CN102187227A - 定量蛋白质系亲和色谱树脂的蛋白质泄露的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供定量蛋白质系亲和色谱介质(例如蛋白质A、蛋白质G和蛋白质L系亲和色谱介质)的蛋白质泄露的方法,其中此类蛋白质用于分离和/或除去结合所述蛋白质的分子(例如免疫球蛋白)。
Description
相关专利申请
本申请要求提交日为2008年9月15日的美国临时专利申请61/192,082的优先权,其全部内容以其整体通过援引加入本文。
技术领域
本发明涉及定量蛋白质系亲和色谱树脂的蛋白质泄露的方法,所述树脂包括但不限于蛋白质A、蛋白质G和蛋白质L系亲和色谱树脂。
背景技术
蛋白质系亲和色谱已广泛用于从实验室规模、试生产规模到生产规模的各种规模的蛋白质、DNA以及其他化学和生物分子的纯化。参见,例如,Hermanson等人,Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press,Inc.San Diego,CA,pgs.317-346(1992)。其中,蛋白质A(PrA)、蛋白质G(PrG)和蛋白质L(PrL)系亲和色谱是公知的并广泛使用的用于免疫球蛋白(Ig)的检测和/或纯化的方法,然而,它们就结合Ig而言各自具有不同的特异性。
举例而言,PrA系试剂在生物技术领域中具有特别广泛的应用,例如在亲和色谱中用于捕获和纯化抗体以及用于抗体检测法中。目前,PrA系的亲和介质或树脂可能是用于从包括细胞培养物在内的不同样品分离单克隆抗体及其片段的最广泛使用的亲和介质。因此,各种包含蛋白质A-配体的基质是可商购的,包括,例如,ProSep-vA High Capacity、ProSep vA Ultra和ProSep UltraPlus(Millipore)以及Protein A SepharoseTM、rmp Protein A Sepharose Fast Flow、MabSelectTM、MabSelect XtraTM和MabSelect SuRe(GE Healthcare)、Poros MabCapture A(Applied Biosystems)以及Sartobind Protein A(Sartorius)。
发明概述
尽管蛋白质系亲和色谱树脂例如蛋白质A、G和L系亲和色谱树脂对于纯化与它们结合的分析物或分子,例如免疫球蛋白(Ig)(在PrA、PrG和PrL的情况下),是非常合乎需要的,但是一个缺点是蛋白质例如蛋白质A、G或L与感兴趣的分析物或分子例如免疫球蛋白一起从色谱柱泄露。例如,由于例如能够以高容量特异地结合抗体并能够达到高纯度,所以蛋白质A系亲和色谱对于大规模抗体纯化是非常合乎需要的,然而,由于洗出的PrA自身的生物学活性和毒理学性质,其通常被认为是免疫球蛋白洗出液中不期望的杂质。因此,在本发明的一些方面,监测PrA泄露并最终在后续的色谱步骤中将其除去是有益的。例如,一种最小化PrA泄露的方法是使用显示出从色谱柱的最小量PrA泄露的PrA树脂。因此,在一些方面,本发明的方法可用于鉴定显示出从色谱柱的最小量PrA泄露的蛋白质系亲和色谱树脂,包括但不限于PrA、PrG和PrL系亲和色谱树脂。此类蛋白质系亲和色谱树脂包括已知的树脂和可能在将来被开发的那些树脂。
还开发了许多基于酶联免疫吸附测定法(ELISA)的筛选测定法用于检测色谱柱的PrA泄露。然而,大多数这些测定法在本质上是定性的并且通常显示出较高的变异性(例如,≥25%),因而不适合用作分析工具用于例如提供PrA系亲和色谱树脂的比较、鉴定显示出最小量PrA泄露的树脂以及用于在亲和色谱和后续色谱步骤之后监测抗体洗出液池中的洗出的PrA。
由于与荧光标记物相关的高灵敏度和选择性,所以此类标记物被广泛用于生物化学和化学研究中。例如,之前已使用荧光染料检测来自亲和树脂的洗出的蛋白质A,然而,这些染料大多用于生成定性信息例如检测,并且不能提供任何定量信息,例如洗出的PrA的量。参见,例如,Carter-Franklin等人,Journal of Chromatography A,1163:105-111(2007)。
本发明至少部分涉及用例如荧光标记物检测色谱介质或树脂的蛋白质(例如PrA)泄露的定量方法。本发明方法显示出低于10%的变异性并特别适于鉴定显示出最小量PrA泄露的PrA色谱树脂。
本发明一方面提供定量PrA系亲和色谱树脂的PrA泄露的方法,其中所述方法包括以下步骤:(a)用一种或多种荧光标记物标记所述PrA系色谱树脂;(b)将标记的树脂分成相等的第一部分和第二部分;(c)用适合的方法处理第一部分以从所述树脂释放标记的PrA,并且向所述第二部分加入过量的Ig;(d)测量来自步骤(c)所述第一部分中经处理的树脂的荧光(FL消化物)和PrA浓度([PrA]);以及(e)测量来自步骤(c)所述第二部分的树脂Ig洗脱浓度([Ig])和Ig洗出液中的荧光信号(FLIg),其中通过计算{(FLIg)/((FL消化物)/[PrA])}/[Ig]定量PrA泄露。
本发明的另一方面提供定量PrA系亲和色谱树脂的PrA泄露的方法,其中所述方法包括以下步骤:(a)用一种或多种荧光标记物标记所述PrA系色谱树脂;(b)向标记的树脂加入过量的Ig并且测量来自所述树脂的树脂Ig洗脱浓度([Ig])和Ig洗出液中的荧光信号(FLIg);(c)从所述树脂除去残留的Ig,然后用适合的方法处理所述树脂以从所述树脂释放标记的PrA;以及(d)测量来自经处理的树脂的荧光(FL消化物)和PrA浓度([PrA]),其中通过计算{(FLIg)/((FL消化物)/[PrA])}/[Ig]定量PrA泄露。
在一些实施方案中,本发明的方法用于定量PrG系亲和色谱树脂的蛋白质G(PrG)的泄露。
因此,本发明的又一方面提供定量PrG系亲和色谱树脂的PrG泄露的方法,所述方法包括以下步骤:(a)用一种或多种荧光标记物标记所述PrG色谱树脂;(b)将标记的树脂分成相等的第一部分和第二部分;(c)用适合的方法处理第一部分以从所述树脂释放标记的PrG,并且向所述第二部分加入过量的Ig;(d)测量来自步骤(c)所述第一部分中经处理的树脂的荧光(FL消化物)和PrG浓度([PrG]);以及(e)测量来自步骤(c)所述第二部分的树脂Ig洗脱浓度([Ig])和Ig洗出液中的荧光信号(FLIg),其中通过计算{(FLIg)/((FL消化物)/[PrG])}/[Ig]定量PrG泄露。
在又一方面,定量PrG系色谱树脂的PrG泄露的方法包括以下步骤:(a)用一种或多种荧光标记物标记所述PrG系色谱树脂;(b)向标记的树脂加入过量的Ig并且测量来自所述树脂的树脂Ig洗脱浓度([Ig])和Ig洗出液中的荧光信号(FLIg);(c)从所述树脂除去残留的Ig,然后用适合的方法处理所述树脂以从所述树脂释放标记的PrG;以及(d)测量来自经处理的树脂的荧光(FL消化物)和PrG浓度([PrG]),其中通过计算{(FLIg)/((FL消化 物)/[PrG])}/[Ig]定量PrG泄露。
在进一步的实施方案中,本发明的方法用于定量PrL系亲和色谱树脂的蛋白质L(PrL)的泄露。
因此,在本发明的另一方面提供定量PrL系亲和色谱树脂的PrL泄露的方法,所述方法包括以下步骤:(a)用一种或多种荧光标记物标记所述PrL系色谱树脂;(b)将标记的树脂分成相等的第一部分和第二部分;(c)用适合的方法处理第一部分以从所述树脂释放标记的PrL,并且向所述第二部分加入过量的Ig;(d)测量来自步骤(c)所述第一部分中经处理的树脂的荧光(FL消化物)和PrL浓度([PrL]);以及(e)测量来自步骤(c)所述第二部分的树脂Ig洗脱浓度([Ig])和Ig洗出液中的荧光信号(FLIg),其中通过计算{(FLIg)/((FL消化物)/[PrL])}/[Ig]定量PrL泄露。
在另一方面,定量PrL系色谱树脂的PrL泄露的方法包括以下步骤:(a)用一种或多种荧光标记物标记所述PrL系色谱树脂;(b)向标记的树脂加入过量的Ig并且测量来自所述树脂的树脂Ig洗脱浓度([Ig])和Ig洗出液中的荧光信号(FLIg);(c)从所述树脂除去残留的Ig,然后用适合的方法处理所述树脂以从所述树脂释放标记的PrL;以及(d)测量来自经处理的树脂的荧光(FL消化物)和PrL浓度([PrL]),其中通过计算{(FLIg)/((FL消化物)/[PrL])}/[Ig]定量PrL泄露。
另外,不希望受到理论的限制,设想本发明方法可用于定量蛋白质系亲和色谱法的任何蛋白质和/或其片段的泄露,所述蛋白质系亲和色谱法用于从混合物分离或除去结合所述蛋白质的分析物或分子。
因此,本发明另一方面提供定量蛋白质系亲和色谱树脂的蛋白质泄露的方法,其中所述方法包括以下步骤:(a)用一种或多种荧光标记物标记所述蛋白质系亲和色谱树脂;(b)将标记的树脂分成相等的第一部分和第二部分;(c)用适合的方法处理第一部分以从所述树脂释放标记的蛋白质,并且向所述第二部分加入过量的结合所述蛋白质的分析物;(d)测量来自步骤(c)所述第一部分中经处理的树脂的荧光(FL消化物)和蛋白质浓度([PrL]);以及(e)测量来自步骤(c)所述第二部分的树脂分析物洗出液浓度([分析物])和分析物洗出液中的荧光信号(FL分析物),其中通过计算{(FL分析物)/((FL消化 物)/[PrL])}/[分析物]定量Pr泄露。
本发明另一方面提供定量蛋白质系亲和色谱树脂的蛋白质泄露的方法,其中所述方法包括以下步骤:(a)用一种或多种荧光标记物标记所述蛋白质系色谱树脂;(b)向标记的树脂加入过量的分析物并测量来自所述树脂的树脂分析物洗脱浓度([Ig])和分析物洗出液中的荧光信号(FL分析物);(c)从所述树脂除去残留的分析物,然后用适合的方法处理所述树脂以从所述树脂释放标记的蛋白质;以及(d)测量来自经处理的树脂的荧光(FL消化物)和蛋白质浓度([Pr]),其中通过计算{(FL分析物)/((FL消化物)/[Pr])}/[分析物]定量蛋白质泄露。
在各种实施方案中,本发明方法可进一步包括用阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和疏水交换色谱、弱分配色谱、羟基磷灰石色谱中的一种或多种或它们的任意组合除去洗出的蛋白质例如PrA、PrG或PrL的步骤。示例性的色谱形式包括但不限于填充柱和膜装置形式。
在本发明的方法的各种实施方案中,荧光标记物选自Alexa Fluor 488TM(Invitrogen,Carlsbad,CA)、Dylight 488TM(ThermoFisher,Waltham,MA)、HiLyte FluorTM 488、5-FAMTM,SE和6-FAMTM,SE(Anaspec,San Jose,CA)。
在各种实施方案中,在本发明的方法中使用的用于从所述树脂释放所述标记的蛋白质例如PrA、PrG和PrL的适合的方法包括化学处理或酶处理。示例性的酶处理包括使用消化所述蛋白质诸如PrA、PrG或PrL的酶,包括但不限于例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和枯草溶菌素(subtlelysin)。示例性的化学处理包括使用适合的酸或碱。
在本发明的方法的各种实施方案中,使用本发明的方法比较可商购的PrA系亲和色谱树脂以鉴定显示出最小量的PrA泄露的那些树脂。示例性的树脂包括但不限于ProSep-vA High Capacity、ProSep vA Ultra和ProSep UltraPlus(Millipore);Protein A SepharoseTM、MabSelectTM、MabSelect XtraTM和MabSelect SuRe(GE Healthcare);Sartobind Protein A(Sartorius)以及POROS MabCaptureTM A(Applied Biosystems)。
在本发明的方法的一些方面,可使用本领域公知的技术例如使用6M盐酸胍或4-8M脲从所述树脂除去残留Ig(例如IgG)。
在本发明的方法的一些方面,分析物或分子(例如Ig)的过量是用于分离或除去所述分析物或分子的蛋白质系亲和色谱树脂或介质的最大结合容量的至少2-5倍大的量。在一些实施方案中,所述分析物或分子是结合PrA系亲和色谱介质或树脂的Ig(例如IgG),其中所述Ig(例如IgG)的过量是所述树脂的结合容量的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或大于5倍。一般而言,可基于通常由所述树脂生产商提供的所述树脂的最大结合容量来确定,或者可由本领域普通技术人员根据本领域的公知技术容易地计算所述分析物或分子(例如Ig)的所述过量。
可使用任何适合的方法包括但不限于用荧光计测量荧光。用荧光计检测的样品载荷可以是比色皿或孔板形式。
在本发明的方法的各种实施方案中,可使用任何适合的方法例如使用适合的pH洗脱所述Ig(例如IgG)。在示例性的实施方案中,用于IgG洗脱的适合的pH是约2.0-约4.0的pH。在特定的实施方案中,将pH 2.0的甘氨酸用于IgG洗脱。
附图简述
图1描绘了本发明示例性方法的示意图,其中用荧光染料(Alexa FluorTM 488)标记PrA。简而言之,如图1所描绘,将标记的介质分成两个1ml部分。一个部分用胰蛋白酶进行酶处理。通过在UV/Vis分光光度计上于UV275nm以及在激发波长为495nm的荧光计上于发射波长519nm读取上清,得到FL消化物/[PrA]比值。将另一部分暴露于约为估计的介质容量的5倍的Ig(例如IgG),这样形成过量IgG。在用PBS(10mM磷酸盐缓冲液)洗涤过量IgG之后,用pH 2的0.1M甘氨酸洗脱结合至PrA介质的IgG。温和混合后,在UV/Vis分光光度计上于UV280nm分析IgG洗脱([IgG])并在激发波长为495nm的荧光计上于发射波长519nm分析IgG洗脱(FLIgG)。
图2描绘的图显示标记的(例如用Alexa Fluor 488)和未标记的PrA的静态IgG结合是相等的。简而言之,在三个不同的日期试验来自相同批次的荧光标记的A型树脂(FL-A-1至FL-A-5)和未标记的树脂(A-1至A-3)的IgG静态结合容量。如图2中的图所描绘的,结果表明标记的和未标记的A型PrA亲和色谱树脂具有相等的静态结合容量值。用不同的PrA系亲和色谱B型树脂进行相同的实验,用FL-B-1至FL-B-4表示标记树脂并用B-1至B-3表示未标记的树脂。如图2所显示的,标记的和未标记的B型树脂也显示相等的IgG静态结合容量值。因此,荧光标记对于不同树脂的PrA-IgG亲和作用显示出极小的干扰。该结果还总结于图2的表中。来自标记的和未标记的A型树脂(介质A)的树脂静态结合容量(Qs)显示于该表的左侧,来自标记的和未标记的B型树脂(介质B)的树脂静态结合容量显示该表的右侧。还显示了标准偏差(STD)和变异系数(CV)。标记的和未标记的介质A(4%对3%)以及标记的和未标记的介质B(7%对6%)的试验变异性是可比的。
图3描绘的表格总结了五个不同批次的二氧化硅系蛋白质亲和树脂的PrA泄露值,各自用两批不同的Alexa Fluor 488试验。如表格中所描述的,用两种不同批次的荧光染料进行的两组实验达到小于8.4%的变异性。
发明详述
本发明涉及定量蛋白质系亲和色谱介质或树脂例如PrA、PrG或PrL系亲和色谱介质或树脂的蛋白质例如PrA、PrG或PrL的泄露的方法。不希望受到理论的限制,设想本发明的方法可用于定量蛋白质系亲和色谱介质或树脂的任何蛋白质的泄露,其中所述蛋白质用于分离或除去结合所述蛋白质的分子,包括但不限于例如结合Ig的蛋白质A、蛋白质G和蛋白质L。
为了使本申请更容易被理解,首先定义一些术语。另外的定义列于整个发明详述中。
I.定义
如本文所使用的,术语“蛋白质A”或“PrA”包括从天然来源例如细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)回收的蛋白质A、合成产生的蛋白质A(例如通过肽合成或通过重组技术),包括保留了结合具有CH2/CH3区的蛋白质(例如免疫球蛋白)的能力的变体或衍生物。PrA的商业来源包括Repligen、GE Healthcare、Fersenius Medical和Fermatech。
如本文中使用的,术语“色谱(法)”指任何类型的纯化技术,该纯化技术例如通过在固体基质和流动相(包括但不限于溶液、缓冲液或溶剂)之间的分配差异,将在混合物中的感兴趣的分析物(例如免疫球蛋白或Ig)与其他分子分开,并使感兴趣的分析物被分离。
如本文所使用的,术语“亲和色谱”、“亲和分离”或“亲和纯化”指涉及将包含靶分析物或分子(例如免疫球蛋白或Ig)的样品添加到携带与所述分析物结合的蛋白质例如PrA、PrG和PrL的固体支持体的任何纯化或测定技术。当靶分析物或分子(例如Ig)与所述蛋白质(例如PrA)结合并且不需要的杂质流出后,可用适合的方法洗脱所述靶分析物或分子。例如,可使用具有适合的pH例如约2-约5的pH或约2-约4的pH的适合的洗脱缓冲液回收所述分析物例如IgG。用于这一目的的洗脱缓冲液的实例包括柠檬酸盐、甘氨酸或醋酸盐缓冲液。
如本文所使用的,术语“PrA系亲和色谱”或“蛋白质A系亲和色谱”指使用蛋白质A或者其衍生物或变体分离或纯化物质和/或分子例如免疫球蛋白,其中所述PrA通常被固定在固体支持体上。
如本文所使用的,术语“PrG系亲和色谱”或“蛋白质G系亲和色谱”指使用蛋白质G或者其衍生物或变体分离或纯化物质和/或分子例如免疫球蛋白,其中所述PrG通常被固定在固体支持体上。
如本文所使用的,术语“PrL系亲和色谱”或“蛋白质L系亲和色谱”指使用蛋白质L或者其衍生物或变体分离或纯化物质和/或分子例如免疫球蛋白,其中所述PrL通常被固定在固体支持体上。
术语“固相”或“固体支持体”通常指用于分离或除去感兴趣的分析物或分子的蛋白质例如蛋白质A(PrA)、蛋白质G(PrG)或蛋白质L(PrL)能够粘附或共价结合的非水基质。例如,PrA可与多种材料偶联,例如琼脂糖、多糖、葡聚糖、硅胶、合成聚合物(聚苯乙烯-二乙烯苯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚砜、聚碳酸酯、聚乙烯醚以及它们对应的共聚物)和玻璃球。固体支持体形式包括但不限于纯化柱、不连续颗粒的间断相、填充床柱以及膨胀床柱、膜等。在一些实施方案中,作为任选的预备步骤,可在对感兴趣的蛋白质实施色谱法之前用适合的缓冲液平衡蛋白质A亲和色谱的固相。示例性的平衡缓冲液包括pH 7.4的10mM磷酸盐缓冲液。
如本文所使用的,术语“亲和树脂”或“亲和色谱树脂”指色谱配体(例如PrA、PrG或PrL)所结合的色谱支持体。所述配体能够结合待从混合物中纯化或除去的感兴趣的分子(例如免疫球蛋白)。用于蛋白质A系亲和色谱的示例性蛋白质A系亲和色谱树脂包括固定至可控孔度玻璃骨架(controlled pore glass backbone)例如PROSEP ATM和PROSEP vATM树脂、High Capacity,Ultra和PROSEP Ultra Plus(Millipore Inc.)上的蛋白质A;固定至聚苯乙烯固相例如POROS 50ATM树脂和POROS MabCapture ATM(Applied BioSystems Inc.)上的蛋白质A;或固定至琼脂糖固相例如rPROTEIN A SEPHAROSE FAST FLOWTM或MABSELECTTM树脂(GEHealthcare)上的蛋白质A。
可在蛋白质A亲和色谱步骤之前或之后对洗脱的Ig(例如IgG)进行另外的纯化步骤。示例性的进一步的纯化步骤包括但不限于过滤、羟基磷灰石色谱、疏水作用色谱(HIC)、硫酸铵沉淀、阴离子或阳离子交换色谱、乙醇沉淀、反相HPLC、弱分配色谱、色谱聚焦、凝胶过滤等。
在一些实施方案中。可将洗脱的Ig(例如IgG)配制在药学可接受的载体中并用于各种诊断、治疗或已知的此类分子的其他用途。
如本文所使用的,术语“蛋白质洗出(protein leaching)”、“蛋白质泄露(protein leakage)”、“洗出的蛋白质(leached protein)”“Pr洗出(Pr leaching)”、“Pr泄露(Pr leakage)”和“洗出的Pr(leached protein)”指蛋白质(Pr)(包括完整的和/或其片段)从其结合的固相分离或洗脱。在一些实施方案中,用本发明的方法定量PrA、PrG或PrL系亲和色谱树脂的PrA、PrG或PrL泄露。蛋白质泄露可由许多不同的原因引起。例如,PrA泄露或PrA洗出可由诸如机械剪切、低/高pH暴露、接触免疫球蛋白、蛋白水解活性等原因引起。可使用本领域公知的各种技术定量测量蛋白质A洗出,包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、SDS PAGE、蛋白质印迹法、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法等。洗出的PrA的量通常表示为ng PrA/ml亲和基质,或表示为ng蛋白质A/mg抗体。
如本文所使用的,术语“免疫球蛋白”、“Ig”或“抗体”(在本文中互换地使用)指具有特异性结合抗原的能力并具有由两条重链和两条轻链组成的四条多肽链基本结构的蛋白质,其中所述链通过例如链间二硫键被稳定化。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(在本文中互换地使用)指具有特异性结合抗原的能力并具有由一条重链和一条轻链组成的二条多肽链结构的蛋白质,其中所述链通过例如链间肽键被稳定化。术语“结构域”指重链或轻链多肽的球形区域,其包括例如通过β-折叠和/或链内二硫键稳定化的肽环(例如包含3-4个肽环)。本文中将结构域进一步称作“恒定的”或“可变的”,在“恒定”结构域的情况下是根据各类成员的结构域中相对缺少序列变异,或者在“可变”结构域的情况下是根据各类成员的结构域中的显著变异。在本领域中,抗体或多肽“结构域”常常被互换地称作抗体或多肽“区”。抗体轻链的“恒定”结构域被互换地称作“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”、“CL”区或“CL”结构域。抗体重链的“恒定”结构域被互换地称作“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“CH”区或“CH”结构域。抗体轻链的“可变”结构域被互换地称作“轻链可变区”、“轻链可变结构域”、“VL”区或“VL”结构域。抗体重链的“可变”结构域被互换地称作“重链可变区”、“重链可变结构域”、“VH”区或“VH”结构域。
在一些实施方案中,免疫球蛋白是IgG抗体。免疫球蛋白或抗体可以是单克隆的或多克隆的,并可以单体或多聚体形式存在,例如以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。术语“片段”指抗体或抗体链的部分,其包含少于完整或完全的抗体或抗体链的氨基酸残基。可通过对完整或完全的抗体或抗体链进行化学或酶处理获得片段。还可通过重组方式获得片段。示例性的片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc和/或Fv片段。
术语“抗原结合片段”指结合抗原或与完整抗体(即与它们所衍生自的完整抗体)竞争抗原结合(即特异性结合)的免疫球蛋白或抗体的多肽部分。结合片段可通过重组DNA技术、或者通过酶裂解或化学裂解完整的免疫球蛋白来产生。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链以及单链抗体。
II.wtPrA结构和免疫球蛋白结合位点
PrA是衍生自细菌金黄色葡萄球菌的约42-kDa的蛋白质并在N-端包含五个串联的高同源性胞外免疫球蛋白(Ig)结合结构域,命名为E、D、A、B和C。PrA的各胞外结构域具有不同的Ig结合位点。一个位点针对Fcγ(IgG型Ig的恒定区),另一个位点针对某些Ig分子的Fab部分(负责抗原识别的Ig部分)。据报导,各所述结构域包含Fab结合位点。SpA的非-Ig结合部分位于C-端并称作X-区或X-结构域。
编码wtPrA的基因的克隆记载于美国专利5,151,350,其完整内容以其整体通过援引加入本文。
III.示例性的Pr系亲和色谱介质
本发明的方法可用于定量蛋白质亲和色谱介质或树脂的蛋白质泄露,其中此类蛋白质系亲和色谱树脂用于分离或纯化结合所述蛋白质的分子。在示例性实施方案中,本发明的方法用于定量亲和色谱介质或树脂的蛋白质泄露,其中此类介质或树脂用于从混合物中分离或除去免疫球蛋白,所述蛋白质包括但不限于PrA、PrG和PrL及其衍生物、变体和片段。
可用于本发明方法中的示例性的蛋白质A系树脂包括但不限于PROSEP vA High Capacity、PROSEP A Ultra、PROSEP Ultra Plus(Millipore)、Protein A Sepharose FastFlow、rmp Protein A Sepharose FastFlow、MabSelect、MabSelect Xtra、MabSelect SuRe(GEHealthcare)、POROS A、POROS MabCapture A(Applied Biosystems)和Sartobind Protein A(Sartorius)。示例性的蛋白质G系树脂包括但不限于PROSEP-G(Millipore)、Protein G SepharoseTM 4 Fast Flow(GEHealthcare)、POROS G(Applied Biosystems)。
IV.示例性的荧光标记物和荧光测量
能够标记蛋白质的任何适合的荧光标记物或染料均可用于本发明的方法中。一般而言,使用消光系数εmax不低于70,000cm-1M-1、量子产率>80%并显示出最小的光漂白或淬灭的荧光标记物或染料是有益的。所使用的染料应在实验条件下例如约1.0-约10.0的pH下是稳定的。对于蛋白质系亲和色谱介质,使用胺、硫醇和羧基反应性染料是有益的。示例性的胺反应性荧光染料包括但不限于琥珀酰亚胺酯(succinimidyl ester)包括磺基琥珀酰亚胺酯(sulfosuccinimidyl ester)、异硫氰酸酯、磺酰氯和四氟苯基酯。示例性的硫醇反应性染料包括但不限于马来酰亚胺、苯基汞、碘乙酰胺、硫代硫酸盐、罗丹明衍生物和苯并噁二唑衍生物。在示例性实施方案中,可用于标记蛋白质系亲和色谱介质的染料包括AlexaFluor 488(Invitrogen,Carlsbad,CA)、Dylight 488(ThermoFisher,Waltham,MA)、HiLyte FluorTM 488以及5-FAM,SE和6-FAM,SE(Anaspec,San Jose,CA)。
本发明的方法通常是基于荧光测量。一般而言,荧光是一类光学光谱,其中分子通过吸收紫外线、可见光或近红外线照射被提高至电子激发态。被激发的分子然后通过发射可使用诸如荧光计的仪器来检测的光衰减至基态或较低的激发电子态。在本发明的方法的情况下,所述荧光染料是结合蛋白质例如PrA的反应性染料。有益的是,此类染料在本发明的方法使用的实验条件例如使用约1.0-约10.0的pH下将荧光强度保持在约20%最大荧光强度的范围内至少半小时。
V.使标记的蛋白质从蛋白质系亲和色谱树脂释放的方法
将蛋白质系色谱介质或树脂的蛋白质标记后,使共价结合的蛋白质从亲和介质或树脂释放。使共价结合标记的蛋白质从亲和介质释放的方法包括但不限于化学方法和酶法。在示例性的化学处理方法中,可使用不显著干扰UV吸收的酸或碱催化的水解。可用于本发明的方法的示例性酸包括但不限于一价酸如盐酸、二价酸如磺酸和三甲酸如磷酸。可用于本发明的方法的示例性碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铯。另外,可使用能够断裂某些肽键由此使标记的蛋白质从其结合的固体支持体释放的化学试剂诸如CNBr。参见,例如,Uhlen和Nilsson,In Proc.Biotech 85(Europe),pg.173(1985)。
示例性的酶处理法包括但不限于使用能够消化蛋白质的酶。示例性的酶包括但不限于例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和枯草溶菌素。
VI.测量来自经化学或酶处理的树脂的荧光和蛋白质浓度
然后,过滤化学或酶处理的树脂得到无颗粒的上清。所述上清包含被消化的标记的蛋白质(例如PrA),可例如使用UV/Vis分光光度计于275nm测量其荧光。该读数包括由被消化的蛋白质(例如从树脂消化的蛋白质A和蛋白A片段)引起的UV吸收。为了特异性地获得所述蛋白质的浓度(例如PrA浓度或[PrA]),需要减去来自化学试剂或酶以及荧光染料的贡献。可通过测量起始的化学试剂或酶浓度(将稀释系数考虑在内)来检测来自用于释放所述蛋白质(例如PrA)的化学试剂或酶的贡献UV酶/化学试剂。还可以通过获得所述荧光标记物或染料的峰UV吸收(通常为激发波长下的UV,UVmax)计算来自所述荧光标记物或染料的贡献。通常可从供应商获得各染料的UV275/UVmax(f)比。例如,假设蛋白质A的消光系数是0.149,可使用下式获得蛋白质A的浓度:[UV275-UV酶/化学试剂-UVmaxXf]/0.149。
通过在某一波长下激发分子并在更长的波长下进行检测以接受发射光谱而生成荧光。一般而言,可以使用供应商建议的最佳激发波长和发射波长。例如对于来自Invitrogen的染料Alexa Fluor 488而言,激发波长是495nm,发射波长是519nm。必要时还可从经过系列稀释的上清获得荧光读数。通常在设定的温度下例如在25℃,在比色皿或孔板形式荧光计上读取荧光。
VII.测量洗出液浓度
在要求保护的发明的各种方法中,需要洗脱的感兴趣的分子或分析物(例如免疫球蛋白或Ig)的浓度用于计算洗出的蛋白质,将其测量为ng洗出的蛋白质每mg洗脱的分子。在示例性的本发明方法中,所述洗脱的分子是免疫球蛋白,用PrA、PrG或PrL系亲和色谱介质将其分离。在一些实施方案中,采用通过梯度变化或阶跃变化改变pH、离子强度/盐浓度和/或温度,使所述洗脱的分子例如免疫球蛋白从所述亲和色谱介质释放。例如,对于IgG而言,通常通过将洗脱pH降低至小于5但是不低于pH 2,最有利地降低至pH 2-4来实现从PrA系色谱介质的洗脱。示例性的洗脱缓冲液包括醋酸、甘氨酸和柠檬酸。在一些实施方案中,通过速率为2000cm/hr或更低、1000cm/hr或更低、800cm/hr或更低、600cm/hr或更低、200cm/hr或更低、100cm/hr或更低、或者50cm/hr或更低的洗脱缓冲液流动达到IgG洗脱。一般而言,流速越慢,越多的IgG结合至所述介质并且洗脱IgG浓度通常越高。当洗脱流速<5cm/hr时,介质结合接近其能够结合的最大量的IgG,并因此达到静态结合容量。将过量(一般为>3-5倍于介质最大结合容量)的IgG用于静态结合容量试验。因此,通常将洗出的蛋白质的量定义为溶液中ng蛋白质A每mg IgG。
通过以下实施例进一步举例说明本发明,这些实施例不应解释为限制性的。在本申请全文中引用的所有文献、专利和公布的专利申请的内容以及附图均通过援引加入本文。
实施例
实施例1:用荧光标记物标记PrA系亲和色谱树脂。
用Alexa Fluor 488染料标记可控孔度玻璃系蛋白质A亲和色谱树脂(例如ProSep-vA High Capacity和ProSep Ultra PrA(Millipore))。简而言之,将1mg Alexa Fluor 488染料(Invetrogen,Carlsbad,CA)溶于约1mlDMSO中。将约3ml的各PrA树脂用NaHCO3(0.1M pH8.4)处理,真空干燥并装入15ml Evergreen柱中(Evergreen Scientific,Los Angeles,CA)。向各柱子中加入约3ml NaHCO3,将柱子加盖并用铝箔包裹。向各柱子中加入约100μl染料并在振荡器上放置约0.5小时。再将100μl染料溶液加入柱子中并再振荡一小时。然后使柱子成浆状并用每次约2个柱体积的NaHCO3洗涤三次,每次约2个柱体积的20%乙醇洗涤三次以及每次约2个柱体积的NaHCO3洗涤两次。
然后将标记的树脂分成1ml份并转移至小瓶中。
实施例2:荧光标记物标记的PrA树脂的酶处理
然后用酶消化一部分荧光标记的PrA树脂。将无荧光标记的PrA树脂用作对照。简而言之,将1ml各PrA树脂用0.1M NH4HCO3处理并真空干燥。将胰蛋白酶溶于0.1M NH4HCO3并读取275nm下的UV测量值使其在0.7和1之间。然后向各树脂中加入约3ml胰蛋白酶溶液并于37℃温育约2小时。将温育的介质浆通过7mL Evergreen湿柱以从介质除去上清。在UV275nmD读取滤液测量值并从该值减去胰蛋白酶的UV275nmT。还读取滤液的UV495nmF测量值。用0.149的消光系数,用式(UV275nmDX稀释系数-UV275nmT-fX UV495nmFX稀释系数)/0.149获得蛋白质A浓度,其得到被消化的蛋白质A的浓度[PA]。f的值是染料在UV275nm/UV495nm的UV消光系数比并由荧光染料的供应商提供。
以~2000X稀释度(用0.1M甘氨酸)测量上述滤液的荧光,这样得到[FL消化物]值。
实施例3:测量IgG洗出液浓度/标记和未标记的树脂的静态容量
如下测定IgG洗出液浓度/标记和未标记的蛋白质A系亲和色谱树脂的静态容量。静态容量的测量还是用荧光标记物标记PrA树脂是否干扰该PrA树脂与例如IgG的相互作用的指示。
边轻弹边量取1ml体积的标记和未标记的PrA树脂(Evergreen Scientific,Los Angeles,CA)。用10ml 10mM磷酸盐缓冲液(PBS)使各样品重新成浆状并将其平衡。弃去PBS的重力洗脱,然后加入5ml 0.1M pH2甘氨酸。弃去洗脱。另加入5ml 0.1M pH2甘氨酸并收集洗脱,作为Frbkgd。在加入5ml的~50mg/mL多克隆hIgG(Sigma-Aldrich,Milwaukee,WI)之前加入两份5ml PBS以平衡介质。然后再加入两份5ml PBS。弃去所有重力作用下的PBS和IgG洗脱。加入甘氨酸(5ml,0.1M,pH2),收集洗出液,标记为FR1。另加入5ml甘氨酸溶液并收集洗出液,标记为FR2。读取280nm的UV测量值用于获得洗脱IgG浓度[IgG]。一项测量PrA树脂的静态容量的此类实验的结果描绘于图2。如图2所示,各PrA树脂与IgG的相互作用未受到向树脂加入荧光染料的干扰。静态容量的测量值还显示于图2的表中。
用(FR1的A280nmX稀释系数+FR2的A280nmX稀释系数)/IgG的消光系数测量洗出液浓度[IgG]。然后用Jasco FP-6500荧光计(Great Dunmow,UK)用495nm的激发波长于519nm测量荧光。将未标记的介质的FR1和FR2荧光值从对应的标记介质的FR1和FR2荧光值中减去。进一步地从以上得到的部分1和部分2的荧光信号的总和减去Frbrgd以获得[FLIgG]。用下式计从树脂的洗出的蛋白质A:{(FLIgG)/((FL消化物)/[PrA])}}/[IgG]。
根据本说明书中引用的文献的教导可最全面地理解本说明书,这些文献通过援引加入本文。本说明书中的实施方案提供了本发明的实施方案的说明并且不应被解誓为限制其范围。本领域技术人员容易地意识到本发明包括许多其他实施方案。所有出版物和发明以其整体通过援引加入本文。对于通过援引加入的材料与本说明书相悖或不一致的情况,以本说明书代替任何此类材料。本文中任何文献引用不是承认这些文献是本发明的现有技术。
除非另外指明,用于包括权利要求在内的本说明书中的表示成分、细胞培养、处理条件等的所有数字应理解为均受到术语“约”的修饰。因此,除非另外相反地说明,数字参数是近似值并可根据本发明所寻求获得的期望性质而变化。除非另外说明,出现在一系列要素之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每一要素。本领域技术人员会理解或仅用常规实验就能确定本文所述的发明的特定实施方案的许多等同。以下的权利要求包括这些等同。
在不偏离本发明的精神和范围的条件下可对其进行许多修改和变化,修改和变化对本领域技术人员也是显而易见的。本文所述的特定实施方案仅以举例方式提供并无意具有任何限制性。本说明书和实施例仅应看做是示例性的,本发明的真正范围和精神由以下的权利要求指明。
Claims (26)
1.定量PrA系亲和色谱树脂的PrA泄露的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)用一种或多种荧光标记物标记所述PrA系色谱树脂;
(b)将标记的树脂分成相等的第一部分和第二部分;
(c)用适合的方法处理第一部分以从所述树脂释放标记的PrA,并向所述第二部分加入过量的免疫球蛋白(Ig);
(d)测量来自步骤(c)所述第一部分中经处理的树脂的荧光(FL消化物)和PrA浓度([PrA]);以及
(e)测量来自步骤(c)所述第二部分的树脂Ig洗出液浓度([Ig])和Ig洗出液中的荧光信号(FLIg),
其中通过计算{(FLIg)/((FL消化物)/[PrA]))}/[Ig]定量PrA泄露。
2.定量PrA系亲和色谱树脂的PrA泄露的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)用一种或多种荧光标记物标记所述PrA系色谱树脂;
(b)向标记的树脂加入过量的免疫球蛋白(Ig)并测量来自所述树脂的树脂Ig洗出液浓度([Ig])和Ig洗出液中的荧光信号(FLIg);
(c)从所述树脂除去残留的Ig,然后用适合的方法处理所述树脂以从所述树脂释放标记的PrA;以及
(d)测量来自经处理的树脂的荧光(FL消化物)和PrA浓度([PrA]),
其中通过计算{(FLIg)/((FL消化物)/[PrA])}/[Ig]定量PrA泄露。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述免疫球蛋白是IgG。
4.如权利要求1所述的方法,其进一步包括用阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和疏水交换色谱、弱分配色谱、羟基磷灰石色谱中的一种或多种或它们的任意组合除去洗出的PrA的步骤。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述荧光标记物选自Alexa Fluor 488、Dylight 488、HiLyte Fluor 488、5-FAM,SE和6-FAM,SE。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述适合的方法包括化学处理。
7.如权利要求1所述的方法,其中所述适合的方法包括酶处理。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述酶处理包括使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和枯草溶菌素。
9.如权利要求6所述的方法,其中所述化学处理包括使用酸或碱。
10.如权利要求1所述的方法,其中所述PrA系色谱树脂选自ProSep A High Capacity、ProSep A Ultra、ProSep Ultra Plus、MabSelect、MabSelect Xtra、MabSelect Sure、Sepharose Protein A、Sartobind Protein A以及Protein Sepharose Fast Flow。
11.如权利要求1所述的方法,其中用荧光计测量所述荧光。
12.如权利要求1所述的方法,其中用适合的pH洗脱所述Ig。
13.如权利要求1所述的方法,其中所述Ig是单克隆的。
14.如权利要求1所述的方法,其中所述Ig是多克隆的。
15.如权利要求2所述的方法,其中所述免疫球蛋白是IgG。
16.如权利要求2所述的方法,其进一步包括用阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和疏水交换色谱、弱分配色谱、羟基磷灰石色谱中的一种或多种或它们的任意组合除去洗出的PrA的步骤。
17.如权利要求2所述的方法,其中所述荧光标记物选自Alexa Fluor 488、Dylight 488、HiLyte Fluor 488、5-FAM,SE和6-FAM,SE。
18.如权利要求2所述的方法,其中所述适合的方法包括化学处理。
19.如权利要求2所述的方法,其中所述适合的方法包括酶处理。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述酶处理包括使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和枯草溶菌素。
21.如权利要求18所述的方法,其中所述化学处理包括使用酸或碱。
22.如权利要求2所述的方法,其中所述PrA系色谱树脂选自ProSep A High Capacity、ProSep A Ultra、ProSep Ultra Plus、MabSelect、MabSelect Xtra、MabSelect Sure、Sepharose Protein A、Sartobind Protein A和Protein Sepharose Fast Flow。
23.如权利要求2所述的方法,其中用荧光计测量所述荧光。
24.如权利要求2所述的方法,其中用适合的pH洗脱所述Ig。
25.如权利要求2所述的方法,其中所述Ig是单克隆的。
26.如权利要求2所述的方法,其中所述Ig是多克隆的。
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