ニトロセルロース蛋
白質プロットについてだけの研究であるが、他の蛋白質
着色法よりも感度が良く且つ使い易いということが記述
されている。しかしながらこの方法で与えられるコント
ラストは非常に鋭くない。
ような直接的な関連を困難にする。更に重要なことに、
それはある種の蛋白質に対して問題となるかも知れない
プロッティングめ精度及び効率に関する情報を与えない
、インド・インキでの着色法〔ハンコック（Ｈａｎｃｏ
ｃｋ）及びツアング（’Ｉ”ｓｕｎ−ｇ）、アナル・ビ
オヘム（Ａｎａｌ−ｒ３１ｏｃｌ＋ｅｍ、 ）、１９８
３．１３３．１５７〜１６２〕は、ニトロセルロース蛋
白質プロットについてだけの研究であるが、他の蛋白質
着色法よりも感度が良く且つ使い易いということが記述
されている。しかしながらこの方法で与えられるコント
ラストは非常に鋭くない。
核酸の錯体混合物を分析するための方法は、例えばデボ
ス（１）ｅｖｏｓ）ら、ジエイ・モル・ビオル（Ｊ、
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ）、１２８．５９５−６１９（
１９７９）に記述されている。核酸の着色は普通工チノ
ウムテ゛ロマイドを用いて行なわれる。この方法の感度
は１°１１いけれども、これはプロッティング膜に適用
されない或いは変性１”） Ｎ Ａに適用されないとい
う重大な欠点を有する。
ス（１）ｅｖｏｓ）ら、ジエイ・モル・ビオル（Ｊ、
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ）、１２８．５９５−６１９（
１９７９）に記述されている。核酸の着色は普通工チノ
ウムテ゛ロマイドを用いて行なわれる。この方法の感度
は１°１１いけれども、これはプロッティング膜に適用
されない或いは変性１”） Ｎ Ａに適用されないとい
う重大な欠点を有する。
以Ｆに記述する本発明は、すべての種類の相体中又は上
における蛋白質又は核酸の着色を取り扱う。この点に関
する核酸はリボ核酸及びデオキシリボ核酸を含んでなる
。本発明の本質的な点は、最適なｐＨ及び濃度に調節さ
れたコロイド状金属粒子を着色剤として用いることであ
る。ここに使用する１コロイド状金属粒子、１とは、金
属、金属化合物或いは金属又は金属化合物で被覆された
核からなる粒子の分散液、好ましくはゾルを包含するこ
とが意図される。コロイド状金属粒子は、金、銀、白金
、又は水酸化鉄などの懸濁液又はゾルを製造するために
記述されているような技術的に公知の方法に従って製造
することがでおる。 、本発明は、最適な濃度及びｐｏ
に調節されたコロイド状金属粒子が高親和性及び高選択
性で蛋白質及び核酸に結合し１１つ用いたコロイド状金
属斡子に対して明らかなコンｌ−ラス１の色特性をりえ
るという驚くべきＱ ’ｙＬにＪ、ｌｉづいている。
における蛋白質又は核酸の着色を取り扱う。この点に関
する核酸はリボ核酸及びデオキシリボ核酸を含んでなる
。本発明の本質的な点は、最適なｐＨ及び濃度に調節さ
れたコロイド状金属粒子を着色剤として用いることであ
る。ここに使用する１コロイド状金属粒子、１とは、金
属、金属化合物或いは金属又は金属化合物で被覆された
核からなる粒子の分散液、好ましくはゾルを包含するこ
とが意図される。コロイド状金属粒子は、金、銀、白金
、又は水酸化鉄などの懸濁液又はゾルを製造するために
記述されているような技術的に公知の方法に従って製造
することがでおる。 、本発明は、最適な濃度及びｐｏ
に調節されたコロイド状金属粒子が高親和性及び高選択
性で蛋白質及び核酸に結合し１１つ用いたコロイド状金
属斡子に対して明らかなコンｌ−ラス１の色特性をりえ
るという驚くべきＱ ’ｙＬにＪ、ｌｉづいている。
随時シグナルは、史なる物理的現像剤に、１：り或いは
コロイド状Ｊ＆、属の金属イオンの変換、続く金属イオ
ンの技術的に公知の色間定法により、改良し及び／又は
高めることがで終る。例えばコロイド状水酸化鉄の１・
ｅ３＋は例えば７工ロシニド塩錯体〔例えばＫ 、Ｆｅ
（（１，Ｎ ）６、フェロシアン化カリウム）と、強い
色を呈する安定な錯体を生成する。
コロイド状Ｊ＆、属の金属イオンの変換、続く金属イオ
ンの技術的に公知の色間定法により、改良し及び／又は
高めることがで終る。例えばコロイド状水酸化鉄の１・
ｅ３＋は例えば７工ロシニド塩錯体〔例えばＫ 、Ｆｅ
（（１，Ｎ ）６、フェロシアン化カリウム）と、強い
色を呈する安定な錯体を生成する。
最適なｐｌＩ及び濃度にｊ調節した時に蛋白質及び核酸
に結合するコロイド状＠−属粒子の例は、金属白金、會
、銀及び銅、また金属化合物、ヨウ化銀、臭化銀、水利
酸化銅、酸化鉄、水酸化又は水利酸化鉄“、水酸化又は
水利酸化アルミニウム、水酸化又は水利酸化クロム、酸
化バナジウム、硫素砒累、水酸化マグネシウム、硫酸鉛
、硫化水銀、硫酸バリウム及び二酸化チタンである。」
二連の金属又は金属化合物で被覆された核からなるコロ
イドも使用できる。この粒子金属又は金属化合物のコロ
イドと同様の性質を有するが、その寸法、密度及び金属
含量は最適に組合わせることができる一般に蛋白の結合
に最適なＩ） Ｈに調節でトる１１一つ蛋白の染色にお
いて肉眼での観察に十分な色強度を与えるすべてのコロ
イド状金属粒子又は金属化合物が使用しうる。好ましく
は、その感度は４を属の金及び銀で得られるものに等し
いか、又はそれより優れている。
に結合するコロイド状＠−属粒子の例は、金属白金、會
、銀及び銅、また金属化合物、ヨウ化銀、臭化銀、水利
酸化銅、酸化鉄、水酸化又は水利酸化鉄“、水酸化又は
水利酸化アルミニウム、水酸化又は水利酸化クロム、酸
化バナジウム、硫素砒累、水酸化マグネシウム、硫酸鉛
、硫化水銀、硫酸バリウム及び二酸化チタンである。」
二連の金属又は金属化合物で被覆された核からなるコロ
イドも使用できる。この粒子金属又は金属化合物のコロ
イドと同様の性質を有するが、その寸法、密度及び金属
含量は最適に組合わせることができる一般に蛋白の結合
に最適なＩ） Ｈに調節でトる１１一つ蛋白の染色にお
いて肉眼での観察に十分な色強度を与えるすべてのコロ
イド状金属粒子又は金属化合物が使用しうる。好ましく
は、その感度は４を属の金及び銀で得られるものに等し
いか、又はそれより優れている。
蛋白質の染色の場合、金、銀及び水酸化鉄コロイドを用
いる時に特に良好な結果が得られる。コロイド状水酸化
鉄は核酸の染色に特に有用であることがわかった。
いる時に特に良好な結果が得られる。コロイド状水酸化
鉄は核酸の染色に特に有用であることがわかった。
コロイド状金属又は金属化合物粒子の粒径は、好ましく
は１−１０ Ｏｎ＋ｎである。適当なＩ） ｆ−（は、
好ましくは結合が最適であり、また最も強い色が得られ
るｐＨである。蛋白質とコロイド状金属粒子が相対する
真の荷電を有する時に１＆尚の結合が起こる。これは蛋
白質で被覆されたコロイド状金属粒子を、組織化学及び
生化学におけるプローブ（ｐｒｏｂｅ）として使用せし
める公知の方法とは異なっている。この分野では、蛋白
質のｔｔＩに近いｐＨにおいて、蛋白質をコロ・イド状
金属粒子にに吸にｌ？８せる。１〕１１の調節は普通の
方法のいずれかで性成することかできる。緩衝液を約１
（１ｍＭの最終濃度までコロイド状金属粒子に添加する
ことは好適な方法である。
は１−１０ Ｏｎ＋ｎである。適当なＩ） ｆ−（は、
好ましくは結合が最適であり、また最も強い色が得られ
るｐＨである。蛋白質とコロイド状金属粒子が相対する
真の荷電を有する時に１＆尚の結合が起こる。これは蛋
白質で被覆されたコロイド状金属粒子を、組織化学及び
生化学におけるプローブ（ｐｒｏｂｅ）として使用せし
める公知の方法とは異なっている。この分野では、蛋白
質のｔｔＩに近いｐＨにおいて、蛋白質をコロ・イド状
金属粒子にに吸にｌ？８せる。１〕１１の調節は普通の
方法のいずれかで性成することかできる。緩衝液を約１
（１ｍＭの最終濃度までコロイド状金属粒子に添加する
ことは好適な方法である。
コロイド状金属粒子の適当な濃度は、実際的な保温時間
（数分−１１１間）内に完全な色の飽和を与えるもので
ある。これは原料の適当な濃度の選択により或いは公知
の方法で希釈又は濃縮により得ることができる。
（数分−１１１間）内に完全な色の飽和を与えるもので
ある。これは原料の適当な濃度の選択により或いは公知
の方法で希釈又は濃縮により得ることができる。
蛋白質及び核酸が本発明に従って染色できるそのための
担体は、種々の種類のものであり、例えばゲル、特に蛋
白質及び核酸の、クロマトグラフィー、電気泳動による
分離に使用される或いは技術的に公知の免疫化学的方法
例えば免疫拡散法、放射性免疫拡散法、免疫電気泳動法
、計数免疫電気泳動法のいずれかに対する支持体として
使用されるもの；及び蛋白質又は核酸に対するオーバー
レイ技術（ハイブリッド化技術）に対する担体として用
いられる固定化マトリックス、を含んでなる。
担体は、種々の種類のものであり、例えばゲル、特に蛋
白質及び核酸の、クロマトグラフィー、電気泳動による
分離に使用される或いは技術的に公知の免疫化学的方法
例えば免疫拡散法、放射性免疫拡散法、免疫電気泳動法
、計数免疫電気泳動法のいずれかに対する支持体として
使用されるもの；及び蛋白質又は核酸に対するオーバー
レイ技術（ハイブリッド化技術）に対する担体として用
いられる固定化マトリックス、を含んでなる。
１２一
本発明の染色法が成功裏に適用できるそのようなゲルの
例１土例えば寒天及び酢酸セルロースのゲルを含む。
例１土例えば寒天及び酢酸セルロースのゲルを含む。
固定化マトリックスは、蛋白質又は核酸が固定で外るい
ずれかの種類の重合体物質、特に蛋白質又は核酸が一般
にプロッティング（ｂｌｏｔｔｉＢ）として汀及される
方法によって分離媒体から移せる物質を含むことが意図
される。そのようなマトリックスの例ハ、ニトロセルロ
ース、ナイロン（例、ｔばポリへキサメチレンアジバミ
ン）、酢酸セルロース及び種々の改変酢酸セルロース例
えばジアゾベンジロキシメチル（ＤＢＭ）−又はジアゾ
フェニルチオエーテル（Ｉ） Ｐ Ｔ ）−改変セルロ
ース紙である。
ずれかの種類の重合体物質、特に蛋白質又は核酸が一般
にプロッティング（ｂｌｏｔｔｉＢ）として汀及される
方法によって分離媒体から移せる物質を含むことが意図
される。そのようなマトリックスの例ハ、ニトロセルロ
ース、ナイロン（例、ｔばポリへキサメチレンアジバミ
ン）、酢酸セルロース及び種々の改変酢酸セルロース例
えばジアゾベンジロキシメチル（ＤＢＭ）−又はジアゾ
フェニルチオエーテル（Ｉ） Ｐ Ｔ ）−改変セルロ
ース紙である。
染色過程萌に支持体を洗浄することは有利である。この
洗浄は付着している干渉物質、例えばポリアミドゲル粒
子及び残在５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）（Ｓｌ’
）Ｓ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）
を最初に用いる場合）を除去することが意図される。
洗浄は付着している干渉物質、例えばポリアミドゲル粒
子及び残在５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）（Ｓｌ’
）Ｓ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）
を最初に用いる場合）を除去することが意図される。
ｐ Ｉ−１を調節するｉＩｊ又１よ後に、洗剤をコロイ
ド状金属粒子に添加することも有利であることかわかっ
た。ツウイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタンモ
７ラウレート）、１リドン−ＸＩＯ（１及びミ、リスチ
ルトリメナルアンモニウムブロマイドが例としてここに
言及されるけれど、同様の表面活性物質も同様に使用す
ることができる。
ド状金属粒子に添加することも有利であることかわかっ
た。ツウイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタンモ
７ラウレート）、１リドン−ＸＩＯ（１及びミ、リスチ
ルトリメナルアンモニウムブロマイドが例としてここに
言及されるけれど、同様の表面活性物質も同様に使用す
ることができる。
現在の染色技術と比べて、本発明の方法は特にその実質
的な高感度に関して明らかに優れている。
的な高感度に関して明らかに優れている。
結果として、それは、多くの環境において非常に望よ【
、い対像物である非常に紙皿の蛋白質及び核酸を検知す
るために使用することがで鰺る。Ｉ−述したように、そ
のような高感度は蛋白質プロットの適当な染色のために
必須である。本方法は蛋白質又は核酸の、他の担体、特
に例えば分離媒体のようなゲル、例えば電気泳動媒体中
又は上における直接的な肉１１での観察と関連して大き
な利点も有する。この点においで、本発明は非常に低い
蛋白質含量の試料、例えば脳を髄液のようなある種の生
物学的液体の蛋白質分離を肉眼で見えるようにすること
かできる。ｃｓｒｒは非常に定量でしか蛋白質を含有・
すす、従って普通の分析及び診断技術を用いれば電気泳
動蛋白質分析を行なう前に液体の濃縮が必要であり、か
くして比較的多量の試料が必要である。１回の穿刺では
限られた量１７か得ることができず、また患者に刻する
外傷のため及び良好な試料を（ｊ）るために要求される
努力及び技術が故に、分析に必要な８祉を減する手段は
、現在分析及び診断法として存在するものよりも明確な
利点として考えられ、また技術を構成する。
、い対像物である非常に紙皿の蛋白質及び核酸を検知す
るために使用することがで鰺る。Ｉ−述したように、そ
のような高感度は蛋白質プロットの適当な染色のために
必須である。本方法は蛋白質又は核酸の、他の担体、特
に例えば分離媒体のようなゲル、例えば電気泳動媒体中
又は上における直接的な肉１１での観察と関連して大き
な利点も有する。この点においで、本発明は非常に低い
蛋白質含量の試料、例えば脳を髄液のようなある種の生
物学的液体の蛋白質分離を肉眼で見えるようにすること
かできる。ｃｓｒｒは非常に定量でしか蛋白質を含有・
すす、従って普通の分析及び診断技術を用いれば電気泳
動蛋白質分析を行なう前に液体の濃縮が必要であり、か
くして比較的多量の試料が必要である。１回の穿刺では
限られた量１７か得ることができず、また患者に刻する
外傷のため及び良好な試料を（ｊ）るために要求される
努力及び技術が故に、分析に必要な８祉を減する手段は
、現在分析及び診断法として存在するものよりも明確な
利点として考えられ、また技術を構成する。
試料の予備的な濃縮又は高濃度化が避けられるという事
実は、重要な改良であり、血清及び尿のような種々の液
体に適用される診断法を容易にする。
実は、重要な改良であり、血清及び尿のような種々の液
体に適用される診断法を容易にする。
結果して、本発明の方法は、多くの代謝の変調及び病気
の診断のための現在技術、例えばＣＳ Ｆ分析による脳
腫瘍の検知及び尿試料分析に上る骨髄腫の検知の技術に
かなりの改良を提供する。ここに本発明は特にＩＩＦＪ
、法的診断において非常ら有用性を有するものである。
の診断のための現在技術、例えばＣＳ Ｆ分析による脳
腫瘍の検知及び尿試料分析に上る骨髄腫の検知の技術に
かなりの改良を提供する。ここに本発明は特にＩＩＦＪ
、法的診断において非常ら有用性を有するものである。
染色過程の結果は定ヤ１：的及び定Ｍｔ的評価の双ノｊ
に使用することがでトる。定１／Ｉ：的評価は汗通ｔＢ
なる肉眼で見ることによって行なわれる。定ｊｊ、’的
測定は普通分光法例えば反射法又は密度法を用いて行な
われる。密度法を用いる場合には、担体を適当な溶媒例
えばキシレンでの処理により最初に透明にしておくこと
が必要である。
に使用することがでトる。定１／Ｉ：的評価は汗通ｔＢ
なる肉眼で見ることによって行なわれる。定ｊｊ、’的
測定は普通分光法例えば反射法又は密度法を用いて行な
われる。密度法を用いる場合には、担体を適当な溶媒例
えばキシレンでの処理により最初に透明にしておくこと
が必要である。
本発明は、
ｉ）適当に洗浄した及び所望により続いて風乾した蛋白
質又は核酸支持体を、好よ［、＜は蛋白質又は核酸の結
合を妨害１−ない洗剤例えば０．１％の非イオン性洗剤
すウイーン２０を含有し１１．つ適当なｐ ｌ−（に調
節された媒体中に懸濁した十分な濃度のコロイド状金属
粒子と接触させ、そして随時コロイド状金属粒子によっ
て生ずる光学的シグナルを物理的現像剤のような適当な
増感剤によって高め或いはコロイド状舎属の金属イオン
への変換後の技術的に公知の色間定法により改良し及び
／又は高めてもよく； ｉｉ） 生じた着色シグナル及び結合したコロイド状
金属ネζｆ子にヌ・１する特性を肉眼で或いは技術的に
公知な分光法例えば密度法を用いて読む、という続く工
程を含んでいる。
質又は核酸支持体を、好よ［、＜は蛋白質又は核酸の結
合を妨害１−ない洗剤例えば０．１％の非イオン性洗剤
すウイーン２０を含有し１１．つ適当なｐ ｌ−（に調
節された媒体中に懸濁した十分な濃度のコロイド状金属
粒子と接触させ、そして随時コロイド状金属粒子によっ
て生ずる光学的シグナルを物理的現像剤のような適当な
増感剤によって高め或いはコロイド状舎属の金属イオン
への変換後の技術的に公知の色間定法により改良し及び
／又は高めてもよく； ｉｉ） 生じた着色シグナル及び結合したコロイド状
金属ネζｆ子にヌ・１する特性を肉眼で或いは技術的に
公知な分光法例えば密度法を用いて読む、という続く工
程を含んでいる。
′ 次の実施例は本発明を更に説明するが、その範囲を
制限することを意図しない。
制限することを意図しない。
束嵐獅−１−
ある濃度範囲の、ニトロセルロース膜１こ移された蛋白
質の分子量マーカーの、コロイド状金粒子での染色 用いた物質は、平均直径２（ｌｎｍの粒子〔販売元：ジ
ャンセン・ライフ・サイエンシーズ・プログクツ（Ｊ
ｕｎｓＳｅｎ １− ｉｆｅ Ｓ ｃｉｅｎｃｅ Ｐ
ｒｏｄｕｃｌ、ｓ）、ピアス（Ｂｅａｒｓｅ）、ベルギ
ー〕からなるコロイド状金ゾル及びニトロセルロースの
シート（０，４５μ）、・７ウイーン２０及び高分子量
物（１−ｆＭＷ）（すべてがビオーラッド製）を含有し
た。このＩ−Ｉ Ｍ Ｗ標準物はミオシン（２＋１ （
ｌ ｋｌ） ａ）、β−ガラクトシグーゼ（１１６，５
ｋｌ）ａ）、ホスホリラーゼＨ（９２，５ｋｌ’）ａ）
、牛の血清アルブミン（（ｉ６．２ｋ ｌ’） ａ ）
及びオバルブミン（４３ｋｌ’） ｕ）からなり、すべ
ては製造元が示すように約２ ｍＦ１７ ｍ １の濃度
であった。ｔ（Ｍ Ｗ標準物を、レムリ・オー・ケイ（
Ｌ、ｕｅ＋ｎｍ１ｉ、 ｃ”）＋ Ｋ、 ）（ネーチャ
ー（Ｎ ａｔ、ｕｒｅ） １ ！３７０．２’２；／、
６８（１−６８５）に従い、２つの７．５％ポリアクリ
ルアミドｒルー＃−，でのＳ Ｉ） Ｓ−ウ′ル電気泳
動法で分離した。
質の分子量マーカーの、コロイド状金粒子での染色 用いた物質は、平均直径２（ｌｎｍの粒子〔販売元：ジ
ャンセン・ライフ・サイエンシーズ・プログクツ（Ｊ
ｕｎｓＳｅｎ １− ｉｆｅ Ｓ ｃｉｅｎｃｅ Ｐ
ｒｏｄｕｃｌ、ｓ）、ピアス（Ｂｅａｒｓｅ）、ベルギ
ー〕からなるコロイド状金ゾル及びニトロセルロースの
シート（０，４５μ）、・７ウイーン２０及び高分子量
物（１−ｆＭＷ）（すべてがビオーラッド製）を含有し
た。このＩ−Ｉ Ｍ Ｗ標準物はミオシン（２＋１ （
ｌ ｋｌ） ａ）、β−ガラクトシグーゼ（１１６，５
ｋｌ）ａ）、ホスホリラーゼＨ（９２，５ｋｌ’）ａ）
、牛の血清アルブミン（（ｉ６．２ｋ ｌ’） ａ ）
及びオバルブミン（４３ｋｌ’） ｕ）からなり、すべ
ては製造元が示すように約２ ｍＦ１７ ｍ １の濃度
であった。ｔ（Ｍ Ｗ標準物を、レムリ・オー・ケイ（
Ｌ、ｕｅ＋ｎｍ１ｉ、 ｃ”）＋ Ｋ、 ）（ネーチャ
ー（Ｎ ａｔ、ｕｒｅ） １ ！３７０．２’２；／、
６８（１−６８５）に従い、２つの７．５％ポリアクリ
ルアミドｒルー＃−，でのＳ Ｉ） Ｓ−ウ′ル電気泳
動法で分離した。
一連の希釈物（１０（）０〜：ｔ、５ｎ［？／ポリペプ
チドバンド）を１（）のウェル（…ｅｌｆ）−ゲルの９
つの１ンエル中に負荷した。最後のウェルには試料の緩
衝液だけを負荷した。
チドバンド）を１（）のウェル（…ｅｌｆ）−ゲルの９
つの１ンエル中に負荷した。最後のウェルには試料の緩
衝液だけを負荷した。
泳動後、１つのゲルを銀染色法〔モリシー・ジエイ・エ
イチ（Ｍｏｒｉｓｓｅｙ、 Ｊ 、 Ｉ−１，）、ア
ナル・ビオヘム（Ａ ｎａｌ、 Ｔ’３１ｏｃｂｅ＋ａ
、 ）、１９８１．１１７−１３０７〜３１１）で染色
した。他のゲルの分離された蛋白質をニトロセルロース
紙に電気移動（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｔｅｒ）させ
た（夕１ンビンら、ブロク・ナツル・アカド・サイ、１
９７６．７６．４３５０〜４３５４ ）。プロットを大
きいベトリ皿中において０．ｌｖ／ｖ％ツウィーン２０
を含む燐酸塩緩衝の食塩水（Ｃａ２＋及びＭ ［”を含
まず、ｐｌ＋７．２）（ＰＢＳ−ＴＷ）ｒ３７℃下に洗
浄し、＊ ？、： Ｐ １１ Ｓ−１’ Ｗで室温ｌζ
に３ Ｘ １０分間洗浄した。洗浄したプロットを過剰
の水でゆすいだ。このゆすいだプロットを次のように（
１（１０ｍ／に対して）調整したコロイド状の含着色剤
と共に保温した；コロイド＆金（Ｇ２ｏ、ジャンセン ・ライフ・サイエンス・プログクツ）７５ωｒＩＩ２０
中２％ツウィーン２０ ５ｍｌ＋） ［１
ｇ 、 Ｏの５０＋ｎＭクエン酸ａ衝液 ２
０＋ｎ Ｉｔ緩衝剤の添加曲にツウイーン２０及び金ゾ
ルを良く混合した。保温を４時間続けた。次いで着色さ
れたプロットをｒ−１２０中でゆすぎ、空気乾燥した。
イチ（Ｍｏｒｉｓｓｅｙ、 Ｊ 、 Ｉ−１，）、ア
ナル・ビオヘム（Ａ ｎａｌ、 Ｔ’３１ｏｃｂｅ＋ａ
、 ）、１９８１．１１７−１３０７〜３１１）で染色
した。他のゲルの分離された蛋白質をニトロセルロース
紙に電気移動（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｔｅｒ）させ
た（夕１ンビンら、ブロク・ナツル・アカド・サイ、１
９７６．７６．４３５０〜４３５４ ）。プロットを大
きいベトリ皿中において０．ｌｖ／ｖ％ツウィーン２０
を含む燐酸塩緩衝の食塩水（Ｃａ２＋及びＭ ［”を含
まず、ｐｌ＋７．２）（ＰＢＳ−ＴＷ）ｒ３７℃下に洗
浄し、＊ ？、： Ｐ １１ Ｓ−１’ Ｗで室温ｌζ
に３ Ｘ １０分間洗浄した。洗浄したプロットを過剰
の水でゆすいだ。このゆすいだプロットを次のように（
１（１０ｍ／に対して）調整したコロイド状の含着色剤
と共に保温した；コロイド＆金（Ｇ２ｏ、ジャンセン ・ライフ・サイエンス・プログクツ）７５ωｒＩＩ２０
中２％ツウィーン２０ ５ｍｌ＋） ［１
ｇ 、 Ｏの５０＋ｎＭクエン酸ａ衝液 ２
０＋ｎ Ｉｔ緩衝剤の添加曲にツウイーン２０及び金ゾ
ルを良く混合した。保温を４時間続けた。次いで着色さ
れたプロットをｒ−１２０中でゆすぎ、空気乾燥した。
コロイド状４￥着色物によって検出される蛋白質バンド
は赤外バンドとして現われた。この着色の感度はポリア
クリルアミドゲル中の蛋白質の銀染色と同一の範囲であ
った。検出限界は±２５０ｐｇ／ ｖ ｍ ２と推定さ
れた。
は赤外バンドとして現われた。この着色の感度はポリア
クリルアミドゲル中の蛋白質の銀染色と同一の範囲であ
った。検出限界は±２５０ｐｇ／ ｖ ｍ ２と推定さ
れた。
害１１例−］−
ニトロセルロース膜に移した分子ｔマーカーの、コロイ
ド状銀粒子での染色 ７レンズ（Ｆｒｅｎｓ）及びオーバービーク（Ｏｖｅｒ
ｂｅ−ｅｋ）（コル・ゼット・ニー・ゼット・ボリム（
Ｋｏｌｌ、 Ｚ、ｕ、χ、 Ｐｏｌｙｍ）１９６９．２
２３．９２２〜９２９ ］に従ってコロイド状銀粒子を
製造した、ＨＭＷ標準物、ニトロセルロースシート及び
ツウイーン２０は実施例１と同一であった。ＬＩＭＷ椋
準物原溶＠１２，５μβを同一の緩衝剤５（）０μ！し
で希釈し、３分間沸Ｉｌｌさせ、実施例１にのおける如
く１つのウェルの７．５％ポリアクリルアミドゲル中で
泳動させた。
ド状銀粒子での染色 ７レンズ（Ｆｒｅｎｓ）及びオーバービーク（Ｏｖｅｒ
ｂｅ−ｅｋ）（コル・ゼット・ニー・ゼット・ボリム（
Ｋｏｌｌ、 Ｚ、ｕ、χ、 Ｐｏｌｙｍ）１９６９．２
２３．９２２〜９２９ ］に従ってコロイド状銀粒子を
製造した、ＨＭＷ標準物、ニトロセルロースシート及び
ツウイーン２０は実施例１と同一であった。ＬＩＭＷ椋
準物原溶＠１２，５μβを同一の緩衝剤５（）０μ！し
で希釈し、３分間沸Ｉｌｌさせ、実施例１にのおける如
く１つのウェルの７．５％ポリアクリルアミドゲル中で
泳動させた。
電気移動、ｌ） ＋１８−’ＦＷでの洗浄及び水でのゆ
すぎを実施例１における如く行った。Ｉｌｌ ４ ｍｍ
の１つの細片を含着色剤と共に保温１７た。第２の細片
を次の如く製造したコロイド収録着色剤と共に保温した
： コロイド状銀（水中で１０Ｃ）倍に 希釈した時Ａ ３ｇ、ｎｍ：” ＋、（１）
７５１０１２水中２％ツウイーン
５＋ｏｉ２ｐ Ｉ（８、０の５（１ｍＭク
エン酸４１１Ｊｊｍ ２（１ｍｇ緩衝剤の
添加１１１１にツウィーン２０及び銀ゾルを良く混合し
た。保温を４時間続けた。着色されたプロットをＦｌ
２０中でゆすぎ、風乾した。
すぎを実施例１における如く行った。Ｉｌｌ ４ ｍｍ
の１つの細片を含着色剤と共に保温１７た。第２の細片
を次の如く製造したコロイド収録着色剤と共に保温した
： コロイド状銀（水中で１０Ｃ）倍に 希釈した時Ａ ３ｇ、ｎｍ：” ＋、（１）
７５１０１２水中２％ツウイーン
５＋ｏｉ２ｐ Ｉ（８、０の５（１ｍＭク
エン酸４１１Ｊｊｍ ２（１ｍｇ緩衝剤の
添加１１１１にツウィーン２０及び銀ゾルを良く混合し
た。保温を４時間続けた。着色されたプロットをＦｌ
２０中でゆすぎ、風乾した。
コロイド収録着色剤によって検出された蛋白質バンドは
褐色ないし黒色のバンドとして現われた。
褐色ないし黒色のバンドとして現われた。
感度はコロイド状金着色剤ど同一の範囲であった。
実１舛」−
ゼータ（Ｚｅｔａ）−プローブ膜に移した分子量マーカ
ーの、コロイド状水酸化鉄粒子での染色コロイド状水酸
化銀は、プラトベリー（Ｂｒａｄｂｕ−ｒｒｙ）ら、ヒ
ストヘム・ジエイ（１−１１ｓｔｏｃｌ＋ｅｍ、 Ｊ
、 ）１９７０、？−１２６３〜２７４に従って製造
した。
ーの、コロイド状水酸化鉄粒子での染色コロイド状水酸
化銀は、プラトベリー（Ｂｒａｄｂｕ−ｒｒｙ）ら、ヒ
ストヘム・ジエイ（１−１１ｓｔｏｃｌ＋ｅｍ、 Ｊ
、 ）１９７０、？−１２６３〜２７４に従って製造
した。
０．０５Ｍ ｌ”ｅＣ１３（６Ｔ−Ｔ ２０ ）２０
０ ｌｌｌ１）を、連続的に攪拌ｌ、なから沸騰水８０
０ｍ／に滴々に添加した。コロイドをｌＴ２Ｏを何回か
変えて透析した。
０ ｌｌｌ１）を、連続的に攪拌ｌ、なから沸騰水８０
０ｍ／に滴々に添加した。コロイドをｌＴ２Ｏを何回か
変えて透析した。
ＩＩ Ｍ Ｗ楳噌物は実施例１と同一であった。プロッ
ティング媒体としては、ゼータ−プローブ、即ち！ｌ！
！造中に多くの：（級アミノ基を導入することによって
改変したナイロンマトリックス（ナイロン６６と１７て
ｒ１及されるポリへキサメチレンアジパミン）（発売元
：ビオーフッド）であった。トリトン−Ｘ−１（１０（
オクチルフェノキシボリエトキシエタノ−ル）［発光）
Ｃ：シグマ（Ｓ ｉｇｍａ） ］。ＨＭ Ｗ ｆｆ準原
溶液１２．５μβを、試料ａ衝液５００メ１１で希釈し
、３分間沸騰させ、実施例２におけるように１つのウェ
ルの７．５％ポリアクリルアミドゲル中で泳動させた。
ティング媒体としては、ゼータ−プローブ、即ち！ｌ！
！造中に多くの：（級アミノ基を導入することによって
改変したナイロンマトリックス（ナイロン６６と１７て
ｒ１及されるポリへキサメチレンアジパミン）（発売元
：ビオーフッド）であった。トリトン−Ｘ−１（１０（
オクチルフェノキシボリエトキシエタノ−ル）［発光）
Ｃ：シグマ（Ｓ ｉｇｍａ） ］。ＨＭ Ｗ ｆｆ準原
溶液１２．５μβを、試料ａ衝液５００メ１１で希釈し
、３分間沸騰させ、実施例２におけるように１つのウェ
ルの７．５％ポリアクリルアミドゲル中で泳動させた。
ゼータ−プローブへの電気移動はゲルショニ及ヒバレー
ド、アナル・ビオヘム、１９Ｂ２．１２４−１３９６〜
４０６に記述されるように行った。移動緩衝剤中にメタ
ノールを使用しなかった。
ド、アナル・ビオヘム、１９Ｂ２．１２４−１３９６〜
４０６に記述されるように行った。移動緩衝剤中にメタ
ノールを使用しなかった。
プロットを、１％トリトン−ＸｉＯ（ｌを補充した水で
、室温下に夜通し洗浄した。次いで中４＋ｎ＋。
、室温下に夜通し洗浄した。次いで中４＋ｎ＋。
のプロットの垂直の細片を０．２％トリトン−Ｘ−１０
０中で洗浄し、次の、ｌ；）に！！！造したコロイド状
水酸化鉄着色剤５＋ｏｎと共に史に保温した：透析した
コロイド状水酸化鉄 ２００μｌ水中１０ｖ／
ｖ％ ト リ ト ンーＸ−１０（１１００μ １０．
２Ｍナトリウム力コジレート／ ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７［発売元： Ｉ３ Ｄ Ｈケミカルス゛・リミテッド（Ｃｂｅａ＋１
ｃａｌｓ Ｌｔｄ、）、プール（Ｐｏｏｌｅ）、イヤリ
ス） ４，７１Ｉｅ保温を４時間
続けた。着色したプロットを０２０中でゆすぎ、風乾し
た。
０中で洗浄し、次の、ｌ；）に！！！造したコロイド状
水酸化鉄着色剤５＋ｏｎと共に史に保温した：透析した
コロイド状水酸化鉄 ２００μｌ水中１０ｖ／
ｖ％ ト リ ト ンーＸ−１０（１１００μ １０．
２Ｍナトリウム力コジレート／ ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７［発売元： Ｉ３ Ｄ Ｈケミカルス゛・リミテッド（Ｃｂｅａ＋１
ｃａｌｓ Ｌｔｄ、）、プール（Ｐｏｏｌｅ）、イヤリ
ス） ４，７１Ｉｅ保温を４時間
続けた。着色したプロットを０２０中でゆすぎ、風乾し
た。
コロイド状水酸化鉄着色剤で検出された蛋白質２ バン
ドは、非常に明るい背景を褐色として現われた。
ドは、非常に明るい背景を褐色として現われた。
火施−例−−４゜
ゼータ−プローブ膜に移した分子量マーカーのコロイド
状金粒子での染色 染色はｉｌ／、均直什２ （ｉ ｎｕｎのコロイド状金
粒子（発売元：ジャンセン・ライフ・サイエンス・プロ
グクツ、ピアス、ベル￥−）を用いて↑ｔった。ＩＩＭ
Ｗ標帛物ゼータ−プローブは実施例３におけるものと同
一であった。
状金粒子での染色 染色はｉｌ／、均直什２ （ｉ ｎｕｎのコロイド状金
粒子（発売元：ジャンセン・ライフ・サイエンス・プロ
グクツ、ピアス、ベル￥−）を用いて↑ｔった。ＩＩＭ
Ｗ標帛物ゼータ−プローブは実施例３におけるものと同
一であった。
染色のために用いた蛋白質プロットは実施例３における
ものと同様に作った。このプロットを過剰の水で、室温
Ｆに夜通し洗浄した。
ものと同様に作った。このプロットを過剰の水で、室温
Ｆに夜通し洗浄した。
Ｉｌｌ ４ ｍｍのプロア）の１Ｆ直の細片を、次のよ
うに！！！！遺したコロイド状合着色剤５饋βと共に更
に保温し、た： コロイド状金ゾル ４ｍ１−２：（
− １、０ｗ／ ｖ％ミリスチリルトリメチルアンモニウム
ブロマイド １１ＩＩ！ｐＨをＮａＯＨで
８に調節した。
うに！！！！遺したコロイド状合着色剤５饋βと共に更
に保温し、た： コロイド状金ゾル ４ｍ１−２：（
− １、０ｗ／ ｖ％ミリスチリルトリメチルアンモニウム
ブロマイド １１ＩＩ！ｐＨをＮａＯＨで
８に調節した。
保温を４時間続けた。着色した細片をＩ］２０中で洗い
、風乾した。このコロイド状金着色剤で検出される蛋白
質のバンドは明るい桃色の背景を有する赤色のバンドと
して現われた。この感度は、コロイド状水酸化鉄をゼー
タ・プローブに対して用いた場合（実施例３）に得られ
るものと対比できた。
、風乾した。このコロイド状金着色剤で検出される蛋白
質のバンドは明るい桃色の背景を有する赤色のバンドと
して現われた。この感度は、コロイド状水酸化鉄をゼー
タ・プローブに対して用いた場合（実施例３）に得られ
るものと対比できた。
実施例−」Ｌ
ゼータ−プローブ膜に移した分子量マーカーのコロイド
状水酸化銖粒子での染色、続く塩酸での加水分解と７エ
ロシアン化カリウム（Ｋ＜）ｅ（ＣＮ）６〕でのターン
プル（ｔｕｒｎｂｕｌｌ）■への変換実施例３に従って
、コロイド次水酸化鉄で染色した細片を準備した。
状水酸化銖粒子での染色、続く塩酸での加水分解と７エ
ロシアン化カリウム（Ｋ＜）ｅ（ＣＮ）６〕でのターン
プル（ｔｕｒｎｂｕｌｌ）■への変換実施例３に従って
、コロイド次水酸化鉄で染色した細片を準備した。
コロイド状水酸化鉄中での保温の完了後、細片を水中で
数回洗浄し、次いで次の溶液で±６０秒間処理した： ＩＮＨＣ’、１ ２部水
２部０．０５Ｍ
Ｋ、）’ｅ（ＣＮ）６ １
部この溶液を新しく作った。
数回洗浄し、次いで次の溶液で±６０秒間処理した： ＩＮＨＣ’、１ ２部水
２部０．０５Ｍ
Ｋ、）’ｅ（ＣＮ）６ １
部この溶液を新しく作った。
細片を、水を数回変えてゆすぎ、風乾した。この標準的
な染色法で検出される蛋白質バンドは明青色の背景に対
して青色バンドとして現われた。
な染色法で検出される蛋白質バンドは明青色の背景に対
して青色バンドとして現われた。
蛋白質の見えやすさはがなり高められ、今やこの？ｉ１
％７Ｊｅハニトロセルロースプロット」二においでコロ
イド状金着色剤で得られたものに近かった。
％７Ｊｅハニトロセルロースプロット」二においでコロ
イド状金着色剤で得られたものに近かった。
実」虻例−−更
蛋白質のｆ１１酸セルロース膜中での染色Ａ、電気泳動
分離 セロゲルを３０％メタノール中で貯蔵し、使用前に乾燥
した。この膜を、ベロナル（Ｖ ｅｒｏｎａ Ｉ ）１
゜３４ｇ／ １０００ ＋ａ ｌ！及ヒヘロナルーナト
リウＡ １０３ｇ／１０１００Ｏを含有する電気泳動緩
衝剤（ｐＨ８，６）中で洗浄した。
分離 セロゲルを３０％メタノール中で貯蔵し、使用前に乾燥
した。この膜を、ベロナル（Ｖ ｅｒｏｎａ Ｉ ）１
゜３４ｇ／ １０００ ＋ａ ｌ！及ヒヘロナルーナト
リウＡ １０３ｇ／１０１００Ｏを含有する電気泳動緩
衝剤（ｐＨ８，６）中で洗浄した。
３μ！の馬の血清を含む、電気泳動緩衝剤でそれぞれ１
／２、及びｌ／１００で希釈した試料を、ミクロアプリ
ケータで負荷した。電気泳動分＾１＃を２００Ｖ（を大
強度１（ｌｔｎＡ）で３５分間行なった。
／２、及びｌ／１００で希釈した試料を、ミクロアプリ
ケータで負荷した。電気泳動分＾１＃を２００Ｖ（を大
強度１（ｌｔｎＡ）で３５分間行なった。
Ｂ、染色
複製ゲルを、アミドブラック或いは実施例１に記述１．
たものと同一のコロイド状’に７ｆ色剤で染色した。
たものと同一のコロイド状’に７ｆ色剤で染色した。
１、アミドブラックでの染色
膜を、メタノール５０［ｆｌβ、水４０１１中及び酢酸
１０ｍＡ’中にアミド黒０，５ｇを含む溶液と３０分間
接触させることによって染色した。次いでメタノール５
００＋ｎｆ、酢酸１００Ｉ１１１及び水４００ｍｆの混
合物を用いて１５分間に百り着色物の除去を行なった。
１０ｍＡ’中にアミド黒０，５ｇを含む溶液と３０分間
接触させることによって染色した。次いでメタノール５
００＋ｎｆ、酢酸１００Ｉ１１１及び水４００ｍｆの混
合物を用いて１５分間に百り着色物の除去を行なった。
２、金での染色
膜をメタノール５０ＩＩＩＩ２、水４０＋ｏｌ及び酢酸
１０ ＋ｎ ｅの混合物中に３０分間固定した。次いで
これを燐酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７，６）で１５分間に３
回洗浄した。次いで着色剤が飽和するまで膜を金着色剤
中で保温した（約２時間）。
１０ ＋ｎ ｅの混合物中に３０分間固定した。次いで
これを燐酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７，６）で１５分間に３
回洗浄した。次いで着色剤が飽和するまで膜を金着色剤
中で保温した（約２時間）。
Ｃ０結果
アミド黒の場合、普通の蛋白質の染色模様が得られた。
１／１００に希釈した試料においては、アルブミンのバ
ンドの弱い着色だけが検出できた。
ンドの弱い着色だけが検出できた。
含着色剤の場合、蛋白質バンドは紫がかった赤色に着色
した。１／１００に希釈した試料において、すべての主
な蛋白質バンドが依然見えた。
した。１／１００に希釈した試料において、すべての主
な蛋白質バンドが依然見えた。
含着色剤はアミド黒よりも少くとも５０倍以−にの感度
を有するように見える。
を有するように見える。
実施例７
コロイド状水酸化鉄着色剤での染色を用いるナイロンに
基づく膜に固定された核酸の検出法Ｍ酸（Ｄ Ｎ Ａ
又１．ｔ ＲＮ Ａ ）Ｉｔ、濾紙−１１に直接適用（
点プロット）し、或いはサザン（Ｓ ｏｕｔｈｅｒｎ）
法［サザン・Ｅ（Ｓｏｕｔｌ＋ｅｒｎ Ｅ、 ）、メ
ソツズ・イン・エンサイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、東影（１９７９）、
１５８頁」又はノーイン（Ｎｏｒｔ、ｈｅｒｎ）法［ト
ーマス拳ビーーｘス（ＴｈｏｍａｓＰ、Ｓ、）、ブロク
・ナツル・アカド・サイ、ニーニスエイ（ＵＳＡ）７７
． （１９８０）５２０頁１を用いて寒天ゲル中での分
離後に移すことができた。
基づく膜に固定された核酸の検出法Ｍ酸（Ｄ Ｎ Ａ
又１．ｔ ＲＮ Ａ ）Ｉｔ、濾紙−１１に直接適用（
点プロット）し、或いはサザン（Ｓ ｏｕｔｈｅｒｎ）
法［サザン・Ｅ（Ｓｏｕｔｌ＋ｅｒｎ Ｅ、 ）、メ
ソツズ・イン・エンサイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、東影（１９７９）、
１５８頁」又はノーイン（Ｎｏｒｔ、ｈｅｒｎ）法［ト
ーマス拳ビーーｘス（ＴｈｏｍａｓＰ、Ｓ、）、ブロク
・ナツル・アカド・サイ、ニーニスエイ（ＵＳＡ）７７
． （１９８０）５２０頁１を用いて寒天ゲル中での分
離後に移すことができた。
続いて、核酸を８０°Ｃで１時間加熱することによって
膜に固定した。ＤＮＡに対して「点プロット」法を用い
る場合、濾紙を変性溶液（０，５Ｍ Ｎａ０１Ｔ、
１．５Ｍ ＮａＣ１）で処理し及び３Ｍ ＮａＡｃ
溶液で中和（’ｐｔＴ５，８）Ｌ、次いで加熱工程に供
した。
膜に固定した。ＤＮＡに対して「点プロット」法を用い
る場合、濾紙を変性溶液（０，５Ｍ Ｎａ０１Ｔ、
１．５Ｍ ＮａＣ１）で処理し及び３Ｍ ＮａＡｃ
溶液で中和（’ｐｔＴ５，８）Ｌ、次いで加熱工程に供
した。
ゲルから移す（サザン又はノーイン法）場合、核酸の変
性をゲル中で常法により行ない、次いで移した。加熱工
程後、膜を０．２％ツウイーン２０で簡単に洗浄（２回
；５分）し、続いてコロイド状水酸化鉄の懸濁液中で穏
やかに保温（１時間）した。
性をゲル中で常法により行ない、次いで移した。加熱工
程後、膜を０．２％ツウイーン２０で簡単に洗浄（２回
；５分）し、続いてコロイド状水酸化鉄の懸濁液中で穏
やかに保温（１時間）した。
この懸濁液は、蛋白質の着色に記述されている通りに正
確に調製した。核酸は膜へ適用する方法に依存して黄褐
色の点またはバンドとして検出された。続いて濾紙を水
で激しく洗浄（３回、５分）し、乾燥した。蛋白質の染
色に対して記述したように、Ｋ ４ Ｆ ｅ（ＣＮ ）
＋＋どの反応を用いることも可能であった。この場合、
黄褐色は明青色に変わり、高感度となった。
確に調製した。核酸は膜へ適用する方法に依存して黄褐
色の点またはバンドとして検出された。続いて濾紙を水
で激しく洗浄（３回、５分）し、乾燥した。蛋白質の染
色に対して記述したように、Ｋ ４ Ｆ ｅ（ＣＮ ）
＋＋どの反応を用いることも可能であった。この場合、
黄褐色は明青色に変わり、高感度となった。
交雑に先立つ核酸の染色は続く交雑の結果を妨害しない
ことが示された。
ことが示された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、通用される着色剤がコロイド状金属粒子の懸濁液で
あり、また蛋白質及び核酸を、コロイド状金属粒子の、
蛋白質及び核酸への結合位に局在化した着色シグナルと
して目に見えるようにし、或いは公知の分光学的方法に
従い、この結合位においてそれを定量的に決定する、固
体担体中又は上における蛋白質及び核酸の染色法。 ２、コロイド状金属粒子が金、銀又は白金、或いは金、
銀、白金、鉄又は銅化合物からなる特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ３、コロイド状金属粒子が金又は銀金属或いは水酸化鉄
からなり且つその粒径が１〜１００ｍｍである特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ４、コロイド状金属粒子の最終的な検出を、銀又は金含
有化合物である物理的現像剤の適用後に行なう特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ５、着色剤が水酸化鉄のコロイド状懸濁液であり、また
着色剤の最終的検知を、水酸化鉄の酸での加水分解及び
このように生成した第２鉄塩のフエロシアニド塩錯体で
の処置の後に行なう特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、着色剤がコロイド状金属粒子のゾルであり、また蛋
白質及び核酸を、コロイド状金属又は金属化合物粒子の
、蛋白質及び核酸への結合位に局在化した着色シグナル
として目に見えるようにし、或いは公知の分光学的方法
に従い、この結合位において定量的に決定する、固定化
マトリック上に固定された蛋白質及び核酸を着色する方
法。 ７、ｉ）検知すべき蛋白質及び核酸を固定化マトリック
ス上に固定化し、 ｉｉ）随時この固定化マトリックスを洗浄し；ｉｉｉ）
固定化マトリックスを、適当な濃度及びｐＨに調節した
且つコロイド状金属粒子の蛋白質及び核酸への特異的結
合を促進する少くとも１つの物質を補充した適当な媒体
中において、金属粒子のゾルを含んでなる着色剤懸濁液
と接触させ；ｉｖ）随時この固定化マトリックスを洗浄
し、そして ｖ）着色したシグナルを、固定化マトリックスの表面に
おける反応位において検出する、 工程を含んでなる特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、随時電気泳動分離工程を適用し、続いて分離された
蛋白質及び核酸を電気泳動媒体から固定化マトリックス
へ移動させ或いはブロッテイング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）
させることによる直接的吸着及び／又は共有結合によっ
て固定化工程を行なう特許請求の範囲第７項記載の方法
。 ９、固定化マトリックスを、特にコロイド状金属又は金
属化合物粒子の蛋白質及び核酸への特異的な結合及び蛋
白質と核酸が固定化されてない固定化マトリックスの部
分におけるそのような結合の不存在として定義される着
色を促進する少くとも１種の物質が随時補充された緩衝
溶液又は水と接触させることによって、固定化マトリッ
クスの洗浄を行なう特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０、特異的着色を促進する物質が洗剤である特許請求
の範囲第９項記載の方法。 １１、該洗剤がツウイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、ツウイ
ーン８０、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ−１００、及
びミリスチルトリメチルアンモニウムブロマインドから
選択される特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、着色剤がコロイド状金属粒子のゾルであり、また
蛋白質及び核酸を、コロイド状金属又は金属化合物粒子
の、蛋白質及び核酸への結合位に局在化した着色シグナ
ルとして目に見えるようにし、或いは公知の分光学的方
法に従い、この結合位において定量的に決定する、蛋白
質及び核酸をゲル支持体中で着色する方法。 １３、ｉ）随時蛋白質又は核酸を技術的に公知の固定溶
液で固定した後、ゲル支持体を、適当な濃度及びｐＨに
調節した且つコロイド状金属粒子の蛋白質及び核酸への
特異的結合を促進する少くとも１種の物質を補充した適
当な媒体中のコロイド状金属粒子を含有する着色剤懸濁
液、好ましくはゾルと接着させ； ｉｉ）随時このゲル支持体を洗浄し；そしてｉｉｉ）着
色したシグナルをゲル支持体中の反応部分で検出する、 工程を含んでなる特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、ゲル支持体を、特にコロイド状金属粒子の蛋白質
及び核酸への特異的な結合及び蛋白質と核酸が存在して
ないゲル支持体の部分におけるそのような結合の不存在
として定義される着色を促進する少くとも１種の物質が
随時補充された緩衝溶液又は水と接触させることによっ
て、ゲル支持体の洗浄を行なう特許請求の範囲第１３項
記載の方法。 １５、特異的着色を促進する物質が洗剤である特許請求
の範囲第１４項記載の方法。 １６、該洗剤がツウイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、ツウイ
ーン８０、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ−１００、及
びミリスチルトリメチルアンモニウムブロマインドから
選択される特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １７、適用される着色剤が金ゾルであり、また蛋白質を
、金粒子の蛋白質への結合位に局在化した着色シグナル
として目に見えるようにし、或いは公知の分光学的方法
に従い、この結合位においてそれを定量的に決定する。 固定支持体中又は上における蛋白質の染色法。 １８、金属粒子のゾルを、適当な濃度及びｐＨに調節し
た及びコロイド状金属又は金属化合物粒子の蛋白質及び
核酸への特異的結合を促進する少くとも１種の物質を補
充した適当な媒質中に含む着色剤懸濁液を含んでなる、
特許請求の範囲第１項記載の方法に使用するためのキッ
ト。 １９、（ｉ）適当な濃度及び適当なｐＨに調節した及び
コロイド金属粒子の蛋白質又は核酸への特異的結合を促
進する少くとも１種の物質を補充した適当な媒体中に金
属粒子のゾルを含む着色剤懸濁液；及び （ｉｉ）コロイド状金属又は金属化合物に起源するシグ
ナルを改良し及び／又は高める試剤、を含んでなる特許
請求の範囲第１８項記載のキット。 ２０、着色剤懸濁液が金ゾルであり、またシグナルを改
良し及び／又は高める試剤が銀化合物を物理的現像剤と
して含有する特許請求の範囲第１９項記載のキット。 ２１、着色剤懸濁液が水酸化鉄のゾルを金属化合物とし
て含有し、また金属化合物に起源するシグナルを高める
試剤がフエロシアニド塩錯体を含む特許請求の範囲第２
０項記載のキット。
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