JP2012250945A - Fcレセプターの精製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決の手段】 陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にFcレセプターを含む溶液を添加して前記担体にFcレセプターを吸着させ、前記担体に吸着したFcレセプターを溶出液を用いて溶出させることで、Fcレセプターを精製する際に、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するFcレセプターを含む溶液および溶出液に尿素を含ませることで前記課題を解決する。
【選択図】 なし
Description
第一の態様は、
陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にFcレセプターを含む溶液を添加して、前記担体にFcレセプターを吸着させ、
前記担体に吸着したFcレセプターを溶出液を用いて溶出させる、
Fcレセプターの精製方法であって、
陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するFcレセプターを含む溶液および溶出液が尿素を含んでいる、前記精製方法である。
Fcレセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液から疎水クロマトグラフィー用担体を用いて精製することで、Fcレセプターを含む溶液を調製し、
陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にFcレセプターを含む溶液を添加して、前記担体にFcレセプターを吸着させ、
前記担体に吸着したFcレセプターを溶出液を用いて溶出させる、
Fcレセプターの精製方法であって、
陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するFcレセプターを含む溶液および溶出液が尿素を含んでいる、前記精製方法である。
本発明の精製方法において、溶出液で溶出した画分中のFcレセプターを定量するには、従来から知られている安定かつ効率的に定量できる方法の中から適宜選択すればよいが、ELISA法(酵素結合免疫吸着法)による分析方法が好ましい。
(1)ヒトFcレセプターFcγRIをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された大腸菌を2YT培地(Tryptone 16g/L、酵母エキス 10g/L、塩化ナトリウム 5g/L)に植菌し、OD660nm=3になるまで30℃で培養した。
(2)15℃に冷却後、IPTG(イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド)を終濃度0.05mmol/Lになるように添加し、さらに一晩培養した。
(3)培養液より菌体を回収後、抽出液(0.6% Triton X−100、0.02%デオキシコール酸ナトリウム、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L PMSF、0.3mg/mL リゾチーム、0.001% Benzonaseを含む20mmol/L Tris−HCl緩衝液(pH 8.0))に菌体を懸濁し、撹拌することで菌体内からタンパク質を抽出し、遠心分離により無細胞抽出液を調製した。
(4)1mLのTOYOPEARL Phenyl−650C(東ソー株式会社製)ゲルをオープンカラムに充填し、5mLの緩衝液A(6%硫酸アンモニウムを含む20mmol/L Tris−HCl緩衝液(pH 8.0))にてゲルを平衡化した。
(5)(3)で調製したヒトFcγRIを含む無細胞抽出液に、硫酸アンモニウムを終濃度6%となるよう添加したアプライ液10mLをゲルに添加し、10mLの緩衝液Aにより洗浄後、10%(w/v)グリセロールを含む20mmol/L Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)5mLによりヒトFcγRIを溶出することで、ヒトFcγRI粗精製溶液を得た。
(6)(5)のヒトFcγRI粗精製溶液を20mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)で透析後、尿素を終濃度2mol/Lとなるよう添加し、これをアプライ液とした。
(7)1mLのTOYOPEARL CM−650M(東ソー株式会社製)ゲルをオープンカラムに充填し、5mLの緩衝液A(2mol/L尿素を含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH 6.0))にてゲルを平衡化した。
(8)(6)で調製したアプライ液5mLを導入し、10mLの緩衝液Aにより洗浄後、2mol/L尿素および1mol/L NaClを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH 8.0)5mLによりヒトFcγRIを溶出した。溶出したヒトFcγRIの回収率を算出した結果、55%であった。また、粗精製溶液中におけるヒトFcγRIの全タンパクに対する割合(比活性)は4.5倍へと向上した。
実施例1(6)における20mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)で透析したヒトFcγRI粗精製溶液に添加する尿素の量を終濃度1mol/Lとし、実施例1(8)におけるヒトFcγRIを溶出させる緩衝液の組成を1mol/L尿素および1mol/L NaClを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH 8.0)とした他は、実施例1と同様の実験を行なった。結果、ヒトFcγRIの回収率は50%であり、粗精製溶液中におけるヒトFcγRIの全タンパクに対する割合(比活性)は3.2倍へと向上した。
実施例1(6)における20mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)で透析したヒトFcγRI粗精製溶液に尿素は添加せず、実施例1(8)におけるヒトFcγRIを溶出させる緩衝液の組成を1mol/L NaClを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH 8.0)とした他は、実施例1と同様の実験を行なった。結果、ヒトFcγRIの回収率は31%であり、粗精製溶液中におけるヒトFcγRIの全タンパクに対する割合(比活性)は3.0倍となった。
実施例1(6)における20mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)で透析したヒトFcγRI粗精製溶液に塩酸グアニジンを終濃度1mol/Lとなるよう添加し、実施例1(8)におけるヒトFcγRIを溶出させる緩衝液の組成を1mol/L塩酸グアニジンおよび1mol/L NaClを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH 8.0)とした他は、実施例1と同様の実験を行なった。結果、ヒトFcγRIの回収率は21%であり、粗精製溶液中におけるヒトFcγRIの全タンパクに対する割合(比活性)は1.5倍となった。
Claims (4)
- 陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にFcレセプターを含む溶液を添加して、前記担体にFcレセプターを吸着させ、
前記担体に吸着したFcレセプターを溶出液を用いて溶出させる、
Fcレセプターの精製方法であって、
陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するFcレセプターを含む溶液および溶出液が尿素を含んでいる、前記精製方法。 - Fcレセプターをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液から疎水クロマトグラフィー用担体を用いて精製することで、Fcレセプターを含む溶液を調製し、
陽イオン交換クロマトグラフィー用担体にFcレセプターを含む溶液を添加して、前記担体にFcレセプターを吸着させ、
前記担体に吸着したFcレセプターを溶出液を用いて溶出させる、
Fcレセプターの精製方法であって、
陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するFcレセプターを含む溶液および溶出液が尿素を含んでいる、前記精製方法。 - 陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するFcレセプターを含む溶液および溶出液に含まれる尿素の濃度がそれぞれ1mol/L以上である、請求項1または2に記載の精製方法。
- 請求項1から3のいずれかに記載の精製方法を用いた、Fcレセプター。
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JP2014125437A (ja) * | 2012-12-25 | 2014-07-07 | Tosoh Corp | Fc結合性タンパク質の精製方法および定量方法 |
JP2016183113A (ja) * | 2015-03-25 | 2016-10-20 | 東ソー株式会社 | Fc結合性タンパク質の精製方法 |
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