KR20160029840A - 친화성 크로마토그래피 매트릭스 - Google Patents

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필리쁘 파올란토나치
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라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스
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Abstract

본 발명은 올리고당의 밀도가 0.2 내지 0.7 mg/매트릭스 ml 에 포함되는 것을 특징으로 하는, 스페이서를 통해 A 형 혈액 에피토프 및/또는 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자를 포함하는, 겔로서의 친화성 크로마토그래피 매트릭스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료적 사용을 위한 면역글루불린의 농축물의 제조를 위한 이러한 매트릭스의 용도에 관한 것이다.

Description

친화성 크로마토그래피 매트릭스 {AFFINITY CHROMATOGRAPHY MATRIX}
본 발명은 혈액 생성물의 A 형 혈액 및/또는 B 형 혈액의 항원에 대응하는 항체를 유지 및 제거하도록 의도된, 친화성 크로마토그래피를 적용하기 위한 매트릭스에 관한 것이다.
많은 병리학은 현재 면역글로불린 (Ig) 의 조성물로 처리된다. 예를 들어 항체, 가와사키 질환 (Kawasaki's disease), 어린이 및 성인의 면역 혈소판감소 자반병, 항체 생성의 결여에 의한 2차 면역결핍, 특히 만성 림프구성 백혈병 또는 재발성 감염과 연관된 골수종, 박테리아 감염과 연관된 HIV 에 의한 어린이의 감염, 다초점성 운동 신경병증, 귈랑-바레 증후군 (Guillain-Barre's syndrome), Parvovirus B19 에 의한 심각한 또는 만성 급성 감염, 획득 또는 구성 면역결핍, 피질-저항 피부근염, 급성 근무력증, 특발성 만성 다발성신경근염, 면역 혈소판감소 자반병 (예를 들어 HIV 감염과 연관됨), 근육강직 증후군, 자가면역 호중구감소증, 내성 자가면역 적아구감소증, 자기항체에 의해 획득된 항응고 증후군, 류마티즘 다발성 관절염, 포도막염 등이 언급될 수 있다.
치료 요법에서 Ig 가 강화된 인간 혈장 분획의 사용 증가는 정맥내 경로 (IgIV) 또는 피하 경로 (Igsc) 를 통해 주입가능한 매우 정제된 Ig 농축물의 예를 들어 인간 혈장으로부터의 대규모 제조를 필요로 한다.
이제 이러한 제조는 특히 수득된 Ig 농축물의 무해성과 관련하여 많은 제약에 직면한다.
유럽 약전에 따르면, 용혈 위험성을 감소시키기 위해 이러한 농축물은 A 형 혈액 및/또는 B 형 혈액의 항원에 대응하는 항체 ("항- A 형 혈액 항체" 및 "항- B 형 혈액" 또는 또한 "항-A 항체" 및 "항-B 항체" 또는 또한 "항-A 동종응집소" 및 "항-B 동종응집소" 로서 약술하여 상세한 설명에서 지칭됨) 의 감소된 함량을 가져야 한다.
Ig 의 수요가 지속적으로 증가함을 고려하면, O 형 혈액에서 통계적으로 더 풍부할 공여자의 매우 큰 풀을 갖는 것이 필요하다. 따라서, 혈액 혈장의 풀로부터의 Ig 농축물의 산업적 제조 동안 혈액 생성물의 항-A 및 항-B 항체의 제거 가능성을 제공하는 방법을 갖는 것이 필수적이 되었다.
출원 WO2007/077365 은 항-A 및 항-B 항체에서 후자의 고갈을 목적으로 하는 면역친화성 크로마토그래피 단계를 포함하는 Ig 농축물의 제조 방법을 기재하고 있다.
본 출원인은 이제 산업적 규모로 친화성 크로마토그래피에 의해 혈액 생성물의 항-A 및/또는 항-B 항체를 유지 및 제거하기에 특히 유용한 지지체를 개발하였다.
따라서 본 발명은 A 형 혈액 및/또는 B 형 혈액 에피토프 (epitope) 에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자를 포함하는 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 겔로서 제공하며, 상기 올리고당은 스페이서를 통해 상기 입자에 그라프트되고, 올리고당의 밀도는 0.2 내지 0.7 mg/매트릭스 ml 에 포함되는 것을 특징으로 한다. 상기 스페이서는 이것이 화학식 (I) -NH-R1-CO-NH-R2 (식 중, R1 은 C4-C6 알킬 기이고, R2 는 C3-C8 알킬 기임) 을 갖고, 상기 스페이서는 이의 관능기를 통해 입자에 결합되는 것을 특징으로 한다.
이러한 그라프트 입자의 다이아그램은 도 1 에 나타나 있다.
특정 구현예에서, 매트릭스는 (i) A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자 및/또는 (ii) B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 매트릭스는 (i) A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자, 및 (ii) B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자를 포함한다. 이러한 구현예는 도 4A 에서 설명된다.
또다른 구현예에서, 매트릭스는 A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당 및 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당 모두가 그라프트되는 중합체성 입자를 포함한다. 이러한 구현예는 도 4B 에 설명된다.
특정 구현예에서, (i) A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자, (ii) B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자, 및 (iii) A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당 및 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당 모두가 그라프트되는 중합체성 입자의 혼합물을 포함한다. 이러한 구현예는 도 4C 에 설명되어 있다.
모든 구현예에서, 입자에 A 형 혈액 에피토프에 상응하는 리간드를 결합하는 스페이서 및 입자에 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 리간드를 결합하는 스페이서는 동일 또는 상이하고, 바람직하게는 동일하지만, 항상 화학식 (I) 을 갖는다.
본 발명은 또한 항-A 및/또는 항-B 항체를 결합하는 친화성 크로마토그래피에서의 이러한 매트릭스 또는 지지체의 사용을 목표로 한다.
본 발명은 또한 치료적 사용을 위한 면역글로불린 G (IgG) 의 산업적 규모로의 제조를 위한 이러한 매트릭스 또는 지지체의 사용을 목표로 한다.
본 발명은 또한 에탄올 분별 및/또는 카프릴계 분별 및/또는 크로마토그래피 분리에 의해 혈액 혈장으로부터의 Ig 조성물의 수득하고, 본원에 정의된 매트릭스를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 조성물에 가능하게는 존재하는 항-A 및/또는 항-B 항체를 제거하는 것을 포함하는, 치료적 사용을 위한 면역글로불린 (Ig) 의 농축물을 제조하는 방법을 제공한다.
이러한 매트릭스의 장점은 항-A 및 항-B 항체에 대한 이의 높은 선택성 및 특이성, 및 후자에 대한 이의 높은 결합 능력이다. 따라서, 컬럼 부피마다 다량의 생성물을 통과시켜, 산업적 규모로의 생성물의 처리 시간을 감소시킬 수 있게 된다.
도면에 대한 설명:
도 1 은 본 발명에 따른 특정 구현예에서 A 형 혈액 또는 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자의 간략화된 다이아그램을 설명한다.
도 2 는 A 형 혈액 에피토프에 상응하는 삼당류가 그라프트되는 중합체성 입자를 설명하는 본 발명의 바람직한 구현예의 간략화된 다이아그램을 설명한다.
도 3 은 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 삼당류가 그라프트되는 중합체성 입자를 설명하는 본 발명의 바람직한 구현예의 간략화된 다이아그램을 설명한다.
도 4A 는 A 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당을 포함하는 입자 및 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당을 포함하는 입자의 혼합물을 포함하는 매트릭스의 본 발명의 특정 구현예의 간략화된 다이아그램을 나타낸다.
도 4B 는 A 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당 및 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당을 모두 포함하는 입자를 포함하는 매트릭스의 본 발명의 특정 구현예의 간략화된 다이아그램을 설명한다.
도 4C 는 A 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당을 포함하는 입자, B 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당을 포함하는 입자, 및 A 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당 및 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당을 포함하는 입자의 혼합물을 포함하는 매트릭스의 본 발명의 특정 구현예의 간략화된 다이아그램을 설명한다.
지지체:
본 발명의 매트릭스는 중합체성 입자의 지지체를 포함하고, 바람직하게는 겔 또는 수지의 형태이다.
이러한 중합체성 입자는 바람직하게는 구형 또는 직사각형 형상이고, 이는 특히 비이드일 수 있다. 이러한 입자는 일반적으로 약 0.1 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛, 바람직하게는 약 20 내지 약 500 ㎛, 보다 바람직하게는 약 50 내지 약 200 ㎛, 보다 바람직하게는 약 70 ㎛ 내지 약 120 ㎛ 직경의 평균 크기를 갖는다.
바람직하게는 이러한 입자는 다공성이다.
중합체는 천형 또는 비천연, 유기 또는 무기, 가교 또는 비가교될 수 있다.
중합체는 바람직하게는 유기 중합체, 바람직하게는 가교된다.
바람직한 구현예에서, 중합체는 셀룰로오스이고, 입자는 바람직하게는 다공성 셀룰로오스 비이드이다.
보다 바람직하게는, 이는 가교된 셀룰로오스이다.
가능한 중합체의 다른 유형은 한천, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 스티렌 및 디비닐벤젠의 공중합체 또는 이러한 중합체의 혼합물을 포함한다.
입자는 예를 들어 컬럼을 충전하는데 사용될 수 있는 크로마토그래피 매질을 제공할 수 있다.
리간드:
본 발명에 따른 지지체에 의해 포함되는 리간드는 자연적으로 이루어지는 A 형 혈액 또는 B 형 혈액의 항원을 나타내는 올리고당이다.
더욱 구체적으로는, 본 발명에 따른 매트릭스에 의해 포함된 A 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당 및/또는 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당은 전형적으로 삼당류이다. 용어 "혈액형 에피토프에 상응하는 올리고당" 은 각각 항-A 또는 항-B 항체에 의해 인식된 항원 결정요인과, 항원 관점에서 동일 또는 유사한 단위를 나타낸다. 본 발명에 따른 지지체에 의해 포함된 리간드는 이에 따라 항-A 또는 항-B 항체에 특이적이다.
바람직하게는, 본 발명에서 리간드로서 사용된 A 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당은 삼당류, N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)-갈락토오스(Gal)-푸코오스, 더욱 구체적으로는 N-아세틸Galα1-3(Fuc α1-2)Gal 이고, 스페이서는 바람직하게는 갈락토오스의 위치 1 에서 탄소에 결합된 산소 원자를 통해 결합된다:
Figure pct00001
.
본 발명에서 리간드로서 사용된 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당은 바람직하게는 올리고당, 갈락토오스-갈락토오스-푸코오스, 더욱 구체적으로 Gal α1-3(Fuc α1-2)Gal 이고, 스페이서는 바람직하게는 갈락토오스의 위치 1 에서 탄소에 결합된 산소 원자에 결합된다:
Figure pct00002
.
스페이서:
리간드는 입자에 리간드를 결합시키는 스페이서에 공유 결합된다. 스페이서는 입체 장애를 감소시키고 결합을 위한 항-A 및 항-B 항체에 대한 리간드의 접근성을 증가시키는 가능성을 제공한다.
스페이서는 A 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당 (이는 바람직하게는 상기 기재된 삼당류, N-아세틸Galα1-3(Fuc α1-2)Gal 임) 또는 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당 (이는 바람직하게는 상기 기재된 삼당류, Galα1-3(Fuc α1-2)Gal 임) 을 입자에 고정시키는데 사용된다.
입자는 여러 스페이서를 포함할 수 있다.
리간드와 스페이서 사이의 결합은 예를 들어 아미드 결합일 수 있다.
스페이서는 전형적으로 하나 이상의 C, O, N 또는 S 원자를 포함한다.
이는 예를 들어 -(CH2)mX(CH2)n- 또는 -(CH2)mX1(CH2)nX2(CH2)p (식 중, X, X1 및 X2 는 각각 서로 독립적으로 O, S, NH 및 공유 결합으로부터 선택되고; m, n 및 p 는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 임) 일 수 있다. 또다른 구현예에서, 상기 1, 2 또는 3 개의 수소 원자는 동등한 수의 OH 및/또는 메틸 기로 대체될 수 있다.
구현예에서, 스페이서는 하기로부터 선택되는 구조를 포함한다:
Figure pct00003
[식 중, 각각의 X1 및 X2 는 O, S 및 NH 로부터 독립적으로 선택되고; Ra, Rb, Rc 및 Rd 각각은 독립적으로 H, OH 및 메틸로부터 선택됨].
또다른 구현예에서, 스페이서는 하기 중에서 선택된 구조를 포함한다:
Figure pct00004
.
바람직한 구현예에서, 스페이서는 화학식 (I) -NH-R1-CO-NH-R2- (식 중, R1 은 C4-C6 알킬 기이고, R2 는 C3-C8 알킬 기임) 을 갖고, 상기 스페이서는 입자에 이의 아민 관능기 (상기 볼드체 글자) 를 통해 결합된다. 이러한 매트릭스의 다이아그램은 도 1 에 나타나있다.
R1 은 선형 또는 분지형, 바람직하게는 선형, C4-C6 알킬 기이다. 바람직하게는, R1 은 C5 알킬 기이다.
R2 는 선형 또는 분지형, 바람직하게는 성형, C3-C8 알킬 기이다. 바람직하게는, R2 는 C3 알킬 기이다.
바람직한 구현예에서, 리간드 (이는 바람직하게는 상기 기재된 삼당류임) 는 하기 화학식의 스페이서에 의해 입자에 그라프트된다: (입자)-NH-C5H10-CO-NH-C3H6-(리간드).
바람직한 구현예에서, 가교 셀룰로오스의 비이드 (여기에 도 2 에 설명된 바와 같은 A 형 혈액 에피토프에 상응하는 삼당류 (N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)-갈락토오스(Gal)-푸코오스) 인 리간드가 그라프트됨) 및 가교 셀룰로오스 비이드 (여기에 도 3 에 설명된 바와 같은 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 삼당류 (갈락토오스-갈락토오스-푸코오스) 인 리간드가 그라프트됨) 는 혼합된다. 삼당류는 하기 화학식의 스페이서에 의해 비이드에 그라프트된다:
(비이드)-NH-C5H10-CO-NH-C3H6-(리간드).
매트릭스의 제조:
리간드는 입자와 스페이서 사이 및 스페이서와 리간드 사이에서 공유 결합에 의해 화학적으로 고정된다.
이러한 고정은 당업자에 의해 통상적 방식으로 달성될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 입자는 팔 (arm) -NH-R1-COOH 를 포함한다. 바람직하게는, 이는 ε-아미노카프로산 (식 중, R1 은 펜틸 기임) 이다.
통상적으로, 입자는 2관능성 작용제 예컨대 에피클로르히드린, 에피브롬히드린, 디브로모- 및 디클로로프로판올, 디브로모부탄, 에틸렌 글리콜 디글리시딜에테르, 부탄디올 디글리시딜에테르, 디비닐술폰, 알릴글리시딜에테르 및 알릴 브로마이드를 사용하여 활성화될 수 있다. 2관능성 작용제는 입자 및 팔 -NH-R1-COOH 와 모두 반응시킬 수 있다. 알릴 이질관능성 화합물, 예컨대 알릴 브로마이드는 바람직한 2관능성 작용제이고, 활성화 매트릭스를 수득하는 가능성을 산출한다.
특정 고체 지지체, 예컨대 셀룰로오스, 히드로겔을 함유하는 복합물 또는 히드록실 기를 갖는 기타 물질의 경우, 2관능성 작용제와의 반응 이전에 히드록시드 공급원에 의해 히드록실 기로부터 양성자를 제거하는 것이 유리하다.
A 형 혈액 및/또는 B 형 혈액의 항원을 나타내는 리간드는 이후 결합 기 -NH-R2 (식 중, R2 는 선형 또는 분지형, 바람직하게는 선형 C3-C8 알킬 기임) 를 통해 팔 -NH-R1-COOH 를 포함하는 활성화 입자에 고정된다. 이를 위해, 입자에 의해 포함되는 팔 -NH-R1-COOH 의 COOH 관능기는 N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드로퀴놀린 유형 (EEDQ) 의 축합 작용제를 적용함으로써 리간드 NH2-R2-올리고당의 NH2 관능기와 반응된다.
당업자는 동일한 입자에 A 형 항원을 나타내는 리간드 또는 B 형 항원을 나타내는 리간드 또는 또한 둘 다를 그라프트시킬 수 있다. 바람직하게는, 사용된 스페이서는 동일하다. 이는 특히 B 형 항원을 나타내는 리간드에 대해 A 형 항원을 나타내는 리간드의 동등한 그라프트를 보장하는데 유리하다. 당업자는 또한 B 형 항원을 나타내는 리간드에 대해 A 형 항원을 나타내는 리간드의 측정된 비율을 포함하는 입자를 수득하기 위해 입자에 대한 리간드의 반응성에 따라 적합한 조건을 어떻게 적합화시킬지 알고 있다.
겔로서의 매트릭스는 리간드를 포함하는 중합체성 입자에 대한 완충제의 표준 첨가에 의해 제조되는데, 이는 이것이 친화성 크로마토그래피에 적합화된 겔로서 매트릭스를 수득하는 것으로 당업자에 공지되어 있기 때문이다.
유리하게는, 리간드의 밀도, 즉 매트릭스의 부피 당 그라프트된 리간드 (즉, A 형 혈액 또는 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당) 의 양은 약 0.2 내지 약 0.7 mg/매트릭스 ml, 보다 바람직하게는 약 0.3 내지 약 0.4 mg/매트릭스 ml 에 포함된다. 바람직하게는 올리고당의 밀도는 약 0.3 mg/매트릭스 ml 이다. 본 발명에 따르면, 이러한 밀도는 1 mg/ml 의 밀도에 비해 친화성 크로마토그래피에 의한 정제 시간을 극적으로 감소시키는 가능성을 제공한다 (예를 들어, Glycorex Transplantation AB (Sweden) 로부터의 GLYCOSORB ABO® 겔, 출원 WO2007/077365 에 언급됨). 매트릭스 부피는 증가될 수 있고, 크로마토그래피 컬럼을 통한 흐름 속도는 증가될 수 있다. 따라서, (1 mg/ml 의 밀도에 비해) 0.3 mg/매트릭스 ml 의 리간드의 밀도를 사용하면, 공정의 기간은 2 로 나뉘어지는데, 이는 산업적 규모에서 현저한 획득을 나타낸다. 유리하게는, 리간드의 밀도 감소는 또한 매트릭스의 비용 감소를 허용하고, 이에 따라 본 발명에 따른 매트릭스에서의 친화성 단계를 덜 비싸게 만들어, 면역글로불린의 최종 조성물의 비용을 감소시키는데 기여한다. 유리하게는, 리간드의 밀도 감소는 항-A 및/또는 항-B 항체를 제거하는 능력의 보존을 동반한다.
바람직한 구현예에서, A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체 입자는 그라프트되고, B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자는 이후 예를 들어 25/75 내지 75/25 (v/v), 바람직하게는 약 50/50 (v/v) 의 비율로 혼합될 수 있다.
A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체 입자, 및 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자는 또한 필요하다면 A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당 및 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당을 모두 포함하는 중합체성 입자와 혼합될 수 있다.
친화성 크로마토그래피:
본원에 정의된 바와 같은 매트릭스는 항-A 및/또는 항-B 항체를 결합하는 친화성 크로마토그래피에서 유용하다.
이를 위해, 매트릭스는 크로마토그래피 컬럼에 도입될 수 있다. 산업적 규모에서, 컬럼은 필요하다면 1 내지 150 리터, 또는 심지어 250 내지 500 L 를 함유할 수 있다. 파일럿 규모로의 적용의 경우, 1 내지 50 cm 높이를 갖는 컬럼을 사용할 수 있고, 직경은 이때 사용된 컬럼 높이에 적합화된다. 컬럼에서 사용된 매트릭스의 부피는 용액의 초기 항-A 및/또는 항-B 항체 수준에 비해 항-A 및/또는 항-B 항체의 원하는 잔여 수준에 따라 조절된다. 매트릭스 부피는 또한 산업 공정의 제한을 만족시키기 위해 조절될 수 있고, 특히 처리되는 생성물의 부피에 적합화될 수 있다.
면역글로불린의 액체 제제에 존재하는 항-A 및/또는 항-B 항체 (또는 혈액 생성물의 유도체) 는 매트릭스에 결합하고, 비흡착 생성물은 회수되고, 항-A 및/또는 항-B 항체가 고갈된다. 면역글로불린 또는 혈액 생성물의 유도체의 액체 제제는 매트릭스에 의해 포함된 리간드와 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 및 속도로 매트릭스를 통해 부어진다.
매트릭스는 임의의 분해 없이 반복적으로, 약 100 회까지 재사용될 수 있다. 이의 재생은 예를 들어 소다 (NaOH) (예를 들어 1 M) 를 사용한 처리에 의해 당업자에 공지된 과정에 의해 달성될 수 있다. 재생 이후, 재사용은 약물 제조를 위한 산업적 공정의 안전 요건, 특히 생물학적 오염 제거에 관한 요구 및 배치로부터 배치로의 오염을 유도할 수 있는 미량의 생성물의 제거를 만족시킨다. 친화성 매트릭스의 재사용에 의해, 또한 유리하게는 면역글로불린의 제조 동안 산업적 비용을 낮출 수 있다.
본 발명에 따른 친화성 매트릭스는 이에 따라 최종 면역글로불린 생성물의 산업적 비용을 극적으로 증가시키지 않고, 용액에 초기에 존재하는 항-A 및/또는 항-B 항체의 강력하고 충분한 제거를 허용함으로써, 면역글로불린과 같은 약물을 제조하기 위한 산업적 사용에 완벽하게 적합화된다.
면역글로불린 생성물의 정제:
본 발명의 매트릭스를 사용하는 친화성 크로마토그래피는 이러한 제제 또는 조성물에 가능하게는 존재하는 원치 않는 항-A 및/또는 항-B 항체를 제거하여, 면역글로불린의 제제 또는 조성물을 정제하고, 이에 따라 치료적 사용을 위한 면역글로불린의 농축물을 제조하는데 특히 유리하다.
"제거" 는 존재하는 항-A 및/또는 항-B 항체의 양의 바람직하게는 25 % 이상, 보다 바람직하게는 50 % 이상, 보다 더 바람직하게는 80 % 이상 또는 90 % 로의 실질적인 감소를 의미한다. 친화성 크로마토그래피 이후 수득된 본 발명의 Ig 농축물은 30 g/L 의 IgG 의 초기 농도로 적용된 직접적 쿰스 시험 (direct Coombs test) 에서 음성 시험에 부합하는 각각의 항-A 및 항-B 항체의 함량 (1/64 의 희석) 을 갖는다. 바람직하게는, 친화성 크로마토그래피 이후 수득된 본 발명의 Ig 농축물은 23 ng/IgG mg 이하인 항-A 항체 함량 및 20 ng/IgG mg 이하인 항-B 항체 함량을 포함한다. 잔여 항-A 및 항-B 항체의 투여 방법은 특히 출원 WO2007/077365 에 기재되어 있다. 바람직하게는, 항-A 및 항-B 항체의 투여 방법은 유동 세포 계측법 (flow cytometry) 에 의해 수행되는데, 그 이론은 이러한 항체의 함량에 비례하는 형광 신호의 검출을 적용하는, 항-A 및 항-B 항체의 역가의 의도된 특이적 측정에 따른 A 형 또는 B 형의 인간 적혈구의 사용을 기초로 한다. 일반적으로 유동 세포 계측법에 의한 투여 방법은 일반적으로 표준 샘플, 예를 들어 면역글로불린의 양성 대조군 (예컨대 1:32 역가의 EDQM, ref#07/306; Thorpe et al. 2009, Vox Sang. 97, 160-168) 또는 단일클론성 항-D 항체 농축물 또는 임의의 기타 적합한 참조 생성물을 사용한다.
면역글로불린 생성물은 본질적으로 IgG 를 함유한다. 전형적으로, 이러한 IgG 는 혈액 혈장으로부터 또는 이미 Ig 가 강화된 혈액 혈장 분획으로부터 수득된 다클론성 IgG 이다.
치료적 사용을 위한 Ig 농축물은 50 내지 100 g/L 에 포함된 농도이다. 이러한 농축물은 임상적 사용이 의도되고 특히 정맥내 경로를 통해 주입될 수 있다. 이러한 목적으로, 이는 보장되어야 하고, 필요하다면 이러한 임상적 사용과 상용가능한 부형제, 예컨대 안정화제를 함유해야 한다.
치료적 사용을 위한 Ig 농축물은 또한 피하 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 경우, 생성물의 농도는 100 g/L 이상, 유리하게는 150 g/L 이상이다.
치료적 사용을 위한 Ig 농축물은 또한 근육내 경로를 통해 투여될 수 있다.
이러한 Ig 농축물은 하기 방식으로 수득될 수 있다:
a) 예를 들어 에탄올 분별 및/또는 카프릴릭 분별 및/또는 크로마토그래피 분리에 의한 Ig 조성물의 제조,
b) 본 발명의 매트릭스에서 Ig 조성물의 침투에 의한 면역친화성 크로마토그래피,
및
c) 생물학적 안전 단계, 바람직하게는 오염성 바이러스 및/또는 입자를 제거하기 위한 나노여과.
Ig 조성물은 본래 Cohn 등에 의해 개발된 에탄올 분별에 의해 (Cohn et al, 1946. J. Am. Chem. Soc. 68, 459; Oncley et al, 1949, J. Am. Chem. Soc. 71, 541), 또는 그밖에 예를 들어 EP　0　703　922 및 WO 99/64462 에 기재된 바와 같은 크로마토그래피 분리에 의해, 또는 추가로 Steinbuch 등에 의해 기재된 카프릴릭 분별에 의해 (Steinbuch et al. 1969, Arch. Biochem. Biophys. 134(2):279-84) 수득될 수 있다. 특허 출원 WO 94/29334 및 WO 02/092632 에서 출원인에 의해 개발된 방법 및 가장 특히 WO 02/092632 에 기재된 것이 가장 특히 바람직하다. 이러한 경우, 혈액 혈장 또는 IgG 가 강화된 혈액 혈장 분획은 카프릴릭 분별 (비-면역글로불린 오염물의 침전에 의한 예비-정제), 알칼리성 pH 에서 수행된 음이온 교환 수지 지지체에서 단일 크로마토그래피, 4 내지 7 에 포함된 pH 에서 적합한 완충제에 의한 단계에서 IgG 의 선택적 용리에 적용된다. 예를 들어 특허 US 4 764 369 에서 Horowitz 에 의해 기재된 용매-세제에 의해 수행되는 바이러스성 불활성 처리가 수행될 수 있다.
이에 따라 수확된 IgG 분획은 이미 농축되어 있지만, 이후 한외여과 및 멸균 여과에 의한 추가 단계에 적용될 수 있다.
이러한 농축물은 본 발명의 매트릭스에서 면역친화성 크로마토그래피에 적용된다. 바람직하게는, 면역글로불린의 제제의 pH 는 크로마토그래피 전에 약 6 내지 약 7, 바람직하게는 약 6 의 pH 로 조절된다.
컬럼의 로드 (load) 는 항-A 및/또는 항-B 항체의 구하는 잔여 수준에 적합화된다. 상기 매트릭스의 특이성은 IgG 분획의 조건화 이전에 필요하지 않은데, 즉 혈장 분별 기술에 의해 수득된 임의의 IgG 분획 또는 농축물이 적합할 수 있다.
농축물의 침투는 임의의 용리 메카니즘을 포함하지 않는다. 따라서, 어떻게 IgG 농축물이 수득되었는지 관계 없이, 이는 임의로는 펌프에 의해 컬럼을 통해 침투된다. 이러한 침투는 항-A 및 항-B 항체의 보유를 허용한다. 리간드와 Ig 제제 사이의 접촉 시간은 1 분 이상, 유리하게는 2 분 정도이다.
컬럼은 이후 컬럼의 죽은 공간에 여전히 존재하는 IgG 를 회수하기 위하여 물로 세척될 수 있다.
IgG 농축물의 침투 이후, 항-A 및 항-B 항체가 결핍된 IgG 분획이 수득된다.
방법은 이후 한외여과 및 멸균 여과에 의한 농축 단계를 포함할 수 있다.
크로마토그래피 컬럼 및 매트릭스는 이후 세척 및 용리되어, 보유된 항-A 및 항-B 항체를 탈착시킬 수 있다.
하기 실시예는 이의 범주를 제한하지 않고 본 발명을 설명한다.
실시예: 친화성 크로마토그래피 (산업적 규모)
크로마토그래피 조건:
10±2 g/L 의 IgG 를 포함하는 출원 WO2002/092632 에 기재된 방법에 따라 분별에 의해 수득된 면역글로불린의 제제는, 도 2 에 설명된 바와 같은 A 형 혈액 에피토프에 상응하는 삼당류 (N-아세틸갈락토오스아민 (GalNAc)-갈락토오스(Gal)-푸코오스) 가 그라프트되는 가교 셀룰로오스 비이드 ("Iso A HyperCel" 로 지칭된 겔) 및 도 3 에 설명된 바와 같이 B 형 혈액 에피토프 (갈락토오스-갈락토오스-푸코오스) 에 상응하는 삼당류가 그라프트되는 가교 셀룰로오스 비이드 ("Iso B HyperCel" 로 지칭된 겔) 의 50/50 혼합물 (v/v) 를 포함하는 컬럼에서 수행된 항-A / 항-B 친화성 크로마토그래피 단계에 산업적 규모로 적용된다.
삼당류는 하기 화학식의 스페이서를 통해 비이드에 그라프트된다:
(비이드)-NH-C5H10-CO-NH-C3H6-(리간드)
그라프트 삼당류의 밀도는 매트릭스 겔 1 ml 당 0.3 mg 이다.
항-A 및 항-B 잔여 활성을 확인하기 위해, 용리액 (음이온 교환 크로마토그래피 이후 수득된 분획) 으로 지칭된 면역글로불린의 제제 (여기서 pH 는 6 (±0.05) 로 조절되었음) 는 1 ml 컬럼 (0.5 ml 의 겔 Iso A HyperCel + 0.5 ml 의 겔 Iso B HyperCel 을 포함함) 에 통과되었다.
컬럼의 포맷: D = 0.5 cm x 5.1 cm (컬럼 부피 (VC) = 1 ml).
접촉 시간: 2 min
로드: 6 g 의 용리액 제제 / A+B 리간드의 mg, 즉 컬럼마다 180 ml 의 생성물.
시험 이후, 겔을 물 (최소 10 VCs) 로 세척하였다.
상이한 방법 단계의 조건은 아래 표에 요약되어 있다:
단계의 표:
Figure pct00005
VC: 컬럼 부피; NAF: 비-흡착 분획
단일 비-흡착 분획 (NAF) 이 수집되었다.
투여량 시험:
수율은 세척 및 침투 이후 비-흡착 분획에 IgG 를 투여하여 측정되었다. 친화성 크로마토그래피 단계 이전에 이의 농도에 대해 최종 제제에 존재하는 항-A 및 항-B 동종응집소의 백분율에 상응하는 항-A 및 항-B 잔여 활성은 아래 기재된 기술에 따라 유동 세포 계측법 (유럽 약전에 의해 요구되는 희석의 것보다 더 민감하고 정확한 기술) 에 의해 측정되었다.
A 형 및 B 형의 적혈구를 EDTA 에서 수집하고 0.9% NaCl 용액에서 2 회 세척 (두 세척 사이에 5 분 동안 1,730 g 으로의 원심분리) 하였다. 2.106 적혈구는 마이크로적정 플레이트에 분포되었고, 50 ㎕ 의 표준 양성 대조군 (1:32 EDQM, ref#07/306; Thorpe et al. 2009) 또는 작업 농도로 희석된 샘플 (PBS pH 7.4, 1% BSA) 을 첨가하였다. 플레이트를 교반하면서 37 ℃ 에서 2h 동안 배양하였다. 세척 이후, 파이코에리트린 (PE) 로 마킹된 인간 항-IgG goat F(ab')2 항체 (Fc 특이적) (Beckman Coulter) 는 PBS-BSA 중에 1/20 로 희석되어 사용되었다. 플레이트를 실온에서 및 빛으로부터 멀리하여 30 분 동안 배양하였다.
세척 이후, 각각의 펠릿을 PBS-BSA 200 ㎕ 에 재현탁하고, 유동 세포 계측계로 판독하였다 (Beckman Coulter Cytomics FC 500).
양성 대조군의 평균 형광 세기 (MFI) 는 0.23 g/L 내지 30 g/L 범위의 농도에 관해 IgG 의 농도 (표준 곡선) 에 비해 보고되었다. 결과는 샘플의 기울기와 양성 표준의 기울기 사이의 비율로 표현된다. 표준 곡선의 등식은 y = ax + b 이고; 여기서 "a" 는 표준 곡선의 기울기의 값이고 "b" 는 시험의 백그라운드 노이즈에 상응하는 0 점이다. 샘플의 등식이 y' = a'x + b 이므로, 그리고 샘플의 MFI 의 공지된 값 (y') 및 IgG 의 농도 (x') 를 사용함으로써, 기울기의 비율은 [(MFI-b)/[IgG 농도]]/a 인 것으로 계산되었다.
결과:
얻어진 IgG 수율 및 항-A 및 항-B 잔여 활성은 아래 표에 나타나 있다:
결과 표:
Figure pct00006
이러한 표의 결과는 비흡착 분획에서 98% 의 IgG 수율을 나타내고, 이는 친화성 지지체가 항-A 및 항-B 동종응집소에 대해 양호한 특이성을 가짐을 증명한다.
이러한 표의 결과는 또한 항-A 및 항-B 잔여 활성에서 실질적인 감소를 나타내는데, 이는 각각 12% 및 8% 이다. 이에 따라 수득된 생성물은 이때 30 g/L 에서 IgG 의 초기 농도로 적용된 직접적 쿰스 시험에서의 음성 결과에 (1/64 의 희석에서) 부합한다.

Claims (17)

  1. A 형 혈액 및/또는 B 형 혈액 에피토프 (epitope) 에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자를 포함하는 겔로서의 친화성 크로마토그래피 매트릭스로서, 상기 올리고당이 스페이서를 통해 상기 입자에 그라프트되고, 올리고당의 밀도가 0.2 내지 0.7 mg/매트릭스 ml 에 포함되고 상기 스페이서가 화학식 (I) -NH-R1-CO-NH-R2- (식 중, R1 은 C4-C6 알킬 기이고, R2 는 C3-C8 알킬 기임) 을 갖고, 상기 스페이서가 이의 아민 관능기를 통해 입자에 결합되는 것을 특징으로 하는 친화성 크로마토그래피 매트릭스.
  2. 제 1 항에 있어서, (i) A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자, 및/또는 (ii) B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자를 포함하는 매트릭스.
  3. 제 2 항에 있어서, (i) A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자, 및 (ii) B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자를 포함하는 매트릭스.
  4. 제 1 항에 있어서, A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당 및 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 모두 그라프트되는 중합체성 입자를 포함하는 매트릭스.
  5. 제 1 항에 있어서, (i) A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자, (ii) B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자, 및 (iii) A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당 및 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 모두 그라프트되는 중합체성 입자의 혼합물을 포함하는 매트릭스.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고당의 밀도가 0.3 내지 0.4 mg/매트릭스 ml, 바람직하게는 약 0.3 mg/매트릭스 ml 에 포함되는 매트릭스.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, A 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당 및/또는 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당이 삼당류인 매트릭스.
  8. 제 7 항에 있어서, A 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당이 삼당류 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)-갈락토오스 (Gal)-푸코오스인 매트릭스.
  9. 제 7 항에 있어서, B 형 혈액 에피토프에 상응하는 올리고당이 올리고당 갈락토오스-갈락토오스-푸코오스인 매트릭스.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, R1 이 C5 알킬 기인 매트릭스.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, R2 가 C3 알킬 기인 매트릭스.
  12. 제 3 항에 있어서, A 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자, 및 B 형 혈액 에피토프에 상응하는 하나 이상의 올리고당이 그라프트되는 중합체성 입자가 25/75 내지 75/25 (v/v), 바람직하게는 약 50/50 (v/v) 의 비율로 혼합되는 매트릭스.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체가 가교 중합체인 매트릭스.
  14. 제 13 항에 있어서, 중합체가 셀룰로오스이고, 입자가 바람직하게는 다공성 셀룰로오스 비이드인 매트릭스.
  15. 항-A 및/또는 항-B 항체를 결합하는 친화성 크로마토그래피에서 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 매트릭스의 용도.
  16. 제 15 항에 있어서, 치료적 사용을 위한 산업적 규모로의 면역글로불린 G (IgG) 의 제조를 위한 매트릭스의 용도.
  17. 에탄올 분별 및/또는 카프릴계 분별 및/또는 크로마토그래피 분리에 의해 혈액 혈장으로부터 Ig 조성물을 수득하는 것, 및 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 매트릭스를 적용하는 친화성 크로마토그래피에 의한 조성물에 가능하게는 존재하는 항-A 및/또는 항-B 항체의 제거를 포함하는, 치료적 사용을 위한 면역글로불린 G (IgG) 의 농축물의 제조 방법.
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