JPH05312809A - 免疫学的簡易測定方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】特別なＢ／Ｆ分離操作を行わなくても、信号と
バックラウンドの差が顕著である免疫学的簡易測定方法
および装置の提供。 【構成】被測定物質と特異的に結合することができる第
１の親和性物質を多孔質担体膜に結合させ、標識物とし
て分画調整された分散染料を用いて標識された第２の親
和性物質と被測定物質を含む液体標本を該多孔質担体膜
を通過させて被測定物質を測定する免疫学的簡易測定方
法および装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は標識物質として分画され
た分散染料を用いて免疫測定を簡便に行うための方法お
よび装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内微量物質の測定は、各種疾患の診
断および治療効果の判定など多くの目的に頻繁に実施さ
れている。最近では医療機関で実施されるだけではな
く、家庭で未熟練者により実施されることも多く、これ
ら診断試薬は使用目的に応じて、高感度で精度の高い測
定方法と、操作が簡単で短時間に結果が得られる簡易測
定法とが使い分けられるようになってきている。特に簡
易測定法については反応装置や測定機器などを用いず簡
単な操作で手軽に実施できることから、半定量もしくは
定性的測定のみによっても十分診断を下すことができる
場合には非常に便利な方法であり、妊娠診断などに広く
利用されている。

【０００３】現在、免疫反応を利用した簡易測定法とし
ては、担体としてラテックスを用いた凝集反応もしくは
凝集阻止反応、標識物質として酵素を用いた酵素免疫測
定法（ＥＩＡ）や標識物質としてコロイド状非金属粒子
や着色ラテックスを用いた免疫学的簡易測定法などが用
いられている。

【０００４】ラテックスを用いた凝集反応もしくは凝集
阻止反応は測定感度はやや低いが、短時間で結果が得ら
れるため、妊娠診断などそれほど高感度を必要としない
診断には広く利用されているが、結果の判定に熟練を要
するために誰でもが確実に実施できるものではない。

【０００５】ＥＩＡは感度は比較的高いがそのような高
感度を得るためには長時間の反応が必要であり、さらに
Ｂ／Ｆ分離（抗原抗体反応において抗原と抗体が結合し
て生じた結合型：Bound, Ｂと、結合していない遊離
型：Free, Ｆとを物理的に分離すること）操作が煩雑で
あるという欠点を有している。

【０００６】また、近年、免疫学的簡易測定法で広く利
用されている方法として多孔質担体を利用した方法があ
る。それらの方法の多くは発色のプロセスを酵素に対す
る基質を利用したＥＩＡとは異なり、着色した物質を直
接抗体に結合させていることが多い。この方法を用いる
ことにより従来の技術に比較し、操作性が簡便となり、
短時間で結果が得られるようになった。

【０００７】このような免疫学的簡易測定法の一例とし
て特開平１−２１４７６０号公報の方法を挙げることが
できる。多孔質担体に第１の抗体を結合し、これに被測
定物質を含む検体を反応させ、その反応によって生じた
免疫複合物に着色ラテックスを結合させた第２の抗体を
反応させて、反応結果を可視的に判定するものである。

【０００８】T.C.J.Gribnau ら著、Affinity Chromatog
raphy and Related Techniques, ４１１〜４２４頁（１
９８２年）は、マイクロタイターウエルを用い、標識物
質として分散染料を用い、抗体としてｈＣＧを用いた被
測定物質の測定方法を開示しているが、マイクロタイタ
ーウエルを用いるため４１７頁のサンドイッチアッセイ
法に洗浄操作を行なう必要があると記載している。

【０００９】また、特公平１−５０３１７４号は、毛細
管現象を利用して、各種の標識物質を用いて検体を水平
方向に流す被測定物質の検出方法を開示し、その中の標
識物質の１つとして分散染料がある。しかし、毛細管現
象を利用した装置であるため測定時間が長い。

【００１０】類似の方法としてクロマトグラフィの原理
を用いた免疫学的簡易測定法がある（特開平３−５０４
１６６号公報、特開平３−１７６６５９号公報参照）。
この方法も多孔質担体をクロマトグラフストリップとし
て用いて、その表面の特定部分にセットした試薬をクロ
マトグラフィの原理により検体とともに移動させながら
反応を実施するものである。

【００１１】しかしながら、これらの免疫学的簡易測定
法を用いる場合に注意を要することは、十分なＢ／Ｆ分
離を行わなければならない点にある。つまり、未反応の
標識抗体が可視的な判定を阻害しないために、判定部上
に残存する未反応の標識抗体をさまざまな方法で除去す
る必要がある。特開平１−２１４７６０号公報に示され
た方法では必要に応じ多孔質担体を水、緩衝液などで洗
浄することが必要であるとしており操作が煩雑になる。
また、クロマトグラフィの原理を用いた免疫学的簡易測
定法では、被測定物質を含む検体を余分に供給すること
により多孔質担体上での反応に引き続いてＢ／Ｆ分離の
ための洗浄を行わせているので、反応終了までにかなり
の時間を要する。この方法は独立した操作としてのＢ／
Ｆ分離を行っていないが、反応の過程にＢ／Ｆ分離操作
が存在するため、上記のような欠点を有するものであ
る。

【００１２】従来これらの免疫学的簡易測定法は、妊娠
診断などの半定量もしくは定性的測定のみによっても十
分に診断を下すことができる場合に広く利用されている
のは前述の通りである。さらに、前述の妊娠診断以外
に、周産期管理の一環として母体血中のヒト胎盤ラクト
ゲン（ｈＰＬ）や母体尿中のエストロゲンを測定するこ
とにより胎児の発育状態を把握する際にも多く利用され
ている。例えば、従来破水の診断は、肉眼的観察やｐＨ
測定法、シダ状結晶証明法などで実施されているが、こ
れらの方法を組合せたとしても前期破水での正診率は６
０〜７０％であり、正診率の高い診断方法が望まれてい
た。そこで、BURTON L.ROSHELSON ら著 Obstetorics &
Gynecology １６３〜１６６頁（１９８７年）は、従来
の診断技術では正診率が低い破水の診断に、膣内容液中
に混入した羊水中のＡＦＰを測定することの有用性を報
告している。この報告における膣内容液中のＡＦＰの測
定は破水の診断方法として利用できるのであるが、十分
なＢ／Ｆ分離を行なわなければならないため、かなりの
時間を必要とし、操作も複数回の洗浄を要するなど、煩
雑であるという欠点を有するものである。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】これら免疫学的簡易測
定法の大きな課題としてはＢ／Ｆ分離をいかに確実に簡
便に行うかということであり、ひいてはＢ／Ｆ分離を特
別な独立した工程として行う必要のない免疫学的簡易測
定法の開発が要望されている。この課題が解決されるこ
とにより免疫学的簡易測定法は、より簡単な操作でより
短時間に結果が得られるものとなることが予想される。

【００１４】

【課題を解決するための手段】特別な工程としてのＢ／
Ｆ分離操作を必要としないためには、第２の親和性物質
と結合させた標識物質が第１の親和性物質を結合してい
る多孔質担体膜との非特異的結合を全く生じず、多孔質
担体膜に結合させた第１の親和性物質と被測定物質との
特異的結合により生じた免疫複合物以外の部分はほとん
ど該担体膜を通過し判定の際に妨げにならないものであ
ることが要求される。つまり、洗浄操作等の特別なＢ／
Ｆ分離操作をしなくても第１の親和性物質を結合した多
孔質担体膜上に未反応の第２の親和性物質を結合させた
標識物質が残らず、肉眼による判定に支障を及ぼさない
ようにすることが要求される。このような測定系を求め
て研究を行った結果、標識物質として分画調整された分
散染料を用いるとこれらの要求を満たすことを見いだし
本発明を完成した。特に、標識物質とこれを結合させる
第２の親和性物質との相対的な量を厳密に規定すること
により、測定系における信号とバックグラウンドの比す
なわち、Ｓ／Ｎ比を非常に大きくすることを見出した。

【００１５】本発明は、被測定物質と特異的に結合する
ことができる第１の親和性物質を多孔質担体膜に結合さ
せ、標識物質として分画調整された分散染料を用いて標
識された第２の親和性物質と被測定物質を含む液体標本
とを該多孔質担体膜を通過させることにより液体標本中
の被測定物質を免疫学的に測定する方法およびその測定
装置である。

【００１６】この測定法における被測定物質とは、本発
明の方法により定性あるいは定量的に検出される物質の
ことを意味し、具体的には、抗原あるいは抗体として機
能する各種蛋白質やペプチド、核酸、エフェクター分
子、レセプター分子、酵素、インヒビター、糖鎖あるい
はこれを有する化合物、レクチン、および他の生体物質
等であり、さらに具体的にはヒト絨毛性性腺刺激ホルモ
ン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、アルファフ
ェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、
ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）、ベータ２ミクログロブ
リン（β２ｍ）、フェリチン、ＨＢｓ抗原、エストロゲ
ン、ＨＢｓ抗体、ＨＩＶ抗体、ＩｇＥ抗体、風疹抗体等
が例示される。以後の説明については例として被測定物
質として抗原を用いた測定方法について記載する。被測
定物質として抗体を用いた場合についても同様な結果が
得られるものである。

【００１７】また、この測定法における検体とは、被測
定物質を含有することが予測される液体標本のことを意
味する。具体的には、一般的に測定に用いられる液体標
本、例えば測定に用いられる検体としては一般的に血
液、尿、唾液等が主なものであり種々被測定物質の測定
結果は、その生理的濃度との比較から正常、異常の判断
がなされている。前述の膣内容液中のＡＦＰを測定する
ことにより破水を診断する場合は、破水により羊水が膣
内に漏出すると羊水の成分であるＡＦＰが膣内容液中に
混在することになり、この混在溶液中に羊水が含まれて
いることを証明する手段として、ＡＦＰを測定する。本
発明に使用する検体とは、これらの液体標本も含まれ
る。

【００１８】本発明の親和性物質とは、本発明の被測定
物質に対して親和性を有する物質のことを意味し、具体
的には、抗原あるいは抗体として機能する各種蛋白質や
ペプチド、核酸、エフェクター分子、レセプター分子、
酵素、インヒビター、糖鎖あるいはこれを有する化合
物、レクチン、および他の生体物質等であり、さらに具
体的にはヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体
形成ホルモン（ＬＨ）、アルファフェトプロテイン（Ａ
ＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト胎盤ラクトゲン
（ｈＰＬ）、ベータ２ミクログロブリン（β２ｍ）、フ
ェリチン、ＨＢｓ抗原、エストロゲン等に対する抗体が
例示される。さらに、第１の親和性物質とは、固相面と
物理的に結合し固定化されるものを意味し、第２の親和
性物質とは、水素結合、疎水結合または共有結合などに
よって標識物質と結合し標識化されるものを意味する。
好ましくは、抗体または抗原として機能する各種蛋白質
またはペプチドが挙げられる。

【００１９】本発明に標識物質として用いられる分散染
料は構造的にアゾ系とアントラキノン系のものが代表例
として挙げられる。通常分子量は比較的小さく、置換ア
ミノ基を有するものが大部分である。分散染料は水に不
溶性であるために分散剤を用いて微粒子に分散させた状
態で保存されている。水に分散した状態では分散染料は
粒子の状態で存在する。通常、繊維を染色するために用
いられるが、抗体や種々の蛋白なども水素結合や疎水結
合などによって分散染料に吸着する性質を持っている。
本発明のＢ／Ｆ分離操作ならびに過程を必要としない免
疫学的簡易測定法に用いる分散染料としては、一般的に
溶液とした際の透過百分率の低いものを利用するのが高
い測定感度を得るためには有利であると考えられる。こ
こで、Ｂ／Ｆ分離操作ならびに過程とは、第１の親和性
物質と特異的に結合（Ｂｏｕｎｄ）した状態の被測定物
質を、第１の親和性物質と結合せず遊離（Ｆｒｅｅ）し
た状態の被測定物質を分離するための操作および過程の
ことを意味し、標識物質を用いた免疫学的測定法には、
判定感度を上げるために必要になるもので、具体的に
は、検体を流した後に、水、緩衝液等免疫学的結合に不
活性な溶液を用いて洗浄することおよびその洗浄によっ
て、Ｂ／Ｆ分離が行われる過程を含む。

【００２０】分散染料の具体例としては例えば、可視的
な色調をレッド系にする場合には日本化薬社製の商品名
カヤロンポリ・ライトレッド(Kayalon Poly. Light Re
d) 、カヤロンポリ・レッドバイオレット(Kayalon Pol
y. Red Violet)、サンド(SANDOZ ）社製の商品名フォロ
ン・ブリリアント・バイオレット( Foron Brilliant Vi
olet) などがまた、ブルーの色調を得る場合にはサンド
社製の商品名フォロン・ブリリアント・ブルー(Foron B
rilliant Blue)、バイエル(Bayer) 社製の商品名レゾリ
ン・ブルー(Resolin Blue)、日本化薬社製の商品名カヤ
ロン・ポリ・ブリリアントブルー(Kayalon Poly. Bril
l. Blue) 、三井東圧社製の商品名ミケトン・ファース
ト・ターコイズ・ブルー(Miketon Fast Turquoise Blu
e) など、またその他の色としてサンド社製の商品名フ
ォロン・ブリリアント・イエロー(ForonBrilliant Yell
ow)（黄色）、フォロン・イエロー・ブラウン(Foron Ye
llow Brown)（茶色）などを用いることができる。

【００２１】分散染料は、分散染料粒子の多孔質担体膜
の通過をより容易にし、非特異的結合を防止するために
分画を行う。例えば後述するように多孔質担体膜として
一般的に使用される１〜１０ミクロンの孔径を有するニ
トロセルロースメンブラン、セルロースアセテートメン
ブランなどを使用した場合、１０００×ｇ、１０分間の
遠心分離で沈殿せず、２５０００×ｇ、１０分間の遠心
分離で沈殿する分画（以下１０００〜２５０００×ｇの
範囲の分画という、なお、分画の範囲の記載は、ここで
定義するものを加速度を変える以外は同様の条件で行な
った）、より好ましくは２５００〜２５０００×ｇの範
囲の分画の分散染料を用いることが適当である。

【００２２】被測定物質に対する第２の親和性物質に前
記分散染料を結合する方法としては物理的に吸着させる
手法が利用できる。この方法では親和性物質の溶液と分
散染料の懸濁液を混合し、必要に応じ熱をかけることに
より簡単に調製することができる。

【００２３】分散染料と第２の親和性物質を結合させる
際の、分散染料と第２の親和性物質との好適な使用量の
割合は、それぞれの種類によっても変化するが、分散染
料に対する第２の親和性物質の重量比を３以下とするの
が好ましく、例えば最終濃度１．０ｍｇ／ｍｌの分散染
料溶液の場合は、第２の親和性物質を、最終濃度で０．
１ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌとするのがさらに好まし
く、特に２．０ｍｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。
第２の親和性物質の最終濃度が３．０ｍｇ／ｍｌ超であ
ると、Ｂ／Ｆ分離操作を行わないと肉眼で測定結果を判
定するのに有効な程度の結合標識とバックグラウンドの
差が生じない。

【００２４】第２の親和性物質を結合させることにより
分散染料が凝集することもあるが、通常の場合自己凝集
防止剤として糖、アルブミン、動物血清等を添加するこ
とにより自己凝集を防ぐことが可能である。

【００２５】本発明に使用される多孔質担体膜は、例え
ばろ紙、ニトロセルロースメンブラン、セルロースアセ
テートメンブランなどが挙げられる。必要なことはこれ
らの多孔質担体膜が表面から裏面に連通する孔を有して
いることであり、分散染料で標識された抗体がその連通
する孔を通過するための十分な孔径を有していることで
ある。通常の場合その孔径は１〜１０ミクロンであれば
十分であり特に３〜１０ミクロンが好ましい。

【００２６】多孔質担体膜への第１の親和性物質の結合
は従来の方法により行うことができる。例えばニトロセ
ルロースへの結合は第１の親和性物質溶液を必要量塗布
し３７℃で乾燥後アルブミンなどで未結合部分をブロッ
クすることにより実施できる。

【００２７】さらに、多孔質担体膜上に結合させる第１
の親和性物質の濃度としては、多孔質担体膜１ｃｍ² 当
たり０．００５〜０．１ｍｇが好ましい。第１の親和性
物質の濃度が、０．１ｍｇ超であると、測定物質を含ま
ない検体においても発色が認められる場合があり、０．
００５ｍｇ未満であると、十分な測定感度が得られない
ことがある。

【００２８】また、多孔質担体膜上に結合させる第１の
親和性物質の平面上の形状は、十字、星型、ドーナツ
型、平行な２本線等、識別判断に容易な形状とすること
が好ましい。

【００２９】本発明を実施するに当たっては、被測定物
質を含む検体と分散染料を標識した第２の親和性物質を
混合した溶液を第１の親和性物質を結合した多孔質担体
膜上に滴下あるいは注ぎ込むことにより反応を行うこと
が可能である。また、分散染料を標識した第２の親和性
物質をろ紙や多孔性ポリエチレン樹脂に含ませて第１の
親和性物質を結合した多孔質担体膜上部に設置し、被測
定物質を含む検体を第１および第２の親和性物質に対し
て垂直方向に流し、前記分散染料を溶化混合させながら
多孔質担体膜上に添加する方法が望ましい。この方法を
用いれば反応操作が１ステップとなり、より簡便な免疫
測定法となる。多孔質担体膜の下部には適当な吸収物質
を設置し、溶液の通過速度を制御することも可能であ
る。通常の場合、吸収材としてろ紙、不織布などを使用
すると溶液が多孔質担体膜を通過するのに要する時間は
１分以内である。多孔質担体膜上に検体溶液を添加する
以外の操作例えば特別のＢ／Ｆ分離操作ならびに過程を
必要としないため、１分以内に反応結果の肉眼での判定
が可能となり、従来の免疫学的簡易測定法に比較すると
検査に要する時間は著しく短縮される。

【００３０】また、本発明はクロマトグラフィの原理を
用いた免疫学的簡易測定法にも応用することができる。
公知の方法では多孔質担体膜上での反応が行われるのに
引き続いて反応に用いられた検体でその表面を洗浄する
過程によりＢ／Ｆ分離を行っているが本発明を応用した
場合でも、被測定物質を含む検体と分散染料を標識した
第２の親和性物質を混合した溶液とを第１の親和性物質
を結合した多孔質担体膜上をクロマトグラフィの原理を
用いて平行に移動させることにより反応を行うことがで
きる。

【００３１】本発明の測定法は、特に抗原抗体免疫複合
体を利用したサンドイッチ法により、検体中の被測定物
質を測定する場合に有効である。この測定法を用いて検
体を垂直方向に流れるように測定系を構成すると、測定
時間を短くすることができる。また、この測定法を用い
て検体を平行に移動させるような測定系を構成しても有
効である。

【００３２】さらに本発明は、該測定法を円滑に行うた
めの測定装置を提供するものである。好適な例として
は、図１に示す測定装置が挙げられるが、これによって
本発明が限定されるものではない。

【００３３】図１に示す測定器１は、上部測定系２と、
下部測定系３が、好ましくは継部１３で上下に結合した
構成を有し、必要により上部測定系２と下部測定系３を
離すことができる。

【００３４】上部測定系２は、第１の濾材６と分散染料
を標識した第２の親和性物質を含浸させた分散染料含浸
層７を、垂直方向にこの順序で保持するために、上部外
枠５とその上部に嵌合された口部４を備える。

【００３５】口部４は、中央に検体を流入させるための
開口部１４をもつ。上部外枠５は、中央に貫通孔を有
し、垂直方向に２段の段差を持つ構造となっていて、こ
の段差の部分で、分散染料含浸層７と第１の濾材６とを
それぞれ保持する。

【００３６】下部測定系３は、中空の下部外枠１２中
に、吸収材１１を充填した構造となっていて、吸収材１
１の上に第２の濾材１０とその上にさらに多孔質担体膜
９を設置する。第１の親和性物質を結合させた多孔質担
体膜９は、中空の固定具８により周縁部を固定されて、
スペース１５を介して分散染料含浸層７の底部と連通す
る。または、下部外枠１２と固定具８が一体化して形成
されていてもよい。さらに、下部外枠１２は空気を排出
するための孔を具備している。

【００３７】測定器１は、円筒形であっても四角形であ
ってもよく、大きさは特に限定はされないが、少量の検
体を測定するこの発明の特性上、円筒形の場合、円筒の
直径が２〜８ｃｍ程度、高さが０．５〜８ｃｍ程度のも
のが好ましい。

【００３８】測定器１を構成するそれぞれの部材は、上
述のように、測定器１の形状に応じて円形であっても四
角形であってもよい。

【００３９】第１の濾材６は、分散染料含浸層７を上部
外枠５内に固定すると同時に、検体中の浮遊物を濾去す
るためのもので、セルロースろ紙あるいはガラス繊維ろ
紙が好ましい。

【００４０】分散染料含浸層７は、多孔性のビーズ状、
円柱状または膜状のものであることが好ましく、抗体−
抗原反応に不活性なものである必要がある。好ましく
は、多孔性ポリエチレン樹脂である。吸収材１１として
は、ろ紙、不織布などを使用することができる。

【００４１】第２の濾材１０は、被測定物質を介して第
１の親和性物質と結合しなかった遊離の分散染料を標識
した第２の親和性物質を吸収材１１に排出し、もどりを
抑えるためのもので、ろ紙が好ましい。また、第２の濾
材は、反応時間を規定するために反応液の流速を制御し
うる材質を選定することが好ましい。

【００４２】継部１３は、多孔質担体膜上に現われた判
定結果を見やすいように開くための器具であって、図１
のごとくピン状のスライドするための支点となってもよ
く、図３のごとく上部測定系２と下部測定系３を開く形
であってもよい。さらにまた、上部外枠５と下部外枠１
２が、かみ合うような形の溝を持ち、判定時に、上部測
定系２と下部測定系３を取り外す形態であってもよい。
また、ここでは図示していないが、下部外枠１２の側面
を貫く空間を設け多孔質担体膜９を下部外枠１２の側面
から測定後引き抜く形態をとってもよい。

【００４３】また、多孔質担体膜９に対して、第１の濾
材６および分散染料含浸層７を平行に移動するか、ある
いは分散染料含浸層７に対して多孔質担体膜９を平行に
移動することで、判定部１６を直接目視することが可能
である。

【００４４】スペース１５は、分散染料含浸層７を通過
した検体が多孔質担体膜９上の判定部１６に効率よく供
給され、しかも多孔質担体膜９から分散染料含浸層７へ
のもどりを防ぐためのもので、分散染料含浸層７と多孔
質担体膜９の間隔が、２ｍｍ程度であるのが好ましい。

【００４５】ここで、本発明の測定法を行なうための具
体的な装置の１例として親和性物質が抗体である場合に
ついて図１、図２および図３によって使用の１例を示す
が、これによって本発明が限定されるものではない。図
１に示された測定器１を用いる方法は、口部４に検体
を、滅菌済ピペット等で滴下する。検体は第１の濾材６
を通過し、検体中の浮遊物が除去され、次いで分散染料
を標識した第２の親和性物質を含浸させた分散染料含浸
層７を通過する際に、検体中の被測定物質が分散染料を
標識した第２の親和性物質と結合する。この混液が第１
の抗体を固相化した多孔質担体膜９上に達し、特異的に
第１の抗体と結合した場合は、多孔質担体膜９上に残
り、第１の親和性物質と特異的に結合しない場合は、多
孔質担体膜９を通過し、吸収材１１に移動する。所定時
間（１分程度）後、上部測定系２と下部測定系３を取り
外し、多孔質担体膜９上に同相化された第１の抗体に信
号としての色が認められる（陽性）かまたは認められな
い（陰性）かによって被測定物質の有無を測定する。

【００４６】上部測定系２と下部測定系３を取り外す方
法としては、図１の如く継部１３を中心としてスライド
しながら回転して取り外すか、または、図３の如く継部
１３を測定器１の外部で、上部外枠５と下部外枠１２の
接点付近に取り付けることによって、継部１３と円弧の
対峙する位置から上下に開けることによって、上部測定
系２と下部測定系３を取り外すか、さらにまたは、図３
において継部１３のないものを使用して、上部測定系２
と下部測定系３を上下に取り外す方法等が挙げられる。

【００４７】

【実施例】以下、具体的に実施例を挙げ本発明の説明を
行うが、これによって本発明が限定されるものでない。

【００４８】（実施例１） ｈＣＧの測定 ａ）抗ｈＣＧ単クローン性抗体の精製 ポリエチレングリコールを用いた細胞融合法（免疫実験
操作法 VII ２２１１、１９７８）で得られ、それぞれ
ｈＣＧ上の異なる抗原決定基を認識する２種の単クロー
ン性抗体（以下抗体Ａ、抗体Ｂという）を産生するハイ
ブリドーマ２株を培養し、得られた培養上清１０ｌから
硫酸アンモニウム沈澱法によりそれぞれイムノグロブリ
ンＧ画分を得、それぞれをプロテインＡセファロースカ
ラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製
し、抗体ＡおよびＢを得た。抗体ＡおよびＢは生理食塩
液に対して透析し、それぞれ抗体Ａ ２２０ｍｇ、抗体
Ｂ２３５ｍｇを得た。

【００４９】ｂ）抗体結合分散染料の調製 １ｇの分散染料(SANDOZ 社製 Foron Brilliant Blue)を
１０ｍｌの蒸留水に懸濁し、２５００×ｇで１０分間遠
心分離し、上清をさらに２２０００×ｇで１０分間遠心
分離し、得られた沈澱に５ｍｌの蒸留水を添加し、懸濁
させ標識用分散染料とした。標識用分散染料０．２ｍｌ
に生理食塩液で希釈調製した２ｍｇ／ｍｌの抗体Ａ０．
２ｍｌを添加し５６℃で３０分間インキュベートした。
２０分間氷冷した後２２０００×ｇで遠心分離し、得ら
れた沈澱に０．５ｍｌの２．５％牛血清アルブミン（以
下ＢＳＡという）／２．５％正常家兎血清（以下ＮＲＳ
という）／１０％ラクトース／ＰＢＳ溶液を添加して懸
濁させ分散染料標識抗ｈＣＧ抗体（以下標識抗体Ａとい
う）とした。

【００５０】ｃ）メンブランへの抗体の結合 孔径５ミクロンのニトロセルロースメンブラン（東洋ろ
紙社製）に生理食塩液にて希釈調製した２ｍｇ／ｍｌの
抗体Ｂを塗布し、３７℃で乾燥させた。これを１％ＢＳ
Ａ／ＰＢＳに浸漬しアフターコーティングを行った。
（以下抗体Ｂ結合メンブランという）

【００５１】ｄ）凍結乾燥標識抗体の作製 標識抗体Ａを試験管に０．０２５ｍｌずつ分注し凍結乾
燥を行い、凍結乾燥標識抗体Ａを作製した。

【００５２】ｅ）反応容器の作製 ｃ）で調製した抗体Ｂ結合メンブランの下部にろ紙およ
び不織布からなる吸収材を設置し反応容器とした。

【００５３】ｆ）ｈＣＧの測定 ｈＣＧ標準品（３ｒｄ ＩＳ ７５／５３７に準拠）を
健常人男子尿で希釈してｈＣＧ標準品１０００、５０
０、２００、１００、５０ｍＩＵ／ｍｌを調製した。ｈ
ＣＧ標準品０．５ｍｌをｄ）で調製した凍結乾燥標識抗
体Ａの入った試験管に添加し、撹拌後直ちにｅ）で調製
した反応容器に全量を添加した。検体が吸収材に完全に
吸収された時点（約１分）で特別なＢ／Ｆ分離操作を全
く行わずに抗体Ｂ結合メンブラン上の発色を肉眼により
判定した。呈色したものを陽性（＋）、呈色しなかった
ものを陰性（−）として判定した結果を表１に示した。

【００５４】 表１ ｈＣＧ ─────────────────────── ｈＣＧ濃度 mIU/ml 0 50 100 200 500 1000 ─────────────────────── 判定 − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ───────────────────────

【００５５】（実施例２） ＬＨの測定 ａ）抗ＬＨ単クローン性抗体の精製 ポリエチレングリコールを用いた細胞融合法（免疫実験
操作法 VII ２２１１、１９７８）で得られ、それぞれ
ＬＨ上の異なる抗原決定基を認識する２種の単クローン
性抗体（以下抗体Ｃ、抗体Ｄとする）を産生するハイブ
リドーマ２株を培養し、得られた培養上清１０ｌから実
施例１−ａ）と同様の方法で精製し、抗体ＣおよびＤを
得た。抗体ＣおよびＤは生理食塩液に対して透析し、そ
れぞれ抗体Ｃ２５５ｍｇ、抗体Ｄ２１３ｍｇを得た。

【００５６】ｂ）抗体結合分散染料の調製 ａ）で調製した抗体Ｃを用いて実施例１−ｂ）と同様の
方法で分散染料標識抗ＬＨ抗体（以下標識抗体Ｃとい
う）を得た。

【００５７】ｃ）メンブランへの抗体の結合 実施例１−ｃ）と同様の方法で生理食塩液にて希釈調製
した２ｍｇ／ｍｌの抗体Ｄを塗布し、３７℃で乾燥させ
た。これを１％ＢＳＡ／ＰＢＳに浸漬しアフターコーテ
ィングを行った。（以下抗体Ｄ結合メンブランという）

【００５８】ｄ）標識抗体保持担体の調製 多孔性ポリエチレン樹脂（Ｐｏｒｅｘ ＃４７４４）を
１％ＢＳＡ／ＰＢＳに浸漬後室温にて乾燥しＢＳＡ処理
Ｐｏｒｅｘを調製した。これに前記ｂ）で調製した標識
抗体Ｃを添加し凍結乾燥を行い標識抗体Ｃ保持担体を調
製した。

【００５９】ｅ）反応容器の作成 検体ろ過材としてろ紙（東洋ろ紙Ｎｏ．６３）を用い、
測定物質のろ過材への非特異的吸着を防ぐため１％ＢＳ
Ａ／ＰＢＳに浸漬後室温にて乾燥し、ＢＳＡ処理ろ紙を
調製した。このＢＳＡ処理ろ紙をｄ）で調製した標識抗
体Ｃ保持担体の上部面に固定し、ｃ）で調製した抗体Ｄ
結合メンブランの上部に設置した。これら標識抗体Ｃ保
持担体および抗体Ｄ結合メンブランの下部にろ紙および
不織布からなる吸収材を設置し反応容器（測定器）とし
た。この反応容器を、図１に測定器１として記載した。

【００６０】ｆ）ＬＨの測定 ＬＨ標準品（ＵＣＢ社、Luteinizing Hormone 1st IRP
68/40 に準拠）を健常人男子尿で希釈してＬＨ標準品２
００、１００、５０ｍＩＵ／ｍｌを調製しこれをｅ）で
調製した反応容器に０．５ｍｌ添加し、検体が完全に吸
収材に吸収された時点（約１分）で特別なＢ／Ｆ分離操
作を全く行わずに検体濾材および標識抗体Ｃ保持担体を
取り除き、抗体Ｄ結合メンブラン上の発色を肉眼で測定
した。判定は呈色しなかったものを陰性（−）、呈色し
たもののうち呈色の弱いものを陽性（＋）、強いものを
強陽性（＋＋）とした。その結果を表２に示した。ま
た、正常月経周期を有する婦人尿を毎日採取したものを
検体とし、測定した結果を表３に示した。

【００６１】 表２ ＬＨ ───────────────────────── ＬＨ濃度 0 50 100 200 mIU/ml ───────────────────────── 判 定 − ＋ ++ ++ ─────────────────────────

【００６２】

【表１】

【００６３】（実施例３）本発明の分散染料を選択する
ために実施例３を行った。通常、分散染料は様々な粒径
の粒子の混合物であるため、使用する担体膜の孔径との
関係により好適な分散染料の粒径等が決められるが、一
般的には担体膜を通過しやすいように粒径の小さいも
の、すなわち分散染料１ミリモルあたりの光の透過率の
低い分画を利用するのが有利であると考えられる。そこ
で標識物質として使用する分散染料の粒子径と多孔質担
体膜として使用するメンブランの孔径との関係を明らか
にするためｈＣＧ測定系を用い検討を行った。

【００６４】実験方法 １ｇの分散染料(SANDOZ 社製、Foron Brilliant Blue)
を１０ｍｌに懸濁し、その５ｍｌを表４左欄に記した重
力によりそれぞれ分画した。分画したそれぞれの分散染
料及び未分画の分散染料にモノクローナル抗ｈＣＧ抗体
を物理的に吸着させて標識抗体を調製し、０．０２５ｍ
ｌずつ分注して凍結乾燥した。多孔質担体膜として東洋
ろ紙社製孔径５ミクロンのニトロセルロースメンブラン
を用い、これに第１の親和性物質としてポリクローナル
抗ｈＣＧ抗体を結合させ、この担体膜に検体０．５ｍｌ
と前記凍結乾燥した標識抗体との混合液を添加し、混合
液が通過した後のバックグランド（抗体を結合していな
い多孔質担体膜上の部分）の発色度合を調べた。

【００６５】表４に結果を示した。分散染料を分画する
ことによりバックグラウンドの発色が認められない分画
範囲が存在し、Ｂ／Ｆ分離のための操作を必要としない
ことを示した。しかし、バックグラウンドの発色が認め
られない分画でも透過率の低すぎるものでは判定部での
呈色が悪いためにかえって感度が低下する傾向が認めら
れるので、１０００〜２２０００×ｇの範囲の分画、特
に２５００〜２２０００×ｇの範囲の分画が最も適して
いることがわかった。

【００６６】反応時間はいずれの条件でも１分以内で終
了しており、感度についても特別なＢ／Ｆ分離操作を要
せずにｈＣＧ５０ｍＩＵ／ｍｌの感度が得られた。以上
のように標識物質として分散染料を特に分画して使用す
ればＢ／Ｆ分離操作の必要のない診断試薬として十分に
使用可能であることがわかった。

【００６７】 表４ ───────────────────────────── 分画範囲 透過率 バックグラ 感度 ×ｇ ンドの発色 (mIU/ml) ───────────────────────────── 未分画 1.3 × 10 -3 ＋ ５０ 22000 以下 6.5 × 10 -11 ± ５０ 1000 〜22000 2.5 × 10 -12 ± ５０ 2500 〜22000 4.8 × 10 -14 − ５０ 5000 〜22000 8.1 × 10 -18 − ５０ 10000 〜22000 2.5 × 10 -30 − １００ ───────────────────────────── ＋：発色が認められる。 ±：発色がやや認められる。 −：発色が認められない。

【００６８】（実施例４）多孔質担体膜の孔径と測定系
のバックグラウンドの発色との関係について実験し、結
果を表５に示した。表４で示した２５００〜２２０００
×ｇの範囲で分画した分散染料を用い、多孔質担体膜と
して東洋ろ紙社製の各種孔径を有するニトロセルロース
メンブランを用いた場合のバックグラウンドの発色およ
び測定感度を実施例１に示したｈＣＧ測定系を用いて調
べた。表から明らかなように、ニトロセルロースメンブ
ランの孔径が小さいものではバックグラウンドの発色が
強くなり、これら孔径の小さい多孔質担体膜は本発明に
適さないことがわかった。したがって、本発明を実施す
るに際しては分散染料の粒径と多孔質担体膜の孔径との
関係を考慮する必要があることを示している。

【００６９】 表５ ────────────────────── 多孔質担体膜 バックグランド 感 度 孔径(ミクロン) の発色 (mIU/ml) ────────────────────── ０．２２ ＋ ５０ ０．４５ ＋ ５０ ０．８ ＋ ５０ １．０ ± ５０ ３．０ − ５０ ５．０ − ５０ ────────────────────── ＋：発色が認められる。 ±：発色がやや認められる。 −：発色が認められない。

【００７０】（実施例５）表６は表５と同じ条件（２５
００〜２２０００×ｇ）で分画した分散染料を用い、検
体の添加速度を調節し、反応時間を変化させた場合の測
定感度に及ぼす影響を実施例１に示したｈＣＧ測定系を
用いて示したものである。検体と分散染料を標識した第
２の親和性物質の混合溶液を第１の親和性物質を結合し
た多孔質担体膜上を通過させる際の時間を変化させるこ
とにより測定感度が変化しており、上記混合溶液と第１
の親和性物質を結合した多孔質担体膜の接触時間を調節
することにより本発明による免疫学的簡易測定法の感度
の調節が容易にできることを示している。

【００７１】

【００７２】（実施例６）分散染料を標識した第２の親
和性物質について、抗体の結合量がＢ／Ｆ分離操作の必
要性、反応性および判定の容易さに与える影響について
検討を行った。 実験方法 多孔質担体膜として、実験例１で示した東洋ろ紙社製孔
径５ミクロンのニトロセルロースメンブランを用い、第
１の親和性物質として抗ｈＣＧポリクローナル抗体を用
い上記ニトロセルロースメンブランに結合させて実験に
用いた。抗体結合分散染料は以下の方法により調製し
た。表４に示した２５００〜２２０００×ｇの範囲で分
画した分散染料を用い、最終濃度が１ｍｇ／ｍｌの分散
染料に対して最終濃度が０．１、０．５、１．０、２．
０、３．０、４．０ｍｇ／ｍｌとなるように第２の親和
性物質である抗ｈＣＧモノクローナル抗体を加え、後に
示す比較実験例の方法で、各抗体結合量の異なる抗体結
合分散染料を調製した。各抗体濃度で調製した抗体結合
分散染料０．１ｍｌと検体（ｈＣＧ５０ｍＩＵ／ｍｌお
よび１０００ｍＩＵ／ｍｌを含むｈＣＧ標準液）０．５
ｍｌとを混合し、その混合液を第１の抗体を結合させた
多孔質担体膜上に添加した。混合液通過後にバックグラ
ウンド（抗体を結合していない多孔質担体膜上の部分）
の発色および反応性を肉眼およびＬａｂ−ｂ値（呈色度
合を色の３刺激値Ｘ、ＹおよびＺからＨｕｎｔｅｒの式
により計算されるＬａｂのｂ値で、無呈色の場合はＬａ
ｂ−ｂは１０となり、青色が増大するにしたがって、こ
の値は減少し、８．０以下ではほぼ１００％の人間が青
色を認めた。）を観察した。これらの抗体結合分散染料
の反応性を表７および図４に示した。

【００７３】 表 ７ ──────────────────────────────────── 抗体濃度（mg/ml) 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 ──────────────────────────────────── バックグラウンド - - - - + ++ Ｌａｂ−ｂ値 8.6 8.5 8.3 8.1 6.8 4.5 ──────────────────────────────────── 反応性(hCG 50mIU/ml) - + + + + + Ｌａｂ−ｂ値 8.4 6.7 5.9 5.0 4.3 3.2 ──────────────────────────────────── 反応性(hCG 1000mIU/ml) + ++ ++ ++ ++ ++ Ｌａｂ−ｂ値 5.7 -0.8 -1.1 -1.3 -1.8 -2.1 ────────────────────────────────────

【００７４】抗体結合分散染料調製時の抗体濃度が０．
１ｍｇ／ｍｌと低い場合は、バックグラウンドおよび５
０ｍＩＵ／ｍｌでの発色は認められなく、１０００ｍＩ
Ｕ／ｍｌでの発色も非常に弱かった。また、抗体濃度を
３．０ｍｇ／ｍｌ超にした場合、１０００ｍＩＵ／ｍｌ
では明かな陽性と判定することができたがバックグラウ
ンドの発色（Ｌａｂ−ｂ ６．８）が認められたため、
肉眼判定は非常に難しい結果となった。

【００７５】バックグラウンドは、分散染料に結合させ
る抗体の量が増加するに従って強い発色となったが、こ
のことは分散染料の粒子が結合した抗体を介して非特異
的に凝集し、その結果として３．０ｍｇ／ｍｌ超の濃度
で抗体を結合させた分散染料を用いた場合、本反応系で
は多孔質担体膜上に非特異的に抗体結合分散染料が残存
すると考えられた。

【００７６】一方、５０ｍＩＵ／ｍｌでの発色は、抗体
濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ以上で認められ、測定感度が５
０ｍＩＵ／ｍｌを有する肉眼判定可能なｈＣＧ測定系と
しては抗体濃度が０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌの範囲で抗
体結合分散染料を調製する必要があることがわかった。
以上のようにバックグラウンドの発色が見られず、十分
な測定感度を得るためには至適量の抗体を分散染料に結
合する必要があり、特にバックグラウンドの発色が認め
られない測定系を作成するためには、最終濃度１ｍｇ／
ｍｌの分散染料に対する抗体量は最終濃度２ｍｇ／ｍｌ
以下であることが必要であることがわかった。

【００７７】（実施例７および比較例）実施例３で示し
た本発明に用いる分散染料が、従来の技術で標識物質と
して用いられているコロイド状金属粒子や着色ラテック
スと比較した場合、Ｂ／Ｆ分離操作の必要性、反応性な
らびに判定のし易さなどについてどの程度の差が認めら
れるかを確認するための比較実験を行った。

【００７８】実験方法 多孔質担体膜として、実施例３で示した東洋ろ紙社製孔
径５ミクロンのニトロセルロースメンブランを用いた。
また第１の親和性物質として抗ｈＣＧポリクローナル抗
体を用い、上記ニトロセルロースメンブランに結合させ
て、実験に使用した。

【００７９】第２の親和性物質は抗ｈＣＧモノクローナ
ル抗体を用い、標識物質としては実施例３で示した２５
００〜２２０００×ｇの範囲で分画した分散染色を用い
た。また比較する標識物質として金コロイドおよびブル
ーに着色されたラテックスを選択した。

【００８０】抗体結合分散染料は以下の方法により製造
した。すなわち標識用分散染料０．２ｍｌに生理食塩液
で希釈調製した２ｍｇ／ｍｌの抗体０．２ｍｌを添加し
５６℃で３０分間インキュベートした。２０分間氷冷し
た後２２０００×ｇで遠心分離し、得られた沈澱に０．
５ｍｌの２．５％ＢＳＡ／２．５％ＮＲＳ／１０％ラク
トース／ＰＢＳ溶液を添加して懸濁させ抗体結合分散染
料とした。

【００８１】金コロイドはバイオセル(Biocell) 社製(
粒径１０ｎｍ) を用い、Jan H.W.Leuvering らの方法(1
983 J.Immunol.Methods 60 9-23)により抗ｈＣＧモノク
ローナル抗体を結合し、抗体結合金コロイドを調製し
た。ブルーに着色されたラテックスは MAGSPHERE社製
（粒径２００ｎｍ）を用いた。官能基としてカルボキシ
ル基を有しているのでＮ−ヒドロキシスクシイミド法に
より抗ｈＣＧモノクローナル抗体を結合させ、抗体結合
ラテックスを調製した。

【００８２】抗体結合分散染料、抗体結合金コロイド、
抗体結合ラテックスを適宜希釈し、その０．１ｍｌと検
体（ｈＣＧ１００ｍＩＵ／ｍｌを含む標準液）０．５ｍ
ｌとを混合し、その混合液を第１の親和性物質を結合さ
せた多孔質体膜上に添加した。混合液通過後にバックグ
ラウンド（抗体を結合していない多孔質担体膜上の部
分）の発色および反応性を肉眼で観察した。発色がブル
ーを呈する分散染料とラテックスについては、呈色度合
を色の３刺激Ｘ，Ｙ，Ｚにより計算（Ｈｕｎｔｅｒの
式）されるＬａｂのｂ値（以下Ｌａｂ−ｂとする）を測
定し表した（無呈色の場合はＬａｂ−ｂは１０となり、
青色が増大するにしたがってＬａｂ−ｂ値は減少し、
８．０以下でほぼ１００％の人間が青色を認めた）。こ
れら標識抗体の反応性を比較した結果を表８および図５
に示した。

【００８３】

【表２】

【００８４】抗体結合分散染料を用いた場合には肉眼判
定上、バックグラウンドの発色は全く認められず、(Lab
-b 8.5) 、ｈＣＧ１０００ｍＩＵ／ｍｌでは明かな陽性
(Lab-b -0.8)と判定することができた。ラテックスおよ
び金コロイドを標識物質として用いた場合には、バック
グラウンドを肉眼判定する上で支障のない程度(Lab-b8.
0以上) にするためには抗体結合標識物質の濃度を非常
に薄くする必要があり、このときにはｈＣＧ１０００ｍ
ＩＵ／ｍｌでの発色の肉眼判定が非常に困難であった
（通常１０００ｍＩＵ／ｍｌではLab-b 値は０付近が適
当である）。

【００８５】一方、ｈＣＧ１０００ｍＩＵ／ｍｌでの発
色を肉眼ではっきりと判定するためには、抗体結合ラテ
ックス及び金コロイドの濃度を濃くしなければならず、
その際にはバックグラウンドに発色が認められるため、
肉眼判定が困難であることがわかった。

【００８６】以上のように、分散染料を標識物質として
使用した場合にはＢ／Ｆ分離の操作ならびに過程を全く
行わなくても肉眼判定に支障のない簡易測定法を作成す
ることが可能であったが、金コロイド及びラテックスを
標識物質として用いた場合にはＢ／Ｆ分離を全く必要と
しない測定系を作成することは困難であることを確認し
た。免疫学的に簡易な測定方法としては、標識物質とし
て分散染料を使用することが最も適していることがわか
った。

【００８７】（実施例８） 膣内容液中ＡＦＰの測定 ａ）抗ＡＦＰ単クローン性抗体の精製 ポリエチレングリコールを用いた細胞融合法（免疫実験
操作法 VII ２２１１、１９７８）で得られ、それぞれ
ＡＦＰ上の異なる抗原決定基を認識する２種の単クロー
ン性抗体（以下抗体Ｅ、抗体Ｆとする）を産生するハイ
ブリドーマ２株を培養し、得られた培養上清１０ｌを実
施例１−ａ）と同様の方法で精製し、抗体ＥおよびＦを
得た。抗体ＥおよびＦを生理食塩液を用いて透析し、そ
れぞれ抗体Ｅ２４８ｍｇ、抗体Ｆ２３５ｍｇを得た。 ｂ）抗体結合分散染料の調製 ａ）で調製した抗体Ｅを用いて実施例１−ｂ）と同様の
方法で分散染料標識抗ＡＦＰ抗体（以下標識抗体Ｅとい
う）を得た。 ｃ）メンブランへの抗体の結合 孔径５ミクロンのニトロセルロースメンブラン（東洋ろ
紙社）を縦１ｃｍ横５ｃｍの大きさに切断し、これを１
％ＢＳＡ／ＰＢＳに浸漬し、前処理を行った。ニトロセ
ルロースメンブランの中央部に実施例１−ｃ）と同様の
方法で生理食塩液にて希釈調製した２ｍｇ／ｍｌの抗体
Ｆを塗布し３７℃で乾燥させた。（以下抗体Ｆ結合メン
ブランという） ｄ）反応メンブランの調製 ｃ）で調製した抗体Ｆ結合メンブランの抗体Ｆを塗布し
た位置より上流部にｂ）で調製した標識抗体Ｅを塗布
し、乾燥を行なった。（以下反応メンブランという） ｅ）反応容器の作成 検体ろ過材としてろ紙（ミリポア社 １７Ｃｈｒ）を用
い、測定物質のろ過材への非特異的吸着を防ぐため２０
％正常兎血清（以下ＮＲＳという）、１％Ｔｗｅｅｎ２
０／ＰＢＳに浸漬後室温にて乾燥し、検体ろ過材を調製
した。また、検体吸収材としてろ紙（東洋ろ紙社Ｎｏ．
３２４）を用いた。ｄ）で調整した反応メンブランの上
流端に検体ろ過材を、下流端に検体吸収材を設置し、反
応容器とした。反応は、検体を検体ろ過材に添加し、メ
ンブランに対して水平方向に移動させる方法で行なっ
た。 ｆ）ＡＦＰ測定 ＡＦＰ標準品（コスモバイオ社、α−Fetoprotein ）を
０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈してＡＦＰ標準品１０
０、２０ｎｇ／ｍｌを調製し、これをｄ）で調製した反
応容器に０．２ｍｌ添加し、添加された検体により反応
メンブラン上に塗布された標識抗体Ｅが溶化されメンブ
ラン下流端に到達した時点での反応メンブラン上の発色
を肉眼で測定した。判定は呈色しなかったものを陰性
（−）、呈色したもののうち呈色の弱いものを陽性
（＋）、強いものを強陽性（＋＋）とした。その結果を
表９に示した。 ｇ）膣内容液の測定 膣内容液を検体として用いて測定を行なった。反応方法
は検体を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて５０倍に希釈し
ｆ）と同様の方法で行なった。臨床上、前期破水の患者
１５例、正常妊婦１５例および羊水１０例の測定を実施
した。前期破水および羊水においては全例陽性−強陽性
との結果となり、正常妊婦については全例陰性となっ
た。その結果を表１０に示した。

【００８８】

【発明の効果】分画調整された分散染料で標識された第
２の親和性物質を使用して免疫学的に検体を測定する本
発明の測定方法を用いると、通常行われるような洗浄等
のＢ／Ｆ分離の操作ならびに過程を行わずに迅速で簡易
に免疫学的測定を行うことができる。例えば、分散染料
で標識された抗ｈＣＧ抗体を用いると、Ｂ／Ｆ分離の操
作・過程を行わずに、妊娠の診断を行え、分散染料で標
識された抗ＡＦＰを用いると、Ｂ／Ｆ分離の操作・過程
を行わずに破水の診断を行える。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の免疫学的簡易測定法を行なうための
器具の断面側面図である。

【図２】 本発明の免疫学的簡易測定法を行なうための
器具の部材２から部材５を引き離し、部材５の上面図で
ある。

【図３】 本発明の免疫学的簡易測定法を行なうための
器具の断面側面図である。

【図４】 分散染料と各濃度の第２の親和性物質のＬａ
ｂ−ｂ値を示すグラフである。

【図５】 分散染料またはラテックス標識した第２の親
和性物質のＬａｂ−ｂ値を示すグラフである。

【記号の説明】

１ 測定器 ２ 上部測定系 ３ 下部測定系 ４ 口部 ５ 上部外枠 ６ 第１の濾材 ７ 分散染料含浸層 ８ 固定具 ９ 多孔質担体膜 １０ 第２の濾材 １１ 吸収材 １２ 下部外枠 １３ 継部 １４ 開口部 １５ スペース １６ 判定部

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 持 田 英 東京都新宿区四谷一丁目７番地 持田製薬 株式会社内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】被測定物質と特異的に結合することができ
   る第１の親和性物質を多孔質担体膜に結合させ、標識物
   質として分画調整された分散染料を用いて標識された第
   ２の親和性物質と被測定物質を含む液体標本とを該多孔
   質担体膜に接触させることにより液体標本中の被測定物
   質を免疫学的に測定する免疫学的簡易測定方法。
2. 【請求項２】前記接触が、前記液体標本を前記多孔質担
   体膜に対して垂直に通過させる工程である請求項１に記
   載の免疫学的簡易測定方法。
3. 【請求項３】前記接触が、前記液体標本を前記多孔質担
   体膜に対して水平方向に移動させる工程である請求項１
   に記載の免疫学的簡易測定方法。
4. 【請求項４】前記被測定物質が抗原であり、第１および
   第２の親和性物質が抗体である請求項１に記載の免疫学
   的簡易測定方法。
5. 【請求項５】前記被測定物質が抗体であり、第１の親和
   性物質が抗原であり、第２の親和性物質が抗原または前
   記抗体に対する第２抗体である請求項１に記載の免疫学
   的簡易測定方法。
6. 【請求項６】前記分画調整された分散染料が、少なくと
   も１０００×ｇ、１０分間の遠心分離で沈殿せず２５０
   ００×ｇ、１０分間の遠心分離で沈殿する請求項１ない
   し５のいずれかに記載の免疫学的簡易測定方法。
7. 【請求項７】前記分散染料を前記第２の親和性物質に標
   識する際に、該分散染料に対する該第２の親和性物質の
   重量比が３以下である請求項１ないし６のいずれかに記
   載の免疫学的簡易測定方法。
8. 【請求項８】前記分散染料を前記第２の親和性物質に標
   識する際に、該分散染料に対する該第２の親和性物質の
   重量比が３以下で、該分散染料の最終濃度が２．０ｍｇ
   ／ｍｌ以下である請求項１ないし６のいずれかに記載の
   免疫学的簡易測定方法。
9. 【請求項９】前記分散染料を前記第２の親和性物質に標
   識する際に、該分散染料の最終濃度１．０ｍｇ／ｍｌに
   対する該第２の親和性物質の最終濃度が２．０ｍｇ／ｍ
   ｌ以下である請求項１ないし６のいずれかに記載の免疫
   学的簡易測定方法。
10. 【請求項１０】請求項１の測定方法を実施するための装
    置であって、前記第１の親和性物質を結合させた多孔質
    担体膜に対して、前記液体標本が垂直方向に流れるよう
    に構成してなることを特徴とする測定装置。