JPS6325553A - 金ゾル試薬の調整方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫分析の分野に関し、そして更に特に尿又は
他の体液中の、小分子例えば１つのエピトープ部位を含
むものを含む分子を検出するためにコロイド状金及び膜
を用いる新規な免疫分析を提供する。

多くの人間の健康状態は免疫学に基づく免疫分析を用い
て確かめることができる。そのような分析は、モノクロ
ーナル又はポリクローナルに基づく免疫グロブリンと以
下まとめて且つ相互に取りかえて配位体及び配位体を結
合するパートナ−又は生物学的に活性な分子として一般
に言及しうるハプテン、抗原又は他の被検体であってよ
い免疫グロブリンのそれぞれの結合パートナ−との間の
反応特異性に依存する。免疫分析は配位体又はその結合
パートナ−の流体試料中における存在又は不存在を決定
する際に配位体及び配位体を結合するパートナ−間の特
異的結合能力を利用する方法である。多くのそのような
方法は公知であり、サンドウィッチ式分析、競争結合分
析などを含む６本発明はそのような分析の基本的な概念
を利用するが、ここにそのような通常知られた方法を詳
細にまとめることは必ずしも必要ないと思われる。

ホリスバーガー（Ｉｌｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ）及びロサ
ート（Ｒ。

５ｓｅｒｔ）、Ｊ、ヒストケム・サイトケム（Ｊ、ＩＩ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ　・Ｃｙｔｏｃｈｅｍ）、２５，２９
５〜３０５　（１９７７）は、コロイド状金を標識とし
て用いるマンナンに対する凝集反応分析を記述している
。そのようなコロイド状金の凝集反応分析は最近商業化
されているけれど、それはその速度、色による目的の終
点を決定することの困難さなどと関連した欠点を有する
。

本発明の目的はホリスバーガーの凝集反応分析と関連し
た欠点を避けつつコロイド状金を標識として用いること
である。

米国特許第４，３１３，７３４号において、リューベリ
ング（Ｌｅｕｖｅｒ　ｉｎｇ）は、コロイド成金属物買
の使用を含む新規な免疫分析法を記述している。これら
の方法は新しい標識。即ちコロイド状金属の使用を記述
しているけれど、すべてが免疫学的反応部位から化学的
に溶出した後にコロイド状金属の存在を同定するために
分光法又は原吸光分光法を用いるものであった。結果と
して、リューベリングの分析は比較的敏怒でない結果を
引出すために厄介な方法であり、高価な装置に依存した
。それ故にリューベリングの記述する溶出法が、高価な
装置に依存しないで行ないうる迅速で感度の高い経済的
方法を要求している商業市場にその用途が見出せなかっ
たことは驚くべきことではない。

本発明の１つの観点は、リューベリングの記述するよう
なコロイド状金の標識を用いるが、リューベリング法の
すべての欠点を克胴する全体に新規な方法において標識
を利用することである。

ジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）によるヨーロッパ特許願
第０．１５８，７４６号は表面ｌ＼の拡散に依存するプ
ロット・オーバーレイ（ｂｌｏｔ　ｏｖｅｒｌａｙ）分
析法を記述している。この記述された方法は、リューベ
リングよりも劇的な改良を提供するけれど、依然最小の
許容しうる感度を得るために過度な時間が必要である。

ジャンセンも、新しい１１標識法により分析結果の感度
又は可視化を改善する新しい技術を記述している。

本発明の目的は、感度及び分析速度の双方において、ジ
ャンセンの方法より更なる改善を提供することである。

米国特許第３．８８８，６２９号において、バグシェイ
ウ（Ｉｌａｇｓｈａ脣ｅ　）は、膜を通して液体を吸引
するための吸収材と接触する反応表面を含むカートリッ
ジを用い且つラジオアイソトープを利用する免疫分析法
を記述している。バグシエイウの工夫は高感度を特許請
求しているけれど、それは同位体標識に依存する限りに
おいて望ましさの低い解決策である。そのような標識は
反応表面におけるその存在を決定するために高価な検出
装置を必要とする。更に、また公知のように、ラジオア
イソトープはそのような方法を−ｉに望ましくなくする
実質的に健康上及び処置上の困難を生じる。

本発明の他の目的は、アイソトープ法に一般に伴う不利
益を避けながら、バグシェイウのメカニカルな面を改良
する点ある。

ドイッチｘ　（Ｄｅｕｔｓｃｈ　）らの米国特許第４，
２３５．６０１号及び第４，３６１，５３７号は、試料
の特別な特性を決定するための、例えば流体試料中の物
質を決定するための試験具を記述している。

ドイッチュらの装置は流体試料を受は又は種々の試剤成
分を含むための複数の領域を有するストリップ（Ｓｔｒ
ｉρ）要素を用いる。この場合ストリップ要素の１端を
展開する流体中に浸す。流体はキャピラリー通路を通っ
て上方へ流れ、試料と接触し、そして試料を、種々の試
剤を含有する他の領域を通して連続的に上方へ移動させ
る。１つのそのような領域は例えば標識された試剤を含
有しく例えば第１図の領域】４）、また他の領域（例え
ば第１図の領域１５）は第１の領域１３に適用された試
料が、標識及び同定化された抗体が特異的である要素を
含むならば、その領域において標識を保留する固定化さ
れた要素例えば抗体を含有する。

従ってすべての免疫的に反応する成分がストリップ要素
上に貯留される。唯一の液体試剤は展開流体であり、ナ
トリウムバルビトール、塩酸、メヂロサール及びエチレ
ンジアミン四酢酸ジナトリウムの水溶液を含んでなると
記述されている。

本発明の他の観点は、ドイッチュらと同様の手法を利用
するが、ドイッチュらの教示する如き複雑な展開溶液を
用いる必要性を排除し、一方でそれより優れた標識系を
利用する。

ヨーロッパ特許項第１６４，１９４号はストリップ要素
を用いる同様の系を記述しているが、この発明の新規性
の点はストリップ要素を切って、前進する流体前部を均
一な水準にするためにレーザーを用いることに関係して
いるようである９本発明の更に他の観点は、ストリップ
の′＃造法に対して実質的に鈍感であり且つ従ってヨー
ロッパ特許項第１６４．１９４号に教示される方法を必
要としない新規な免疫分析法を提供することである。

ヨーロッパ特許第１４３，５７４号は、Ｒ１３Ｃを吸水
性要素上の空気／液体界面に凝集させるために結合剤を
用いるストリップ要素免疫分析系を教示している。この
分析は通常のＥＬＩＳＡ技術に依存し、そして個々の標
識が所望の感度を生成するのに十分でなく、従って複数
の検出しうる分子を生成することのできる酵素の標識ご
必要とするということを記述している。

本発明の更なる他の観点は、同様のストリップ要素を利
用するが、酵素の標識を必要としない且つ更に可視的に
読むことができる免疫分析を提供することである。

本発明の他の観点は、装置に依存しないで完全に視覚的
に読むことができるが、より高感度を所望する場合又は
他の定量法においては装置を共用してもよい分析法を提
供することである。

本発明の更なる観点は、経済的に行なえ、迅速に実施で
き、且つスタット（ｓｔａｔ）及びバッチ方式の双方に
おいてすべての医学的環境で満足に行なうための必要な
感度を誘導しうる分析法を提供することである。

本発明の観点及び目的によれば、流体試料例えば尿、脳
髄液、唾液、全血、血液成分又は他の水性排泄物或いは
可溶化された排泄物中における抗体又は配位体例えば誤
用した薬剤の存在を決定するための新規な免疫分析法が
提供される。分析は曲りくねった通路の開いている且つ
競争的又はサンドウィッチ式分析を行なうかどうかに依
存して配位体或いは配位体を結合するパートナ−のいず
れかを結合して有するマトリックス表面を用いて行なわ
れる。マトリックス表面又は膜は好ましくは本質的に吸
湿性であり、これによって流体の通流する通路を提供し
、流体を１つ又はそれ以上の場所の膜内に固定化された
配位体又は配位体を結合するパートナ−と接触させる。

最も好ましくは、配位体を含有する試料とコロイド状金
で標識された生物学的に活性な分子を予備混合し、次い
で吸水性のストリップの１端と接触させる。次いでこの
混合物はキャピラリーの作用によってマトリックス中へ
吸い上げられ、固定化された結合するパートナ−を有す
る区域にコロイド状金を局在化させ、一方この過程で結
合してないコロイド状金を洗い運ぶ。免疫グロブリン試
験の場合には試料及びコロイド状金で標識された試剤を
連続的に添加し、中間に洗浄工程を置くことが最も好適
である。

驚くことに、マトリックス中に残るコロイド状金は非常
に強い、可視的に検出しうる着色したスポットをもたら
す。

本発明の結果として、通常の分析におけるよりも少ない
液体試剤で用が足りる。例えばＥＬＩＳＡ法で必要とさ
れる４種又はそれ以上の試剤に対して、１種の試剤を随
意の洗浄流体と共に使用する。結果を読むために装置は
必要でない。しかし、コロイド状金の存在を、その光を
散乱し又は吸収する能力に基づいて測定するために随時
装置を用いてもよい。そしてすべての操作工程と１つの
保温工程を含む全方法は、容易に大きい感度を達成しつ
つも、一般に３分間又はそれ以上で行なうことができる
。ＬＨの場合、試料２〜３滴と約５分間の全試験実行時
間とで２０ｍＩＵ／尿ｍ！又はそれ以上の感度が日常的
に達成される。但しこの測定時間は保温と取扱い時間を
含めてのものである。提供される他の利点は、抗原及び
ハブテンに対する分析に場合に必須の洗浄工程がないか
ら保温と関連した誤差のないことである。更に試験の完
結は安定な終点をもたらす。

本発明者は、驚くことにストリップマトリックス又は膜
表面とコロイド状金を標識として用いる免疫分析の不明
確な組合せが、可視的に検出しうる結果を与える非常に
迅速で感度のよい分析法に帰結することを発見した。そ
のような分析は今まで可能でなかった。これは、通常の
表面分析が可視的に検出しうる十分なコロイド状金を与
えず、また従来の方法が蛍光標識を検出するためのεＬ
ＩＳ＾技術又は装置を必要としたから、特に真実である
。驚くことに、膜の表面は、予期を越えて可視的に検出
しろる形の十分なコロイド状金を捕捉する多くの「層」
を提供する。この観察は、本明細書に全体が引用される
米国特許願第８７２，３５５号（ＯＲＤ−６３）に記述
されているコロイド状金−膜分析（ＣＯＧＭＡ）におい
て主に認められる。その分析とは違って、本分析はＣＯ
ＧＭＡにおけるようなある断面を通してというよりむし
ろ試験ストリップ中の免疫学的成分の領域にすべての試
料が流れるから試料１ｍ１当りに高い感度が達成できる
。関連する利点として、対比しうる感度を得るためには
それより少ないコロイド状金で８識された成分で十分で
ある。

本分析は、流体を通流せしめ且つ生物学的に活性な分子
、最も好ましくは免疫学的に活性な成分が付着しうる曲
りくねった細孔の膜フィルター床又は表面を用いること
によって最も効果的に行われる。そのような曲りくねっ
た膜の表面を用いることにより、通常の溶液相反応と関
連した反応動力学は、免疫学的な反応の１つが固体相表
面で起こるという事実にも拘らず可能になる。更にその
ような材料は、流れの方向が厳密でないから配向に関し
て柔軟性がある。例えばホワットマン（阿ｈａｔｎａｎ
）　３１　ＥＴクロマトグラフィー紙、活性化されたナ
イロン６６例えばバイオダイン（ＢｉｏｄｙｎｅＴ９）
［ボール社（Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐ、）］　、及び活性化
されたＰＶＤＦ（ポリ弗化ビニリデン）例えばインモビ
ロン（Ｉｍｎ＋ｏｂｉｌｏｎ？Ｍ）［ミリボア（Ｎｉｌ
　Ｉ　１ｐｏｒｅ）　］を含む多くの種類のフィルター
膜を使用しうるが、最も好適な材料は取扱いの容易さの
ためにホワットマンの材料である。

サンドウィッチ式分析法において本発明を利用する例と
してＬＨ［リューチナイジング（Ｉｅｕｔｉｎｉｚｉｎ
ｇ）ホルモンコを用いる場合、ＬＨに特異的な抗体を膜
につける。この膜は好ましくは５Ｘ９０ｍｍのような寸
法を有するストリップであるけれど、本発明は物理的構
造に関しては大きい自由度がある。

抗Ｌｌ＋抗体は、膜ストリップにわたって連続的に或い
は膜ストリップに沿って等間隔の領域に付着させるごと
ができる。

疑いのあるＬＨを含む試料例えば尿を、膜に固定化され
た抗体よりも異なったエピトープ部位に特異的であるコ
ロイド状金で標識されたく直接に或いは中間的な抗体又
は他の結合３通して間接的に標識された）抗ＬＨ抗体を
含んでなる液体試剤と混合する。

次いでこの試料及び試剤の混合物を、理想的には露呈し
た膜の１端に適用し、これをストリップ中を移動させる
。本分析は異常なほど容量の変化を許容するけれど、分
析の感度を改善するために、膜の吸収能力と試剤の量に
よってだけ制限されるものではあるもののその増大した
量が有利に使用できることは特記される。

ＬＨを例に記述を続けると、女性の尿中のＬＨ（−般に
は排卵の開始と関連）は、混合物工程中に標識された抗
体によって捕捉され、次いで膜内においてそれに固定化
された抗Ｌｌ＋抗体に付着するようになる。ポリクロー
ナル又はモノクローナル性のいずれかのそのような抗体
の誘導化は十分公知の技術であり、ここに詳細に記述す
る必要はない。

特異性及び製造の観点から、最も好適な抗体は最初に１
９７５年に記述され且つ多くのところに印刷されている
コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉ　ｌ
　１ｓｔｅｉｎ　）の方法により誘導化されるモノクロ
ーナル抗体である。

結合していないコロイド状金で標識された試剤並びに試
料に流体及び非ＬＨ配位体を含む試料の残りの部分は膜
の残りの部分を通して移動せしめられる。結果として、
試料の適用した端（Ｐｉｇえば試料−試剤混合物中に浸
した端）からある距離でコロイド状金（帯青赤色）を観
察することができる。

固定化された抗体をストリップ中に連続的に適用するな
らば、ストリップのある部分が連続的な色を示すであろ
う。色を示す膜の長さは試料中に存在するＬＨの量に比
例する。同様に異なる領域では色の「階段」を示し、こ
の階段の数又は色の領域がＬＨの濃度に関連づけられる
。そのような領域は、標識された成分の濃縮に機能し、
結果として低濃度の標識された成分の使用を可能にし、
一方でストリップ要素上のその領域とバックグラウンド
領域との間のコントラストを保持し又は増大させさえも
するという点で好適である。関連する利点として、標識
された成分が反応領域を流れる試料によって希釈される
から、洗浄工程を省略することができる。試料中のＬＨ
が多ければ、より長い距離又はより多数の着色領域並び
により強い着色領域の色をもたらす。

通常のバックグラウンド値（例えば１０＋ｎｌＵ／尿１
１に等しい又はそれ以下）より大きい濃度の場合、増大
するＬＨは月経サイクルの中期の数日間（例えば６〜９
日）にわたって監視すべきであるから、好適な市販のキ
ット製品は等しい数く６〜９）の膜＋１つ又はそれ以上
のコロイド状金で標識された試剤を含むビン、そして理
想的には指示書を含有するであろう、キットは不規則な
月経す、イクルの女性のために９回の試験用に拡大して
もよい。

随時、特別な陽性の対照物（コロイド状金で直接に標識
された又はコロイド状金で標識された抗体試剤との混合
物に対するＬＨ）も試験ストリップと共に提供しうる。

他にＬＨの追加的領域又はバード（ｂａｒｄ）を膜スト
リップ上に付与することによって内部対照を与えること
もできる。随時ＬＨ（又は同等な配位体）は標準的な色
の比較領域を与えるために既知の濃度に較正することが
できる。そのような内部比較領域は本発明の更なる新規
な観点である。今や随意の洗浄工程を用いて結合してい
ない物質を除去することができるけれど、工程の簡素化
に基づく最も好適な具体例は、有利には時間を節約し、
臨床的に関連する感度を得るために不必要なそのような
洗浄工程を省略する。

実験によれば、５４０ｎｍと６００ｒ＋ａ＋の光学密度
比で測定される如き、約１．７〈大きい粒子）〜３、Ｏ
（小さい粒子）、好ましくは２〜２．５を含む実質的に
種々の寸法のコロイド状金が使用できる。１．７は試験
した最大粒子の寸法と関連するが、それより大きい粒子
、これは製造しにくいけれど、これが満足に使用できな
いと信する理由はない。好適な寸法又は光学的比の範囲
のコロイド状金粒子は溶液中にある時赤味がかった青色
として視覚的に観察できる。好適なコロイド状金の製造
法及びその免疫グロブリンへの付着は後に記述する。

最良の方法は配位体又は配位体を結合するパートナ−の
コロイド状金での直接標識化を意図するけれど、同等な
間接的標識化も使用でき、ある環境では好適でさえある
ことも意図される。そのようの間接的な標識化は典型的
にはコロイド状金でそれ自体標識され且つ特に第２の免
疫グロブリンと反応する、順次検出すべき配位体に対し
て特異的である第３の免疫グロブリンを利用する。その
ような方式はコロイド状金で標識された抗グロブリンを
用いる抗体試験に対して特に有用である。

再び、間接的な標識法は同業者には容易に理解されるも
のである。

試料−コロイド状金で標識された試剤混合物を含有する
液体との接触後、膜ストリップをある期間例えば５分間
展開させることは最も好適であるけれど、特別な保温条
件は必要でなく、室温が好適である。結果はその後の簡
便ないずれかの時期に直接観察することができる。ここ
に免疫グロブリン試験は、好ましくは試料、中間洗浄液
及びコロイド状金で標識された試剤のストリップ膜への
連続的な添加を含む。

本発明の結果として、分析を行なうのに数少ない液体試
料しか必要でなく（確かに多くの分析は、生物学的に活
性な成分を有する１つの試剤だけが必要である）、そし
て必要な工程数も少ないということが特記される。結果
として、典型的な反応は配位体に対して５分以下又は抗
体に対して１０分以下でしばしば行なうことができ、こ
れでも最良の通常の分析に匹敵する感度値が得られ、し
かもそのような他の分析と異なって、可視的に検出しう
る明確な結果を驚くべき速度で与える。

本発明は他の利点も提供する。試剤も、生物学的に活性
な分子を含有する膜も、分析を行なう場合に室温である
必要がない、これは非常に温度に敏感な通常のＥＬＩＳ
Ａ法とのはっきりした対比である。

更に本発明は工程の時期、ｐＨ１及び溶液の温度と厳密
に関連した特性を含むＥＬＩＳ＾技術と関連した欠点を
回避する。更に本発明はそのような制限を回避する。

多分散も驚くべき本発明の観点は、陽性の反応がともか
く可視的に検出しうるという事実である。

本発明のこの観点は本発明者自身によっても未だ十分に
理解されていないけれど、膜の多層性がコロイド状金の
光散乱性と組合さって、増巾でないとしてもコロイド状
金の存在の可視的効果が蓄積されるためであると思われ
る。

他の非抗体分子もＬＨと同様の具合いに試験することが
できる。例えば１つのエピトープ部位を有する小分子を
競争分析法で検出することができる。

そのような小さい分子は誤用の薬剤、ジゴキシン、テオ
フィリン及び存在が臨床と関係する多くの他の物質を含
む。血液試料中のテオフィリン（ＴＩＩＥＯ）の場合、
試験は次のように行なわれる二特異的な抗−ＴＨε０抗
体を、膜ストリップ上に、ストリップの長さに沿って等
間隔の狭いバンド形で共有的に付着させる。斯くしてテ
オフィリンを免疫学的に結合しうる膜ストリップの１端
を、血液試料及びコロイド状金で標識されたＴ　ＩＩ　
Ｅ　Ｏの予備混合した懸濁液を含む管中に挿入する。試
料からの標識されていないＴＩＩＥＯは紙上の抗体結合
部位に対してコロイド状金で標識されたＴ　ＩＩ　Ｅ　
Ｏと競争する。結果として着色した見える信号の高さは
試料中のテオフィリン濃度に直接比例する。

他に、テオフィリンを膜ストリップ上に、ストリップの
全長さに沿って狭いバンド（交叉状）の形で直接付着し
てもよい。他にこの及び前述の例の両方において、生物
学的に活性な分子はバンド領域よりも膜ストリップの長
さ方向に沿って連続的に付着させてもよい。抗テオフィ
リン抗体を免疫学的に結合しうる膜ストリップの１端を
、標識されていないテオフィリンを含む血液試料及びコ
ロイド状金で標識された抗テオフィリン抗体の予じめ混
合した懸濁液を含む管中に挿入する。この場合にも、見
える信号の高さは試料中のテオフィリンの濃度に直接比
例する。

多くの事例において、病原有機体への露呈を決定するた
めに抗体の存在が使用される。そのような試験は例えば
ルベラ（Ｒｕｂｅｌｌａ）　ＩＩｌＧ、ルベラＩｇＭ、
トキソプラスモシス（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）　
ＩＨＧ及びＩｇＭ、シトメグロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅ
ｇｌｏｖｉｒｕｓ）ＩｇＧ及びＩｇＭ、ＨＴＬＶ　Ｉ［
、抗ＥＩＩＮＡモノヌクレオシス、抗コア（Ｃｏｒｅ）
、１１＾Ａ、ヘルペス、及び抗ストレプトリジン（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｌｕｓｉｎ）　Ｏを含む。一般に抗体試験は
、配位体は抗原それ自体を、患者の試料中の抗体との反
応のために膜上に固定化するという点で、小分子試験と
実質的に同一の具合いに行なわれる。この場合コロイド
状金で標識された試剤は抗−人間のＩｇＧ又は１ｇＭと
して適当に選択しうる。色の高さは試料中に存在する抗
体の量に比例しよう。

本発明は微生物例えば連鎖球菌（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ）、クラミジア（ＣｈｌａＢｄｉａ）、淋菌（Ｇ
ｏｎｏｃｏｃｃｕｓ　）又はウィルス微生物例えば肝炎
などを含む感染性病原菌の存在を検出するためにも使用
しうる。

本発明の最も好適な具体例は、同一の試料を用いて多数
の試験を行なう能力をもつことである。

そのような具体例においては、それぞれ試料の配位体又
は抗体に対して異なる特異性を有する複数の領域を使用
するであろう。肝炎のコア、ＩＩＴＬＶ−■（エイズ）
　、ＣＭＶなどに特異的な血液試料中に存在する抗体の
試験を同時に行なうことが意図される。トーチ（Ｔｏｒ
ｃｈ　）系（トキソプロスモシス、風疹、シトメグロウ
ィルス及びヘルペス）は第１の例である。そのような例
の場合、対照領域は用いるならば好ましくはすべての前
方の領域が適切に働き且つ金の存在下に中和されなかっ
たことを保証するために上部（例えば試料の添加から最
も遠いところ）に配置すべきである。

実施例１−コロイド状金のゾルの製造 市販されているコロイド状金と接触させるすべてのガラ
ス具表面を、１％シルウェット＜Ｓｉｌｗｅｔ）７２０
［ユニオン・カーバイド（Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ
）］を用いて１０分間浸し、次いで蒸留水（０，１４，
）でゆすぐことによってシリコーン化した。１！の濾過
した蒸留水を少くとも１０分間１００’Ｃまで加熱した
。反応器に、ミリＱで濾過したＤＪｌ、中１％塩化金［
アルドリッチ（八Ｉｄｒｉｃｈ）］　１０ｒａｌを添加
し、１分間混合した。この反応器に３４１Ｍのクエン酸
すｌ・リウム１０ｍＮ又は６４ｍＨのマレイン酸ナトリ
ウム又はリンゴ酸１．０ｍｎをｐＨ４で添加して還元剤
として作用させ、２０分間迅速に混合しつづけた０色の
変化は金のゾル生成の成功を示した。熱源を除き、反応
器を１５〜３０℃まで冷却した。

１％ＰＥＧ２０　、ＯＯＯの１ｍｌを添加し、ゾル及び
反応物のｐｕを０　、１　Ｍ　Ｋ２ＣＯ２の添加に上っ
て７．１±０．１に調節した。このコロイド状金の吸光
度を５４０ｎａ＋及び６００ｎｍで測定した。この状態
で金のゾルは抗体への結合に適当であった。このように
調製したコロイド状金は、化学的還元条件に依存して、
００５４０／６００比で決定した時約４０〜約５０ｎｍ
の寸法を有した。

実施例２−コロイド状金と抗体の結合 工程１−吸着的結合 分子量１２，０００〜１４，０００を排除する透析管及
び抗体１ｍｌ当り溶液３００！ｓ１を用いることにより
抗体をｐｉｆ７．１で１８時間０．０！Ｍヘペス＆！衝
溶液中に透析し、次いで０．４５μｍのスウイネックス
（Ｓｗｉｎｅｘ”）フィルターを通して濾過した。

抗体の蛋白質濃度を、抗体の２８０ｎｍの吸光度を測定
することによって決定し、０．０１Ｍヘペス７．１を用
いて３〜４Ｂ／＋１の濃度まで希釈し、標識すべき抗体
によって決定される如き最適な抗体−コロイド吸着結合
を得た。実施例１からの反応器中に存在するゾルを用い
て、ゾルを室温で撹拌しながら、上述のように濾過且つ
希釈した抗体を添加した。撹拌を約３０分間続け、この
時０．０１＋ヘヘス；　０．３ＨＤ−マ＝　）−ル：　
０．０５％ＰＥＧ２０．０００．０．１％ＢＳ＾−ＲＩ
Ａ級０．０５％ナトリウムアジドを含んでなるＭｌ液（
Ｄ）（０，１ｘゾル容量）ａ＋１を添加した。撹拌を室
温で３０分間続けた。次いでこの溶液を高速遠心分離器
に移し、遠心分離にかけ、上澄液を除去した。次いでゾ
ルを上述の緩衝液りを用いて４回洗浄し、出発ゾル濃度
の２まで再懸濁し、０．４５ｐｍの膜を通して濾過し、
ポリプロピレン中に２〜８℃で貯蔵した。

好適な方法２−共有結合 子じめｐＨを６．０に調節した前工程からのゾル中に等
重量のＯＳ八を混合したくゾル１００１当り８Ｓ＾１０
０　ｍｇ）。これを室温で２時間撹拌した。

０．２２ミクロンの膜フィルターを通して濾過し、大き
い粒子を除去した。５４０及び６００ｎｎで吸光度（Ｏ
Ｄ）を測定し、ＯＤ比を計算した。許容しうる物質の０
０ｓ＜ｏ１０Ｄ＝ｏｏは２．５０±０．３０であるべき
であった。このように調節したＢＳ＾ゾルを２００ｍ１
取り、遠心分離（２５，０ＯＯＧ、３０分間）にかけ、
蒸留水で１回洗浄した。この洗浄した粒子を１　ｗ／ｖ
％のグルタルアルデヒドと混合し、２時間撹拌した。遠
心分離（２５，０ＯＯＧ、３０分間）にかけ、蒸留水で
３回洗浄し７た。この活性化し且つ洗浄した粒子を、精
製した適当なモノクローナルＩｇＧ　２ｍｇとｐＨ７，
４の燐酸塩緩衝液中で混合し、２〜８℃で夜通し撹拌し
た。次いで水素化ホウ素ナトリウム２．５ｍｇを添加し
て結合を安定化させた。３０分間撹拌し、ｐＨ８，０の
グリシンＢＳＡ［新液５ｍｌで反応を停止させた。遠心
分離（２５，０ＯＯＧ、３０分間）にかけ、ホスフェー
トで緩衝した食塩水（ｐＨ８，０）で３回洗浄した。

再懸濁させ、染料濃度を、最終ｐ１１８緩衝液（５０悄
８トリエタノールアミン、１００　＋ｎＭ　ＮａＣｌ、
０．２％ＢＳ＾、０．１％ＮａＮ、）で、５４０ｎｍに
おける吸光度１０までに調節した。０．２２マイクロフ
イルターを通して沢過し、２〜８°Ｃで貯蔵した。

実施例３−膜のｖＡ造 ホワットマン３１ＥＴ紙（９０Ｘ１５２ｍｍ）を、０．
２Ｍ１．１’−カルボニルジイミダゾールを含有するピ
リジン溶液［ベーカー（Ｂａｋｅｒ）中に浸し、室温下
に６０分間保温した。次いでこの膜ストリップをテトラ
ヒドロフラン（ベーカー）で洗浄した。

膜をガラス板（ＴＬＣ板）上に置き、取り扱い易くする
ためにテープでとめた。リノマット（Ｌｉｎｏ…ａｔ７
１″）適用機を用いて、マウスノ抗−テオフィリンモノ
クロナール抗体２μｍ／インチを、ストリップの長さ方
向に沿って均一な間隔で水平に適用した。膜を板からは
ずし、室温で３０分間培養した。

０．５Ｗ／Ｖ％カゼインクイブ１．０　、１　Ｗ／Ｖ−
％ツウィーン（Ｔｗｅｅｎ”）及びＰＢＳＳを含んでな
る遮閉剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）溶液を股上に適用し、３
７℃に９０分間保温した。この膜をＰ　Ｂ　Ｓ　Ｓ中０
　、１　Ｗ／Ｖ％ツウィーンを含んでなるｐＨ７，３の
洗浄緩衝液を用いて室温で１５分間洗浄した０次いで膜
ストリップを０．５Ｗ／Ｖ％のポリビニルアルコール溶
液（デュポン社）中に浸し、３０分間培養しな０次いで
膜を３７℃で乾燥し、湿気を排除した容器例えば乾燥剤
入りのアルミニウム又はプラスチック製バック中に使用
するまで２〜３０℃で貯蔵した。抗原をコーティングし
た膜の場合（テオフィリンの例において）は、抗体の代
りにテオフィリン＝ＢＳＡ共役体（ｃｏｎ　ｊｕｇａｔ
ｅ）を適用した。

実施例４−尿中のＬＨに対する感度 コロイド状金で標識された抗−ＬＨ抗体２５０μ！を尿
試料２滴（１００μｍ）に添加し、試験管中で混合した
。実施例３に従って製造した抗ＬＨ抗体が適用されてい
る膜ストリップの１端を試験管中に浸した。ＯｍｌＵ／
ｍｌ〜２００　ｍｌＵ／ｍｆの濃度範囲で調製したＬ　
Ｈ標準を用いて試験し、次の結果を得た； 感度、ｍｌＵ／ｍＩＬＨ 標準　　　　　　０　５　１５　４０　１００　２００
観測された反応　−−−＋　　　＋　　　＋実施例５−
患者の試料 月経周期２８日の２人の女性からの尿試料を用いて実施
例４の方法に従った。試料を５日間にわたって集め、試
験結果をアドバンスト・ケアズ・オブタイム・テスト（
＾ｄｖａｎｃｅｄ　Ｃａｒｅ’ｓ　ＯｖｕＬｉｍｅ　Ｔ
ｅ５ｔ　”）　［オルト・ファーマシューテイカル社（
Ｏｒｔｈｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ
、）］によって確かめ、次の結果を得た： 患者Ａ 周期の日数　　　　　　　９　１０　１１　１２　１３
試験結果（実際の記号）　　−−＋　　　＋　　　−オ
ブタイムの結果　　　　− 患者Ｂ 周期の日数　　　　　　　９　　ｔｏ　　１１　１２　
１３試験結果（実際の記号）　　−−＋　　　＋　　　
−オブタイムの結果　　　　一 実施例６−組込まれた試験対照を用いての排卵試験 ストリップが２つの試剤バンドを有する以外実施例４に
従って膜ストリップを製造した。下の方のバンドを抗−
ＬＨ抗体でコーティングしく試験バンドを形成し）、そ
して上の方のバンドをＬＨ（又は交叉反応性のために同
様に反応するｈＣＧ）でコーティングして対照バンドと
して役立たせた。

コロイド状金で標識された抗ＬＨ抗体を実施例２に従っ
て製造した。操作は次の通りであった：コロイド状金で
標識された抗ＬＨ抗体２０Ｉ１１を尿試料１００μ！と
一緒に試験管に添加し、混合した。

上述の膜ストリップの１端を試＠管内の混合物中に挿入
し、５分間展開させた。観察された結果は次の通りであ
った。実施例１に試験したものと同一の２人の女性の尿
試料Ａ及びＢを試験し、同一の結果を確認した。更にこ
の試験は適切に行われたならばすべての試験に対して工
程の試験対照バンドを示した。

患者Ａ 周期の日数　　　　　　　９　１０　１１　１２　１３
試験バンド　　　　　　　−　−＋＋−対照バンド 参照（オブタイム） 患者Ｂ 周期の日数　　　　　　　９　１０　１１　１２　１３
試験バンド 対照バンド 参照（オブタイム） 試験管中で凍結乾燥したコロイド状金で標識された抗体
を用いて前述の操作を繰返した。試験管に尿３滴（１０
０μｍ）を添加し、混合し、そして膜ストリップの１端
を挿入して５分間展開せしめた。ＷＡ察された結果は同
一であった６臨床試料を用いて試験を繰返しな： 試料数　　陽性の数　　陰性の数 女性からの尿　　２４　　　　６　　　　１８同一の試
料に対してオプタイム（ＯｖｕＬｉｍｅ　”）参照試験
を行い、結果を確がめな。

実施例７−禁止分析 ０．０２Ｍホスフェート緩衝の食塩水溶液（ＰＢＳＳ）
で！’［されたモノクロナールの抗ｈＣＧ溶液（１、２
ｕｇ／ｍ１）中にバイオダイン膜（孔径３゜Ｏｐ）を置
いた。この膜を室温で一定の撹拌下に３０分間培養した
。膜を抗体溶液から取り出し、ＰＢＳＳ−０，１％ツウ
ィーン２０洗浄溶液でヂ過しながら洗浄した。この洗浄
した膜を、ＰＢＳＳ中０．５％の乾燥ミルクの遮閉剤溶
液（ｂｌｏｃｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ）中に入れ、３
７℃で１時間培養した。

この膜はＰＢＳＳ−０，１％ツウィーン洗浄溶液でｒ過
によって洗浄し、３７°Ｃで乾燥し、乾燥剤を含む水分
を排除した容器中において２〜３０℃で貯蔵した。モノ
クロナール抗ｈＣＧ抗体をコロイド状金で標識しな６次
いでこれらの抗体をｈｃＧで飽和させ、標識−抗体一被
検本複合物を生成せしめた。予じめ調製した膜を５０＋
ｌｌｌ１１×６ｍ１１１のストリップに切断した。尿試
料５００ｕ１をマーカー１００１Ｊρと混合した。この
ストリップを試料溶液中に置き（深さ５ｆｆｌ１１１ま
で）、そして流体をストリップの上部まで移動せしめた
。コロイド状染料が試料溶液の表面から移動した距離を
可視的に観察した。

観察された結果は次の通りである： ｔｒｌ：ｆ４１ｆｃＧ　　　　　　Ｏ３Ｘ１０２　３Ｘ
１０３　３×１０’　　　３ｘ１０’　　　３Ｘ１０’
　　　３ＸｌＯフモノクロナ一ル抗ｈＣＧ抗体を標識す
るなめにＦＩＴＣを用いる以外実施例７の方法に従い、
ＦＩＴＣを有するストリップを照射することによって結
果を観察した。次の結果を得た： 試料ＩＣＧ　　　Ｏ３×１０２３ＸＬＯ’　　３×１０
４　３Ｘ１０’　　３ｘ１０’　　３Ｘ１０’（＋ａｌ
Ｕ／社） 移動圧Ｍ　　０　０　　　３　　　１２　　１７　　３
２４５（最」一部）（ＩＩｌｆｌＩ） 実施例９−テオフィリン試験 抗テオフィリン抗体を１１のバンドでコーティングする
以外実質的に実施例３に記述した方法に従い、９０Ｘ５
ｍｍの膜を製造した。コロイド状金−ＢＳＡ−テオフィ
リンを実施例２に従って製造しく例えばＢＳＡにアミド
結合で化学的に結合したテオフィリンをモノクロナール
抗体に対して置換し）、そして次の操作を行った：コロ
イド状金で標識された試剤２０ｕＺを血清試料１３０μ
２と一緒に試験管に入れ、混合した。膜ストリップの１
端を混合物中に挿入し、１０分間展開し、次いで読んだ
、テオフィリンの標準物をＯＩＪｇ／ｍｌ〜４０ｕｇ／
ａ１１の濃度範囲で調製し、標準実験から対照チャート
（標準温度とバンドの高さ）を作った。

次の結果を観察した。

対照チャート 濃度　　０　　２．５　５．０　１０．０　２０．０　
４０．０高さく■陶）　　値（ｕｇ／ｍ１） 対照（１）　　　　　　１３　　　　　５（２）　　　
　　　６　　　　　２．５多数のバンドの存在が、シグ
ナルとバックグラウンドの間の明確なコントラストを与
えるのに役立ち、これによってコントラストを高め且つ
結果の解釈を容易にするということは特記されよう。

試験の結果は時間に依存ゼす、展開後のいずれの時間に
おいても観察できる状態であった。更に対照チャートの
製造が可能なことは、定性的結果（例えば予じめ決めら
れた高さ以上）が不十分な場合にテオフィリンの濃度を
定量化さぜうる。

実施例１〇−組込まれた対照と用いる尿による妊娠の試
験 ストリップが２つの試剤バンドをもつ以外実施例４に従
って膜ストリップを製造した。下の方のバンドを抗ｈＣ
Ｇ抗体でコーティングしく試験バンドを形成する）、そ
して上の方のバンドをｈｃＧでコーティングし、対照／
較正バンドとして役立たせた。コロイド状金で標識され
た抗ｈＣＧ抗体を実施例２に従って製造した。この工程
は次の通りであった： コロイド状金で標識された抗ｈＣＧ抗体４０μ２を尿試
料１００ｕＮと一緒に試験管に添加し、混合した。上述
の膜ストリップの１端を試験管内の混合物中に挿入し、
５分間展開させた。観察された結果は次の通りである二 妊婦からの尿　　　８　　　８　　　０不妊婦からの尿
　　３　　　０　　　３この試験結果はハイブリチク（
［ｙｂｒｉｔｅｃｈ）のタンデム・アイコン（Ｔａｎｄ
ｅｓ＋　Ｉｃｏｎ　ＴＭ）　ｈ　ＣＧ試験と完全に（１
００％）一致した。

実施例１１−組み込まれた対照を用いる全血による妊娠
試験 膜ストリップ（９０ＸＩＣ）ｍ）を実施例１０に従って
製造し、対応して全血試料により試験した。

全血試料１０Ｉ１１を、試験バンドと下端との間の位置
の股上にスポット状につけた。次いで膜ストリップを、
コロイド状金で標識された抗ｈＣＧ抗体６０ｐ２及び緩
衝剤（０，１Ｍ　　ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ、０．０５％ツ
ウィーン２０）１６０ｍｉ’の混合物を含む試験管中に
挿入した。１０分後に結果を次のように観察しな： 妊婦からの全血　　３　　　３　　　０不妊婦からの全
血　２　　　０　　　２この試験結果はハイブリチクの
タンデム・アイコンｈＣＧ試験と完全に（１００％）一
致した。

実施例１２−組込まれた対照を用いる風疹抗体試験 膜が２つの試剤バンドを有する以外実施ＰＡ　６に従っ
て膜ストリップを製造した。下の方のバンドを風疹の抗
ＪＪＫ　［イミュノ・サーチ（Ｉｍｍｕｎｏ　５ｃｒｃ
ｈ）、トムス・リバー（Ｔｏｗｓ　Ｒｉｖｅｒ）、ＮＪ
）でコーティングし、上の方のバンドを対照／較正バン
ドとして役立つ人間のＩｇＧでコーティングした。コロ
イド状金で標識されたマウスの抗−人間の抗体を実施例
２に従って調製した。操作は次の通りであった： 血清試料ｌＯμｌを試験管中において緩衝液Ａ（０，１
Ｍ　　ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ、０．０５％ツウィーン２０
）２５μ！で希釈した。上述の膜ストリップの１端を試
験管の中へ押入し、更に２分間展開させた６最後に、こ
のス１−リップを、コロイド状金で標識されたマウスの
抗−人間の抗体３０ｕＮ及び緩衝液Ａ１００μｉの混合
物を含有する第２の試験管に移した。次いでストリップ
を７分間展開させた。観察した結果は次の通りて゛あっ
た。

この試験結果はＥＬＩＳＡの風疹試験と完全に（１００
％）一致した。

本発明の他の観点は、液体試剤及び膜ストリップ上の生
物学的に活性な分子が活性であるということ、また水性
試料の添加を含めて分散工程が適切に行なわれたという
ことを保証するための特徴を膜ストリップ中に組込める
柔軟性と関係する。

これは免疫グロブリン試験に対して特に有用であり、本
明細書に参考文献として全体が引用されるグラハム（Ｇ
ｒａｈｚａ＋）の米国特許第　　　　　　　号に更に詳
細に記述されている。要約すると、膜ストリップは異な
る起源からのすべて同様の試料においてどこにでもある
試料成分と特に反応しうる固定化された成分を有する反
応領域を含んでなる。

続いて、標識された成分は理想的にはそれが決定すべき
免疫グロブリン又は他の配位体及びどこにでもある試料
成分と反応しうるように選択される。

従って内部標準化された対照は分析の全体の一部として
行なわれることが理解されよう。

上記記述から、可視的に検出しうる結果を得るために物
質を膜中に通流させることによってマトリックス膜中で
行なわれる免疫分析において、コロイド状金で標識され
た試剤の組合せを含んでなる本発明の本質を依然用いつ
つも、免疫学的に活性な成分、膜、及び液体試剤の選択
に関して多くの改変を行ないうろことは同業者の容易に
認めるところである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）曲りくねった通路の通じている孔性の膜ストリ
   ップを準備し、但し該膜が２つの 端を有し且つ更にｉ）抗体又はｉｉ）試料の抗原と同一
   の免疫学的反応性をもつ抗原を 有し； ｂ）ｉ）試料の抗原と同一の免疫学的反応性をもつ抗原
   又はｉｉ）該抗原に特異的な抗体又は工程（ａ）の選択
   に依存する抗原をそれぞれ含んでなる生物学的に活性な
   分子を有す る液体試剤を準備し、但し該生物学的に活 性な分子は直接に又は間接的にコロイド状 の金で標識されており； ｃ）該試料及び該液体試剤を混合して混合物を調製し； ｄ）該膜の１端を該混合物と接触させ；そして次いで ｆ）該膜を色の存在に対して観察し、但し該混合物に接
   触する該端からの色の距離がコロ イド状金及び流体試料中の該抗原の存在に 関係づけうる、 工程を含んでなる該流体試料中に抗原を含む単一のエピ
   トープを検出する方法。 ２、該コロイド状金が５４０と６００ｎｍにおける比と
   して測定して約１．７〜３．０の光学密度比を有する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、該コロイド状金が５４０と６００ｎｍにおける比と
   して測定して約２〜２．５の光学密度比を有する特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ４、該膜が活性化されたナイロン６６、活性化された吸
   水性紙、及び活性化されたポリビニリデンジフルオライ
   ドからなる群から選択される特許請求の範囲第３項記載
   の方法。 ５、ａ）２つの端と曲りくねった端間に通じている通路
   を有し且つ更に抗体に特異的な配 位体を付着して有する孔性の膜ストリップ を準備し； ｂ）該固定化された配位体に結合でき且つ直接に又は間
   接的にコロイド状金で標識されて いる生物学的に活性な分子を有する液体試 剤を更に準備し； ｃ）該試料を該膜ストリップの１端と接触させ；ｄ）該
   膜の１端を該液体試剤と接触させ；そして次いで ｅ）該膜を色の存在に対して観察し、但し該混合物に接
   する該端からの色の距離がコロイ ド状金及び流体試料中の該抗体の存在に関 係づけうる、 工程を含んでなる流体試料中の抗体を検出する方法。 ６、該試料の接触の工程ｃ）後に該膜ストリップの１端
   を洗浄溶液と接触させる工程を更に含んでなる特許請求
   の範囲第５項記載の方法。 ７、該観察工程に先立って該膜を約１０分より少ない時
   間、室温で保温する工程を更に含んでなる特許請求の範
   囲第５項記載の方法。 ８、ａ）曲りくねった通路が通じており且つ試料の抗原
   と同一の免疫学的反応性をもつ抗 原又は抗体を付着して有する孔性の膜スト リップを準備し； ｂ）該試料の抗原と同一の免疫学的反応性をもつ抗原或
   いは該抗原に特異的な抗体又は工 程（ａ）の選択に依存する抗原をそれぞれ有する生物学
   的に活性な分子を有する液体試 剤を更に準備し、但し該生物学的に活性な 分子は直接に又は間接的にコロイド状金で 標識されており； ｃ）該試料及び該液体試剤を混合して混合物を調製し； ｄ）該膜を該混合物と接触させ； そして次いで ｅ）該膜ストリップを色の存在に対して観察し、但し該
   膜ストリップ中の色の長さがコロイ ド状金及び流体試料中のＬＨの存在に関係づける、 工程を含んでなる流体試料中の該ＬＨを検出する方法。 ９、全方法が膜ストリップ中を移動する時間と接触工程
   に必要な時間に等しい時間で行なうことができ、但し後
   者は一般に合計で約３０秒より短い特許請求の範囲第５
   項記載の方法。 １０、全方法が膜ストリップ中を移動する時間と接触工
   程に必要な時間に等しい時間で行なうことができ、但し
   後者は一般に合計で約３０秒より短い特許請求の範囲第
   ８項記載の方法。 １１、該膜ストリップが検出すべき該抗原に対する較正
   を更に含んでなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 １２、該膜ストリップが検出すべき該抗体に対する較正
   を更に含んでなる特許請求の範囲第５項記載の方法。 １３、該膜ストリップが複数の異なる配位体を別々の領
   域中に付着して有し、この結果これに特異的な複数の抗
   体を検出することができる特許請求の範囲第５項記載の
   方法。 １４、検出すべき配位体又は配位体を結合するパートナ
   ーに結合するそれぞれ配位体を結合するパートナー又は
   配位体を、膜を通して連続的に固定化して或いは別々の
   領域に有する膜；及び競争分析では膜上の配位体又は配
   位体を結合するパートナーのいずれかに結合する或いは
   サンドウィッチ式分析では流体試料中の配位体又は配位
   体を結合するパートナーに結合するコロイド状金で標識
   された配位体又は配位体を結合するパートナーを有する
   容器、を含んでなる流体試料中の配位体又は配位体を結
   合するパートナーを検出するための分析に用いるキット
   。