JP5155453B2 - タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのタンパク質漏出を定量するための方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2008年9月15日に出願された米国仮特許出願第61/192,082号の優先権の利益を主張するものである。この全内容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
本発明は、限定されないが、プロテインA、プロテインGおよびプロテインLをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む、タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのタンパク質漏出を定量するための方法に関する。
タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質、DNAおよび他の化学分子および生物分子の精製に、実験室規模から、パイロット規模、生産規模までの範囲に及ぶ種々の規模で、幅広く使用されている。例えば、Hermanson他、Immobilized Affinity Ligand Techniques、Academic Press,Inc.San Diego、CA、317−346頁(1992)を参照されたい。これらの中で、プロテインA(PrA)、プロテインG(PrG)およびプロテインL(PrL)をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、免疫グロブリン(Ig)の検出および/または精製のための、よく知られており幅広く使用されている方法であるが、それらはそれぞれ、Igとの結合に関して異なる特異性を有する。
タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂、例えば、プロテインA、GおよびLをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、これらに結合する分析物または分子、例えば、PrA、PrGおよびPrLの場合には免疫グロブリン(Ig)の精製に非常に望ましいが、1つの欠点は、クロマトグラフィーカラムから、関心対象の分析物または分子、例えば、免疫グロブリンと一緒に、タンパク質、例えば、プロテインA、GまたはLが漏出することである。例えば、プロテインAをベースとするアフィニティークロマトグラフィーは、例えば、高い捕集容量で抗体を特異的に結合させるその能力のために、抗体の大規模精製におよび高純度を達成するのに非常に望ましいが、それ自体の生物活性および毒性学プロフィールのために、浸出されたPrAは通常、免疫グロブリン溶出液中の望ましくない不純物と考えられている。したがって、本発明のいくつかの態様において、PrA漏出をモニターし、その後のクロマトグラフィーステップにおいて、最後にそれを除去することが望ましい。例えば、PrA漏出を最小限に抑えるための1つのやり方は、クロマトグラフィーカラムからの最小量のPrA漏出を示すPrA樹脂を使用することである。したがって、いくつかの態様において、本発明の方法は、クロマトグラフィーカラムからの最小量の漏出を示す、限定されないが、PrA、PrGおよびPrLをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む、タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂を明らかにするために使用され得る。そのようなタンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、知られている樹脂および将来開発され得る樹脂を含む。
本発明は、タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー媒質または樹脂、例えば、PrA、PrGおよびPrLをベースとするアフィニティークロマトグラフィー媒質または樹脂からの、タンパク質、例えば、PrA、PrGまたはPrL漏出を定量する方法に関する。理論によって制限されることを所望することなく、本発明による方法は、タンパク質に結合する分子、限定されないが、例えば、Igに結合するプロテインA、プロテインGおよびプロテインLを含む、分子を単離するまたは除去するために使用されるタンパク質をベースとするクロマトグラフィー媒質または樹脂からの、いかなるタンパク質の漏出も定量するために使用することができることが企図される。
本明細書において使用される場合、「プロテインA」または「PrA」という用語は、は、天然源から、例えば、細菌スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)から回収されたプロテインA、合成的に(例えば、ペプチド合成によってまたは組み換え技術によって)製造されたプロテインA、例えば、免疫グロブリンなどのCH2/CH3部位を有するタンパク質に結合する能力を保持する、その変異体または誘導体などを包含する。PrAの市販源は、Repligen、GE Healthcare、Fersenius MedicalおよびFermatechを含む。
PrAは、細菌スタフィロコッカス・アウレウスから誘導される約42−kDaのタンパク質であり、N末端に、E、D、A、BおよびCと呼ばれる5つの縦列型の高相同性の細胞外免疫グロブリン(Ig)結合ドメインを含有する。PrAの細胞外ドメインはそれぞれ、別個のIg結合部位を所有する。一方の部位は、Fcγ(IgのIgGクラスの定常領域)に対するものであり、他方の部位は、ある特定のIg分子のFab部分(抗原認識に関与しているIgの部分)に対するものである。ドメインのそれぞれはFab結合部位を含有することが報告されている。SpAの非Ig結合部分はC末端に位置され、X領域またはX−ドメインと呼ばれている。
本発明の方法は、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー媒質または樹脂からのタンパク質の漏出を定量するために使用することができ、そのようなタンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、タンパク質に結合している分子を単離するまたは除去するために使用される。例示的な実施形態において、本発明の方法は、アフィニティークロマトグラフィー媒質または樹脂からのタンパク質の漏出を定量するために使用され、そのような媒質または樹脂は、限定されないが、PrA、PrGおよびPrLならびにこれらの誘導体、変異体および断片を含む混合物から、免疫グロブリンを単離するまたは免疫グロブリンから除去するために使用される。
タンパク質を標識することができる任意の適した蛍光タグまたは色素が、本発明の方法に使用され得る。一般に、70,000cm−1M−1以上の吸光係数εmaxを有し、80%を超える量子収量を有し、最小限の光退色または消光を示す、蛍光タグまたは色素を使用することが望ましい。使用される色素は、実験の条件下、例えば、約1.0から約10.0までのpH範囲の下で安定であるべきである。タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー媒質に関して、アミン、チオールおよびカルボキシ反応性色素を使用することが望ましい。例示的なアミン反応性蛍光色素は、限定されないが、スルホスクシンイミジルエステルを含むスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、塩化スルホニルおよびテトラフルオロフェニルエステルを含む。例示的なチオール反応性色素は、限定されないが、マレイミド、フェニル水銀、ヨードアセトアミド、チオ硫酸塩、ローダミン誘導体およびベンゾオキサジアゾ誘導体を含む。例示的な実施形態において、タンパク質をベースとするアフィニティークロマトグラフィー媒質を標識するために使用され得る色素は、AlexaFluor 488(Invitrogen、Carlsbad、CA)、Dylight 488(ThermoFisher、Waltham、MA)、HiLyte Fluor(商標)488ならびに5−FAM、SEおよび6−FAM、SE(Anaspec、San Jose、CA)を含む。
タンパク質をベースとするクロマトグラフィー媒質または樹脂中のタンパク質を標識した後、共有結合しているタンパク質は、アフィニティー媒質または樹脂から解離される。共有結合している標識されたタンパク質をアフィニティー媒質から解離させる方法は、限定されないが、化学的方法または酵素的方法を含む。例示的な化学的処理方法には、UV吸収に著しく干渉しない、酸または塩基触媒による加水分解が使用され得る。本発明の方法に使用され得る例示的な酸は、限定されないが、塩酸などの一価の酸、硫酸などの二価の酸およびリン酸などの三価の酸を含む。本発明の方法に使用され得る例示的な塩基は、限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化セシウムを含む。加えて、ある特定のペプチド結合を切断し、これによって、標識されたタンパク質を、これが吸着している固体支持体から解離させることができる、CNBrなどの化学物質が使用され得る。例えば、UhlenおよびNilsson、In Proc.Biotech 85(Europe)、173頁(1985)を参照されたい。
化学的または酵素的に処理された樹脂は、続いてろ過され、微粒子が含まれていない上清を得る。上清は、消化された標識されたタンパク質(例えば、PrA)を含有し、この蛍光が、例えば、UV/Vis分光光度計を使用して、275nmにて測定され得る。この示数は、消化されたタンパク質(例えば、樹脂から消化されたプロテインAおよびプロテインA断片)によって寄与されるUV吸収を含む。タンパク質の濃度(PrA濃度または[PrA])を特異的に得るために、蛍光示数における化学物質または酵素および蛍光色素からの寄与は、差し引かれる必要がある。タンパク質(例えば、PrA)を解離させるために使用される化学物質または酵素からの寄与、UVenz/chemは、希釈係数中に要因として含める化学物質または酵素の出発濃度を測定することによって検出することができる。同様に、蛍光タグまたは色素からの寄与は、通常は励起波長、UVmaxにおけるUVである、蛍光タグまたは色素のピークにおけるUV吸収を得ることによって計算することができる。それぞれの色素についての比UV275/UVmax(f)は、典型的には、製造供給元から得ることができる。例として、プロテインAの吸光係数が0.149であると仮定すれば、プロテインA濃度は、式:[UV275−UVenz/chem−UVmax×f]/0.149を使用して得ることができる。
請求されている本発明による種々の方法において、関心対象の溶出された分子または分析物(例えば、免疫グロブリンまたはIg)の濃度が、浸出されたタンパク質の計算に必要とされ、これは、溶出された分子1mg当たりの浸出されたタンパク質のngとして測定される。本発明による例示的な方法において、溶出された分子は免疫グロブリンであり、これは、PrA、PrGまたはPrLをベースとするアフィニティークロマトグラフィー媒質を使用して単離される。いくつかの実施形態において、溶出された分子、例えば、免疫グロブリンは、アフィニティークロマトグラフィー媒質から、pH、イオン強度/塩濃度および/または温度における勾配または段階変化による変化を使用して放出される。例えば、IgGの場合には、PrAをベースとするクロマトグラフィー媒質からの溶出は、典型的には、溶出pHを5未満であるが2以上に低下させ、最も望ましくはpH2と4との間に低下させることによって達成される。例示的な溶出緩衝液は、酢酸、グリシンおよびクエン酸を含む。いくつかの実施形態において、IgGの溶出は、2000cm/時以下、1000cm/時以下、800cm/時以下、600cm/時以下、200cm/時以下、100cm/時以下または50cm/時以下の速度での溶出緩衝液の流れによって達成される。一般に、流速が遅ければ遅いほど、より多くのIgGが媒質に結合し、溶出IgG濃度が典型的に、より高くなる。溶出流速が5cm/時未満の場合には、媒質は、これが結合することができるIgGの最大量に近いIgGに結合し、ひいては静的結合容量に到達する。過剰量のIgGが、静的結合容量試験に使用され、通常は、媒質の最大結合容量の3−5倍を超える。したがって、浸出されたプロテインAの量は通常、溶液中のIgG1mg当たりのプロテインAのngとして定義される。
細孔制御ガラスをベースとするプロテインAアフィニティークロマトグラフィー樹脂(例えば、ProSep(登録商標)−vA High CapacityおよびProSep(登録商標)Ultra PrA(Millipore))を、Alexa Fluor 488色素で標識した。簡単に言えば、1mgのAlexa Fluor 488色素(Invitrogen、Carlsbad、CA)を、約1mlのDMSO中に溶かした。PrA樹脂のそれぞれおよそ3mlをNaHCO3(0.1M pH8.4)で処理し、真空乾燥させ、15mlEvergreenカラム(Evergreen Scientific、Los Angeles、CA)中に充填した。およそ3mlのNaHCO3をそれぞれのカラムに加え、カラムに蓋をし、アルミ箔で覆った。約100μlの色素をそれぞれのカラムに加え、振盪機上に約0.5時間置いた。さらに100μlの色素溶液をカラムに加え、さらに1時間振盪した。続いて、カラムをスラリーにし、各回約2カラム体積のNaHCO3を用いて3回洗浄し、各回約2カラム体積の20%エタノールを用いて3回洗浄し、各回約2カラム体積のNaHCO3を用いて2回洗浄した。
蛍光標識されたPrA樹脂の一方の画分を、続いて酵素的に消化した。蛍光標識されていないPrA樹脂を、対照として使用した。簡単に言えば、PrA樹脂のそれぞれ1mlを0.1M NH4HCO3で処理し、真空乾燥させた。トリプシンを0.1M NH4HCO3中に溶かし、275nmにおけるUV測定が、0.7と1との間であるように測定を行った。続いて、約3mlのトリプシン溶液をそれぞれの樹脂に加え、37℃にて約2時間インキュベートした。インキュベートされた媒質スラリーを、7mLのEvergreen滴下カラムを通してろ過し、媒質から上清を除去した。ろ液の測定をUV275nmDにて行い、トリプシンのUV275nmTを、この値から差し引いた。同様に、ろ液のUV495nmF測定を行った。プロテインA濃度を得るために、0.149の吸光係数を使用し、式(UV275nmD×希釈係数−UV275nmT−f×UV495nmF×希釈係数)/0.149を使用して、消化されたプロテインAの濃度である[PA]を得た。fの値は、UV275nm/UV495nmにおける色素のUV吸光係数の比であり、蛍光色素の製造供給元によって提供される。
標識されたおよび標識されていないプロテインAをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂のIgG溶出液濃度/静的容量を、以下のように決定した。静的容量の測定はまた、PrA樹脂が、例えば、PrA樹脂とIgGとの相互作用を阻害する蛍光タグで標識されているかどうかの指標である。
Claims (26)
- PrAをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのPrA漏出を定量するための方法であって、
(a)PrAをベースとするクロマトグラフィー樹脂を、1種以上の蛍光タグで標識するステップ;
(b)標識された樹脂を、同等の第1および第2の部分に分割するステップ;
(c)第1の部分を化学的処理又は酵素的処理により処理し、標識されたPrAを樹脂から解離させ、ならびに第2の部分に過剰量の免疫グロブリン(Ig)を加えるステップ;
(d)ステップ(c)における第1の部分中の処理された樹脂から、蛍光(FLdigest)およびPrA濃度([PrA])を測定するステップ;ならびに
(e)ステップ(c)における第2の部分からのIg溶出液中の樹脂Ig溶出液濃度([Ig])および蛍光シグナル(FLIg)を測定するステップ
を含み、
PrA漏出は、{(FLIg)/((FLdigest)/[PrA]))}/[Ig]を計算することによって定量される、方法。 - PrAをベースとするアフィニティークロマトグラフィー樹脂からのPrA漏出を定量するための方法であって、
(a)PrAをベースとするクロマトグラフィー樹脂を、1種以上の蛍光タグで標識するステップ;
(b)標識された樹脂に過剰量の免疫グロブリン(Ig)を加え、樹脂からのIg溶出液(FLIg)中の樹脂Ig溶出液濃度([Ig])および蛍光シグナルを測定するステップ;
(c)残余のIgを樹脂から除去した後、樹脂を化学的処理又は酵素的処理により処理し、標識されたPrAを樹脂から解離させるステップ;ならびに
(d)処理された樹脂から、蛍光(FLdigest)およびPrA濃度([PrA])を測定するステップ
を含み、
PrA漏出は、{(FLIg)/((FLdigest)/[PrA])}/[Ig]を計算することによって定量される、方法。 - 免疫グロブリンがIgGである、請求項1の方法。
- 1種以上の、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性交換クロマトグラフィー、弱分配クロマトグラフィーまたはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して、浸出されたPrAを除去するステップをさらに含む、請求項1の方法。
- 蛍光タグが、Alexa Fluor(登録商標)488、Dylight(登録商標)488、HiLyte(商標)Fluor 488、5−FAM,SEおよび6−FAM,SEからなる群から選択される、請求項1の方法。
- ステップ(c)において第1の部分を化学的処理により処理する、請求項1の方法。
- ステップ(c)において第1の部分を酵素的処理により処理する、請求項1の方法。
- 酵素的処理が、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、サーモリシンおよびスブトレリシン(subtlelysin)の使用を含む、請求項7の方法。
- 化学的処理が、酸または塩基の使用を含む、請求項6の方法。
- PrAをベースとするクロマトグラフィー樹脂が、ProSep(登録商標)A high capacity、ProSep(登録商標)A Ultra、ProSep(登録商標)Ultra Plus、Mabselect(商標)、Mabselect Xtra(商標)、Mabselect Sure(商標)、Sepharose(登録商標)Protein A、Sartobind(登録商標)Protein AおよびProtein Sepharose(登録商標)Fast Flowからなる群から選択される、請求項1の方法。
- 蛍光が、蛍光光度計を使用して測定される、請求項1の方法。
- Igが、適したpHを使用して溶出される、請求項1の方法。
- Igがモノクローナルである、請求項1の方法。
- Igがポリクローナルである、請求項1の方法。
- 免疫グロブリンがIgGである、請求項2の方法。
- 1種以上の、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性交換クロマトグラフィー、弱分配クロマトグラフィーまたはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して、浸出されたPrAを除去するステップをさらに含む、請求項2の方法。
- 蛍光タグが、Alexa Fluor(登録商標)488、Dylight(登録商標)488、HiLyte(商標)Fluor 488、5−FAM,SEおよび6−FAM,SEからなる群から選択される、請求項2の方法。
- ステップ(c)において樹脂を化学的処理により処理する、請求項2の方法。
- ステップ(c)において樹脂を酵素的処理により処理する、請求項2の方法。
- 酵素的処理が、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、サーモリシンおよびスブトレリシンの使用を含む、請求項19の方法。
- 化学的処理が、酸または塩基の使用を含む、請求項18の方法。
- PrAをベースとするクロマトグラフィー樹脂が、ProSep(登録商標)A high capacity、ProSep(登録商標)A Ultra、ProSep(登録商標)Ultra Plus、Mabselect(商標)、Mabselect Xtra(商標)、Mabselect Sure(商標)、Sepharose(登録商標)Protein A、Sartobind(登録商標)Protein AおよびProtein Sepharose(登録商標)Fast Flowからなる群から選択される、請求項2の方法。
- 蛍光が、蛍光光度計を使用して測定される、請求項2の方法。
- Igが、適したpHを使用して溶出される、請求項2の方法。
- Igがモノクローナルである、請求項2の方法。
- Igがポリクローナルである、請求項2の方法。
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