JP5155453B2 - タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのタンパク質漏出を定量するための方法 - Google Patents

Description

（関連出願）
本出願は、２００８年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／１９２，０８２号の優先権の利益を主張するものである。この全内容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

（発明の分野）
本発明は、限定されないが、プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む、タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのタンパク質漏出を定量するための方法に関する。

（背景）
タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質、ＤＮＡおよび他の化学分子および生物分子の精製に、実験室規模から、パイロット規模、生産規模までの範囲に及ぶ種々の規模で、幅広く使用されている。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ他、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、３１７−３４６頁（１９９２）を参照されたい。これらの中で、プロテインＡ（ＰｒＡ）、プロテインＧ（ＰｒＧ）およびプロテインＬ（ＰｒＬ）をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、免疫グロブリン（Ｉｇ）の検出および／または精製のための、よく知られており幅広く使用されている方法であるが、それらはそれぞれ、Ｉｇとの結合に関して異なる特異性を有する。

例として、ＰｒＡをベースとする試薬は、バイオテクノロジーの分野において、例えば、抗体の捕捉および精製のためのアフィニティークロマトグラフィーにおいてならびに抗体検出方法において、広範囲に及ぶ使用を特に見出されている。現在において、ＰｒＡをベースとするアフィニティー媒質または樹脂は恐らく、細胞培養物を含む種々のサンプルからモノクロナール抗体およびこれらの断片を単離するための、最も幅広く使用されているアフィニティー媒質である。したがって、プロテインＡ−リガンドを含む種々のマトリックスが市販されており、これには例えば、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）−ｖＡ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）ｖＡ ＵｌｔｒａおよびＰｒｏＳｅｐ（登録商標）ＵｌｔｒａＰｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ならびにＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ｒｍｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（商標）およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｐｏｒｏｓ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ならびにＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）が含まれる。

Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ他、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、３１７−３４６頁（１９９２）

（発明の要旨）
タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂、例えば、プロテインＡ、ＧおよびＬをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、これらに結合する分析物または分子、例えば、ＰｒＡ、ＰｒＧおよびＰｒＬの場合には免疫グロブリン（Ｉｇ）の精製に非常に望ましいが、１つの欠点は、クロマトグラフィーカラムから、関心対象の分析物または分子、例えば、免疫グロブリンと一緒に、タンパク質、例えば、プロテインＡ、ＧまたはＬが漏出することである。例えば、プロテインＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィーは、例えば、高い捕集容量で抗体を特異的に結合させるその能力のために、抗体の大規模精製におよび高純度を達成するのに非常に望ましいが、それ自体の生物活性および毒性学プロフィールのために、浸出されたＰｒＡは通常、免疫グロブリン溶出液中の望ましくない不純物と考えられている。したがって、本発明のいくつかの態様において、ＰｒＡ漏出をモニターし、その後のクロマトグラフィーステップにおいて、最後にそれを除去することが望ましい。例えば、ＰｒＡ漏出を最小限に抑えるための１つのやり方は、クロマトグラフィーカラムからの最小量のＰｒＡ漏出を示すＰｒＡ樹脂を使用することである。したがって、いくつかの態様において、本発明の方法は、クロマトグラフィーカラムからの最小量の漏出を示す、限定されないが、ＰｒＡ、ＰｒＧおよびＰｒＬをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む、タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂を明らかにするために使用され得る。そのようなタンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、知られている樹脂および将来開発され得る樹脂を含む。

多くの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づいたスクリーニングアッセイが、クロマトグラフィーカラムからのＰｒＡ漏出を検出するために開発されている。しかし、これらのアッセイの多くは、アフィニティークロマトグラフィーおよびその後のクロマトグラフィーステップの後に、例えば、ＰｒＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂の比較を提供するための、最小量のＰｒＡ漏出を示す樹脂を明らかにするためのおよび抗体溶出プール中に浸出されたＰｒＡをモニターするための分析ツールとして適しているにしては、事実上定性的であり、一般に、より高い変動性（例えば、２５％以上）を示す。

蛍光タグは、そのようなタグに伴う高感度および高選択性のために、生化学および化学の研究において幅広く使用されている。例えば、アフィニティー樹脂から浸出されたプロテインＡは、これまで蛍光色素を使用して検出されてきたが、そのような色素は、定性的な情報を生み出すために、例えば検出するために普通は使用されており、いずれの定量的な情報も、例えば、浸出されたＰｒＡの量をもたらさない。例えば、Ｃａｒｔｅｒ−Ｆｒａｎｋｌｉｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、１１６３：１０５−１１１頁（２００７）を参照されたい。

本発明は、少なくとも１つには、例えば、蛍光タグを使用して、クロマトグラフィー媒質または樹脂からのタンパク質の漏出、例えば、ＰｒＡの漏出を検出するための定量的な方法に関する。本発明による方法は、１０％未満の変動性を示し、最小量のＰｒＡ漏出を示すＰｒＡクロマトグラフィー樹脂を明らかにするのに特に適している。

本発明による一態様において、（ａ）ＰｒＡをベースとするクロマトグラフィー樹脂を、１種以上の蛍光タグで標識するステップ；（ｂ）標識された樹脂を、同等の第１および第２の部分に分割するステップ；（ｃ）第１の部分を適した手段を用いて処理し、標識されたＰｒＡを樹脂から解離させ、第２の部分に過剰量のＩｇを加えるステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）における第１の部分中の処理された樹脂から、蛍光（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）およびＰｒＡ濃度（［ＰｒＡ］）を測定するステップ；ならびに（ｅ）ステップ（ｃ）における第２の部分からのＩｇ溶出液中の樹脂Ｉｇ溶出濃度（［Ｉｇ］）および蛍光シグナル（ＦＬ_Ｉｇ）を測定するステップを含み、ＰｒＡ漏出は、｛（ＦＬ_Ｉｇ）／（（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）／［ＰｒＡ］）｝／［Ｉｇ］を計算することによって定量される、ＰｒＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのＰｒＡ漏出を定量するための方法が提供される。

本発明による別の態様において、（ａ）ＰｒＡをベースとするクロマトグラフィー樹脂を、１種以上の蛍光タグで標識するステップ；（ｂ）標識された樹脂に過剰量のＩｇを加え、樹脂からのＩｇ溶出液（ＦＬ_Ｉｇ）中の樹脂Ｉｇ溶出濃度（［Ｉｇ］）および蛍光シグナルを測定するステップ；（ｃ）残余のＩｇを樹脂から除去した後、樹脂を適した手段を用いて処理し、標識されたＰｒＡを樹脂から解離させるステップ；ならびに（ｄ）処理された樹脂から、蛍光（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）およびＰｒＡ濃度（［ＰｒＡ］）を測定するステップを含み、ＰｒＡ漏出は、｛（ＦＬ_Ｉｇ）／（（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）／［ＰｒＡ］）｝／［Ｉｇ］を計算することによって定量される、ＰｒＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのＰｒＡ漏出を定量するための方法が提供される。

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＰｒＧをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのプロテインＧ（ＰｒＧ）の漏出を定量するために使用される。

したがって、本発明によるさらに別の態様において、（ａ）ＰｒＧをベースとするクロマトグラフィー樹脂を、１種以上の蛍光タグで標識するステップ；（ｂ）標識された樹脂を、同等の第１および第２の部分に分割するステップ；（ｃ）第１の部分を適した手段を用いて処理し、標識されたＰｒＧを樹脂から解離させ、第２の部分に過剰量のＩｇを加えるステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）における第１の部分中の処理された樹脂から、蛍光（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）およびＰｒＧ濃度（［ＰｒＧ］）を測定するステップ；ならびに（ｅ）ステップ（ｃ）における第２の部分からのＩｇ溶出液中の樹脂Ｉｇ溶出濃度（［Ｉｇ］）および蛍光シグナル（ＦＬ_Ｉｇ）を測定するステップを含み、ＰｒＧ漏出は、｛（ＦＬ_Ｉｇ）／（（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）／［ＰｒＧ］）｝／［Ｉｇ］を計算することによって定量される、ＰｒＧをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのＰｒＧ漏出を定量するための方法が提供される。

さらに別の態様において、ＰｒＧをベースとするクロマトグラフィー樹脂からのＰｒＧ漏出を定量するための方法は、（ａ）ＰｒＧをベースとするクロマトグラフィー樹脂を、１種以上の蛍光タグで標識するステップ；（ｂ）標識された樹脂に過剰量のＩｇを加え、樹脂からのＩｇ溶出液（ＦＬ_Ｉｇ）中の樹脂Ｉｇ溶出濃度（［Ｉｇ］）および蛍光シグナルを測定するステップ；（ｃ）残余のＩｇを樹脂から除去した後、樹脂を適した手段を用いて処理し、標識されたＰｒＧを樹脂から解離させるステップ；ならびに（ｄ）処理された樹脂から、蛍光（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）およびＰｒＧ濃度（［ＰｒＧ］）を測定するステップを含み、ＰｒＧ漏出は、｛（ＦＬ_Ｉｇ）／（（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）／［ＰｒＧ］）｝／［Ｉｇ］を計算することによって定量される。

その上さらなる実施形態において、本発明の方法は、ＰｒＬをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのプロテインＬ（ＰｒＬ）の漏出を定量するために使用される。

したがって、本発明によるさらに別の態様において、（ａ）ＰｒＬをベースとするクロマトグラフィー樹脂を、１種以上の蛍光タグで標識するステップ；（ｂ）標識された樹脂を、同等の第１および第２の部分に分割するステップ；（ｃ）第１の部分を適した手段を用いて処理し、標識されたＰｒＬを樹脂から解離させ、第２の部分に過剰量のＩｇを加えるステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）における第１の部分中の処理された樹脂から、蛍光（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）およびＰｒＬ濃度（［ＰｒＬ］）を測定するステップ；ならびに（ｅ）ステップ（ｃ）における第２の部分からのＩｇ溶出液中の樹脂Ｉｇ溶出濃度（［Ｉｇ］）および蛍光シグナル（ＦＬ_Ｉｇ）を測定するステップを含み、ＰｒＬ漏出は、｛（ＦＬ_Ｉｇ）／（（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）／［ＰｒＬ］）｝／［Ｉｇ］を計算することによって定量される、ＰｒＬをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのＰｒＬ漏出を定量するための方法が提供される。

別の態様において、ＰｒＬをベースとするクロマトグラフィー樹脂からのＰｒＬ漏出を定量するための方法は、（ａ）ＰｒＬをベースとするクロマトグラフィー樹脂を、１種以上の蛍光タグで標識するステップ；（ｂ）標識された樹脂に過剰量のＩｇを加え、樹脂からのＩｇ溶出液（ＦＬ_Ｉｇ）中の樹脂Ｉｇ溶出濃度（［Ｉｇ］）および蛍光シグナルを測定するステップ；（ｃ）残余のＩｇを樹脂から除去した後、樹脂を適した手段を用いて処理し、標識されたＰｒＬを樹脂から解離させるステップ；ならびに（ｄ）処理された樹脂から、蛍光（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）およびＰｒＬ濃度（［ＰｒＬ］）を測定するステップを含み、ＰｒＬ漏出は、｛（ＦＬ_Ｉｇ）／（（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）／［ＰｒＬ］）｝／［Ｉｇ］を計算することによって定量される。

加えて、理論によって制限されることを所望することなく、本発明の方法は、タンパク質に結合する分析物または分子を、混合物から単離するまたは除去するために使用される、タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー法からの、任意のタンパク質および／またはこの断片の漏出を定量するために使用され得ることが企図される。

したがって、本発明によるさらに別の態様において、（ａ）タンパク質をベースとするクロマトグラフィー樹脂を、１種以上の蛍光タグで標識するステップ；（ｂ）標識された樹脂を、同等の第１および第２の部分に分割するステップ；（ｃ）第１の部分を適した手段を用いて処理し、標識されたタンパク質を樹脂から解離させ、第２の部分に、タンパク質に結合する過剰量の分析物を加えるステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）における第１の部分中の処理された樹脂から、蛍光（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）およびタンパク質濃度（［Ｐｒ］）を測定するステップ；ならびに（ｅ）ステップ（ｃ）における第２の部分からの分析物溶出液中の樹脂分析物溶出濃度（［分析物］）および蛍光シグナル（ＦＬ_{ａｎａｌｙｔｅ}）を測定するステップを含み、Ｐｒ漏出は、｛（ＦＬ_{ａｎａｌｙｔｅ}）／（（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）／［Ｐｒ］）｝／［分析物］を計算することによって定量される、タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのタンパク質漏出を定量するための方法が提供される。

本発明による別の態様において、（ａ）タンパク質をベースとするクロマトグラフィー樹脂を、１種以上の蛍光タグで標識するステップ；（ｂ）標識された樹脂に過剰量の分析物を加え、樹脂からの分析物溶出液（ＦＬ_{ａｎａｌｙｔｅ}）中の樹脂分析物溶出濃度（［分析物］）および蛍光シグナルを測定するステップ；（ｃ）残余の分析物を樹脂から除去した後、樹脂を適した手段を用いて処理し、標識されたタンパク質を樹脂から解離させるステップ；ならびに（ｄ）処理された樹脂から、蛍光（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）およびタンパク質濃度（［Ｐｒ］）を測定するステップを含み、Ｐｒ漏出は、｛（ＦＬ_{ａｎａｌｙｔｅ}）／（（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）／［Ｐｒ］）｝／［分析物］を計算することによって定量される、タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのタンパク質漏出を定量するための方法が提供される。

種々の実施形態において、本発明の方法は、１種もしくは複数種の、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性交換クロマトグラフィー、弱分配クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはこれらの任意の組合せを使用して、浸出されたタンパク質、例えば、ＰｒＡ、ＰｒＧまたはＰｒＬを除去するステップをさらに含み得る。例示的なクロマトグラフィー形式は、限定されないが、充填カラムおよび膜デバイスの形式を含む。

本発明の方法の種々の実施形態において、蛍光タグは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８、５−ＦＡＭ（商標）、ＳＥおよび６−ＦＡＭ（商標）、ＳＥ（Ａｎａｓｐｅｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）からなる群から選択される。

種々の実施形態において、樹脂から、標識されたタンパク質、例えば、ＰｒＡ、ＰｒＧおよびＰｒＬを解離させるのに適した、本発明の方法において使用される手段は、化学的処理または酵素的処理を含む。例示的な酵素的処理は、タンパク質、例えば、ＰｒＡ、ＰｒＧまたはＰｒＬを消化する酵素の使用を含み、かかる酵素は、限定されないが、例えば、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、サーモリシンおよびスブトレリシン（ｓｕｂｔｌｅｌｙｓｉｎ）を含む。例示的な化学的処理は、適した酸または塩基の使用を含む。

本発明の方法の種々の実施形態において、市販されているＰｒＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、最小量のＰｒＡ漏出を示すものを明らかにするために、本発明の方法を使用して比較される。例示的な樹脂は、限定されないが、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）−ｖＡ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）ｖＡ ＵｌｔｒａおよびＰｒｏＳｅｐ（登録商標）ＵｌｔｒａＰｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（商標）およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）；ならびにＰＯＲＯＳ（登録商標）ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（商標）Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含む。

本発明の方法のいくつかの態様において、残余のＩｇ（例えば、ＩｇＧ）は、当技術分野においてよく知られている技術、例えば、６ＭグアニジニウムＨＣＬまたは４−８Ｍ尿素の使用を含む技術を使用して、樹脂から除去され得る。

本発明の方法のいくつかの態様において、分析物または分子（例えば、Ｉｇ）の過剰量は、分析物または分子を単離するまたは除去するために使用される、タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂または媒質の最大結合容量に比べて少なくとも２−５倍大きい量である。いくつかの態様において、分析物または分子は、ＰｒＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィー媒質または樹脂に結合するＩｇ（例えば、ＩｇＧ）であり、Ｉｇ（例えば、ＩｇＧ）の過剰量は、樹脂の結合容量の、少なくとも２倍であるまたは少なくとも３倍であるまたは少なくとも４倍であるまたは少なくとも５倍であるまたは５倍を超える。一般に、分析物または分子（例えば、Ｉｇ）の過剰量は、樹脂の製造業者によって典型的に提供される、樹脂の最大結合容量に基づいて決定することができるまたは当技術分野においてよく知られている技術に基づいて、当業者によって容易に計算され得る。

蛍光は、限定されないが、蛍光光度計の使用を含む任意の適した手段を使用して、測定することができる。蛍光光度計を使用する検出用にロードするサンプルは、キュベットまたはウェル−プレートの形式であり得る。

本発明の方法の種々の実施形態において、Ｉｇ（例えば、ＩｇＧ）は、例えば、適したｐＨの使用などの任意の適した手段を使用して、溶出させることができる。例示的な実施形態において、ＩｇＧ溶出に使用される適したｐＨは、約２．０から約４．０までのｐＨである。特定の実施形態において、ｐＨ２．０のグリシンが、ＩｇＧ溶出に使用される。

ＰｒＡが蛍光色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８）で標識される、本発明による例示的な方法を示す概略図である。簡単に言えば、図１に描かれているように、標識された媒質は、２つの１ｍｌ画分に分けられる。一方の画分は、トリプシンで酵素的に処理される。比ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}／［ＰｒＡ］は、上清を、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計において、ＵＶ_２７５ｎｍにて読み取ることによっておよび励起波長４９５ｎｍの蛍光光度計において、発光波長５１９ｎｍにて読み取ることによって得られる。他方の画分は、過剰量のＩｇＧを構成する、媒質の推定容量のおよそ５倍を用いて、Ｉｇ（例えば、ＩｇＧ）に曝される。過剰のＩｇＧが、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸生理食塩緩衝液）を用いて洗い流されるとすぐに、ＰｒＡ媒質に結合しているＩｇＧは、０．１ＭグリシンｐＨ２で溶出される。穏やかに混合した後、ＩｇＧ溶出が、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計において、ＵＶ_２８０ｎｍにて分析され（［ＩｇＧ］）、励起波長４９５ｎｍの蛍光光度計において、発光波長５１９ｎｍにて分析される（ＦＬ_ＩｇＧ）。 標識された（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を用いて）および標識されていないＰｒＡの静的ＩｇＧ結合は同等であることを示すグラフである。簡単に言えば、同一バッチ由来の、蛍光標識されたタイプＡ樹脂（ＦＬ−Ａ−１からＦＬ−Ａ−５まで）および標識されていない樹脂（Ａ−１からＡ−３まで）が、これらのＩｇＧ静的結合容量について、異なる３日に分けて試験された。結果は、図２のグラフに描かれているように、標識されたおよび標識されていないタイプＡＰｒＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂が、同等の静的結合容量値を有することを実証している。同一の実験が、異なるＰｒＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィータイプＢ樹脂を用いて行われ、標識された樹脂についてはＦＬ−Ｂ−１からＦＬ−Ｂ−４までおよび標識されていない樹脂についてはＢ１からＢ３までによって表された。この場合も同様に、図２のグラフによって実証されているように、標識されたおよび標識されていないタイプＢ樹脂の両方が、同等のＩｇＧ静的結合容量値を示している。したがって、蛍光標識は、異なる樹脂に対するＰｒＡ−ＩｇＧアフィニティー相互作用に関して、最小限の干渉を与える。結果はまた、図２の表にまとめられている。標識されたおよび標識されていないタイプＡ樹脂（媒質Ａ）由来の、樹脂の静的結合容量（Ｑｓ）は、表の左側に示されており、標識されたおよび標識されていないタイプＢ樹脂（媒質Ｂ）由来の同容量は、表の右側に示されている。標準偏差（ＳＴＤ）および変動係数（ＣＶ）が、同様に提示されている。標識されたおよび標識されていない媒質Ａについての試験変動（４％対３％）ならびに媒質Ｂについての試験変動（７％対６％）が比較できる。 ２つの異なるバッチのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を用いてそれぞれ試験された、５つの異なるロットのシリカをベースとするタンパク質アフィニティー樹脂のＰｒＡ漏出値を要約する表である。表に示されているように、８．４％未満の変動が、２つの異なるバッチの蛍光色素を使用した２セットの実験に対して得られている。

（発明の詳細な記述）
本発明は、タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー媒質または樹脂、例えば、ＰｒＡ、ＰｒＧおよびＰｒＬをベースとするアフィニティークロマトグラフィー媒質または樹脂からの、タンパク質、例えば、ＰｒＡ、ＰｒＧまたはＰｒＬ漏出を定量する方法に関する。理論によって制限されることを所望することなく、本発明による方法は、タンパク質に結合する分子、限定されないが、例えば、Ｉｇに結合するプロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬを含む、分子を単離するまたは除去するために使用されるタンパク質をベースとするクロマトグラフィー媒質または樹脂からの、いかなるタンパク質の漏出も定量するために使用することができることが企図される。

本開示をより容易に理解することができるように、ある特定の用語は、最初に定義される。追加の定義は、詳細な説明を通じて述べられる。

Ｉ．定義
本明細書において使用される場合、「プロテインＡ」または「ＰｒＡ」という用語は、は、天然源から、例えば、細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）から回収されたプロテインＡ、合成的に（例えば、ペプチド合成によってまたは組み換え技術によって）製造されたプロテインＡ、例えば、免疫グロブリンなどのＣ_Ｈ２／Ｃ_Ｈ３部位を有するタンパク質に結合する能力を保持する、その変異体または誘導体などを包含する。ＰｒＡの市販源は、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｅｒｓｅｎｉｕｓ ＭｅｄｉｃａｌおよびＦｅｒｍａｔｅｃｈを含む。

「クロマトグラフィー」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば、固体基質と、限定されないが、溶液、緩衝液または溶媒を含む移動相との間の分配におけるこれらの差異によって、混合物中の他の分子から関心対象の分析物（例えば、免疫グロブリンまたはＩｇ）を分離し、関心対象の分析物を単離することができる、任意の種類の精製技術を指す。

本明細書において使用される場合、「アフィニティークロマトグラフィー」、「アフィニティー分離」または「アフィニティー精製」という用語は、本明細書において使用される場合、標的分析物または分子（例えば、免疫グロブリンまたはＩｇ）を含有するサンプルを、分析物に結合するタンパク質、例えば、ＰｒＡ、ＰｒＧおよびＰｒＬをその上に担持する固体支持体に添加することを含む、任意の精製技術またはアッセイ技術を指す。標的分析物または分子（例えば、Ｉｇ）をタンパク質（例えば、ＰｒＡ）に結合させ、望ましくない不純物を貫流させた後、標的分析物または分子は、適した手段を使用して溶出され得る。例えば、ＩｇＧなどの分析物は、適したｐＨ、例えば、約２から約５までの範囲のｐＨまたは約２から約４までの範囲のｐＨを有する適した溶出緩衝液を使用して回収され得る。この目的のための溶出緩衝液の例は、クエン酸塩、グリシンまたは酢酸塩の緩衝液を含む。

「ＰｒＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィー」または「プロテインＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィー」という用語は、本明細書において使用される場合、一般に固体支持体に固定されるプロテインＡまたはこの誘導体もしくは変異体を使用した、免疫グロブリンなどの物質および／または分子の分離または精製を指す。

「ＰｒＧをベースとするアフィニティークロマトグラフィー」または「プロテインＧをベースとするアフィニティークロマトグラフィー」という用語は、本明細書において使用される場合、一般に固体支持体に固定されるプロテインＧまたはこの誘導体もしくは変異体を使用した、免疫グロブリンなどの物質および／または分子の分離または精製を指す。

「ＰｒＬをベースとするアフィニティークロマトグラフィー」または「プロテインＬをベースとするアフィニティークロマトグラフィー」という用語は、本明細書において使用される場合、一般に固体支持体上に固定されるプロテインＬまたはこの誘導体もしくは変異体を使用した、免疫グロブリンなどの物質および／または分子の分離または精製を指す。

「固体相」または「固体支持体」という用語は、一般に、関心対象の分析物または分子を単離するまたは除去するために使用されるタンパク質、例えば、プロテインＡ（ＰｒＡ）、プロテインＧ（ＰｒＧ）またはプロテインＬ（ＰｒＬ）が、付着するまたは共有結合することができる非水性マトリックスを指す。例えば、ＰｒＡは、例えば、アガロース、多糖、デキストラン、シリカゲル、合成ポリマー（ポリスチレン−ジビニルベンゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリビニルエーテルおよびこれらの相当するコポリマー）ならびにガラスビーズなどの種々の材料に結合し得る。固体支持体形式は、限定されないが、精製カラム、別個の粒子の不連続相、充填床カラムおよび膨張床カラム、膜などを含む。いくつかの実施形態において、場合による予備ステップとして、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーのための固体相は、関心対象のタンパク質のクロマトグラフィー前に、適した緩衝液と平衡化され得る。例示的な平衡緩衝液は、１０ｍＭリン酸生理食塩緩衝液ｐＨ７．４を含有する。

「アフィニティー樹脂」または「アフィニティークロマトグラフィー樹脂」という用語は、本明細書において使用される場合、クロマトグラフィーリガンド（例えば、ＰｒＡまたはＰｒＧまたはＰｒＬ）が吸着されているクロマトグラフ支持体を指す。リガンドは、混合物から精製されるまたは除去されることになっている関心対象の分子（例えば、免疫グロブリン）に結合することができる。プロテインＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィーに使用するための、例示的なプロテインＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、細孔制御ガラスバックボーン（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ ｂａｃｋｂｏｎｅ）、例えば、ＰＲＯＳＥＰ Ａ（商標）およびＰＲＯＳＥＰ ｖＡ（商標）樹脂、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＵｌｔｒａおよびＰＲＯＳＥＰ Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｎｃ．）上に固定されるプロテインＡ；ポリスチレン固体相、例えば、ＰＯＲＯＳ ５０Ａ（商標）樹脂およびＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）上に固定されるプロテインＡ；またはアガロース固体相、例として、ｒＰＲＯＴＥＩＮ Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（商標）もしくはＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定されるプロテインＡを含む。

溶出されたＩｇ（例えば、ＩｇＧ）は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーステップの前または後の、追加の精製ステップに供され得る。例示的なさらなる精製ステップは、限定されないが、ろ過、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨｌＣ）、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、弱分配クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲルろ過などを含む。

いくつかの実施形態において、溶出されたＩｇ（例えば、ＩｇＧ）は、薬学的に許容される担体に製剤することができ、そのような分子で知られている、種々の診断上の使用、治療上の使用または他の使用のために使用される。

本明細書において使用される場合、「タンパク質浸出」、「タンパク質漏出」、「浸出されたタンパク質」、「Ｐｒ浸出」、「Ｐｒ漏出」および「浸出されたＰｒ」という用語は、タンパク質（Ｐｒ）（無傷のものおよび／またはこの断片を含む）の、それが結合している固体相からの剥離または流失を指す。いくつかの実施形態において、ＰｒＡ、ＰｒＧまたはＰｒＬの漏出は、ＰｒＡ、ＰｒＧまたはＰｒＬをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂から、本発明の方法を使用して定量される。タンパク質漏出は、多くのさまざまな理由のために生じ得る。例えば、ＰｒＡ漏出またはＰｒＡ浸出は、機械的剪断、低／高ｐＨに曝されること、免疫グロブリンへの接触、タンパク質分解活性などの理由のために生じ得る。プロテインＡ浸出は、当技術分野においてよく知られている、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法などを含む種々の技術を使用して、定性的に測定することができる。浸出されたＰｒＡの量は、一般に、アフィニティーマトリックス１ｍｌ当たりのＰｒＡ ｎｇとして表されるまたはそれは、抗体１ｍｇ当たりのプロテインＡ ｎｇとして表され得る。

本明細書において使用される場合、（本明細書において同義的に使用される）「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」または「抗体」という用語は、２本の重鎖および２本の軽鎖からなる基本的な４本のポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は、例えば、鎖間ジスルフィド結合によって安定化され、かかるタンパク質は、抗原に特異的に結合する能力を有する。（本明細書において同義的に使用される）「単鎖免疫グロブリン」または「単鎖抗体」という用語は、１本の重鎖および１本の軽鎖からなる２本のポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は、例えば、鎖間ペプチドリンカーによって安定化され、かかるタンパク質は、抗原に特異的に結合する能力を有する。「ドメイン」という用語は、例えば、β−プリーツシートおよび／または鎖間ジスルフィド結合によって安定化されたペプチドループを含む（例えば、３から４つまでのペプチドループを含む）重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を指す。ドメインはさらに、本明細書において「定常」または「可変」と称され、これは、「定常」ドメインの場合には、種々のクラスメンバーのドメイン内部の配列変異の相対的欠如に基づいておりまたは「可変」ドメインの場合には、種々のクラスメンバーのドメイン内部の著しい変異に基づいている。抗体またはポリペプチド「ドメイン」は、当技術分野において同義的に、抗体またはポリペプチド「領域」と称されることが多い。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと同義的に称される。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと同義的に称される。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと同義的に称される。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと同義的に称される。

いくつかの実施形態において、免疫グロブリンはＩｇＧ抗体である。免疫グロブリンまたは抗体は、モノクロナールまたはポリクロナールであってよく、単量体または重合体で存在することができ、例えば、ＩｇＭ抗体は、五量体で存在しおよび／またはＩｇＡ抗体は、単量体、二量体または多量体で存在する。「断片」という用語は、無傷のまたは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む、抗体または抗体鎖の一部または部分を指す。断片は、無傷のまたは完全な抗体または抗体鎖の化学的処理または酵素的処理を介して得ることができる。断片は、組み換え手段によっても得ることができる。例示的な断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片および／またはＦｖ断片を含む。

「抗原結合断片」という用語は、抗原に結合するまたは抗原結合（すなわち、特異的な結合）のための無傷の抗体と（すなわち、それらが誘導される無傷の抗体と）競合する、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド部分を指す。結合断片は、組み換えＤＮＡ技術によってまたは無傷の免疫グロブリンの酵素的切断もしくは化学的切断によって形成することができる。結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖および単鎖抗体を含む。

ＩＩ．ｗｔＰｒＡ構造および免疫グロブリン結合部位
ＰｒＡは、細菌スタフィロコッカス・アウレウスから誘導される約４２−ｋＤａのタンパク質であり、Ｎ末端に、Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣと呼ばれる５つの縦列型の高相同性の細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）結合ドメインを含有する。ＰｒＡの細胞外ドメインはそれぞれ、別個のＩｇ結合部位を所有する。一方の部位は、Ｆｃγ（ＩｇのＩｇＧクラスの定常領域）に対するものであり、他方の部位は、ある特定のＩｇ分子のＦａｂ部分（抗原認識に関与しているＩｇの部分）に対するものである。ドメインのそれぞれはＦａｂ結合部位を含有することが報告されている。ＳｐＡの非Ｉｇ結合部分はＣ末端に位置され、Ｘ領域またはＸ−ドメインと呼ばれている。

ｗｔＰｒＡをコード化する遺伝子のクローニングは、米国特許第５，１５１，３５０号に記載されており、この全内容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

ＩＩＩ．例示的なＰｒをベースとするアフィニティークロマトグラフィー媒質
本発明の方法は、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー媒質または樹脂からのタンパク質の漏出を定量するために使用することができ、そのようなタンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、タンパク質に結合している分子を単離するまたは除去するために使用される。例示的な実施形態において、本発明の方法は、アフィニティークロマトグラフィー媒質または樹脂からのタンパク質の漏出を定量するために使用され、そのような媒質または樹脂は、限定されないが、ＰｒＡ、ＰｒＧおよびＰｒＬならびにこれらの誘導体、変異体および断片を含む混合物から、免疫グロブリンを単離するまたは免疫グロブリンから除去するために使用される。

本発明の方法において使用され得る、例示的なプロテインＡをベースとする樹脂は、限定されないが、ＰＲＯＳＥＰ ｖＡ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＰＲＯＳＥＰ Ａ Ｕｌｔｒａ、ＰＲＯＳＥＰ Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦａｓｔＦｌｏｗ、ｒｍｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦａｓｔＦｌｏｗ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰＯＲＯＳ Ａ、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を含む。例示的なプロテインＧをベースとする樹脂は、限定されないが、ＰＲＯＳＥＰ−Ｇ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰＯＲＯＳ Ｇ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含む。

ＩＶ．例示的な蛍光タグおよび蛍光の測定
タンパク質を標識することができる任意の適した蛍光タグまたは色素が、本発明の方法に使用され得る。一般に、７０，０００ｃｍ^−１Ｍ^−１以上の吸光係数ε_ｍａｘを有し、８０％を超える量子収量を有し、最小限の光退色または消光を示す、蛍光タグまたは色素を使用することが望ましい。使用される色素は、実験の条件下、例えば、約１．０から約１０．０までのｐＨ範囲の下で安定であるべきである。タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー媒質に関して、アミン、チオールおよびカルボキシ反応性色素を使用することが望ましい。例示的なアミン反応性蛍光色素は、限定されないが、スルホスクシンイミジルエステルを含むスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、塩化スルホニルおよびテトラフルオロフェニルエステルを含む。例示的なチオール反応性色素は、限定されないが、マレイミド、フェニル水銀、ヨードアセトアミド、チオ硫酸塩、ローダミン誘導体およびベンゾオキサジアゾ誘導体を含む。例示的な実施形態において、タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー媒質を標識するために使用され得る色素は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８ならびに５−ＦＡＭ、ＳＥおよび６−ＦＡＭ、ＳＥ（Ａｎａｓｐｅｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を含む。

本発明の方法は、一般に、蛍光の測定に基づいている。一般に、蛍光は、分子が紫外線、可視光線または近赤外線照射の吸収によって電子的に励起された状態に促進される、光学分光法の一種である。次いで、励起された分子は、光の放出によって、基底状態またはより低い位置にある励起された電子状態に戻り、この光の放出が、蛍光光度計などの機器を使用して検出される。本発明の方法の場合には、蛍光色素は、タンパク質、例えば、ＰｒＡに結合する反応性色素である。そのような色素は、本発明の方法において使用される実験条件下、例えば、約１．０から約１０．０までの範囲のｐＨの使用下で、少なくとも３０分間、最大強度の約２０％の範囲内の蛍光強度を維持することが望ましい。

Ｖ．タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂から標識されたタンパク質を解離させる方法
タンパク質をベースとするクロマトグラフィー媒質または樹脂中のタンパク質を標識した後、共有結合しているタンパク質は、アフィニティー媒質または樹脂から解離される。共有結合している標識されたタンパク質をアフィニティー媒質から解離させる方法は、限定されないが、化学的方法または酵素的方法を含む。例示的な化学的処理方法には、ＵＶ吸収に著しく干渉しない、酸または塩基触媒による加水分解が使用され得る。本発明の方法に使用され得る例示的な酸は、限定されないが、塩酸などの一価の酸、硫酸などの二価の酸およびリン酸などの三価の酸を含む。本発明の方法に使用され得る例示的な塩基は、限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化セシウムを含む。加えて、ある特定のペプチド結合を切断し、これによって、標識されたタンパク質を、これが吸着している固体支持体から解離させることができる、ＣＮＢｒなどの化学物質が使用され得る。例えば、ＵｈｌｅｎおよびＮｉｌｓｓｏｎ、Ｉｎ Ｐｒｏｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ８５（Ｅｕｒｏｐｅ）、１７３頁（１９８５）を参照されたい。

例示的な酵素的処理方法は、限定されないが、タンパク質を消化することができる酵素の使用を含む。例示的な酵素は、限定されないが、例えば、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、サーモリシンおよびスブトレリシンを含む。

ＶＩ．化学的または酵素的に処理された樹脂からの蛍光およびタンパク質濃度の測定
化学的または酵素的に処理された樹脂は、続いてろ過され、微粒子が含まれていない上清を得る。上清は、消化された標識されたタンパク質（例えば、ＰｒＡ）を含有し、この蛍光が、例えば、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を使用して、２７５ｎｍにて測定され得る。この示数は、消化されたタンパク質（例えば、樹脂から消化されたプロテインＡおよびプロテインＡ断片）によって寄与されるＵＶ吸収を含む。タンパク質の濃度（ＰｒＡ濃度または［ＰｒＡ］）を特異的に得るために、蛍光示数における化学物質または酵素および蛍光色素からの寄与は、差し引かれる必要がある。タンパク質（例えば、ＰｒＡ）を解離させるために使用される化学物質または酵素からの寄与、ＵＶ_{ｅｎｚ／ｃｈｅｍ}は、希釈係数中に要因として含める化学物質または酵素の出発濃度を測定することによって検出することができる。同様に、蛍光タグまたは色素からの寄与は、通常は励起波長、ＵＶ_ｍａｘにおけるＵＶである、蛍光タグまたは色素のピークにおけるＵＶ吸収を得ることによって計算することができる。それぞれの色素についての比ＵＶ_２７５／ＵＶ_ｍａｘ（ｆ）は、典型的には、製造供給元から得ることができる。例として、プロテインＡの吸光係数が０．１４９であると仮定すれば、プロテインＡ濃度は、式：［ＵＶ_２７５−ＵＶ_{ｅｎｚ／ｃｈｅｍ}−ＵＶ_ｍａｘ×ｆ］／０．１４９を使用して得ることができる。

蛍光は、ある特定の波長における分子の励起および発光スペクトルを受け取るためのより長い波長における検出によって発生される。一般に、蛍光色素の製造供給元によって推奨される最適な励起波長および発光波長が使用され得る。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に関して、励起波長は４９５ｎｍであり、発光波長は５１９ｎｍである。同様に、蛍光示数は、必要ならば連続希釈を用いて、上清から得ることができる。蛍光は、典型的には、キュベットまたはウェル−プレート形式の蛍光光度計を用いて、２５℃などの設定温度にて読み取られる。

ＶＩＩ．溶出液濃度の測定
請求されている本発明による種々の方法において、関心対象の溶出された分子または分析物（例えば、免疫グロブリンまたはＩｇ）の濃度が、浸出されたタンパク質の計算に必要とされ、これは、溶出された分子１ｍｇ当たりの浸出されたタンパク質のｎｇとして測定される。本発明による例示的な方法において、溶出された分子は免疫グロブリンであり、これは、ＰｒＡ、ＰｒＧまたはＰｒＬをベースとするアフィニティークロマトグラフィー媒質を使用して単離される。いくつかの実施形態において、溶出された分子、例えば、免疫グロブリンは、アフィニティークロマトグラフィー媒質から、ｐＨ、イオン強度／塩濃度および／または温度における勾配または段階変化による変化を使用して放出される。例えば、ＩｇＧの場合には、ＰｒＡをベースとするクロマトグラフィー媒質からの溶出は、典型的には、溶出ｐＨを５未満であるが２以上に低下させ、最も望ましくはｐＨ２と４との間に低下させることによって達成される。例示的な溶出緩衝液は、酢酸、グリシンおよびクエン酸を含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＧの溶出は、２０００ｃｍ／時以下、１０００ｃｍ／時以下、８００ｃｍ／時以下、６００ｃｍ／時以下、２００ｃｍ／時以下、１００ｃｍ／時以下または５０ｃｍ／時以下の速度での溶出緩衝液の流れによって達成される。一般に、流速が遅ければ遅いほど、より多くのＩｇＧが媒質に結合し、溶出ＩｇＧ濃度が典型的に、より高くなる。溶出流速が５ｃｍ／時未満の場合には、媒質は、これが結合することができるＩｇＧの最大量に近いＩｇＧに結合し、ひいては静的結合容量に到達する。過剰量のＩｇＧが、静的結合容量試験に使用され、通常は、媒質の最大結合容量の３−５倍を超える。したがって、浸出されたプロテインＡの量は通常、溶液中のＩｇＧ１ｍｇ当たりのプロテインＡのｎｇとして定義される。

本発明は、限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によって、さらに説明される。本出願の全体にわたって引用されている、すべての文献、特許および公開特許出願の内容ならびに図は、参照により本明細書に組み込まれる。

（実施例１） ＰｒＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂の蛍光タグでの標識
細孔制御ガラスをベースとするプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂（例えば、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）−ｖＡ Ｈｉｇｈ ＣａｐａｃｉｔｙおよびＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ＰｒＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８色素で標識した。簡単に言えば、１ｍｇのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、約１ｍｌのＤＭＳＯ中に溶かした。ＰｒＡ樹脂のそれぞれおよそ３ｍｌをＮａＨＣＯ_３（０．１Ｍ ｐＨ８．４）で処理し、真空乾燥させ、１５ｍｌＥｖｅｒｇｒｅｅｎカラム（Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）中に充填した。およそ３ｍｌのＮａＨＣＯ_３をそれぞれのカラムに加え、カラムに蓋をし、アルミ箔で覆った。約１００μｌの色素をそれぞれのカラムに加え、振盪機上に約０．５時間置いた。さらに１００μｌの色素溶液をカラムに加え、さらに１時間振盪した。続いて、カラムをスラリーにし、各回約２カラム体積のＮａＨＣＯ_３を用いて３回洗浄し、各回約２カラム体積の２０％エタノールを用いて３回洗浄し、各回約２カラム体積のＮａＨＣＯ_３を用いて２回洗浄した。

標識された樹脂を、続いて１ｍｌの部分に分割し、バイアル中に移した。

（実施例２） 蛍光タグ標識されたＰｒＡ樹脂の酵素的処理
蛍光標識されたＰｒＡ樹脂の一方の画分を、続いて酵素的に消化した。蛍光標識されていないＰｒＡ樹脂を、対照として使用した。簡単に言えば、ＰｒＡ樹脂のそれぞれ１ｍｌを０．１Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３で処理し、真空乾燥させた。トリプシンを０．１Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３中に溶かし、２７５ｎｍにおけるＵＶ測定が、０．７と１との間であるように測定を行った。続いて、約３ｍｌのトリプシン溶液をそれぞれの樹脂に加え、３７℃にて約２時間インキュベートした。インキュベートされた媒質スラリーを、７ｍＬのＥｖｅｒｇｒｅｅｎ滴下カラムを通してろ過し、媒質から上清を除去した。ろ液の測定をＵＶ_{２７５ｎｍＤ}にて行い、トリプシンのＵＶ_{２７５ｎｍＴ}を、この値から差し引いた。同様に、ろ液のＵＶ_{４９５ｎｍＦ}測定を行った。プロテインＡ濃度を得るために、０．１４９の吸光係数を使用し、式（ＵＶ_{２７５ｎｍＤ}×希釈係数−ＵＶ_{２７５ｎｍＴ}−ｆ×ＵＶ_{４９５ｎｍＦ}×希釈係数）／０．１４９を使用して、消化されたプロテインＡの濃度である［ＰＡ］を得た。ｆの値は、ＵＶ_{２７５ｎｍ}／ＵＶ_{４９５ｎｍ}における色素のＵＶ吸光係数の比であり、蛍光色素の製造供給元によって提供される。

上記ろ液の蛍光を、約２０００倍希釈（０．１Ｍグリシンを用いて）にて測定し、［ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}］値を得た。

（実施例３） 標識されたおよび標識されていない樹脂のＩｇＧ溶出液濃度／静的容量の測定
標識されたおよび標識されていないプロテインＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂のＩｇＧ溶出液濃度／静的容量を、以下のように決定した。静的容量の測定はまた、ＰｒＡ樹脂が、例えば、ＰｒＡ樹脂とＩｇＧとの相互作用を阻害する蛍光タグで標識されているかどうかの指標である。

標識されたおよび標識されていないＰｒＡ樹脂を、それぞれ１ｍｌ体積で測定し（Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）、タッピングした。それぞれのサンプルを、１０ｍｌの１０ｍＭリン酸生理食塩緩衝液（ＰＢＳ）を用いて再度スラリーにし、平衡化した。ＰＢＳの重力による溶出液を捨てた後、５ｍｌの０．１Ｍ ｐＨ２グリシンを加えた。溶出液を捨てた。さらに５ｍｌの０．１Ｍ ｐＨ２グリシンを加え、溶出液をＦｒ_ｂｋｇｄとして集めた。各５ｍｌのＰＢＳを２回分加え、媒質を平衡化した後、５ｍｌの約５０ｍｇ／ｍＬポリクロナールｈＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）を加えた。この後、さらに各５ｍｌのＰＢＳを２回分加えた。すべてのＰＢＳおよびＩｇＧの重力による溶出液を捨てた。グリシン（５ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ２）を加え、溶出液を集め、ＦＲ_１と名称をつけた。さらに５ｍｌのグリシン溶液を加え、溶出液を集め、ＦＲ_２と名称をつけた。２８０ｎｍにてＵＶ測定を行い、溶出ＩｇＧ濃度［ＩｇＧ］を得た。ＰｒＡ樹脂の静的容量を測定する１つのそのような実験の結果を、図２に描く。図２によって実証されているように、ＰｒＡ樹脂のそれぞれとＩｇＧとの相互作用は、樹脂に蛍光色素を加えることによって阻害されなかった。同様に、静的容量の測定を、図２の表に示す。

溶出液濃度［ＩｇＧ］を、ＦＲ_１を使用したＡ_{２８０ｎｍ}×希釈係数＋ＦＲ_２のＡ_{２８０ｎｍ}×希釈係数）／ＩｇＧの吸光係数より測定する。続いて、Ｊａｓｃｏ ＦＰ−６５００蛍光光度計（Ｇｒｅａｔ Ｄｕｎｍｏｗ、ＵＫ）を使用して、蛍光を５１９ｎｍにて、励起波長４９５ｎｍを用いて測定する。標識されていない媒質のＦＲ_１およびＦＲ_２の蛍光値を、対応する標識された媒質の値から差し引く。上記の値から、画分１および画分２の蛍光シグナルの合計をＦｒ_ｂｋｇｄによってさらに差し引き、［ＦＬ_ＩｇＧ］を得る。樹脂から浸出されたプロテインＡを、以下の式：｛（ＦＬ_ＩｇＧ）／（（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）／［ＰｒＡ］））｝／［ＩｇＧ］を使用して計算する。

本明細書は、参照により本明細書に組み込まれる、本明細書内に引用されている参照の教示を考慮に入れると、最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明における実施形態を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明によって包含されることを、容易に認識する。すべての出版物および発明は、参照により完全に組み込まれる。参照により組み込まれる材料が、本明細書に矛盾するまたは一致しない程度まで、本明細書は、そのような任意の材料に優先する。本明細書における任意の参照の引用は、そのような参照が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。

他に特に指示がない限り、特許請求の範囲を含む本明細書において用いられている成分の量、細胞培養物、処理条件などを表現するすべての数は、すべての場合に、「約」という語によって変更されるものと理解されるべきである。したがって、他に特に逆の指示がない限り、数値パラメータは近似値であり、本発明が得ようとする所望の特性に応じて変化する可能性のある値である。他に特に指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という語は、連続したすべての要素を指すことを理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対して、多くの相当物を認識するまたは確認することができる。そのような相当物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図したものである。

本発明の多くの変更および改変は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得るが、このことは当業者には明らかである。本明細書に記載されている特定の実施形態は、例としてのみ提示されるものであり、何らかの限定をされるつもりはない。本明細書および実施例は、単なる例証とみなされることを意図したものであり、本発明の真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲によって示されている。

Claims (26)

1. ＰｒＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのＰｒＡ漏出を定量するための方法であって、
   （ａ）ＰｒＡをベースとするクロマトグラフィー樹脂を、１種以上の蛍光タグで標識するステップ；
   （ｂ）標識された樹脂を、同等の第１および第２の部分に分割するステップ；
   （ｃ）第１の部分を化学的処理又は酵素的処理により処理し、標識されたＰｒＡを樹脂から解離させ、ならびに第２の部分に過剰量の免疫グロブリン（Ｉｇ）を加えるステップ；
   （ｄ）ステップ（ｃ）における第１の部分中の処理された樹脂から、蛍光（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）およびＰｒＡ濃度（［ＰｒＡ］）を測定するステップ；ならびに
   （ｅ）ステップ（ｃ）における第２の部分からのＩｇ溶出液中の樹脂Ｉｇ溶出液濃度（［Ｉｇ］）および蛍光シグナル（ＦＬ_Ｉｇ）を測定するステップ
   を含み、
   ＰｒＡ漏出は、｛（ＦＬ_Ｉｇ）／（（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）／［ＰｒＡ］））｝／［Ｉｇ］を計算することによって定量される、方法。
2. ＰｒＡをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのＰｒＡ漏出を定量するための方法であって、
   （ａ）ＰｒＡをベースとするクロマトグラフィー樹脂を、１種以上の蛍光タグで標識するステップ；
   （ｂ）標識された樹脂に過剰量の免疫グロブリン（Ｉｇ）を加え、樹脂からのＩｇ溶出液（ＦＬ_Ｉｇ）中の樹脂Ｉｇ溶出液濃度（［Ｉｇ］）および蛍光シグナルを測定するステップ；
   （ｃ）残余のＩｇを樹脂から除去した後、樹脂を化学的処理又は酵素的処理により処理し、標識されたＰｒＡを樹脂から解離させるステップ；ならびに
   （ｄ）処理された樹脂から、蛍光（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）およびＰｒＡ濃度（［ＰｒＡ］）を測定するステップ
   を含み、
   ＰｒＡ漏出は、｛（ＦＬ_Ｉｇ）／（（ＦＬ_{ｄｉｇｅｓｔ}）／［ＰｒＡ］）｝／［Ｉｇ］を計算することによって定量される、方法。
3. 免疫グロブリンがＩｇＧである、請求項１の方法。
4. １種以上の、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性交換クロマトグラフィー、弱分配クロマトグラフィーまたはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して、浸出されたＰｒＡを除去するステップをさらに含む、請求項１の方法。
5. 蛍光タグが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）４８８、ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ ４８８、５−ＦＡＭ，ＳＥおよび６−ＦＡＭ，ＳＥからなる群から選択される、請求項１の方法。
6. ステップ（ｃ）において第１の部分を化学的処理により処理する、請求項１の方法。
7. ステップ（ｃ）において第１の部分を酵素的処理により処理する、請求項１の方法。
8. 酵素的処理が、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、サーモリシンおよびスブトレリシン（ｓｕｂｔｌｅｌｙｓｉｎ）の使用を含む、請求項７の方法。
9. 化学的処理が、酸または塩基の使用を含む、請求項６の方法。
10. ＰｒＡをベースとするクロマトグラフィー樹脂が、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ａ ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ａ Ｕｌｔｒａ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（商標）、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（商標）、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡおよびＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗからなる群から選択される、請求項１の方法。
11. 蛍光が、蛍光光度計を使用して測定される、請求項１の方法。
12. Ｉｇが、適したｐＨを使用して溶出される、請求項１の方法。
13. Ｉｇがモノクローナルである、請求項１の方法。
14. Ｉｇがポリクローナルである、請求項１の方法。
15. 免疫グロブリンがＩｇＧである、請求項２の方法。
16. １種以上の、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性交換クロマトグラフィー、弱分配クロマトグラフィーまたはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して、浸出されたＰｒＡを除去するステップをさらに含む、請求項２の方法。
17. 蛍光タグが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）４８８、ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ ４８８、５−ＦＡＭ，ＳＥおよび６−ＦＡＭ，ＳＥからなる群から選択される、請求項２の方法。
18. ステップ（ｃ）において樹脂を化学的処理により処理する、請求項２の方法。
19. ステップ（ｃ）において樹脂を酵素的処理により処理する、請求項２の方法。
20. 酵素的処理が、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、サーモリシンおよびスブトレリシンの使用を含む、請求項１９の方法。
21. 化学的処理が、酸または塩基の使用を含む、請求項１８の方法。
22. ＰｒＡをベースとするクロマトグラフィー樹脂が、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ａ ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ａ Ｕｌｔｒａ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（商標）、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（商標）、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡおよびＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗからなる群から選択される、請求項２の方法。
23. 蛍光が、蛍光光度計を使用して測定される、請求項２の方法。
24. Ｉｇが、適したｐＨを使用して溶出される、請求項２の方法。
25. Ｉｇがモノクローナルである、請求項２の方法。
26. Ｉｇがポリクローナルである、請求項２の方法。

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