JPS63500656A - モノマ−ＩｇＧの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノマーＩｇＧの製造方法 〔発明の分野〕 本発明は正常なまたは過免疫のヒトガンマグロブリン（ＩｇＧ）、例えばコーン 分画■または他の適当な材料から得られた生成物の新しい処理方法に関する。凝 集したＩｇＧとモノマーＩｇＧとはこの方法によって分離されて、実質的にモノ マー１ｇＧから成り、静脈注射によって投与可能な生成物を生ずる。本発明はさ らにＩｇＡ。

ＩｇＭ、プラスミノゲン、プラスミン、第Ｘ　Ｉ　Ｉ−ＩＪ子、プレカリクレイ ン活性化因子（ＰＫＡ）、カリクレイン。

°及びその他のカリクレイン様エステラーゼ活性を含む混入蛋白質の種々な除去 方法に関する。

現在入手可能なＩｇＧ製剤に付随するいくつかの欠点を多少とも克服することが 本発明の目的である。本発明の方法がモノマー形の免疫グロブリンから凝集形と ダイマー形の免疫グロブリンの除去を可能にし、その結果いわゆる抗補体活性（ ＡＣＡ）を滅じ、さらに他の混入蛋白質、特にキニンを生成させるような蛋白質 の有意な除去を可能にすることが判明している。前記の全ての形のＩｇＧはコー ンフラクション■のようなＩｇＧ冨化フラクション中に通常存在する。

〔発明の背景〕

ヒト血液の血清または血漿は、種々な発生源からの異なる性質範囲を有する抗原 に対応する免疫グロブリンＧ　（ＩｇＧ’）に冨んでいる。例えば、ウィルスま たは細菌微生物の侵入及びその結果による固体の特異的免疫原への暴露は一般に 、Ｂ細胞リンパ球によるＩｇＧクラスの特異的抗体の産生をもたらす。これらの 抗体は微生物のいっそうの増殖を、マクロファージ及び補体系の血漿蛋白質と共 に効果的に抑制する。このプロセスは体液免疫として知られている。

固体が特異的免疫原に対して体液反応を開始する能力の度合は種々であり、免疫 原の性質によって変化する。体液免疫は生後６か月〜１２か月の間で最も弱く、 ２０才すぎまで発達し続ける。成る人々は弱いＩｇＧ産生力を有するにすぎない ため、妥協した免疫を有する。

このような条件は遺伝的である　（例えば、乳児のＸ染色体結合像ガンマグロブ リン血症−ブルトン病−）か、または後天的であり、通常選択的または部分的抗 体欠乏症候群として存在する。このような人は通常、種々なしばしば再発性の感 染症に罹患しており、可能な場合には、正常なドナーの血液プールから調製した ＩｇＧが与えられる。ＩｇＧによる受動免疫も、感染症の治療と予防に、特に抗 生物質療法に耐性な細菌に感染した場合に、さらに最近では、特発性の血小板減 少性紫斑病の治療に重要な選択すべき手段になっている。従って、ヒ）ｒｇＧ製 剤の必要性は充分に認められており、実証されている。

ストークス（Ｓｔｏｋｅｓ）等が１９４４年にＩｇＧ製剤（すなわちガンマグロ ブリン濃縮物）主臨床導入して以来（Ｊ。

５ｔｏｋｅｓ、Ｅ、Ｐ、Ｍａｒｉｓ、Ｓ、Ｓ、Ｇｅ１ｌｉｓ、Ｊ、Ｃ１１ｎ　Ｉ ｎｖｅｓｔ、（１９４４）２３巻、５３１頁〕、副作用を生ずることなく静脈内 投与す、ることのできる製剤を製造するために多くの試みがなされている。それ にも拘らず、以下に述べる困難性のために、ブルドン（Ｂｒｕｔｏｎ）が１９５ ２年に無ガンマグロブリン血症の治療に用いたコーン■分画ＩｇＧの筋肉内注射 法は（０，Ｃ，Ｂｒｕｔｏｎ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（１９５２）　９巻、７２ 〜７７７）、多年にわたって標準的方法になっており、実際に米国ではごく最近 になって旧式な方法と見做されるようになった。筋肉内径路は静脈内投与に比べ て、多くの重大な欠点を有している。例えば、注入量は限られており、筋肉塊の 小さい小児では特に問題であり、注入部位からの吸収は比較的緩慢であり、免疫 グロブリンの大部分は注入部位で蛋白質分解によって破壊され、その結果、血漿 レベルは不変であり予測し難く、また注入は痛みを伴う。

上記の欠点から、ＩｇＧ注入の静脈内経路が選択すべき経路であることが明らか である。重要な特別の利点は、ＩｇＧがより効果的に利用されることである。例 えば、妊娠中の胎児から得られるＤ　Ｒｈｅｓｕｓ陽性細胞を中合には筋肉内投 与する場合に比べて数分の−である。

しかし、既述したように、初期のＩｇＧ製剤は副作用を生ずるために、静脈内投 与することができなかった（Ｃ，Ａ、Ｊａｎｅｗａｙ等、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ 、Ｍｅｄ、　（１９６８）２７８巻、９１９頁）。現在用いられている製剤の大 部分はまだ副作用が無いわけではないので、特にＩｇＧ製剤の不利な性質に対し て正常な対照よりも敏感な、抗体欠乏症候群患者に対しては、希釈形で非常に緩 慢に通常投与する。

初期のガンマグロブリン濃縮物に対する不利な反応は重度であり、低血圧性環境 不全によるショック反応をしばしば生じた。第２世代ＦＧ’（７４縮物、すなわ ち静脈内投与用に改良したＩｇＧ製剤の多くは、特に無ガンマグロブリン血症に 罹患している患者のような、影響されやすい患者の場合には、悪心、嘔吐９発熱 、硬直。

背痛、胸狭窄感、潮紅、低血圧等の２反応をまだ生ずる。

アナフィラキシ一様反応及びアナフィラキシ−反応は、ＩｇＧ製剤中に種々な量 で存在する凝集１ｇＧの抗補体活性（ＡＣＡ）に帰因されている。これは、凝集 ＩｇＧが補体を不活化する、すなわち抗原−抗体複合体と同様に、補体カスケー ドを活性化することが判明しているからである（Ｔ、ｌ５ｈｉｚａｋａ、に、ｌ ５ｈｉｚａｋａ、Ｔ、Ｂｏｒｏｓ、Ｊ、Ｉｍｍｕ−ｎｏｌ、　（１９６１）８７ 巻、４３３頁）。

補体カスケードの活性化は特に、血管拡張剤効果を有し、毛細血管の透過性を高 めるアナフィラキシンを発生させる。従って、制御されない活性化は低血圧と環 境虚脱を生じ得る。

補体固定部位は１ｇ０分子のＦｃフラグメント中に局在すルコとが判明している （Ａ、Ｔａｒａｎｔａ、　Ｅ、Ｃ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ＋５ｃｉｅｎｃｅ（１９６ １）　１３４巻、　１９８１頁）。このため、コノ後にはＩｇＧのＦｃ部分が酵 素によって除かれた生成物が得られている（以下参照）。２つのＦｃフラグメン トを固定補体に並置させなければならないことも判明している（Ｈ，Ｉｓ　１ｊ ｋｅｒ、　Ｈ，Ｊａｃｏ　ｔ−Ｇｕ　ｉ　Ｉ　Ｉａｒｍｏｄ、　Ｊ、ＣＪａ　Ｊ ｏｎ、　Ｅｒｇｅｂｎ。

ｐｈｙｓｉｏｌ、　（１９６５）５６巻、６７頁）　、　Ｆｃ部分のこの「非特 異的活性化」は抽出中にＩｇＧが損傷する結果であると思われるが、この機構は まだ解明されていない。ＩｇＧは配座変化を受けて、それまで隠れていた部位を 露出して、この部位が細胞とＭｉ繊織上Ｆｃレセプタ部位と結合してこれを活性 化すると考えられる。ＩｇＧ製造方法はＩｇＧを活性化するような過程を避けな ければならないことになり、モノマー形のＩｇＧを得ることの望ましさが強調さ れる。

凝集体が不利な反応を生ずるが、または不利な反応の原因の一部であるという臨 床証明はまだ存在しない。

この不満足な状況は不利な反応の原因となる因子を検出し、その量を評価するた めの適当な薬理学的モデルが存在しないことに基づいている。副作用の機序が充 分に理解されていす、また現在の静脈内用■ｇＧ製剤が非常に不均質であるので 、不利な反応の原因である因子の全てを標準化した臨床条件下で研究することは 現在困難である。

静脈内投与用の安全なＩｇＧ製剤を製造業者が製造する可能性は、不利な反応の 機構についてのこ□Ｔ完全な知識によって妨げられている。種々な製造業者の製 品が不均質であることもこの分野の論争に寄与している。そのため、特許及び科 学文献に多数のＩｇＧ精製精製法が存在することも意外ではない。比較的良く知 られた方法の幾つかを以下簡単に検討する。

（ａｌ　ＩｇＧ分画：血漿、血清、胎盤及びその他の液体のような、ヒトまたは 動物起源の出発物質がらＩｇＧを分画する幾つかの方法が公知である。例えば、 低温でのアルコールによる分画（Ｅ、Ｊ、Ｃｏｂｎ等、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　（１９４６）６８巻、４５９〜４７５頁；　Ｊ、Ｌ、０ｎｃｌｅｙ、 　Ｍ、Ｍｅｌ　ｉｎ。

Ｄ、Ａ、Ｒｉｃｈｅｒｔ、Ｊ、Ｗ、Ｃａｍｅｒｏｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇｒｏｓｓ、Ｊｒ 、、Ｊ、八ｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　（１９４９）７１Ｓ、　５４１頁；　Ｐ、Ｋ１５ｔｌｅｒ、Ｈ，Ｎｉ ｔｓｃｈｍａｎｎ＋Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、　（１９６２）　７巻、４１４〜４２４ 頁）　；　Ｒ４ｖａｎｏｌ（アクリノールの商品名）−硫酸アンモニウムによる 分画（Ｊ、Ｈｏｒｅｊｉｓｉ、Ｒ，Ｓｍｅｔａｎａ、Ａｃｔａ　Ｍｅｄｉｃａ　 ５ｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ（１９５６）　１５５巻、６５〜７０頁）とイオン交 換クロマトグラフィによる分画（Ｈ，Ｈｏｐｅ等、Ｐｌｕｎｃｈｅｎ　Ｍｅｄｉ ｚｉｎｉｓｃｈｅＷｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ（１９６７）３４巻、　１７４９ 〜１７５２頁）。

さらに、カナダ特許第Ｌ１３７，４１３号は少なくとも１種類の水溶性の塩基性 窒素含有有機化合物（解離定数７以下）または同化合物の酸塩の存在下で分画を 実施することによってこれらの方法を改良すると、モノマー含有量の高い生成物 が得られることを述べている。

ＩｇＧ凝集体の除去：超遠心分離は静脈内投与用に充分に寛容化された低ＡＣＡ 生成物を生ずることができるが（Ｓ、　Ｂａｒｕｎｄａｎ等、　Ｖｏｘ　Ｓａｎ ｇ、（１９６２）７巻、１５７〜１７４頁）、分取用超遠心分離は非実用的な手 段である。ｉｇｃ凝集体の除去は活性炭による吸着（Ｍ、５ｔｅｉｎ−ｂｕｃｈ 、Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ　・（１９６７）１３巻、１０３頁）、澱粉による吸着、ケ イ酸塩による吸着（西ドイツ公開明細書第２６５８３４３号）によって、ならび にポリエチレングリコールによる沈澱によって（西ドイツ公開明細書第２７５１ ７１７号）　（Ａ、Ｐｏ１ｓｏｎ等、Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、（１９７２）２３巻、 １０７〜１１８頁；　Ｗ、５ｃｈｎｅｉｄｅｒ等、　Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、（１９ ７６）３１巻。

１４１〜１５１頁参照）試みられている。しかし、これらの方法のいずれも抗補 体活性を完全には除去することができない。

酵素分解：ペプシンによるＩｇＧの酵素分解（）１．Ｂ。

５ｃｈｕ　ｌ　ｔｚｅ、　Ｇ、　Ｓｃｈｗｉｃｋ、　Ｄｔｓｃｈ、Ｍｅｄ　、Ｗ ｓｃｈｒ、　（１９６７）　８７巻。

１６４３頁）は、ＡＣＡを有しない市販製剤の製造に利用されている。例えば、 フランス特許第２，３８２．０００号はこのような製剤を述べている。この方法 は抗体力価を減することなくＡＣＡを効果的に低下させる。

しかし、Ｆｃフラグメントが完全に破壊されるので、１ｇ０分子の組織結合力が 除去される。この特徴と尿中に小フラグメントが失われることが（Ｂａｒａｎｄ ｕｎ等。

上記）、この製剤の体内での半減期が非常に低下することの原因である（Ｈ，Ｋ ｏｂｌｅｔ、　Ｈ，Ｄｉｇｇｅｌｍａｎｎ、　Ｓ、Ｂａ−ｒａｎｄｕｎ　、　Ｈ ，Ｇｅｒｂｅｒ、　Ｂｉｂ　１．　Ｈａｅｍａ　ｔ、　（Ｂａｓｅｌ）　（１９ ６５）　２３ｔＪ　＋１１０２頁）。さらに、Ｆｃフラグメントが除去されると 、このような製剤は胎盤バリヤーを通過できなくなる。

ヒトプラスミンによるＩｇＧの処理によって、ＩｇＧは分子量５０，０００の３ 成分とＡＣＡを有しない生成物とに分割される（Ｊ、Ｔ、Ｓｇｏｕｒｉｓ、Ｖｏ ｘ　Ｓａｎｇ、（１９６７）１３巻。

７１頁）。充分に低レベルのプラスミンを用いると、分子の１５％のみが分解し て、８５％は完全なガンマグロブリンとして残る（Ｓｇｏｕｒｉｓ、上記）。消 化されないで残留する完全なガンマグロブリンは殆んど抗補体活性を示さず、不 利な反応を生ずることなく静脈内投与されている（Ｊ、Ｈｉｎｍａｎ等、　Ｖｏ ｘ　Ｓａｎｇ　・（１９６７）１３巻、８５頁）このようにして製造された物質 はインビトロ及びインビボの防御活性を有するよ・うに思われる　（Ｆ、に、Ｆ ｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ、Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、（１９６７）１３巻、８５頁）。こ のアプローチの欠点の１つは、プラスミンが完全には除去されないことである。

従って、この物質を４℃で保存する場合にも、分解が続けられる。

プラスミン処理ｒｇｃ製剤は西ドイツ公開明細書箱２７５２、６９４号に述べら れている。

Ｓ、Ｂａｒａｎｄｕｎ等（上記）は、ｐＨ４，０，３７℃におけるガンマグロブ リンのインキュベーションが抗補体活性を低下させることを示した：例えば、２ ４時間インキュベーションすると、完全にＡＣＡが除去される。この結果はガン マグロブリン中に不純物として存在する小量の血清酵素の活性に起因することが 示唆されている（Ｃ，Ｂｌａｔｒｉｘ等、　Ｐｒｅｓｓｅ　Ｍｅｄ、（１９６９ ）　７７Ｓ、　６３５〜６３６頁）。プラスミン処理したガンマグロブリンと同 様に、このｒｐＨ４，０ガンマグロブリン」は患者に投与する前に、抗補体活性 を回復することが判明している（Ｊ、Ｍａｌｇｒａｓ等、　Ｒｅｖ、Ｆｒａｎｃ 、Ｔｒａｎｓ。

（１９７０）１３巻、１７３頁）。

プラスミン処理ガンマグロブリンとｐＨ４，０ガンマグロブリンの両方は、非修 飾ガンマグロブリンよりも短いインビボ半減期を有しており、例えば非修飾ガン マグロブリンの２０日間に比べて１４〜１６日間のインビボ半減期を有する（Ｈ ，ＫｏｂＩｅｔ等、Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ。

（１９６７）　１３巻、９３頁；　Ｅ、Ｍｅｒｌｅｒ等、Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、（ １９６７）１３巻、１０３頁）。

（（Ｉｆ）　化学的修飾二次の例に示すように、商業的に用いられる多くの方法 が文献からめられる。

ｉ）　β−プロビオラクトンムこよるＩｇＧのＦｃセグメント補体レセプターの ブロッキング（Ｗ、５ｔｅｐｈａｎ。

Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、（１９７５）２８巻、４２２〜４３７頁）。このようにして 得られた生成物はもはや補体を固定せず、９０％程度までのモノマーから成る。

しかし、生物学的半減期は４〜１２日間に減少する（ヨーロッパ特許出願７５） ９巻、３９〜６０頁Ｋａｒｇｅｒ、　Ｂａ５ｅｌ）。

ｉｉ）　１ｇ０分子のジスルフィド架橋の還元とスルホン化は抗補体活性を非常 に減する（Ｔ、Ｙａｍａｎａｋａ等。

Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、（１９７９）３７巻、１４〜２０頁；この他カナダ特許第１ ，１２８，４１８号と米国特許第４，１６８，３０３号にも述べられている）。

ｉｉｉ　）　部分的還元とアルキル化（Ｄ、Ｄ、５ｃｈｒｏｄｅｒ等。

Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、（１９８１）　４０巻、３８３〜３９４頁とさらに、米国特 許第３，９０３，２６２号に述べられている）またはアミド化（西ドイツ公開明 細書箱２４４２６５５号）は低反応性製剤を生ずる。

失と新しい抗原決定因子のＩｇＧ分子内への出現は、これらの化学的干渉によっ て除外することができない。

（ｅ）　イオン交換クロマトグラフィ法：イオン交換クロマトグラフィに基づく 、ヒト血漿と血清からの免疫グロブリンＧ　（ＩｇＧ）の調製方法は充分に確立 されている（Ｂａｕｍｓ　ｔａｒｋ等、　Ａｒｃｈｉｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＆　 Ｂｉｏｐｈｙｓ。

（１９６４）　１０８巻、５１４〜５２２頁；　Ａ、Ｊ、Ｗｅｂｂ、Ｖｏｘ　Ｓ ａｎｇ。

（１９７２）　２３巻、２７９〜２９０頁）。コーン分画■からＩｇＧ凝集体そ の他の好ましくない成分を除去してＡＣＡの低い生成物を得るだめのＤＥＡＥセ ルロールの使用は述べられている（Ａ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｈａｂｅｅｂ等、Ｖｏｘ　 Ｓａｎｇ。

（１９７７）３２巻、１４３〜１５８頁；米国特許第４．３１２．９４９号）同 様に、プロトロンビン−複合蛋白質の除去に有効であると主張されているＤＥＡ Ｅ　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−５０の使用も述べられている（ＰＣＴ特許出願第Ｕ Ｓ８３１０１０１６号等）。Ｒｈｏ（Ｄ）のような過免疫１ｇＧと抗破傷風免疫 グロブリンのイオン交換（ＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘ）による精製も述べられ ている（ｔｌｏｐｐｅ等、　Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、　（１９７３）２５巻、３０８ 〜３１６頁；　Ｆｒ１ｅｓａｎ等、　Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

（１９８１）　３巻、１６４〜１７５頁）、またイオン交換クロマトグラフィも スルホン化キノマーＩｇＧの精製に用いられている　（カナダ特許第１，１２８ ，４１８号）。

カルボキシメチルセルロースのような陽イオン交換体が、モノマーからＩｇＧ凝 集体を部分分割するために用いられている（オーストラリア特許出願第ＡＵ−Ａ −９１３２８／８２号）。

イオン交換（ＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）とアフィニ ティクロマトグラフィ（アルギニン−５ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂとベンズアミジン −５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｂ）の組合せが低■レベルでＩｇＧ濃縮物から凝集 体、フラグメント及びＰＫＡを除去すると報告されている（Ｊ、Ｈ，Ｂｅｒｇ− １ｏｆ、Ｓ、Ｅｒ１ｋｓｓｅｎ、第１８回国際血液輸注学会会議ミュンヘン１９ ８４）。

イオン交換クロマトグラフィの可能で特に望ましい特徴は、オーストラリア特許 出願ＡＵ−Ａ−１７２７７／８３号に述べられているように、例えばＩｇＧがＤ ＥＡＥ　５ｅ−ｐｈａｄｅｘまたはＱＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘに結合して、選択 的に溶出される場合のように混入肝炎８表面抗原を除去または減少できることで ある。

伝統的なイオン交換クロマトグラフィには、幾つかの周知の欠点も存在する。例 えば、イオン交換材に結合し、選択的に溶出されるモノマー１ｇＧに依存する方 法は交換材の結合力が限定されている、過程が全体的に緩慢であるという欠点を 有している。イオン交換クロマトグラフィはしばしば５ｉ０２吸収段階と組合さ れて、脂質物質とプロ酵素を吸収するが、この方法はＩｇＧを著しく損失させる ことになる　（２０％）。他の欠点はクロマトグラフィ自体がＩｇＧを凝集させ る可能性があるということである。例えば、ＰＣＴ特許出願第ＵＳ８３１０１０ １６号はＩｇＧを陰イオン交換樹脂で精製する場合にこの傾向を克服するために 、実質的に非界面活性な種々な安定剤をＩｇＧに包含させることを扱っている。

伝統的なイオン交換媒質上の流速は、直線流速度２５〜３０ｃ＋＋＋／時を典型 的に超えないが、架橋を改良したアガロースゲルは１２０ｃｍ／時の流量で用い られている。さらに、これらの慣晋的なイオン交換樹脂は、免疫グロブリン製剤 を含めたバイオポリマーの迅速な高分解能分離への利用を限定する、次のような 欠点を有している： １、機械的安定性が不充分である。

・２．溶離剤条件、流量、温度等の選択により樹脂変形が生ずる。

３、粒径分布と孔度分布の両方に関して、樹脂粒子が多分散性である。

４、動的条件下で負荷能力が低い。

５、粒子の性質に機械的、物理的または化学的変化が生ずるため、使用後の樹脂 再生が困難である。

６、高い直線流速度での単位時間あたりの分解能が低い。

７、特別なスループットで最適分解能を達成するために必要な溶離剤組成物の選 択を限定せざるを得ない問題がある。

８、ゾーン展開速度が低いことにより、すなわち可能な直線流速度が低いことに より必要な保持時間と分離時間が大きくなるため、生物学活性が著しく失われる 。

記述したように、以上の公知の方法と生成物に伴う欠点を避け、木質的にモノマ ー１ｇＧからなる生成物を生ずるように、免疫グロブリンＧ含有分画を分割する 方法を提供することが本発明の目的である。

本発明の第１態様によると、次の段階：（ｉ）　メゾ及びマクロ孔質表面を存す る微粒状強陰イオン交換樹脂上での免疫グロブリンＧ含有物質の分画、及び（ｉ ｉ）前記樹脂から溶出による精製ＩｇＧ分画の回収から成るＩｇＧ含有物質の精 製方法を提供する。

この態様では、本発明は上記方法によって得られる精製１ｇＧにまで及んでいる 。

微粒状陰イオン交換樹脂は、例えば、３．　５．１０゜３０及び９０μｍの公称 粒径を有し、粒径分布は狭い、また＞　１０ｍＭの孔度を基準にして孔度分布も 狭い。このような陰イオン交換体ばＪ、Ｕｇｅｌｓ　Ｌａｄ、　Ｐ、Ｃ，Ｍｏｒ ｋ、　Ａ、Ｂｅｒｇｅ＋Ｔ、ＥＩｌｉｎｇａｅｎ及びＡ、Ａ、Ｋａｈｎによって ｒＥｍｕｌｓｉｏｎ　Ｐｏｌｙ−ｍｅｒｉｚａｔｉｏｎＪ　（ｆ、Ｐｉｉｒｍａ によって編集）３８３〜４１３頁にューヨーク、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓから１９８３年出版）に述べられている。陰イオン交換樹脂は？Ｉｏｎｏ　Ｑ 樹脂のような、Ｍｏｎｏｂｅａｄｓの商標（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌｓ）で入手される物質に基づくものであることが望ましい。

おおまかに上述したような粒度と孔度を特徴とする強陰イオン交換体の使用は、 例えばコーン分画■のペーストまたは粉末のようなＩｇＧ含有出発物質から、ガ ヅマグロブリン凝集体、抗補体活性、プレカリクレイン活性化因子活性、第ＸＩ Ｉ因子、プラスミンとプラスミノゲン活性、ＩｇＡならびにＩｇＭの除去を可能 にすることが判明している。従って、この方法は静脈内使用に耐え得るｒｇｃの 製造に寄与する。

例えばＭｏｎｏ　Ｑ樹脂のような微粒状４級及び３級強陰イオン樹脂の使用は次 の利点を提供する：１、良好な機械的安定性。

２、樹脂が溶離剤条件によって実質的に変形しない。

３、樹脂が粒度分布と孔度分布の点で限定された分散性を示す。

４、負荷能力が高い。

５、直線流速度が高く、機械的安定性が良好である等のために、再生が比較的容 易である。

６、単位時間あたりの分解能が大きい。

７、樹脂の機械的及び化学的安定性を損なうことなく、また分割と回収を不利に 損なうことなく、非常に多様な溶離剤組成物、流速及び温度の使用が可能。

８、保持時間と分離時間が短いために回収率が大きく、生物学的活性の損失が低 下する。

迅速で大規模な処理に適した性質を有する他の樹脂は、例えば八ｃｃｅ　Ｉ　Ｉ ＱＭＡ　（Ｄｉｏｓｙｎｔｈ、オランダ、オッス）と５ｐｈｅｒｏｓｉｌ　ＱＭ Ａ（Ｒｈｏｎｅ　Ｐｏｕｌｅｎｃ、フランス）のようなシリカを主成分とする樹 脂ならびに使用度は低いが、例えばＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ　Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ、スウェーデン、ウプサラ）のような高度に架橋したアガロース支持体を含む 。

本発明はまた、１ｇＧ含有物質からカリクレイン様エステラーゼ活性を除去する ために色素アフィニティクロマトグラフィを用いる方法をも提供する。この方法 は単独で、または上記陰イオン交換方法と組合せて用いることができる。

本発明のこの態様では、ＴｇＧ含有物質にマクロ孔質の機械的に安定なゲル支持 体に固定した蛋白質結合色素を接触させ、カリクレイン含有量の低い、精製した ＩｇＧ含有物質を回収する段階から成る、ｒｇｃ含有物質からカリクレイン様エ ステラーゼ、その他のプロテアーゼ酵素またはプロテアーゼチモーゲン活性を除 去する方法を提供する。

本発明はさらに、上記方法によって得られる精製ｒｇＧに及ぶ。

ｒｇｃ含有物質はコーン分画■製剤（任意に、上記陰イオン交換段階を予め受け されたもの）のようなＩｇＧ冨化吻質である。

陰イオン交換段階と色素アフィニティクロマトグラフィ方法との組合せは、この ようなＩｇＧ冨化製剤から良好な分割率でモノマー１ｇＧを迅速に分離して、静 脈色素アフィニティクロマヒグラフィは陰イオン交換方法の前に実施するのが好 ましい。

蛋白質結合色素は、典型的にはＰｒｏｃｉｏｎタイプ（ＩＣＩＡｕｓｔｒａｌｉ ａ　０ｐｅｒａｔｉｏｎｓ）のトリアジニ）Ｉｉ色素または、他の製造業者によ って製造されたこれの同等物であることが好ましい。色素アフィニティクロマト グラフィに用イルマトリックスもＦｒａｃｔｏｇｅｌ　（Ｍｅｒｃｋ、西ドイツ 。

ダルムシュタソト）、もしくはＴＳＫ　（東洋曹達）のようなその同等物、また はＴｒｉｓａｃｒｙｌ　（Ｒｅａｃｔｉｆｓ　１．Ｂ。

Ｆ、、フランス）もしくは同様な物質のような半固定マトリックスである。

色素アフィニティクロマトグラフィは多くの酵素及び蛋白質の精製に用いられて いる。一般にクロロトリアジンを主成分とする色素が用いられている。これらは アガロース、　５ｅｐｈａｄｅｘ、ビーズ化セルロース、金属ｒｏｎ、ガラス、 微粒状シリカ及びアガロース−アクリルアミド（１１１ｔｒａｇｅｌ）コポリマ ーを含む種々な支持体に共有結合している（Ｃ，Ｌｏｗ＋Ｊ、Ｐｅａｒｓｏｎ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ。

１０４　巻、　ハートＣ１９７〜１１３頁参照）。クロロトリアジン色素も実験 室規模の方法で血清蛋白質の精製または除去に用いられている。

最も一般的に用いられる色素マトリックスはアガロースに結合したＣ１ｂａｃｒ ｏｎ　Ｆ３ＧＡ（Ｃ４ｂａ　Ｇｅｉｇｙ）である。

Ｃ１ｂａｃｒｏｎ　Ｆ３ＧＡマトリックスは種々な血漿蛋白質の分画（Ｅ、Ｇｉ ａｎｕｚｚａ、Ｐ−Ａｉｎａｕｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、（１９８２）２０１ 巻。

１２９〜１３６頁）、他の血清蛋白質から血清アルブミンとリボ蛋白質の除去（ Ｊ、Ｔｒａｖｉｓ、Ｒ，Ｐａｎｎｅｌｌ、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｊｍ。

Ａｃｔａ（１９７３）４９巻、４９頁）、補体蛋白質の精製（Ａ、Ｇｅｅ等。

Ｊｊｍｍ、Ｍｅｔｈｓ（１９７９）３０巻、　１９頁）及びα２マクログロブリ ンの精製（Ｇ、Ｖｉｒｃａ等、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ　（１９７８）８９巻。

２７４頁）に用いられている。ブルーデキストラン（デキストランに結合した一 Ｃｉｂａｃｒｏｎ　Ｂ］ｕｅ　Ｆ３ＧＡ）は血清リボ蛋白質の精製（Ｌ、Ｗｉｌ ｌｅ、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、　（１９７６）７１巻、３５頁）、第Ｘ 因子の単離（Ｌ、Ｖｉｃｃａｎ、Ｇ、Ｔｉ５ｈｋｏｆｆ。

Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　（１９７６）　４３４巻、１９９ 頁）及び凝固箱■、第■、第■と第Ｘ因子の分離（Ａ、Ｓｗａｒｔ、　Ｈ，）Ｉ ｅｍｋｅｒ。

Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ（１９７０）２２２巻、６９２頁） に用いられている。アガロースに結合したＰｒｏｃｉｏｎ　Ｒｅｄ　（ＩＣＩＡ ｕｓｔｒａｌｉａ）は血清からプラスミノゲンの抽出に用いられている（Ｎ、Ｈ ａｒｒｉｓ、Ｐ、Ｂｙｆｉｅｌｄ、ＦＥＢＳ　Ｌｔｒｓ（１９７９）１０３巻。

１６２頁）に用いられている。

本発明の方法では、今までに用いられていない、Ｐｒｏｃｉｏｎシリーズ（ＩＣ Ｉ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ　０ｐｅｒａｔｉｏｎｓ）の色素のような他のトリアジ ン色素を、例えばＦｒａｃｔｏｇｅｌ、と７ｒｉｓａｃｒｙｌのような大規模／ 工業的プロセス規模の分離に適した、機械的に安定なゲルマトリックスに結合さ せて、ガンマグロブリン溶液からのカリクレイン様活性の除去に用いる。Ｆｒａ ｃｔｏｇｅｌは親水性ビニルポリマーから成り、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌはアクリル モノマーと二官能性の親水性モノマーとのコポリマーである。これらの支持体の 利点は次の通りである： ｉ　機械的安定性が大きい。

１１　ゲルマトリックスに対する蛋白質の特異的結合が一般に弱い。

ｉｉｉ　色素に対する結合力が高い〔通常、Ｆｒａｅｔｏｇｅｌまたは７ｒｉｓ ａｃｒｙｌの１ｄがＭＸシリーズからのＰｒｏｃｉｏｎ色素１０■と結合するが 、アガロース１ｄは色素２〜４■と結合するにすぎない（Ｃ，Ｌｏｗｅ、Ｊ、Ｐ ｅａｒｓｏｎ、Ｍｅ−ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ、１０４巻、パートＣ，９７〜 １１３頁）〕。

ｉｖ　微生物による分解に耐性がある。

Ｆｒａｃｔｏｇｅｌに結合した種々なＰｒｏｃｉｏｎ色素がガンマグロブリン製 剤中のカリクレイン様活性と結合することが判明している。ＩｇＧ製剤からカリ クレイン様活性を高度にアフイニテイ結合させるために適した色素の例は、Ｎａ ｖｙ　ＮＥＲ，Ｎａｖｙ　ＨＥＲＤ、　Ｒｅｄ　ＨＥ３Ｂ、　Ｒｅｄ　ＭＸ５Ｂ 。

Ｒｅｄ　ＭＸ８Ｂ、　５ｃａｒｌｅｔ　ＭＸ　ＧＲ及びＹｅｌｌｏｗ　ＭＸ　Ｇ Ｒである。

本発明に用いる色素アフィニティクロマトグラフィは、カリクレイン活性の除去 に対して、例えばベンズアミジンのような固定化基質の使用を凌駕する幾つかの 利点を有している。このような利点は大きい蛋白質結合力、低コスト、−ｉ的な 入手可能性、マトリックス材への結合の容易さ、細菌及び酵素による分解に対す る耐性ならびに低毒性を含んでいる。このことが色素アフィニティクロマトグラ フィを大規模な蛋白質精製に理想的なものにしている。

エタノールはコーン分画Ｈのペースト（２５％）の主要な成分である。従っ−６ 出発物質中のエタノール濃度は重要である。１０％までのエタノール濃度はイオ ン交換と色素アフィニティクロマトグラフィの両方による上記成分の分離に殆ん どまたは全く影響を存さないことが判明している。

本発明のイオン交換方法の典型的な例では、Ｍｏｎｏ　Ｑ樹脂を２０ｍＭ　Ｔｒ ｉｓ　Ｃ１ｐＨ８，０（緩衝液Ａ）、　６０ｍＭ　ＮａＣ１中で平衡化させる。

コーン分画■のペーストまたは粉末から製造したガンマグロブリン溶液をカラム に装入し、緩衝液Ａ　６０ｍＭ　ＮａＣ１によってカラムから落出させて、凝集 体を含まず、ダイマーガンマグロブリン含量が低く、抗補体活性が低く、ＩｇＡ 、ＩｇＭ、ＰＫＡ、第Ｘｌｌ因子、プラスミンまたはプラスミノゲン活性の検出 されないガンマグロブリン溶液を製造する。この製造はガンマグロブリンの高い 回収率で行われる。このアプローチは実施例１と３によって説明する。

本発明による色素アフィニティクロマトグラフィの典型的な方法はＦｒａｃｔｏ ｇｅｌ　ＴＳｔ（−ＨＷ５５　（Ｆ）またはＴＳＫ−）ＩＷ６５．　（Ｆ　）　 に結合したＹｅｌｌｏｉｙ　ＭＸ　ＧＲのようなＰｒｏｃｉｏｎ色素を用いる。

この色素アフィニティヵラムを緩衝液Ａ、、　６０ｍＭ　ＮａＣ１中で平衡化さ せる。コーン分画■のペーストまたは粉末から調製したガンマグロブリン溶液を カラムに装入し、カラムから緩衝液Ａ、　６０ｍＭ　ＮａＣ１により溶出させて 、カリクレイン活性の低下したガンマグロブリン溶液を製造する。ガンマグロブ リンの高い回収率とともに、カリクレイン様活性の９５〜７０％の低下が認めら れる。残留活性は既述のイオン交換方法によって除くことができる。この活性は ＰＫＡの存在によると思われる。このアプローチは実施例２によって説明する。

凝集体（トリマー以上）、抗補体活性、ＰＫＡ、第Ｘｌｌ因子、カリクレイン、 プラスミンとプラスミノゲン、ＩｇＡとＴｇＭを含まないガンマグロブリンの製 造は、本発明によって、色素アフィニティクロマトグラフイとイオン交換クロマ トグラフィとを組み合わせることによって達成される。１つの好ましい方法では 、ＹｅｌｌｏｗＭＸ−ＧＲ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　とＭｏｎｏ口樹脂全樹脂る。

この方法では、カラムを緩衝液Ａ、　６０ｍＭ　ＮａＣ１中で平衡化させる。

次に、ガンマグロブリン溶液を両力ラムに通し、緩衝液Ａ、　６０ｍＭ　ＮａＣ １によって溶出させて、上記性質を有するガンマグロブリン溶液を得る。クロマ トグラフィの好ましい順序としては、色素アフィニティ支持体でのクロマトグラ フィが低レベルの凝集体１ｇＧを生成させて抗補体活性を高めるので、色素アフ ィニティクロマトグラフィの次にイオン交換クロマトグラフィを配置する。この 抗補体活性はイオン交換方法によって除去される。さらに、アフィニティカラム から漏出する色素はイオン交換体によって除去される。

他のイオン交換樹脂（Ａｃｃｅｌｌ　ＱＭＡ、　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｏｗ　Ｑ）の 使用は実施例５，６と７によって説明する。使用可能な他の色素（Ｒｅｄ　Ｍ　 Ｘ　５　Ｂ）の使用は実施例４と６によって説明する。これらの実施例において 、色素は実施例２におけるよりも低い配位子密度で異なるマトリックス（Ｔｒｉ ｓａｃｒｙｌ　ＧＦ　２０００）に結合している。カリクレイン様活性の除去は この実施例ではあまり効果的でないが、ＩｇＧの回収率は大きい。

実施例１ コーン分画■のペーストのＭｏｎｏ　Ｑ処理ＬＣＣ５００マイクロプロセッサ− 、ＵＶＩ制御光学装置。

ＲＥＣ４８２２チヤンネルチヤートレコーダー、　Ｐ５００ポンプ２個、混合室 、ＭＶ７電動弁及び５０ｍ／スパーループがら成るＦＰＬＣ系（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ社製）でクロマトグラフィを実施した。緩衝液は全て、石英ガラス容器で蒸 溜し、Ｍｉｌｌｉ　Ｑ系（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製アメリカ、ミズーリ州。

ベッドフォード）を用いて脱イオン化した水を用いて調製した。緩衝液は全て脱 ガス化し、０．４５μｍ膜を通して濾過した。緩衝液化合物は全てＳｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃ、ａｌｓＣｏ、（アメリカ、ミシシソピ州、セントルイス）から入 手した。用いたイオン交換体はＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ１６／１０（Ｐｈａ−ｒｍａ ｃｉａ社製）であった。

Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ１６／１０　（カラム容積２０ｍ１）をＦＰＬＣ系に結合し 、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＣＩ　ｐＨ８，０（緩衝液Ａ）６０ｍＭ　ＮａＣ１中で 平衡化させた。コーン分画■のベース）　１０ｇを緩衝液Ａ、　６０ｍＭ　Ｎａ Ｃ１３０ｍｆ中に入れ、０．４５．ｃｒｍ膜を通して濾過した。濾過した溶液の 濃度は６５■／ｍｌであった。

この？容液１７ｍ１をＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ１６／１０カラムに、３．０ｍ／／分 の流量で装入した。装入後に、流量は背圧が３．５ＭＰａを超えないように、徐 々に６ｍ／／分まで上昇した。保持されない蛋白質を回収し、ＨＰＳＥＣによっ て分析し、蛋白質分解活性と抗補体活性を評価した。第１表では、Ｍｏｎｏ　Ｑ による処理前後のコーン分画■の溶液の性質を比較する。

（本頁以下余白） 第　１　表 コーン分画■溶液とＭｏｎｏ　Ｑ処理コーン分画■溶液の性質の比較 Ｍ’ｏｎｏＱ処理 コーン分画■　コーン分画■ 凝集体％　）１０ ダイマー％　）１　７　２ モノマー％　）　９２　９８ 抗補体活性　２　１１　＜２ （Ｃｌ３゜／ｍｇ／時） ＰＫＡ（Ｂ、０．Ｂχ参照２）　）　１３　０第ＸＩＩ因子発生ＰＫＡ　）　３ 　４　０（Ｂ、０．Ｂχ参照２）） プラスミン（ΔＡ４０５／分／ｍｇ）　）　３．４Ｘ１０−５　０プラスミノケ ン（ΔＡ４０５／分／ｍｇ））　４　９．５Ｘ１０−’　０カリクレイン　（Δ Ａ４０５／分／ｍｇ））　７．７Ｘ１０”’　５．６Ｘ１０−’ＩｇＧ回収率は ８３％ 第１表の脚注 １、ガンマグロブリン溶液中のＩｇＧ凝集体レベルは、６００　Ｘ　７．５　＊ ｍ　ＴＳＫ　Ｇ３０００ＳＷカラム（東洋曹達工業。

日本）での高性能サイズ排除クロマトグラフィ　（Ｈデータは全て、Ｍｏｄｅｌ 　Ｍ６０００Δ溶媒分配ポンプ、　０６にユニバーサルインジェクター、　Ｍｏ ｄｅｌ　Ｍ４５０可変波長デデクターとＭｏｄｅｌ　７３０　Ｄａｔａ　Ｍｏｄ ｕｌｅ（全てがＷａｔｅｒｓＡｓｓｏｃ、社製）を用いて集積した。クロマトグ ラフィは０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７，０によってｌｒｎ！／分の流速で実 施した。

２、抗補体活性はＷｅｉｒの方法（１９７８）に基づく微小力価プレート免疫溶 血方法（実験免疫学ハンドブック１巻、セクション５Ａ　３〜１３．第３版、　 １９７８年、　Ｂｌａｃｋ−ｗｅｌｌ）によって測定した。抗Ａ、抗体を含まな いヒトＡＢ血清のプールを補体とヘモリシンのソースとして用い、ヒツジ赤血球 の１．４％Ｖ／Ｖ　２．濁液（グループｉｉ）を溶血インジケータ系として用い た。ＩｇＧを補体４ＣＩ＋５゜単位とともに１時間インキュベートした。

結果は、存在するＩｇＧ１■あたりの、ＩｇＧとの１時間インキュベーションで 「消費された」　（すなわちもはや溶血反応に利用されない）補体単位として報 告する。

３、ＰＫＡ、この分析方法はＩｍａｎａｒｉ等１９７４の方法（Ｆｏｇｅｒｔｙ 　Ｉｎｔ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｐｒｏｃ、２７号、２０５〜２１３頁）に基づくもの である。この分析はプレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）がプレカリクレイン （ヒト血漿から抽出）をカリクレインに転化させる能力と、合成Ｍｉ３ＨＴＡＭ Ｅ　（トシルアルギニンメチルエステル）からの３Ｈメタノール発生によるカリ クレイン活性の監視とに依存する。結果は、生物学基準局（Ｂｕｒｅａｕ　ｏｆ 　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）製剤Ｉｇｃ　６０ｍｇ／）容液ｄ として表す。

第ＸＩＴ因子分解から発生するＰＫＡは、ＩｇＧサンプルをプレカリクレインと 硫酸デキストランの存在下で最初にインキュベートしくり、Ｌ、Ｔａｎｋｅｒｓ ｌｅｙ等の方法、　Ｂｌｏｏｄ（１９８３）６２巻、４４８真に基づ＜）、上記 方法を用いて硫酸デキストラン依存性ＰＫＡを決定することによって測定した。

４、プラスミンとカリクレイン活性は、それぞれ色素生産性基質５２２５１と５ ２３０３（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ、ストックホルム）とＣａｒｙのモデル１５ 分光光度計とを用いて分光測光的に測定した。

分析は全て、基質（１ｍＭ）　４０μ！とサンプルμｌとを含む反応量２０（ｌ ｕ＃によって５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　Ｃ１，５０ｍＭ　ＮａＣ１ｐＨ８，０（緩衝 液Ｃ）中で３７℃において実施した。２％酢酸８００μｌを添加して、反応を停 止した。

プラスミノゲン活性はストレプトキナーゼ２５０車位／ｄの存在下、３７℃にお いてサンプルを３０分間ブレインキュベートし、次にストレプトキナーゼ依存性 プラスミン活性を測定することによって測定した。

実施例２ コーン分画■のペーストのＹｅｌｌｏｗ　ＭＸ　ＧＲ−Ｆｒａｃｔｏｇａｌ処理 ＩＣＩ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ社から入手したＹｅｌｌｏｗ　’ｒＩＸ　ＧＲ，ジ クロトリアジン色素（以下では色素と呼ぶ）を次のように、Ｆｒａｃｔｏｇａｌ 支持体に結合させた：水１０−に溶かした色素０．１５ｇを加えた水３０＋ｎＺ 中に、生重量で１０ｇのゲルを懸濁させた。５Ｍ　ＮａＣ１４−を加え、混合物 を室温において攪拌しながら、１時間インキュベートした。５　Ｍ　ＮａＯＨＯ ，１２５＋ｎＺを加え、３０℃において撹拌しながら、インキュベーションを２ 時間続けた。この結合方法後に、色素−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ支持体を２〜５倍量 の６Ｆ尿素、０．５Ｍ　ＮａＯＨで洗浄し、次に水で完全に洗浄した。

７−量のＹｅｌｌｏｗ　ＭＸ　ＧＲ−ＦｒａｃｔｏｇａｌカラムをＰｈａｒｍａ ｃｉａ社製のＨＲ１０／１０カラム中に用意した。これを実施例１に述べたＦＰ ＬＣ系に結合させ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＣＩ　ｐＨ８，０（緩衝液Ａ）６０ｍ Ｍ　ＮａＣ１中に平衡させた。ペースト２ｇを緩衝液Ａ、　６０ｍＭ　ＮａＣ１ ６−中に入れ、０．４５μｍ膜を通して濾過した。濾過した溶液の深度は５０■ ／ｄであった。この溶液３．５　ｍ／を色素カラム中に１．０ｍｆｆ／分の流量 で装入した。この装入後に、背圧が０．７ＭＰａ（１００Ｐｓｉ）を超えないよ うに流量を２．Ｏｎ／／分に高めた。保持されない蛋白質を回収した。この保持 されない蛋白質は装入した全蛋白質の８７％を含んだ。この溶液をＨＰＳＥＣで 分析し、抗補体活性と蛋白質分解酵素活性を評価した。第２表では、コーン分画 ■の溶液の性質と色素カラム処理したコーン分画■の性質とを比較する。

第　２　表 コーン分画■溶液とＹｅｌｌｏｉｙ　ＭＸ−ＧＲ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ処理コー ン分画■との比較 色素処理した コーン分画■　コーン分画■ 凝集体％　１１ ダイマ一％　７　１０ モノマー％　９２８９ ＡＣＡ（Ｃ）ｉｓａ／分／ｍｇ）　Ｉ　１　１９ＰＫＡ（Ｂ、０．Ｂχ参照２） 　１７　７第Ｈ１因子（Ｂ、０．Ｂ″Ａ参照２）５３ＴＩＥ　Ｍデキストラン依 存性ＰＫＡ プラスミン（ΔＡ４０５／分／ｍｇ）　０　０プラスミノケン（Δ八４０５／分 ／ｍｇ）　１．７３　Ｘ　１０−’　１．９１　Ｘ　１０−’カリクトイン（Δ ４４０５／分／ｍｇ）　７．９３Ｘ１０−’　２．４５Ｘ１０−’ＩｇＧ回収率 は８７％であった。

パラメータの説明は表１の脚注を参照のこと。

実施例３ コーン分画ＨのペーストのＭｏｎｏ　Ｑ、　Ｙｅｌｌｏｉｙ　ＭＸＧＲ−Ｆｒａ ｃｔｏｇａｌ処理 Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ１６／１０＋　Ｙｅｌｌｏｗ　ＭＸ　ＧＲ−Ｆｒａｃｔｏｇ ａｌカラム（色素−Ｆｒａｃｔｏｇａｌ　７−をＰｈａｒｍａｃｉａ製ＨＲ１０ ／１０カラムに充填）を連続的に結合して、サンプルをＭｏｎｏ　Ｑカラムに装 入すると、保持されない蛋白質が直接、色素−Ｆｒａｃｔｏｇａｌカラムに通過 するようにした。カラムを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＣＩ　ｐＨ８，０（緩衝液Ａ） 、　６０ｍＭ　ＮａＣ１中で平衡化させた。コーン分画■ベース）　１０ｇを緩 衝液Ａ。

６０ｍＭ　ＮａＣ１３０ｍ！中に加え、０．４５μｍ膜を通して濾過した。濾過 した溶液の密度は６５ｍｇ／−であった。この溶液をカラムに装入した。初期流 速は２ｍｌ／分であったが、装入中に背圧を３．５ＭＰａ未溝に保つために０． ５ｄ／分に減少した。装入後には背圧が低下した場合に、流速を再び２ｍｌ／分 に戻した。保持されない蛋白質を回収した。保持されない蛋白質溶液は装入した 全蛋白質の７０％を含有した。この溶液をＨＰ　Ｓ　Ｅ　Ｃで分析して、抗補体 活性と蛋白質分解酵素活性とを評価した。第３表では、コーン分画■の溶液とＭ ｏｎｏ　Ｑ−色素処理コーン分画■の性質を比較する。

（本頁以下余白） 第　３　表 コーン分画■溶液と、Ｍｏｎｏ　Ｑ−色素処理コーン分画■との比較 ＭｏｎｏＱ−色素処理 コーン分画■　コーン分画■ 凝集体％　１゜ ダイマー％　７２ モノマー％　９２９８ 八ＣＡ（Ｃ）Ｉｓｏ／分／ｍｇ）　ＬＬ　＜２ＰＫＡ（Ｂ、０．Ｂχ参照２）　 ３．　０第ＸＩＩ因子（Ｂ、Ｏ，Ｂχ参照２）４０−硫酸デキストラン依存性Ｐ ＫＡ プラスミン（Δ八４０５／分／ｍｇ）　３．４　Ｘ　１０−’　０プラスミノケ ン（ΔＡ４０５／分／ｍｇ）　９．５　ｘ　１０−　’　０カリクレイシ（ΔＡ ４０５／分／ｍｇ）　７．７　Ｘ　１０−’　ＯＩｇＧ回収率は７０％であった 。

パラメーターの説明は表１の脚注参照のこと次の実施例では、コーン分画Ｈのペ ーストと２０ｍＭＴｒｉｓ／ＣＩ、　６０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐ）（８，０緩衝液 を１＝４の比で混合して、最終蛋白質濃度５４■／ｄにすることによって出発物 質を調製した。樹脂を全て１０−カラムに充填して、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／Ｃ１ −、６０ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ８，０中で予め平衡化させた。

実施例４ コーン分画■の溶液のＲｅｄ　ＭＸ５Ｂ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ処理Ｒｅｄ　ＭＸ 処理Ｒｅ族例２に述べた方法によって、Ｔｒｉｓａ−ｃｒｙｌ　ＧＦ　２０００ に結合させた。但しこの実施例では、湿ったゲル］、Ｏｇ対色素０．０５ｇの比 を用いた。

コーン分画■の溶液１０ｒｎｌを１ｍｌ／分の速度でカラムに装入した。保持さ れないピークを回収したが、これは装入した全蛋白質の９５％を含有した。出発 物質とＲｅｄＭＸ５Ｂ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ処理物質を性質のいくつかを第４表 で比較する。

実施例５ コーン分画■溶液のＡｃｃｅｌｌ叶Ａ処理コーン分画■溶液４．３−をＡｃｃｅ ｌｌ　ＱＭＡカラムに２ｍ１Ｚ分の流速で装入した。保持されないピークを回収 したところ、装入した全蛋白質の９５％を含有した。出発物質とＡｃｃｅｌｌ　 ＱＭＡ処理物質の性質の幾つかを第４表で比較する。

実施例６ 結合したＲｅｄ　ＭＸ５Ｂ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、　Ａｃｃｅｌｌ　ＱＭＡによ る処理 実施例４から保持されないピーク１ｏ−をＡｃｃｅｌｌ　ＱＭＡカラムに２ｍ／ ／分で装入した。結合段階からの回収率は８７％と計算された。出発物質と色素 −Ａｃｃｅｌｌ　ＱＭＡ処理物質の性質の幾つかを第４表で比較する。

実施例７ コーン分画■熔液のＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ　Ｑの処理コーン分画■溶液５ｍｌをＦ ａｓｔ　Ｆｌｏｗカラムに１ｍＺ／分で装入した。保持されないピークを回収し たところ、全蛋白質の８４％を含有した。出発物質とＦａｓｔ　Ｆｌｏｉｖ　Ｑ 処理物質の性質の幾つかを第４表で比較する。

（本頁以下余白） 第　４　表 実施例４〜７からのデータの要約 車６０ｍｇ／ｍ／溶液として標準化 分析方法の説明に関しては表１の脚注参照実施例８ コーン分画■のペースト１　ｋｇを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＣＩ−、６０ｍＭ　Ｎ ａＣ１ｐＨ８，０緩衝液１．５りに溶かして濾過した。

濾液を３００＋ｒ／　Ｙｅｌｌｏｗ　ＭＸ　ＧＲ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌカラムと ＨＲ１６／１０　Ｍｏｎｏ　Ｑカラムに数回のバッチで通して処理した。

カラム溶出液をプールし、酸性化し、エタノールを除去し、蛋白質濃度を透析濾 過によって６％誓／νに調節した。次に溶液を無菌濾過し、ＩｇＧサブクラスと ＩｇＡ含有量について分析した。

第５表に見られるように、製剤中には全てのクラスのＩｇＧが許容できる濃度で 存在した。さらに、この溶液はＩｇＡの３種類の市販テストキットの中の２つの 検出レベル未満のＩｇＡ４Ｊを含有した（第６表）。しかし、２回の分析に見ら れた、３種類のキットの間で明らかに矛盾した値が得られたことの理由は、この 段階では不明である。

（本頁以下余白） 第　５　表 色素−Ｍｏｎｏｂｅａｄ処理ＩｇＧのＩｇＧサブクラス含量、市販Ｔ１ｇＧ静注 用装剤との比較 プロセス　ＩｇＧ１　ＩｇＧ；ｚ　ＩｇＧ３１ｇＧａバ、７チＡ　（１５，０＞ １５．６　＞１．８８　０．７６バソチＢ　（＞２３．５　＞１５．６　１．８ ８　０．７６＃　ＩｇＧ　６０ｇ／ＩｇＧ；容’Ｉｇ、　１　ｒ４’、　Ｍｉｌ ｅｓ　ＡＣＣＲＡサフ゛クラス分類キットにより分析 本実施例８に述べた通り （本頁以下余白） 第　６　表 色素−Ｍｏｎｏｂｅａｄ処理１ｇＧのＩ処理１量Ｇ市販）ｇＧ静注用裂剤と比較 ＩｇＡ濃度（μｇ／ｍ／’） ハツチ１　２２０　５］、０　１５０ ハツチ２　２７０　４１０　２５０ 本実施例８に述べた通り 国際調査報告 ｌＩＩｌｍｌｌｎＡ−１＾−”””””’ＰＣＴ／ＡＬＩ８６１０ＯＩＩＱＡＮ ＮＥＸ　ＴＯＴＨεＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　 ０ＮＵＳ　４５４６ＬｆｉＬ　ＷＯ７９００５４１ＡＵ　５１０３０／８５　ε Ｐ　１８６３６０　ＪＰ　６１１４５１２５　ＵＳ　４５９０００２ＥＮＤ　Ｏ Ｆ　ＡＮＮＥＸ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．次の工程： （ｉ）メゾ孔質面とマクロ孔質面とを有する微粒状強陰イオン交換樹脂上での免 疫グロブリンＧ含有物質の分画、及び （ｉｉ）前記樹脂からの溶出による精製ＩｇＧフラクションの回収 からなる、ＩｇＧ含有物質の精製方法。
2. ２．前記樹脂が微粒状４級または３級強陰イオン交換樹脂である請求の範囲第１ 項記載の方法。
3. ３．前記樹脂が３，５，１０，３０及び９０μｍの公称粒径を有し、粒径分布が 狭い、孔度分布も孔度＞１０ｎＭを基準にして狭いものである請求の範囲第１項 または第２項記載の方法。
4. ４．前記免疫グロブリンＧ含有物質がコーン分画ＩＩのペーストまたは粉末であ る請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の方法。
5. ５．前記陰イオン交換樹脂がＭｏｎｏＱ樹脂である請求の範囲第１項〜第４項の いずれかに記載の方法。
6. ６．請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の方法によって製造した精製Ｉ ｇＧフラクション。
7. ７．次の工程： （ｉ）機械的に安定な、マクロ孔質ゲル支持体上に固定化された蛋白質結合色素 に、ＩｇＧ含有物質を接触させ、 （ｉｉ）酵素とチモーゲンを含まないＩｇＧ含有物質を回収すること から成る、ＩｇＧ含有物質からカリクレイン様エステラーゼ、その他のプロテア ーゼ酵素またはプロテアーゼ・チモーゲン活性を除去する方法。
8. ８．前記ＩｇＧ含有物質が請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の方法に よって製造した精製ＩｇＧ分画である請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．前記ＩｇＧ含有物質がコーン分画ＩＩのペーストまたは粉末である請求の範 囲第７項記載の方法。
10. １０．前記酵素とチモーゲンとを含まないＩｇＧ含有物質を請求の範囲第１項〜 第５項のいずれかの方法によってさらに精製する請求の範囲第７項記載の方法。
11. １１．前記蛋白質結合色素がトリアジニル蛋白質結合色素である請求の範囲第７ 項〜第１０項のいずれかに記載の方法。
12. １２．前記トリアジニル色素がプロシオン（Ｐｒｏｃｉｏｎ）タイプの色素であ る請求の範囲第１１項記載の方法。
13. １３．前記色素をネイビーＨＥＲ，ネイビーＨＥＲＤ，レッドＲＥ３Ｂ，レッド ＭＸ５Ｂ，レッドＭＸ８Ｂ，スカーレットＭＸ　ＧＲ及びイエローＭＸ　ＧＲか ら或る群から選択する請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．前記ゲル支持体が半固体または固体マトリックスである請求の範囲第７項 〜第１３項のいずれかに記載の方法。
15. １５．前記マトリックスがフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）とその同等物ま たはトリスアクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ）材料から作成されたものである請求 の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．請求の範囲第７項〜第１５項のいずれかに記載の方法によって製造した、 カリクレイン，プラスミン及びプラスミノゲンを含まないＩｇＧ含有物質。