WO2019093495A1 - たんぱく質検出法 - Google Patents

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WO2019093495A1
WO2019093495A1 PCT/JP2018/041722 JP2018041722W WO2019093495A1 WO 2019093495 A1 WO2019093495 A1 WO 2019093495A1 JP 2018041722 W JP2018041722 W JP 2018041722W WO 2019093495 A1 WO2019093495 A1 WO 2019093495A1
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measured
filter
detection
color
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章裕 中島
桂子 森久保
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株式会社明治
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method of detecting a protein, a method of calculating the concentration of a protein, and a kit for detecting a protein.
  • the present invention relates to a method for detecting a protein in a liquid, a method for calculating the concentration of a protein in a liquid, and a kit for detecting a protein in a liquid.
  • allergens are often proteins, and enzyme immunoassay (ELISA) is used for detection and measurement.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • the ELISA method is a method of detecting a specific allergen using an antibody, and the protein which can be detected or measured is limited and lacks in versatility.
  • WO 2004/011948 (patent document 1) describes a method of analyzing proteins combining dot blotting and fluorescent staining.
  • the ELISA method and the like are known as detection methods for allergens (proteins) until now, but the operation is complicated, and a kit or the like is also required, which takes time and cost. Therefore, for example, it is difficult to adopt as a method of checking the washing degree of rinse water of manufacturing facilities etc., which is carried out daily in a food manufacturing plant.
  • the turbidity method is known as a simple method for detecting allergens (proteins), but with this method, turbidity due to components other than proteins (oils and fats, etc.) is also detected as proteins, and production facilities etc. Excessive cleaning is required.
  • Patent Document 1 requires the use of a special fluorescence image analysis apparatus for performing the fluorescence staining method, and also requires 4 to 5 hours from sample preparation to image analysis There is a problem that it is difficult to detect allergens (proteins) quickly in the field.
  • Another object of the present invention is to provide a simple method for detecting a protein, which requires less labor and cost than conventional methods. Another object of the present invention is to provide a method for calculating the concentration of the above-mentioned detected protein, and a kit for detecting a protein which can easily detect the protein.
  • the present inventors reviewed and examined the method of pretreatment of the measurement sample and the like in order to construct a simple method for detecting a protein.
  • the protein to be measured is colored in a color reaction specific to the protein, and then filtered using a filter to retain the protein on the filter, concentrate it, and It has been found that even low-density proteins can be easily detected and measured by visual inspection or confirmation with a color difference meter or the like.
  • the protein to be measured is filtered using a filter, concentrated on the filter, and then colored by a color reaction specific to the protein and confirmed by visual observation or color difference meter etc. It has been found that the protein of can be conveniently detected and measured.
  • the present inventors have also found that there is a certain correlation between the concentration of the protein to be measured in the sample and the color value of the color of the protein to be detected. Therefore, it is possible to calculate the concentration of the protein to be measured from the color value obtained by the measurement, by preparing in advance a calibration curve showing the correspondence between the concentration of the protein to be measured and its color value. I found out what I could do.
  • the present inventors have found a protein detection kit capable of carrying out the above-mentioned simple protein detection method.
  • the present invention is as follows. [1] A coloring step of causing the protein to be measured to be colored; A filtration step of filtering the protein to be measured with a filter; And detecting the color of the protein to be measured on the filter. [2] The detection method according to [1], wherein the color development step, the filtration step, and the detection step are performed in this order. [3] The detection method according to [1], wherein the filtration step, the coloration step and the detection step are performed in this order. [4] The coloration step described in any one of [1] to [3], wherein the coloration of the protein to be measured is performed using a measurement reagent whose absorption wavelength is shifted by binding to the protein to be measured. Detection method.
  • a coloring step of causing the protein to be measured to be colored A filtration step of filtering the protein to be measured with a filter; Detecting the color of the protein to be measured on the filter; Measuring the color value of the color of the protein to be measured detected in the detection step; A calibration curve showing the correspondence between the concentration of the protein to be measured in each reference sample and the color value is created using a plurality of reference samples with known concentrations of protein to be measured and their color values.
  • a coloring step in which the protein to be measured is colored by the Bradford method;
  • the measurement target in each reference sample The concentration of the protein to be measured is calculated from the b value measured in the measurement step by creating a calibration curve showing the correspondence between the protein concentration and the b value. Calculation method of concentration of protein.
  • a coloring part for coloring the protein to be measured A filtration unit that filters the protein to be measured with a filter; A detection unit for detecting the coloration of the protein to be measured on the filter; And the detection of said protein is possible from the colored state of said filter, Protein detection kit. [13] Furthermore, it is equipped with a coloring judgment paper, For measuring the concentration of a protein to be measured by comparing the coloration judgment paper with the coloration state in the detection unit, The kit for detecting a protein according to the above [12].
  • proteins can be conveniently detected and measured.
  • allergens such as gelatin and collagen whose simple measurement methods are not known, and other various allergens can also be easily detected and measured while suppressing labor and cost.
  • the concentration of various proteins in a sample can be easily calculated.
  • the required time is at most about one hour, proteins can be detected more rapidly than ELISA, fluorescent staining, etc. For example, it can greatly contribute to the determination of the cleaning property of the manufacturing line (manufacturing facility) of a food factory.
  • Example 1 a bovine serum albumin solution is measured by the detection method of this invention using three types of filters, It is a graph which shows the result of having measured blue coloration as b value by a color difference meter.
  • Example 2 the time after color development is changed, a bovine serum albumin solution is measured by the detection method of this invention, and it is a graph which shows the result of having measured blue coloration as b value with a color difference meter.
  • Example 3 the proteins (egg, milk, wheat, buckwheat, buckwheat, peanuts, crustaceans, gelatin, bovine serum albumin) of various allergens are measured by the detection method of the present invention, and the blue color is measured with a b It is a graph which shows the result measured as.
  • FIGS. 4A and 4B are graphs showing the results of measurement of milk allergen (casein) in Example 5 and measurement of blue coloration as ab value using a color difference meter.
  • FIG. 5 (A) and FIG. 5 (B) are graphs showing the results of measuring the egg allergen (ovalbumin) in Example 6 and measuring the blue coloration as a b-value using a color difference meter.
  • a wheat allergen (gliadin) was measured, and it is a graph which shows the result of having measured blue coloration as b value with a color difference meter.
  • Example 8 a buckwheat allergen (partially purified buckwheat protein) was measured, and it is a graph which shows the result of having measured blue coloration as b value with a color difference meter.
  • Example 9 a peanut allergen (partially purified peanut protein) was measured, and it is a graph which shows the result of having measured blue coloration as b value with a color difference meter.
  • Example 10 it is a graph which shows the result of having measured a crustacean allergen (Crustacea tropomyosin), and measured blue coloration as b value with a color difference meter. It is a figure for demonstrating one embodiment of the detection kit of this invention. It is a figure for demonstrating another embodiment of the detection kit of this invention. In the detection kit of this invention, it is a figure for demonstrating the coloring judgment paper which enables detection of protein.
  • the detection method of the present invention comprises a coloration step, a filtration step, and a detection step.
  • the coloring step is a step of coloring the protein to be measured.
  • the coloration method of the protein is not limited as long as it can be detected in a separately performed detection step. Among them, the method of coloring the protein to be measured using the measurement reagent whose absorption wavelength is shifted by binding to the protein to be measured is advantageous in enhancing the effect of the present invention.
  • the Bradford method is mentioned, for example. This is a method of quantifying a colored protein by using the shift of the absorption wavelength from 465 nm to 595 nm (brown to blue) by binding of the acid dye, coomassie brilliant blue, to the protein to be measured. It is.
  • the coloration by the Bradford method is easy to confirm even with the naked eye, making detection easy. Therefore, it is preferable to use the Bradford method in the coloration step of the present invention.
  • the Bradford method for example, Takara Bradford Protein Assay Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) can be used.
  • the filtration step is a step of filtering the protein to be measured with a filter, holding it on the filter and concentrating it.
  • the filter to be filtered is not particularly limited as long as it can retain the protein to be measured.
  • those capable of physically collecting and concentrating a protein to be measured on a filter such as a glass filter
  • those capable of chemically adsorbing the protein to be measured on a filter electrically converting the protein to be measured on a filter What can be adsorbed can be mentioned.
  • the holding particle diameter of the glass filter is preferably 0.3 ⁇ m to 1.6 ⁇ m, and more preferably 0.3 ⁇ m to 1.0 ⁇ m.
  • the holding particle diameter means a particle diameter which can hold 90% or more when the seven types of powder dispersion water defined in JIS Z 8901 is naturally filtered.
  • the filtration diameter of the glass filter is preferably 3 mm or more, more preferably 5 mm or more, and still more preferably 7 mm or more. Moreover, 40 mm or less is preferable, 35 mm or less is more preferable, and 33 mm or less is more preferable.
  • the filtration diameter of the glass filter means the diameter of the portion of the glass filter that actually filters the sample. When the above conditions for the glass filter are satisfied, the flow rate is preferably 10 ml to 100 ml.
  • the flow-through time can be appropriately adjusted according to the concentration of the sample and the flow rate of the flow-through, and is usually 5 seconds to 40 minutes.
  • the method of filtration is not particularly limited, and examples thereof include natural filtration, vacuum filtration, pressure filtration, centrifugal filtration and the like. It is preferable to perform vacuum filtration by suction filtration from the viewpoint that proteins with low concentration can be easily detected and measured.
  • the detection step is a step of detecting a protein to be measured on the filter after coloration.
  • the protein to be measured that has been colored on the filter is retained and concentrated by the coloration step and the filtration step, so that the protein to be measured can be detected.
  • the detection method is usually carried out in an optimum manner in accordance with the coloration method.
  • the filter in which the above-mentioned protein is retained and concentrated can be carried out using a spectrophotometer or a color difference meter.
  • One embodiment of the detection method of the present invention is carried out in the order of a coloration step, a filtration step and a detection step.
  • the protein to be measured is colored in a color reaction specific to the protein, filtered using a filter, and the color of the protein to be measured which is concentrated on the filter is colored. Is detected (checked) visually or with a colorimeter. Implementing in the above order has an advantage that visual determination and digitization of a trace amount of protein can be performed.
  • the filtration step, the coloration step, and the detection step are carried out in this order.
  • the protein to be measured is filtered using a filter, and the protein to be measured concentrated on the filter is colored in a color reaction specific to the protein, and the color is changed. Is detected (checked) visually or with a colorimeter.
  • the detection method of the present invention is very useful particularly as a method of confirming the degree of washing of rinse water that is carried out daily at a food manufacturing plant. Compared to conventional methods such as ELISA method, turbidity method and fluorescent staining method, it is possible to detect the allergen protein of rinse water very simply and quickly without much effort and cost.
  • the required time for detection can be made 1 hour or less.
  • the required time of a detection means the time from the place which installs a test instrument until a detection result comes out.
  • the required time of a detection can further be shortened.
  • the type of the allergen (protein) to be measured which can be detected by the detection method of the present invention is not particularly limited.
  • the allergen (protein) to be measured is not particularly limited.
  • the type of the allergen (protein) to be measured is not particularly limited.
  • the allergen (protein) to be measured is not particularly limited.
  • in addition to gelatin and collagen, egg, milk, wheat, buckwheat, peanuts, and crustaceans And allergens contained in Specifically, ovalbumin, casein, gliadin, partially purified buckwheat protein, partially purified peanut protein, crustacean tropomyosin and the like can be mentioned.
  • the detection method of the present invention is very useful particularly for detecting gelatin or collagen as an allergen (protein) to be measured.
  • the detection limit of measuring instruments such as gelatin and collagen (for example, HPLC) is said to be 40 ppb.
  • gelatin at a concentration of 1 to 30 ppb can also be detected. Therefore, the present invention is very useful for detecting gelatin and collagen which are allergen proteins which have been difficult to detect.
  • other proteins such as milk allergens and egg allergens
  • concentrations including low concentrations.
  • the sample used in the detection method of the present invention is not particularly limited, but is preferably a liquid.
  • the liquid for example, factory water, in particular, rinse water used for cleaning a manufacturing facility of a food factory is preferably used from the viewpoint of the effect of the present invention.
  • the detection method of the present invention can be applied to a solution having a high chlorine concentration, such as water for industrial use, by previously adding an appropriate neutralizing agent to an object to be measured.
  • an appropriate neutralizing agent for example, sodium ascorbate, sodium thiosulfate and the like can be suitably used.
  • the present invention is also carried out by measuring the color value of the colored state of the protein to be measured detected in the detecting step.
  • the present invention provides a method for calculating the concentration of an allergen (protein) to be measured in a sample.
  • the concentration of the allergen (protein) to be measured in the sample and the color value of the color of the protein to be measured detected in the detection step described above It was found that a certain correlation exists between the In particular, it was found that a linear (linear function) relationship exists between the concentration of the allergen (protein) to be measured and the color value of the color of the protein to be measured.
  • the measurement of the color value depends on the method of coloring the protein to be measured, it can be appropriately performed by a known method, and is not particularly limited.
  • L * a * b * color system, L * c * h * color system, L * u * v * color system, Hunter Lab color system, XYZ (Yxy) color system, Munsell color system, etc. can be done by
  • color values can be measured by a color difference meter.
  • the color value of the protein to be measured may be determined by comparing the coloration judgment paper prepared for each of various color values with the actual coloration state of the protein.
  • the Bradford method is adopted as a color reaction
  • the above-mentioned color value is the b value defined in the L * a * b * color system according to the CIE standard. Is preferred.
  • the L * a * b * color system is also adopted in JIS Z8729.
  • the b value can be measured by a colorimeter.
  • the b value of the protein to be measured may be determined by comparing the coloration judgment paper prepared for each of the various b values with the actual coloration state of the protein.
  • FIG. 12 is a view showing an example of the coloring judgment sheet.
  • the coloring judgment paper 70 pseudo-shows, for example, filter paper colored from colorless to dark blue as shown in (a) to (d), and b value is assigned to each (not shown).
  • the number of colored judgment sheets is not limited, and the larger the number, the more b values will be assigned, so the b values can be determined more accurately, which is preferable.
  • the concentration of the protein to be measured can be calculated by applying the b value obtained in this manner to the previously prepared calibration curve.
  • the concentration calculation method of the present invention although depending on the type of protein to be measured, even if the concentration is about 0.25 ppb, the measured color values are applied to the above calibration curve to obtain the contents in the sample.
  • the concentration of protein to be measured can be calculated.
  • the upper limit is not particularly limited, but is, for example, 2000 ppm or less.
  • the detection method of the present invention includes, for example, a coloring agent and the like used in the coloration step, a filter used in the filtration step, a detection agent used in the detection step as needed, They can also be commercialized as a kit for protein detection by combining them. In this case, the detection method of the present invention can be used simply and quickly, even in a situation where experimental instruments and materials are not available, and is particularly suitable for use in a factory.
  • one embodiment of the detection kit of the present invention is a filter 123 for filtering, holding, and concentrating a protein to be measured, a sample introduction container 12, and a display used in a coloring step. And the colorant 13.
  • a color determination paper may be provided to measure the concentration of the protein to be measured. As described above, it is possible to measure the concentration of the protein to be measured by comparing the coloration judgment paper with the coloration state of the protein detected on the filter.
  • the usage method of the said detection kit 10 is demonstrated using a sample as a rinse liquid.
  • a rinse liquid which is a sample
  • the rinse liquid may be mixed with the coloring agent at the same time as introducing the rinse liquid into the sample introduction container 12 (see FIG. 10)
  • the coloring agent 13 may be added to the rinse liquid in the sample introduction container 12.
  • a coloring agent may not be used, and may be used in the coloration step after filtration described later.
  • the filter 123 is fixed near the top of the sample introduction container 12. Thereafter, the rinse solution of the sample is passed through the filter by any method, and filtration is performed to retain and concentrate the protein to be measured on the filter. At this point, when the coloring agent 13 is not used yet, the coloring agent 13 may be applied to the protein to be measured which is held and concentrated on the filter.
  • the application method can be appropriately selected according to the type of the coloring agent 13. This makes it possible to detect the protein to be measured which has been retained and concentrated in the filter.
  • the detection kit of the present invention comprises a color-developing unit that causes the protein to be measured to be colored, a filtration unit that filters the protein to be measured using a filter, and a detection unit that detects the coloration of the protein to be measured on the filter. And the colored state of the filter enables the detection of the protein. Moreover, you may be equipped with the coloration judgment paper mentioned above.
  • the detection kit of the present invention includes a mode in which a plurality of sample introduction containers 12 are provided to simultaneously detect proteins in a plurality of samples.
  • the detection kit 11 includes a sample introduction container 12, a filter 123, a filtrate storage container 14, a decompression port 16, and a filtrate discharge port 18.
  • a sample introduction container 12 is shown in figure in FIG. 11, you may provide with two or more as needed.
  • a plurality of rinse solutions sampled from the factory are introduced into the sample introduction container 12 respectively.
  • a filter fixing device 122 is provided below the sample introduction container, and a filter such as a glass filter is installed here.
  • the vacuum port 16 and an aspirator (not shown) and decompressing the inside of the filtrate storage container 14
  • the protein to be measured contained in the rinse solution is concentrated on the glass filter, and the filtrate from the filtrate outlet 124 It is discharged into the filtrate storage container 14.
  • the filtrate outlet 18 is normally closed, and when the amount of water storage of the filtrate in the filtrate container 14 increases, the filtrate outlet 18 is opened as appropriate, and the filtrate is stored in the filtrate container 14. Discharge to the outside.
  • the addition procedure is, for example, adding the Bradford reagent in advance to the rinse solution with a predetermined amount and then introducing it into the sample introduction container 12; rinsing into the sample introduction container 12 The solution is introduced, and the Bradford reagent is added thereto; or the Bradford reagent is added to the glass filter after the filtration of the rinse solution, and the like.
  • the glass filter can be taken out and compared with the coloring judgment paper shown in FIG. 12 prepared in advance to measure the concentration of the protein to be measured.
  • the b value of the taken out glass filter may be directly measured by a color difference meter, and the concentration of the protein to be measured may be calculated from the above calibration curve.
  • Example 1 A 2 mg / mL bovine serum albumin (BSA) standard reagent (manufactured by TAKARA) was diluted to prepare 0.05 ppm, 0.1 ppm and 0.15 ppm BSA solutions. 100 ⁇ L of Bradford reagent (manufactured by TAKARA) was added to 10 mL of each, and the mixture was allowed to stand at room temperature (25 ° C.) for 5 minutes, and then passed through a glass filter for 5 seconds.
  • BSA bovine serum albumin
  • Glass filters are “GF-75” (manufactured by ADVANTEC, holding particle diameter: 0.3 ⁇ m), “GF / F” (manufactured by Whatman, holding particle diameter: 0.7 ⁇ m), “GF / B” (Whatman Made and three types of particle diameter: 1.0 ⁇ m) were used for examination.
  • the blue color on the filter was measured with a color difference meter (CR-5, manufactured by Konica Minolta), and the b value obtained was evaluated.
  • Example 2 A 0.1 ppm BSA solution is prepared in the same manner as in Example 1. To 10 mL of the solution, 100 ⁇ L of Bradford reagent (manufactured by TAKARA) is added, and left at room temperature (25 ° C.) for 5 minutes. / B "(manufactured by Whatman) for 5 seconds. Measure the blue color on the filter with a color difference meter (CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.) 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105 minutes after the passage of liquid. It evaluated by the obtained b value.
  • a color difference meter CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.
  • the protein of any allergen could be detected by the detection method of the present invention. Therefore, it has been found that the detection method of the present invention can detect proteins in various types of liquids.
  • Example 4 Prepare 10 ppb and 100 ppb solutions of gelatin, add 1 mL of Bradford reagent (manufactured by TAKARA) to 100 mL of each solution, and allow to stand for 5 minutes at room temperature (25 ° C.).
  • Glass filter “GF / B” (Whatman Solution for 40 minutes.
  • the filtration diameter of the glass filter "GF / B” at the time of liquid flow was 8 mm at the time of 10 ppb solution measurement, and was 33 mm at the time of 100 ppb solution measurement.
  • the blue color on the filter was measured with a color difference meter (CR-5, manufactured by Konica Minolta), and the b value obtained was evaluated.
  • the measurement aperture of the color difference meter for color difference measurement was 3 mm for 10 ppb solution measurement and 30 mm for 100 ppb solution measurement.
  • Example 5 Milk allergen (casein Na) was diluted to prepare solutions of 10 ppb, 20 ppb, 30 ppb, 40 ppb, 50 ppb and 100 ppb. 100 ⁇ L of Bradford reagent (manufactured by TAKARA) was added to 100 mL of each, allowed to stand at room temperature (25 ° C.) for 5 minutes, and then passed through a glass filter for 40 minutes. As the glass filter, “GF / F” (manufactured by Whatman, holding particle diameter: 0.7 ⁇ m, filtration diameter: 8 mm) was used. The blue color on the filter was measured with a color difference meter (CR-5, manufactured by Konica Minolta), and the b value obtained was evaluated.
  • a color difference meter CR-5, manufactured by Konica Minolta
  • Example 5-2 Milk allergen (casein Na) was diluted to prepare solutions of 0.1 ppm, 0.5 ppm, 1 ppm and 2 ppm. 100 ⁇ L of Bradford reagent (manufactured by TAKARA) was added to 10 mL of each, and the mixture was allowed to stand at room temperature (25 ° C.) for 5 minutes, and then passed through a glass filter for 5 seconds. As a glass filter, “GF / F” (manufactured by Whatman, holding particle diameter: 0.7 ⁇ m, filtration diameter: 15 mm) was used. The blue color on the filter was measured with a color difference meter (CR-5, manufactured by Konica Minolta), and the b value obtained was evaluated.
  • a color difference meter CR-5, manufactured by Konica Minolta
  • Example 5-1 The results of Example 5-1 are shown in FIG. 4 (A), and the results of Example 5-2 are shown in FIG. 4 (B). From the results, by using the detection method of the present invention, a wide range of concentrations of milk allergen could be detected, including low concentrations of milk allergen. Furthermore, the correlation between milk allergen concentration and b value could be confirmed.
  • Example 6-1 Egg allergen (ovalbumin) was diluted to prepare solutions of 10 ppb, 20 ppb, 50 ppb and 100 ppb. After that, the experiment was carried out in the same manner as in Example 5-1, and the blue color on the filter was measured with a color difference meter (CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.), and the b value obtained was evaluated.
  • ovalbumin ovalbumin
  • Example 6-2 egg allergen (ovalbumin) was diluted to prepare solutions of 0.25 ppm, 0.5 ppm, 1 ppm and 1.5 ppm. After that, the experiment was carried out in the same manner as in Example 5-2, and the blue color on the filter was measured with a color difference meter (CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.) and evaluated based on the obtained b value.
  • a color difference meter CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.
  • Example 6-1 The results of Example 6-1 are shown in FIG. 5 (A), and the results of Example 6-2 are shown in FIG. 5 (B). From the results, by using the detection method of the present invention, a wide range of concentrations of milk allergen could be detected, including low concentrations of egg allergen. Furthermore, the correlation between milk allergen concentration and b value could be confirmed.
  • Example 7 The wheat allergen (gliadin) was diluted to prepare a solution of 0.25 ppb, 0.5 ppb and 1 ppb. After that, the experiment was carried out in the same manner as in Example 5-1, and the blue color on the filter was measured with a color difference meter (CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.), and the b value obtained was evaluated.
  • a color difference meter CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.
  • Example 8 Buckwheat allergen (partially purified buckwheat protein) was diluted to prepare a solution of 10 ppb, 20 ppb and 30 ppb. After that, the experiment was carried out in the same manner as in Example 5-1, and the blue color on the filter was measured with a color difference meter (CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.), and the b value obtained was evaluated.
  • a color difference meter CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.
  • Example 9 The peanut allergen (partially purified peanut protein) was diluted to prepare a solution of 5 ppb, 10 ppb and 20 ppb. After that, the experiment was carried out in the same manner as in Example 5-1, and the blue color on the filter was measured with a color difference meter (CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.), and the b value obtained was evaluated.
  • a color difference meter CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.
  • Example 10 Crustacean allergen (Crustacea tropomyosin) was diluted to prepare solutions of 0.25 ppb, 0.5 ppb, 1 ppb, 2 ppb. After that, the experiment was carried out in the same manner as in Example 5-1, and the blue color on the filter was measured with a color difference meter (CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.), and the b value obtained was evaluated.
  • a color difference meter CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.
  • Example 11 The rinse water after washing the ice cream production facility was collected, and protein detection was carried out using a detection kit and a color judgment paper as shown in FIGS. 100 ⁇ L of Bradford reagent (manufactured by TAKARA) is added to 10 mL of rinse water, allowed to stand for 5 minutes at room temperature (25 ° C.), introduced into the sample introduction container 12, and the aspirator (not shown) is operated. The air in the storage container 14 was sucked to reduce pressure. As a result, the protein to be measured contained in the rinse solution was concentrated on the glass filter, and the filtrate was discharged from the filtrate outlet 124 into the filtrate container 14.
  • a detection kit and a color judgment paper as shown in FIGS. 100 ⁇ L of Bradford reagent (manufactured by TAKARA) is added to 10 mL of rinse water, allowed to stand for 5 minutes at room temperature (25 ° C.), introduced into the sample introduction container 12, and the aspirator (not shown) is operated. The air in the storage container 14 was
  • Table 2 also shows the b value of the glass filter after coloration measured with a color difference meter (CR-5, manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.). The time required for the detection (the time from the installation of the test instrument to the detection) was 10 minutes.
  • Table 2 also shows the results measured by the ELISA method. From Table 2, it was found that the above protein was an egg protein. Further, as a result of analysis of the rinse water by LC-MS / MS (liquid chromatography mass spectrometry), the egg protein in the rinse water was 1.9 ppm.
  • proteins in a liquid can be easily detected and measured.
  • allergens such as gelatin and collagen for which a simple measurement method is not known can be easily detected and measured while suppressing labor and cost.
  • the detection method of the present invention is very useful for grasping the amount of allergen in the rinse water after cleaning of manufacturing facilities in a factory, and the industrial applicability is extremely large.

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Abstract

本発明は、従来法に比べて手間やコストがかからない、簡便な液中たんぱく質の検出法を提供することを課題とする。本発明は、たんぱく質を、たんぱく質に特異的な呈色反応で呈色し、たんぱく質を吸着しやすいフィルターを用いて濾過することでたんぱく質をフィルター上に濃縮し、呈色を確認することで、たんぱく質を簡便に検出し、測定することができることを見出した。また、たんぱく質を、フィルターを用いて濾過して、たんぱく質をフィルター上で濃縮した後、たんぱく質に特異的な呈色反応で呈色させて確認することで、たんぱく質を簡便に検出し、測定することができることを見出した。

Description

たんぱく質検出法
　本発明は、たんぱく質の検出法、たんぱく質の濃度算出方法、及びたんぱく質の検出キットに関する。特に、本発明は、液中のたんぱく質の検出法、液中のたんぱく質の濃度算出方法、及び液中のたんぱく質の検出キットに関する。
　食品業界においては、ある食品製品中に含まれるアレルゲン（アレルギー性物質）が、別の食品製品に混入することを防ぐ目的で、製造設備等の洗浄後のすすぎ水中のアレルゲン量を把握する必要がある。一般に、アレルゲンはたんぱく質であることが多いことから、その検出や測定には、エンザイムイムノアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）が用いられている。しかし、ＥＬＩＳＡ法は、抗体を用いて特定のアレルゲンを検出する方法であり、検出や測定ができるたんぱく質が限られ、汎用性に欠ける。
　したがって、より多くのアレルゲンを簡便に検出できる方法の検討が広く実施されている。例えば、国際公開第２００４／０１１９４８号（特許文献１）には、ドットブロット法と蛍光染色法を組み合わせたたんぱく質の分析方法が記載されている。
国際公開第２００４／０１１９４８号
　これまでアレルゲン（たんぱく質）の検出法として、上述のように、ＥＬＩＳＡ法等が知られているが、操作が煩雑であり、キット等も必要で手間やコストがかかる。したがって、例えば食品の製造工場で日々実施される、製造設備等のすすぎ水の洗浄度確認の方法としては採用が難しい。
　一方、アレルゲン（たんぱく質）の簡便な検出法として濁度法が知られているが、この方法だと、たんぱく質以外の成分（油脂類等）による濁りもたんぱく質として検出されてしまい、製造設備等の過剰洗浄が必要となる。
　また、上記特許文献１に開示された技術では、蛍光染色法を実施するための特別な蛍光画像解析装置が必要なことや、サンプル調製から画像解析まで４～５時間も必要であり、食品製造現場での迅速なアレルゲン（たんぱく質）の検出が困難であるという問題点がある。
　そこで、本発明では、従来法に比べて手間やコストがかからない、簡便なたんぱく質の検出法を提供することを課題とする。さらに、本発明では、上記検出したたんぱく質の濃度を算出する方法、及び、簡便にたんぱく質の検出が可能な、たんぱく質の検出キットを提供することを課題とする。
　上記課題を解決するために、本発明者らは、簡便なたんぱく質の検出法を構築するべく、測定試料の前処理の方法などを見直して検討した。その結果、驚くべくことに、測定対象のたんぱく質を、当該たんぱく質に特異的な呈色反応で呈色した後、フィルターを用いて濾過することでたんぱく質をフィルター上に保持、濃縮し、呈色を目視又は色差計等で確認することで、低濃度のたんぱく質であっても、簡便に検出や測定ができることを見出した。
　また、測定対象のたんぱく質を、フィルターを用いて濾過し、フィルター上で濃縮した後、当該たんぱく質に特異的な呈色反応で呈色させて目視又は色差計等で確認することによっても、測定対象のたんぱく質を簡便に検出し、測定することができることを見出した。
　また、本発明者らは、サンプル中における測定対象のたんぱく質の濃度と、検出される測定対象のたんぱく質の呈色の色彩値との間に、一定の相関関係が存在することを見出した。したがって、測定対象のたんぱく質の濃度と、その色彩値との対応関係を示す検量線を事前に作成しておくことにより、測定により得られた色彩値から測定対象のたんぱく質の濃度を算出することができることを見出した。
　また、本発明者らは、上記簡便なたんぱく質の検出法を実施可能な、たんぱく質の検出キットを見出した。
　すなわち、本発明は、次の通りとなる。
［１］
　測定対象のたんぱく質を呈色させる呈色工程と、
　測定対象のたんぱく質をフィルターでろ過するろ過工程と、
　フィルター上の測定対象のたんぱく質の呈色を検出する検出工程とを
備えることを特徴とするたんぱく質の検出法。
［２］
　前記呈色工程、前記ろ過工程および前記検出工程をこの順で実施することを特徴とする、［１］に記載の検出法。
［３］
　前記ろ過工程、前記呈色工程および前記検出工程をこの順で実施することを特徴とする、［１］に記載の検出法。
［４］
　前記呈色工程が、前記測定対象のたんぱく質との結合により吸収波長がシフトする測定試薬を用い、前記測定対象のたんぱく質の呈色を行う、［１］から［３］のいずれか一つに記載の検出法。
［５］
　前記呈色工程が、ブラッドフォード法を用いて前記測定対象のたんぱく質を呈色させる呈色工程である、［４］に記載の検出法。
［６］
　前記ろ過工程が、前記測定対象のたんぱく質をガラスフィルターでろ過するろ過工程である、［１］から［５］のいずれか一つに記載の検出法。
［７］
　前記測定対象のたんぱく質が、食品の製造工場の洗浄時のすすぎ水中のたんぱく質である、請求項１から６のいずれか一つに記載の検出法。
［８］
　前記食品の製造工場の洗浄時のすすぎ水中のたんぱく質が、ゼラチンまたはコラーゲンである、［７］に記載の検出法。
［９］
　検出の所要時間が１時間以下であることを特徴とする、［１］から［８］のいずれか一つに記載の検出法。
［１０］
　測定対象のたんぱく質を呈色させる呈色工程と、
　測定対象のたんぱく質をフィルターでろ過するろ過工程と、
　フィルター上の測定対象のたんぱく質の呈色を検出する検出工程と、
　前記検出工程において検出された測定対象のたんぱく質の呈色について、その色彩値を測定する測定工程と、を含み、
　測定対象のたんぱく質の濃度と、その色彩値とが既知の複数の参照用サンプルを用いて、各参照用サンプル中の測定対象のたんぱく質の濃度と前記色彩値との対応関係を示す検量線を作成することにより、前記測定工程で測定される色彩値から測定対象のたんぱく質の濃度を算出することを特徴とする、
　たんぱく質の濃度算出方法。
［１１］
　測定対象のたんぱく質をブラッドフォード法により呈色させる呈色工程と、
　測定対象のたんぱく質をフィルターでろ過するろ過工程と、
　フィルター上の測定対象のたんぱく質の呈色を検出する検出工程と、
　前記検出工程において検出された測定対象のたんぱく質の呈色について、ＣＩＥ規格に準拠したＬ＊ａ＊ｂ＊表色系において定義されるｂ値を測定する測定工程と、を含み、
　測定対象のたんぱく質の濃度とＣＩＥ規格に準拠したＬ＊ａ＊ｂ＊表色系において定義されるｂ値とが既知である複数の参照用サンプルを用いて、各参照用サンプル中の測定対象のたんぱく質の濃度と前記ｂ値との対応関係を示す検量線を作成することにより、前記測定工程で測定されるｂ値から測定対象のたんぱく質の濃度を算出することを特徴とする、
　たんぱく質の濃度算出方法。
［１２］
　測定対象のたんぱく質を呈色させる呈色部と、
　測定対象のたんぱく質をフィルターでろ過するろ過部と、
　フィルター上の測定対象のたんぱく質の呈色を検出する検出部と、
を備え、前記フィルターの呈色状態から、前記たんぱく質の検出を可能に構成した、
たんぱく質の検出キット。
［１３］
　さらに、呈色判断紙を備え、
　前記呈色判断紙と前記検出部における呈色状態とを比較することによって、測定対象のたんぱく質の濃度を測定するための、
　前記［１２］に記載のたんぱく質の検出キット。
　本発明のたんぱく質の検出法および検出キットによれば、たんぱく質を簡便に検出し、測定することができる。特に、ゼラチンやコラーゲンのような、簡便な測定方法が知られていないアレルゲンや、その他種々のアレルゲンについても、手間やコストを抑えて簡便に検出し、測定することができる。
　また、本発明のたんぱく質の濃度算出方法によれば、サンプル中の種々のたんぱく質について、簡易にその濃度を算出することができる。
　また、本発明の検出法や本発明の検出キットを用いた検出においては、所要時間が最大でも１時間程度であるから、ＥＬＩＳＡ法や蛍光染色法等と比べて、たんぱく質を迅速に検出でき、例えば食品工場の製造ライン（製造設備）の洗浄性の良否判定などに大きく寄与できる。
実施例１において、３種類のフィルターを用いて、本発明の検出法で牛血清アルブミン溶液を測定し、青色の呈色を色差計でｂ値として測定した結果を示すグラフである。 実施例２において、呈色後の時間を変えて本発明の検出法で牛血清アルブミン溶液を測定し、青色の呈色を色差計でｂ値として測定した結果を示すグラフである。 実施例３において、本発明の検出法で様々なアレルゲンのたんぱく質（卵、牛乳、小麦、そば、落花生、甲殻類、ゼラチン、牛血清アルブミン）を測定し、青色の呈色を色差計でｂ値として測定した結果を示すグラフである。 図４（Ａ）、図４（Ｂ）は、実施例５において、乳アレルゲン（カゼイン）を測定し、青色の呈色を色差計でｂ値として測定した結果を示すグラフである。 図５（Ａ）、図５（Ｂ）は、実施例６において、卵アレルゲン（卵白アルブミン）を測定し、青色の呈色を色差計でｂ値として測定した結果を示すグラフである。 実施例７において、小麦アレルゲン（グリアジン）を測定し、青色の呈色を色差計でｂ値として測定した結果を示すグラフである。 実施例８において、そばアレルゲン（部分精製そばたんぱく質）を測定し、青色の呈色を色差計でｂ値として測定した結果を示すグラフである。 実施例９において、落花生アレルゲン（部分精製落花生たんぱく質）を測定し、青色の呈色を色差計でｂ値として測定した結果を示すグラフである。 実施例１０において、甲殻類アレルゲン（甲殻類トロポミオシン）を測定し、青色の呈色を色差計でｂ値として測定した結果を示すグラフである。 本発明の検出キットの一実施態様を説明するための図である。 本発明の検出キットの別の一実施態様を説明するための図である。 本発明の検出キットにおいて、たんぱく質の検出を可能とする呈色判断紙を説明するための図である。
　本発明の検出法は、呈色工程と、ろ過工程と、検出工程とを備える。
　まず、呈色工程について説明する。呈色工程は、測定対象のたんぱく質を呈色させる工程である。たんぱく質の呈色方法は、別途実施する検出工程で検出できるのであれば、その呈色の方法は制限されない。なかでも、測定対象のたんぱく質との結合により吸収波長がシフトする測定試薬を用い、上記測定対象のたんぱく質の呈色を行う方法が、本発明の効果を高める点で有利となる。
　上記たんぱく質の呈色方法の一例として、例えばブラッドフォード法が挙げられる。これは、酸性染料であるクマシーブリリアントブルーと測定対象のたんぱく質とが結合することで、その吸収波長が４６５ｎｍから５９５ｎｍ（茶色から青）へシフトすることを利用し、呈色したたんぱく質を定量する方法である。ブラッドフォード法による呈色は肉眼でも確認しやすく、検出が簡便になる。そのため、本発明の呈色工程では、ブラッドフォード法を用いることが好ましい。ブラッドフォード法としては、例えば、Ｔａｋａｒａ　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いることができる。
　つづいて、ろ過工程について説明する。ろ過工程は、測定対象のたんぱく質をフィルターでろ過し、そのフィルター上に保持して濃縮する工程である。ろ過するフィルターは、測定対象のたんぱく質を保持できるものであれば、特に制限されない。例えば、フィルター上に物理的に測定対象のたんぱく質を収集し濃縮できるもの（ガラスフィルター等）；フィルターに対し測定対象のたんぱく質を化学的に吸着できるもの；フィルターに対し測定対象のたんぱく質を電気的に吸着できるもの等を挙げることができる。本発明におけるろ過工程では、例えばガラスフィルターを用いることが好ましい。
　具体的には、ガラスフィルターの保持粒子径は０．３μｍ～１．６μｍが好ましく、０．３μｍ～１．０μｍがより好ましい。保持粒子径とは、ＪＩＳ　Ｚ　８９０１で規定された７種粉体分散水を自然ろ過した際に、９０％以上を保持できる粒子径を意味する。
　ガラスフィルターのろ過径は３ｍｍ以上が好ましく、５ｍｍ以上がより好ましく、７ｍｍ以上がさらに好ましい。また、４０ｍｍ以下が好ましく、３５ｍｍ以下がより好ましく、３３ｍｍ以下がさらに好ましい。ガラスフィルターのろ過径とは、ガラスフィルターのうち実際にサンプルをろ過する部分の直径を意味する。
　また、上記ガラスフィルターの条件を満たす場合、通液量は１０ｍｌ～１００ｍｌが好ましい。また、通液時間はサンプルの濃度や通液する流速に従って適宜調整することができ、通常５秒～４０分である。
　また、ろ過の方法は特に制限されず、例えば、自然ろ過、減圧ろ過、加圧ろ過、遠心ろ過等が挙げられる。低濃度のたんぱく質を、簡便に検出し、測定ができるという観点からは、吸引ろ過による減圧ろ過を行うことが好ましい。
　つづいて、検出工程について説明する。検出工程は、呈色後のフィルター上の測定対象のたんぱく質を検出する工程である。検出工程では、上記呈色工程およびろ過工程により、フィルター上で呈色した測定対象のタンパク質が保持、濃縮されることで、測定対象のたんぱく質の検出が可能となる。検出方法は、通常、呈色方法にあわせた最適な方法で実施される。例えば、上記タンパク質が保持、濃縮されたフィルターに対し、分光光度計や色差計を用いて実施できる。また、後述するように呈色判断紙を用いて実施してもよい。
　本発明の検出法の一実施態様としては、呈色工程、ろ過工程、検出工程の順で実施する。この場合、具体的には、測定対象のたんぱく質を、当該たんぱく質に特異的な呈色反応で呈色し、フィルターを用いてろ過し、フィルター上に濃縮された測定対象のたんぱく質について、その呈色を目視や色差計等で検出（確認）する。上記順で実施することにより微量なたんぱく質の目視判定や数値化ができるという利点がある。
　また、本発明の検出法の他の実施形態では、ろ過工程、呈色工程、検出工程の順で実施する。この場合、具体的には、測定対象のたんぱく質を、フィルターを用いてろ過し、フィルター上に濃縮された測定対象のたんぱく質について、当該たんぱく質に特異的な呈色反応で呈色し、その呈色を目視や色差計等で検出（確認）する。上記順で実施することにより、たんぱく質に結合していない余分な色素をフィルター上から除くことができるという利点がある。
　本発明の検出法は、特に、食品の製造工場での日々実施されるすすぎ水の洗浄度確認の方法として、非常に有用である。ＥＬＩＳＡ法や濁度法、蛍光染色法等の従来法に比べて、手間やコストがかからず、非常に簡便で迅速にすすぎ水のアレルゲンのたんぱく質を検出できる。具体的には、本発明の検出法によれば、検出の所要時間を１時間以下とすることができる。なお、検出の所要時間とは、試験器具を設置するところから検出結果が出るまでの時間を意味する。また、後述するキットによれば、検出の所要時間をさらに短縮することができる。
　本発明の検出法で検出できる測定対象のアレルゲン（たんぱく質）の種類は、特に制限されるものではないが、例えば、ゼラチン、及びコラーゲンの他、卵、牛乳、小麦、そば、落花生、及び甲殻類に含有されるアレルゲン等が挙げられる。具体的には、卵白アルブミン、カゼイン、グリアジン、部分精製そばたんぱく質、部分精製落花生たんぱく質、甲殻類トロポミオシン等が挙げられる。
　本発明の検出法は、特に、測定対象のアレルゲン（たんぱく質）として、ゼラチンまたはコラーゲンの検出に非常に有用である。例えばゼラチンやコラーゲンの測定機器（例えばＨＰＬＣ）による検出限界は４０ｐｐｂと言われている。しかし、本発明の検出法によれば、１～３０ｐｐｂの濃度のゼラチンも検出が可能である。したがって、これまで検出困難だったアレルゲンのたんぱく質であるゼラチンやコラーゲンの検出に、本発明は非常に有用である。
　また、他のたんぱく質（乳アレルゲンや卵アレルゲン等）についても、低濃度を含む、広範囲の濃度において検出が可能となる。
　本発明の検出法に用いるサンプルは特に制限されるものではないが、液体であることが好ましい。液体としては、例えば、工場用水、特に、食品工場の製造設備の洗浄に用いたすすぎ水が、本発明の効果の観点から好ましく用いられる。
　また、本発明の検出法は、適当な中和剤を、測定対象に事前に添加しておくことで、例えば工場用水のような塩素濃度が高い溶液でも、適用できる。中和剤は、例えばアスコルビン酸ナトリウムや、チオ硫酸ナトリウム等を好適に使用できる。
　また、本発明は、上記検出法における呈色工程、ろ過工程、検出工程に加え、検出工程において検出された測定対象のたんぱく質の呈色状態について、その色彩値を測定する測定工程を経ることにより、サンプル中における測定対象のアレルゲン（たんぱく質）の濃度を算出する方法を提供する。
　本発明者らの検討によれば、後述する実施例で示すとおり、サンプル中における測定対象のアレルゲン（たんぱく質）の濃度と、上述した検出工程で検出される測定対象のたんぱく質の呈色の色彩値との間に、一定の相関関係が存在することが判明した。特に、測定対象のアレルゲン（たんぱく質）の濃度と、測定対象のたんぱく質の呈色の色彩値との間には線型（一次関数）の関係が存在することが分かった。
　したがって、測定対象のたんぱく質の濃度とその色彩値とが既知である複数の参照用サンプルを用いて、各参照用サンプル中の測定対象のたんぱく質の濃度と上記色彩値との対応関係を示す検量線を、事前に作成しておくことにより、測定により得られた色彩値から測定対象のたんぱく質の濃度を算出することが可能となる。
　上記色彩値の測定は、測定対象のたんぱく質を呈色する方法にもよるが、適宜公知の方法により実施することができ、とくに制限されるものではない。例えばＬ＊ａ＊ｂ＊表色系、Ｌ＊ｃ＊ｈ＊表色系、Ｌ＊ｕ＊ｖ＊表色系、ハンターＬａｂ表色系、ＸＹＺ（Ｙｘｙ）表色系、マンセル表色系等により行うことができる。
　これらの色彩値は、色彩色差計により測定可能である。また、例えば、種々の色彩値ごとに作成した呈色判断紙と、実際のたんぱく質の呈色状態を比較することによって、測定対象のたんぱく質の色彩値を求めてもよい。
　本発明のたんぱく質の濃度算出方法においては、特に、呈色反応としてブラッドフォード法を採用し、かつ、上記色彩値がＣＩＥ規格に準拠したＬ＊ａ＊ｂ＊表色系において定義されるｂ値であることが好ましい。Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系は、ＪＩＳ　Ｚ８７２９においても採用されている。
　上記ｂ値は、色彩色差計により測定可能である。また、例えば、種々のｂ値ごとに作成された呈色判断紙と、実際のたんぱく質の呈色状態を比較することによって、測定対象のたんぱく質のｂ値を求めてもよい。図１２は、呈色判断紙の一例を示す図である。呈色判断紙７０は、例えば（ａ）～（ｄ）のように無色から濃青色まで着色されたろ紙を擬似的に示しており、それぞれｂ値が割り当てられている（図示せず）。呈色判断紙の枚数は制限されず、その枚数は多いほど、多くのｂ値が割り当てられることになるため、より正確にｂ値を求めることができ、好ましい。このようにして得られたｂ値を、事前に作成しておいた上記検量線に適用することにより、測定対象のたんぱく質の濃度を算出することができる。
　本発明の濃度算出方法によれば、測定対象のたんぱく質の種類にもよるが、濃度が０．２５ｐｐｂ程度であっても、測定された色彩値を上記検量線に適用することにより、サンプル中の測定対象のたんぱく質濃度を算出することができる。好ましくは、例えば、０．２５ｐｐｂ以上、０．５ｐｐｂ以上、１ｐｐｂ以上、２ｐｐｂ以上、５ｐｐｂ以上、１０ｐｐｂ以上、等である。なお上限については特に制限はないが、例えば、２０００ｐｐｍ以下である。
　また、本発明の検出法は、例えば、呈色工程に使用する呈色剤等と、ろ過工程に使用するフィルターと、必要に応じて検出工程に使用する検出剤や、検出の判定に用いるゲージ等を組み合わせて、たんぱく質の検出用のキットとして製品化することもできる。この場合、実験器具や資材等が揃っていない状況でも、本発明の検出法を簡便で迅速に使用でき、特に工場での使用に非常に好適である。
　具体的に、本発明の検出キットの一実施形態は、図１０に示すように、測定対象のたんぱく質をろ過、保持、濃縮するフィルター１２３と、サンプル導入容器１２と、呈色工程に使用する呈色剤１３とを備える。また、測定対象のたんぱく質の濃度を測定するための、呈色判断紙を備えていてもよい。上述したとおり、当該呈色判断紙とフィルター上で検出されるたんぱく質の呈色状態とを比較することによって、測定対象のたんぱく質の濃度を測定することが可能となる。
　以下、サンプルをすすぎ液として、上記検出キット１０の使用方法について説明する。
　まず、サンプルであるすすぎ液を、サンプル導入容器１２内に導入する。サンプル導入容器１２には、あらかじめ呈色剤１３を収納しておくことで、すすぎ液をサンプル導入容器１２に導入すると同時に、すすぎ液が呈色剤と混合するようにしておいてもよく（図１０）、あるいは、すすぎ液をサンプル導入容器１２に充填してから、呈色剤１３をサンプル導入容器１２中のすすぎ液に添加してもよい。あるいは、この時点では呈色剤を使用せず、後述するろ過後の呈色工程において使用してもよい。
　つづいて、フィルター１２３をサンプル導入容器１２の上部付近に固定する。その後、サンプルのすすぎ液を、任意の方法でフィルターに通液させ、ろ過を行うことによって、フィルターに測定対象のたんぱく質を保持、濃縮させる。なお、この時点で、まだ呈色剤１３を使用していない場合は、フィルター上に保持、濃縮された測定対象のたんぱく質に対して、呈色剤１３を適用してもよい。当該適用方法は呈色剤１３の種類に応じて適宜選択できる。これにより、フィルターに保持、濃縮された測定対象のたんぱく質の検出が可能となる。
　また、本発明の検出キットは、測定対象のたんぱく質を呈色させる呈色部と、測定対象のたんぱく質をフィルターでろ過するろ過部と、フィルター上の測定対象のたんぱく質の呈色を検出する検出部と、を備えており、上記フィルターの呈色状態から、上記たんぱく質の検出を可能に構成されたものともいえる。また、上述した呈色判断紙を備えていてもよい。
　本発明の検出キットの別の実施形態としては、複数のサンプル中のたんぱく質を同時に検出すべく、サンプル導入容器１２を複数備えた態様が挙げられる。具体的には、例えば図１１に示すように、検出キット１１は、サンプル導入容器１２と、フィルター１２３と、ろ液収容容器１４と、減圧口１６と、ろ液排出口１８とを備える。なお、図１１中、サンプル導入容器１２は１つのみ図示しているが、必要に応じて複数個備えていてもよい。
　まず、工場からサンプリングした、例えば複数のすすぎ液をサンプル導入容器１２内にそれぞれ導入する。サンプル導入容器の下方には、例えばフィルター固定器１２２が設けられ、ここにガラスフィルター等のフィルターが設置される。減圧口１６と図示しないアスピレータとを接続し、ろ液収容容器１４内を減圧することにより、すすぎ液に含まれる測定対象のたんぱく質はガラスフィルター上に濃縮されるとともに、ろ液はろ液出口１２４からろ液収容容器１４内に排出される。ろ液排出口１８は通常閉塞しており、ろ液収容容器１４内のろ液の貯水量が増加した場合には、適宜ろ液排出口１８を開放し、ろ液をろ液収容容器１４の外部に排出する。
　呈色剤がブラッドフォード試薬である場合、その添加手順は、例えば、所定量でもってすすぎ液に予めブラッドフォード試薬を添加し、その後サンプル導入容器１２内に導入する；サンプル導入容器１２内にすすぎ液を導入し、そこにブラッドフォード試薬を添加する；又は、すすぎ液のろ過終了後のガラスフィルターにブラッドフォード試薬を添加する、等が挙げられる。
　上記工程が終了した後は、例えば、ガラスフィルターを取り出し、事前に準備した図１２に示す呈色判断紙と比較し、測定対象のたんぱく質の濃度を測定することもできる。これとは別に、取り出したガラスフィルターのｂ値を直接色差計により測定し、上記検量線から測定対象のたんぱく質の濃度を算出してもよい。
　以下、実施例に基づいて、本発明をより具体的に説明する。なお、この実施例は、本発明を限定するものではない。
　［実施例１］
　２ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）標準試薬（ＴＡＫＡＲＡ社製）を希釈し、０．０５ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、０．１５ｐｐｍのＢＳＡ溶液を調製した。それぞれの１０ｍＬに対し、ブラッドフォード試薬（ＴＡＫＡＲＡ社製）１００μＬを加え、室温（２５℃）で５分静置後、ガラスフィルターに５秒かけて通液した。ガラスフィルターは、「ＧＦ－７５」（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、保持粒子径：０．３μｍ）、「ＧＦ／Ｆ」（Ｗｈａｔｍａｎ社製、保持粒子径：０．７μｍ）、「ＧＦ／Ｂ」（Ｗｈａｔｍａｎ社製、保持粒子径：１．０μｍ）の３種類を用意して検討に用いた。フィルター上の青色の呈色を色差計（ＣＲ－５、コニカミノルタ社製）で測定し、得られたｂ値で評価した。
　結果を図１に示した。検討に用いたいずれのガラスフィルターにおいても青色の着色が認められ、かつ、着色はＢＳＡ濃度依存性を示した（すなわち、ＢＳＡの濃度に依存して着色が進行した）。したがって、本発明の検出法により、簡便に液中のたんぱく質を検出できることが判明した。
　［実施例２］
　実施例１と同様の方法で、０．１ｐｐｍＢＳＡ溶液を調製し、その１０ｍＬに対し、ブラッドフォード試薬（ＴＡＫＡＲＡ社製）１００μＬを加え、室温（２５℃）で５分静置後、ガラスフィルター「ＧＦ／Ｂ」（Ｗｈａｔｍａｎ社製）に５秒かけて通液した。フィルター上の青色の呈色を色差計（ＣＲ－５、コニカミノルタ社製）で通液時から０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５、９０、１０５分後にそれぞれ測定し、得られたｂ値で評価した。
　結果を図２に示した。結果より、通液後すぐに安定して青色が呈色され、６０分までは安定した青色の呈色が認められた。したがって、本発明の検出法により、迅速に液中のたんぱく質を検出できることが判明した。また、６０分以内に測定すれば退色しないことが判明した。
　［実施例３］
　アレルゲン特定原材料６品目（卵：卵白アルブミン、牛乳：カゼイン、小麦：グリアジン、そば：部分精製そばたんぱく質、落花生：部分精製落花生たんぱく質、甲殻類：甲殻類トロポミオシン）のたんぱく質とゼラチン、及びＢＳＡの１ｐｐｍ溶液を用意し、それぞれの１０ｍＬに対し、ブラッドフォード試薬（ＴＡＫＡＲＡ社製）１００μＬを加え、室温（２５℃）で５分静置後、ガラスフィルター「ＧＦ／Ｂ」（Ｗｈａｔｍａｎ社製）に５秒かけて通液した。フィルター上の青色の呈色を色差計（ＣＲ－５、コニカミノルタ社製）で測定し、得られたｂ値で評価した。
　結果を図３に示した。結果より、いずれのアレルゲンのたんぱく質でも本発明の検出法で検出できた。したがって、本発明の検出法により、様々な種類の液中のたんぱく質を検出できることが判明した。
　［実施例４］
　ゼラチンの１０ｐｐｂ、１００ｐｐｂ溶液を用意し、それぞれの１００ｍＬに対し、ブラッドフォード試薬（ＴＡＫＡＲＡ社製）１ｍＬを加え、室温（２５℃）で５分静置後、ガラスフィルター「ＧＦ／Ｂ」（Ｗｈａｔｍａｎ社製）に４０分間かけて通液した。通液時のガラスフィルター「ＧＦ／Ｂ」のろ過径は、１０ｐｐｂ溶液測定時では８ｍｍ、１００ｐｐｂ溶液測定時では３３ｍｍとした。フィルター上の青色の呈色を色差計（ＣＲ－５、コニカミノルタ社製）で測定し、得られたｂ値で評価した。色差測定の色差計の測定口径は、１０ｐｐｂ溶液測定時では３ｍｍ、１００ｐｐｂ溶液測定時では３０ｍｍとした。
　結果を表１に示した。結果より、検出が難しいことが知られているゼラチンでも、本発明の検出法で問題なく検出できた。したがって、本発明の検出法により、従来法では検出困難な液中のたんぱく質を検出できることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　［実施例５］
（実施例５－１）
　乳アレルゲン（カゼインＮａ）を希釈し、１０ｐｐｂ、２０ｐｐｂ、３０ｐｐｂ、４０ｐｐｂ、５０ｐｐｂ、１００ｐｐｂの溶液を調製した。それぞれの１００ｍＬに対し、ブラッドフォード試薬（ＴＡＫＡＲＡ社製）１００μＬを加え、室温（２５℃）で５分静置後、ガラスフィルターに４０分かけて通液した。ガラスフィルターは、「ＧＦ／Ｆ」（Ｗｈａｔｍａｎ社製、保持粒子径：０．７μｍ、ろ過径：８ｍｍ）を用いた。フィルター上の青色の呈色を色差計（ＣＲ－５、コニカミノルタ社製）で測定し、得られたｂ値で評価した。
（実施例５－２）
　乳アレルゲン（カゼインＮａ）を希釈し、０．１ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、２ｐｐｍの溶液を調製した。それぞれの１０ｍＬに対し、ブラッドフォード試薬（ＴＡＫＡＲＡ社製）１００μＬを加え、室温（２５℃）で５分静置後、ガラスフィルターに５秒かけて通液した。ガラスフィルターは、「ＧＦ／Ｆ」（Ｗｈａｔｍａｎ社製、保持粒子径：０．７μｍ、ろ過径：１５ｍｍ）を用いた。フィルター上の青色の呈色を色差計（ＣＲ－５、コニカミノルタ社製）で測定し、得られたｂ値で評価した。
　実施例５－１の結果を図４（Ａ）、実施例５－２の結果を図４（Ｂ）に示した。結果より、本発明の検出法を用いることにより、低濃度の乳アレルゲンを含む、広範囲の濃度の乳アレルゲンを検出できた。さらに、乳アレルゲン濃度とｂ値との相関性を確認できた。
　［実施例６］
　（実施例６－１）
　卵アレルゲン（卵白アルブミン）を希釈し、１０ｐｐｂ、２０ｐｐｂ、５０ｐｐｂ、１００ｐｐｂの溶液を調製した。それ以降は実施例５－１と同様に実験を行い、フィルター上の青色の呈色を色差計（ＣＲ－５、コニカミノルタ社製）で測定し、得られたｂ値で評価した。
　（実施例６－２）
　また、卵アレルゲン（卵白アルブミン）を希釈し、０．２５ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、１．５ｐｐｍの溶液を調製した。それ以降は実施例５－２と同様に実験を行い、フィルター上の青色の呈色を色差計（ＣＲ－５、コニカミノルタ社製）で測定し、得られたｂ値で評価した。
　実施例６－１の結果を図５（Ａ）、実施例６－２の結果を図５（Ｂ）に示した。結果より、本発明の検出法を用いることにより、低濃度の卵アレルゲンを含む、広範囲の濃度の乳アレルゲンを検出できた。さらに、乳アレルゲン濃度とｂ値との相関性を確認できた。
　［実施例７］
　小麦アレルゲン（グリアジン）を希釈し、０．２５ｐｐｂ、０．５ｐｐｂ、１ｐｐｂの溶液を調製した。それ以降は実施例５－１と同様に実験を行い、フィルター上の青色の呈色を色差計（ＣＲ－５、コニカミノルタ社製）で測定し、得られたｂ値で評価した。
　結果を図６に示した。結果より、本発明の検出法を用いることにより、低濃度の小麦アレルゲンを検出できた。さらに、小麦アレルゲン濃度とｂ値との相関性を確認できた。
　［実施例８］
　そばアレルゲン（部分精製そばたんぱく質）を希釈し、１０ｐｐｂ、２０ｐｐｂ、３０ｐｐｂの溶液を調製した。それ以降は実施例５－１と同様に実験を行い、フィルター上の青色の呈色を色差計（ＣＲ－５、コニカミノルタ社製）で測定し、得られたｂ値で評価した。
　結果を図７に示した。結果より、本発明の検出法を用いることにより、低濃度のそばアレルゲンを検出できた。さらに、そばアレルゲン濃度とｂ値との相関性を確認できた。
　［実施例９］
　落花生アレルゲン（部分精製落花生たんぱく質）を希釈し、５ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、２０ｐｐｂの溶液を調製した。それ以降は実施例５－１と同様に実験を行い、フィルター上の青色の呈色を色差計（ＣＲ－５、コニカミノルタ社製）で測定し、得られたｂ値で評価した。
　結果を図８に示した。結果より、本発明の検出法を用いることにより、低濃度の落花生アレルゲンを検出できた。さらに、落花生アレルゲン濃度とｂ値との相関性を確認できた。
　［実施例１０］
　甲殻類アレルゲン（甲殻類トロポミオシン）を希釈し、０．２５ｐｐｂ、０．５ｐｐｂ、１ｐｐｂ、２ｐｐｂの溶液を調製した。それ以降は実施例５－１と同様に実験を行い、フィルター上の青色の呈色を色差計（ＣＲ－５、コニカミノルタ社製）で測定し、得られたｂ値で評価した。
　結果を図９に示した。結果より、本発明の検出法を用いることにより、低濃度の甲殻類アレルゲンを検出できた。さらに、甲殻類アレルゲン濃度とｂ値との相関性を確認できた。
　［実施例１１］
　アイスクリーム製造設備を洗浄した後のすすぎ水を採取し、図１１および１２に示すような検出キットおよび呈色判断紙を用い、たんぱく質の検出を行った。
　すすぎ水の１０ｍＬにブラッドフォード試薬（ＴＡＫＡＲＡ社製）１００μＬを加え、室温（２５℃）で５分静置後、サンプル導入容器１２に導入し、図示しないアスピレータを稼働させ、減圧口１６からろ液収容容器１４内の空気を吸引し、減圧状態とした。これにより、すすぎ液に含まれる測定対象のたんぱく質はガラスフィルター上に濃縮されるとともに、ろ液はろ液出口１２４からろ液収容容器１４内に排出された。なお、ガラスフィルターは、「ＧＦ／Ｆ」（Ｗｈａｔｍａｎ社製、保持粒子径：０．７μｍ、ろ過径１５ｍｍ）を用いた。上記工程完了後、ガラスフィルターを取り出し、ガラスフィルター上の青色の呈色を、呈色判断紙７０の（ａ）～（ｄ）と比較した。その結果、ガラスフィルターの青色の呈色は、呈色判断紙７０の（ｃ）とほぼ同じであり、事前に上記と同条件の工程を行って調べておいた（ｃ）のたんぱく質濃度から、すすぎ水中のたんぱく質濃度は、約１．４ｐｐｍであることが判明した。
　上記結果を表２に示す。なお表２では、色差計（ＣＲ－５、コニカミノルタ社製）で測定した呈色後のガラスフィルターのｂ値も併せて示した。なお、検出に要した時間（試験器具設置から検出までの時間）は１０分であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２では、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果も示した。表２から、上記たんぱく質は卵たんぱく質であることが分かった。また、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析法）によりすすぎ水を分析した結果、すすぎ水中の卵たんぱく質は１．９ｐｐｍであった。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更及び変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１７年１１月１０日付で出願された日本特許出願（特願２０１７－２１６９０９）に基づいており、その全体が引用により援用される。
　本発明によれば、液中のたんぱく質を簡便に検出し、測定することができる。特に、ゼラチンやコラーゲンのような、簡便な測定方法が知られていないアレルゲンでも、手間やコストを抑えて簡便に検出し、測定することができる。特に食品業界において、工場での製造設備の洗浄後のすすぎ水中のアレルゲン量を把握するために、本発明の検出法は非常に有用であり、産業上の利用可能性は極めて大きい。
１０，１１　検出キット
１２　サンプル導入容器
１２２　フィルター固定器
１２３　フィルター
１２４　ろ液出口
１３　呈色剤
１４　ろ液収容容器
１６　減圧口
１８　ろ液排出口
７０　呈色判断紙

Claims (13)

  1. 　測定対象のたんぱく質を呈色させる呈色工程と、
    　測定対象のたんぱく質をフィルターでろ過するろ過工程と、
    　フィルター上の測定対象のたんぱく質の呈色を検出する検出工程とを
    備えることを特徴とするたんぱく質の検出法。
  2. 　前記呈色工程、前記ろ過工程および前記検出工程をこの順で実施することを特徴とする、請求項１に記載の検出法。
  3. 　前記ろ過工程、前記呈色工程および前記検出工程をこの順で実施することを特徴とする、請求項１に記載の検出法。
  4. 　前記呈色工程が、前記測定対象のたんぱく質との結合により吸収波長がシフトする測定試薬を用い、前記測定対象のたんぱく質の呈色を行う、請求項１から３のいずれか一項に記載の検出法。
  5. 　前記呈色工程が、ブラッドフォード法を用いて前記測定対象のたんぱく質を呈色させる呈色工程である、請求項４に記載の検出法。
  6. 　前記ろ過工程が、前記測定対象のたんぱく質をガラスフィルターでろ過するろ過工程である、請求項１から５のいずれか一項に記載の検出法。
  7. 　前記測定対象のたんぱく質が、食品の製造工場の洗浄時のすすぎ水中のたんぱく質である、請求項１から６のいずれか一項に記載の検出法。
  8. 　前記食品の製造工場の洗浄時のすすぎ水中のたんぱく質が、ゼラチンまたはコラーゲンである、請求項７に記載の検出法。
  9. 　検出の所要時間が１時間以下であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の検出法。
  10. 　測定対象のたんぱく質を呈色させる呈色工程と、
    　測定対象のたんぱく質をフィルターでろ過するろ過工程と、
    　フィルター上の測定対象のたんぱく質の呈色を検出する検出工程と、
    　前記検出工程において検出された測定対象のたんぱく質の呈色について、その色彩値を測定する測定工程と、を含み、
    　測定対象のたんぱく質の濃度と、その色彩値とが既知の複数の参照用サンプルを用いて、各参照用サンプル中の測定対象のたんぱく質の濃度と前記色彩値との対応関係を示す検量線を作成することにより、前記測定工程で測定される色彩値から測定対象のたんぱく質の濃度を算出することを特徴とする、
    　たんぱく質の濃度算出方法。
  11. 　測定対象のたんぱく質をブラッドフォード法により呈色させる呈色工程と、
    　測定対象のたんぱく質をフィルターでろ過するろ過工程と、
    　フィルター上の測定対象のたんぱく質の呈色を検出する検出工程と、
    　前記検出工程において検出された測定対象のたんぱく質の呈色について、ＣＩＥ規格に準拠したＬ＊ａ＊ｂ＊表色系において定義されるｂ値を測定する測定工程と、を含み、
    　測定対象のたんぱく質の濃度とＣＩＥ規格に準拠したＬ＊ａ＊ｂ＊表色系において定義されるｂ値とが既知である複数の参照用サンプルを用いて、各参照用サンプル中の測定対象のたんぱく質の濃度と前記ｂ値との対応関係を示す検量線を作成することにより、前記測定工程で測定されるｂ値から測定対象のたんぱく質の濃度を算出することを特徴とする、
    　たんぱく質の濃度算出方法。
  12. 　測定対象のたんぱく質を呈色させる呈色部と、
    　測定対象のたんぱく質をフィルターでろ過するろ過部と、
    　フィルター上の測定対象のたんぱく質の呈色を検出する検出部と、
    を備え、前記フィルターの呈色状態から、前記たんぱく質の検出を可能に構成した、
    たんぱく質の検出キット。
  13. 　さらに、呈色判断紙を備え、
    　前記呈色判断紙と前記検出部における呈色状態とを比較することによって、測定対象のたんぱく質の濃度を測定するための、
    　請求項１２に記載のたんぱく質の検出キット。
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