JP2021123538A

JP2021123538A - ヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液

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Publication number: JP2021123538A
Application number: JP2020015961A
Authority: JP
Inventors: 陽介寺尾; Yosuke Terao; 遼子渡邉; Ryoko Watanabe
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2020-02-03
Filing date: 2020-02-03
Publication date: 2021-08-30
Anticipated expiration: 2040-02-03
Also published as: JP7443794B2

Abstract

【課題】ヒトＦｃγＲＩＩＩａを沈殿させることなく安定に保存する保存溶液を提供する。【解決手段】ヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液をクロマトグラフィ用担体充填カラムにアプライし、当該担体にヒトＦｃγＲＩＩＩａを吸着させる工程、溶出緩衝液を前記カラムにアプライし、担体に吸着したヒトＦｃγＲＩＩＩａを溶出させる工程と、該ヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む画分を回収する工程を含み、回収したヒトＦｃγＲＩＩＩａを保存溶液に３％（ｗ／ｖ）から４５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含ませるヒトＦｃγＲＩＩＩａの安定化方法。【選択図】なし

Description

本発明は、ＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液に関する。特に本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを沈殿させることなく保存可能な、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液に関する。

Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の認識ドメインによって認識している。これによって、免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる。Ｆｃレセプターは、さらにいくつかのサブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであるＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある。また各レセプターは更に細かく分類されており、Ｆｃγレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。

Ｆｃγレセプターの中でも、ＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの細胞表面に存在しており、ヒト免疫機構の中でも重要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に関与している重要なレセプターである。このＦｃγＲＩＩＩａとヒトＩｇＧとの親和性は結合の強さを示すＫ_Ｄ値が１０^−７Ｍ以下であることが報告されている（非特許文献２）。また、抗体の糖鎖構造の違いにより、ＦｃγＲＩＩＩａと抗体との結合性が異なることが知られている（非特許文献３）。

天然型のヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０８６３７）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中の番号はアミノ酸番号を示しており、その番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２０９番目のバリン（Ｖａｌ）から２２９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２３０番目のリジン（Ｌｙｓ）から２５４番目のリジン（Ｌｙｓ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なおＦｃγＲＩＩＩａはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるヒトＩｇＧサブクラスのうち、特にＩｇＧ１とＩｇＧ３に対し強く結合する一方、ＩｇＧ２とＩｇＧ４に対する結合は弱いことが知られている。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａは抗体の糖鎖構造を認識するため、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤は、抗体をその糖鎖構造に基づく結合性の違いにより分離できる（特許文献１および２）。抗体の糖鎖構造は、抗体医薬品における薬効や安定性に大きく関与するため、抗体医薬品を製造する際に糖鎖構造を制御することは極めて重要である。このため前記吸着剤は、抗体医薬品製造時の工程分析や分取に有用である。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードする遺伝子を挿入した遺伝子組換え大腸菌を培養し、得られた培養液を陽イオン交換クロマトグラフィに供することで、高純度かつ高効率に製造できる（特許文献３）。しかしながら、特にアミノ酸置換によりアルカリ耐性を向上させたヒトＦｃγＲＩＩＩａにおいて、前記クロマトグラフィの溶出画分に含まれるヒトＦｃγＲＩＩＩａが沈殿してしまう問題があった。

特開２０１５−０８６２１６号公報特開２０１６−１６９１９７号公報特開２０１６−１８３１１３号公報

Ｔａｋａｉ．Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８−３２６，２００５Ｊ．Ｇａｌｏｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８−１９３２，１９９７Ｃ．Ｌ．Ｃｈｅｎ等，ＡＣＳＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１２，１３３５−１３４５，２０１７

本発明の課題は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（特にアミノ酸置換によりアルカリ耐性を向上させたヒトＦｃγＲＩＩＩａ）を、沈殿させることなく安定に保存可能なヒトＦｃγＲＩＩＩａの安定化方法および保存溶液を提供することにある。

前記課題を解決するために鋭意検討した結果、ヒトＦｃγＲＩＩＩａに終濃度３％（ｗ／ｖ）から４５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含ませることで、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの沈殿が生じないことを見出し、本発明の完成に至った。

すなわち、本発明は以下の［１］から［４］に記載の態様を包含する。

［１］
ヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液であって、３％（ｗ／ｖ）から４５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含む、前記保存溶液。

［２］
ヒトＦｃγＲＩＩＩａと３％（ｗ／ｖ）から４５％（ｗ／ｖ）のグリセロールとを接触させる工程を含む、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの安定化方法。

［３］
ヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液をクロマトグラフィ用担体充填カラムにアプライし、当該担体にヒトＦｃγＲＩＩＩａを吸着させる工程と、
溶出緩衝液を前記カラムにアプライし、前記担体に吸着したヒトＦｃγＲＩＩＩａを溶出させる工程と、
溶出したヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む画分を回収する工程と、
回収した画分を保存する工程とを含む、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの製造方法であって、
保存する工程を［１］に記載の保存溶液で保存する、前記製造方法。

［４］
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドである、［１］に記載の保存溶液。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１９９番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１９９番目までのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明のヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液に終濃度で３％（ｗ／ｖ）から４５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含ませることを特徴としており、当該溶液中に存在するヒトＦｃγＲＩＩＩａが沈殿するのを抑制できる。なおヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液に含ませるグリセロールを終濃度５％（ｗ／ｖ）から４０％（ｗ／ｖ）までの範囲とすると好ましい。

一態様として、未精製、粗精製または精製済のヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液に、前述した濃度のグリセロールを添加することでヒトＦｃγＲＩＩＩａを安定化することができる。
また別の態様として、後述する本発明のヒトＦｃγＲＩＩＩａの製造方法を実施する場合は、溶出緩衝液に前述した濃度のグリセロールを添加することで、溶出したヒトＦｃγＲＩＩＩａを安定化することができる。

ここで、「安定化」とはヒトＦｃγＲＩＩＩａの沈殿が生じにくいことを意味する。

本発明のヒトＦｃγＲＩＩＩａの製造方法では、クロマトグラフィ用担体充填カラムを用いた精製工程を含む。前記カラムにアプライする、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液の一例として、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドで形質転換した宿主（形質転換体）の培養液より粗精製したヒトＦｃγＲＩＩＩａ溶液があげられる。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現させるための宿主としては、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞に代表される動物細胞、バチルス属（ブレビバチルス属細菌やパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）や大腸菌に代表される細菌、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属に代表される酵母、麹菌に代表される糸状菌などが利用できる。中でも取扱いの簡便な大腸菌を宿主とすると好ましい。なお宿主が大腸菌の場合は、特開２０１２−０３４５９１号公報および特開２０１３−０８５５３１号公報に開示した方法等により、形質転換体を培養することでヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現させればよい。

前記形質転換体の培養液から、クロマトグラフィ用担体充填カラムにアプライする、粗精製したヒトＦｃγＲＩＩＩａ溶液を得るには、発現の形態によって適宜選択すればよい。例えば、発現したヒトＦｃγＲＩＩＩａが宿主細胞のペリプラズムに発現する場合は、培養液を遠心分離して得られる宿主細胞を適切な緩衝液で懸濁し細胞破砕（物理的破砕、薬剤による破砕など）後、遠心分離により破砕残渣を除去することで、発現したヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む無細胞抽出液を得ればよく、発現したヒトＦｃγＲＩＩＩａが宿主細胞のペリプラズムから培養上清に漏出する場合は、培養液を遠心分離して得られる培養上清から発現したヒトＦｃγＲＩＩＩａを回収すればよい。なお薬剤により宿主細胞を破砕する際は、例えば、特開２０１３−２５２０９９号公報に開示した方法や、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＰｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（タカラバイオ社製）等の市販の抽出試薬を用いて破砕するとよい。

本発明のヒトＦｃγＲＩＩＩａの製造方法で用いる、クロマトグラフィ用担体充填カラムは、当業者が通常タンパク質精製で用いるクロマトグラフィ用担体を充填したカラムであれば特に限定はなく、前記担体として、ゲル濾過クロマトグラフィ用担体、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体、陰イオンクロマトグラフィ用担体、疎水クロマトグラフィ用担体、アフィニティクロマトグラフィ用担体が例示できる。中でも陽イオン交換クロマトグラフィ用担体が、本発明の製造法におけるクロマトグラフィ用担体として好ましい。

陽イオン交換クロマトグラフィ用担体は、カルボキシメチル基、スルホプロピル基、スルホン酸基といった陽イオン交換基を担体に導入したものであれば特に限定はなく、具体例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＣＭ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＳＰ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＧｉｇａＣａｐＳ−６５０（以上、東ソー製）、ＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）があげられる。なお、前記陽イオン交換クロマトグラフィ用担体を用いて、本発明の精製方法を実施する際は、前記担体へのヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液（アプライ液）の添加量や、前記担体のタンパク吸着性能等によって決定した量の担体を、適切なオープンカラム等に充填して行なえばよい。また、前記陽イオン交換クロマトグラフィ用担体は、アプライ液を添加する前に、あらかじめ、適切な緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、リン酸塩緩衝液等）で平衡化するとよい。

本発明のヒトＦｃγＲＩＩＩａの精製方法を、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体充填カラムを用いて行なう場合の具体例を以下に示す。
（Ｉ）前述した方法で得られた粗精製ヒトＦｃγＲＩＩＩａ溶液を、あらかじめ平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィ用担体充填カラムにアプライし、前記担体にヒトＦｃγＲＩＩＩａを吸着させる。
（ＩＩ）塩化ナトリウムを含む洗浄液を前記カラムにアプライし、夾雑タンパク質を除去する。
（ＩＩＩ）溶出緩衝液を前記カラムにアプライし、前記担体に吸着したヒトＦｃγＲＩＩＩａを溶出させる。溶出緩衝液としては前記洗浄液よりも高い塩化ナトリウムを含む緩衝液を用いればよい。また溶出緩衝液に終濃度３％（ｗ／ｖ）から４５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含ませてもよい。
（ＩＶ）溶出したヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む画分を回収し、保存する。なお（ＩＩＩ）でグリセロールを含まない溶出緩衝液で溶出させた場合は、前記画分に終濃度３％（ｗ／ｖ）から４５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含ませてから保存する。

本発明におけるヒトＦｃγＲＩＩＩａの一例として、以下の（ｉ）から（ｖ）のいずれかに記載のポリペプチドがあげられる。
（ｉ）配列番号１に記載の天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列のうち、細胞外領域（図１ではＥＣ領域）の一部である、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド；
（ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１９９番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド；
（ｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１９９番目までのアミノ酸配列に対して８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、の相同性を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。

前記（ｉｉ）および（ｉｖ）における、「１もしくは数個」とは、例えば、１から３０個、１から２０個、または１から１０個（１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個）を意味してよい。

前記（ｉｉ）の一例として、特開２０１５−０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、特開２０１６−１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、特開２０１７−１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、特開２０１８−１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、およびＷＯ２０１９／０８３０４８号で開示のＦｃ結合性タンパク質があげられる。

中でも前記（ｉｉｉ）から（ｖ）のいずれかに記載のポリペプチドは、溶液中で凝集／沈殿しやすい点で、本発明におけるヒトＦｃγＲＩＩＩａの好ましい態様である。なお前記（ｉｉｉ）から（ｖ）に記載の、配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ（この表記は、配列番号１の２１番目のグルタミン酸がグリシンに置換されていることを表す、以下同じ）、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ３３Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｌｙｓ４０Ｇｌｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ａｓｎ５６Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏ、Ｔｙｒ７４Ｐｈｅ、Ｐｈｅ７５Ｉｌｅ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ｔｈｒ８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１１９Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ａｓｐ１２２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３２Ａｒｇ、Ｔｈｒ１４０Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１４１Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌ、Ｔｙｒ１５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｖａｌ１７６Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７８Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１８４Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１８５Ａｌａ、Ａｓｎ１８７ＡｓｐおよびＩｌｅ１９０Ｖａｌのアミノ酸置換を有するアミノ酸残基である。

なお、本発明の保存溶液には終濃度０．５Ｍ以上、好ましくは０．８Ｍ以上、１．５Ｍ以下、好ましくは１．０Ｍ以下となるように塩（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム等）が含まれてよく、ｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．５前後となるよう塩基（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）が含まれてよい。

本発明はヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液として、３％（ｗ／ｖ）から４５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含んだ溶液を用いることを特徴としている。本発明により、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを沈殿させることなく、溶液中で安定に保存できる。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造を示す図。

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は前記例に限定されるものではない。

実施例１ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ）の製造（その１）
（１）ＷＯ２０１９／０８３０４８号に記載の方法で作製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を発現する形質転換体を、２Ｌのバッフルフラスコに入った１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。なおＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までが改良ＰｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔＮｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチドであって、ただし６番目のプロリンをセリンにアミノ酸置換したオリゴペプチド）であり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基であり、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ３３Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｌｙｓ４０Ｇｌｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ａｓｎ５６Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏ、Ｔｙｒ７４Ｐｈｅ、Ｐｈｅ７５Ｉｌｅ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ｔｈｒ８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１１９Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ａｓｐ１２２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３２Ａｒｇ、Ｔｈｒ１４０Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１４１Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌ、Ｔｙｒ１５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｖａｌ１７６Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７８Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１８４Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１８５Ａｌａ、Ａｓｎ１８７ＡｓｐおよびＩｌｅ１９０Ｖａｌのアミノ酸置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列）であり、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。

（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよびカルベニシリン１００ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽（バイオット製）を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。

（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。

（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。

（５）組換え大腸菌の培養液より菌体を回収後、抽出液（１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭの硫酸マグネシウム、２５０Ｕｎｉｔ／ＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク製）、０．００５％（ｗ／ｖ）のリゾチーム、および０．５％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、菌体内に発現した前記タンパク質を抽出した。菌体抽出液から４℃で２０分間、１５，０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ抽出液を得た。

（６）（５）で得たＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ抽出液を、あらかじめ２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した１４０ｍＬの陽イオン交換クロマトグラフィ用担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＣＭ−６５０Ｍ、東ソー製）を充填したＶＬ３２×２５０カラム（メルクミリポア製）に流速１３ｍＬ／分でアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．４Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄することで、夾雑不純物を除去した。

（７）０．７Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを溶出した。溶出後のＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓは、濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように０．７Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈した。

（８）（７）で得られた、濃度１ｍｇ／ｍＬのＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ溶液に、塩濃度が０．８Ｍ以上になるように塩化ナトリウムを、ｐＨが８．５になるように水酸化ナトリウム水溶液を、終濃度５％（ｗ／ｖ）となるようにグリセロールを、それぞれ添加し、４℃で４日間保存した。

（９）（８）で保存後のＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ溶液の沈殿の有無を目視で確認した。

実施例２ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの製造（その２）
実施例１（８）で添加するグリセロール濃度を終濃度で２０％（ｗ／ｖ）とした他は、実施例１と同様な方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを精製し、保存後、沈殿の有無を確認した。

実施例３ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの製造（その３）
実施例１（８）で添加するグリセロール濃度を終濃度で４０％（ｗ／ｖ）とした他は、実施例１と同様な方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを精製し、保存後、沈殿の有無を確認した。

実施例４ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの製造（その４）
（１）実施例１（１）から（５）までと同様の方法でＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ抽出液を得た。

（２）実施例１（６）と同様の方法でＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ抽出液をカラムにアプライし、洗浄により夾雑不純物を除去した。

（３）溶出緩衝液として０．７Ｍの塩化ナトリウムおよび１０％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた他は、実施例１（７）と同様の方法でＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを溶出した。

（４）（３）で得られた、濃度１ｍｇ／ｍＬのＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ溶液に、塩濃度が０．８Ｍ以上になるように塩化ナトリウムを、ｐＨが８．５になるように水酸化ナトリウム水溶液を、それぞれ添加し、４℃で４日間保存した。なお前記塩化ナトリウムおよび水酸化ナトリウム水溶液添加による、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ溶液中のグリセロール濃度への影響は軽微である。

（５）実施例１（９）と同様な方法で沈殿の有無を確認した。

比較例１ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの製造（その５）
実施例１（８）でグリセロールを添加しない他は、実施例１と同様な方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを精製し、保存後、沈殿の有無を確認した。

比較例２ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの製造（その６）
実施例１（８）で添加するグリセロール濃度を終濃度で５０％（ｗ／ｖ）とした他は、実施例１と同様な方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを精製し、保存後、沈殿の有無を確認した。

比較例３ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの製造（その７）
実施例１（８）でグリセロールの代わりに、終濃度１０００ｍＭとなるようにスクロースを添加した他は、実施例１と同様な方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを精製し、保存後、沈殿の有無を確認した。

比較例４ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの製造（その８）
実施例１（８）でグリセロールの代わりに、終濃度８００ｍＭとなるようにＤ−ソルビトールを添加した他は、実施例１と同様な方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを精製し、保存後、沈殿の有無を確認した。

比較例５ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの製造（その９）
実施例１（８）でグリセロールの代わりに、終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）となるようにＴｗｅｅｎ２０（商品名）を添加した他は、実施例１と同様な方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを精製し、保存後、沈殿の有無を確認した。

沈殿の有無を確認した結果を表１に示す。グリセロールを添加して保存（実施例１から４および比較例２）すると、溶液中のヒトＦｃγＲＩＩＩａは安定し、沈殿は生じなかった。一方、未添加（比較例１）ならびにグリセロール以外の糖類（比較例３および４）または界面活性剤（比較例５）を添加して保存すると、溶液中のヒトＦｃγＲＩＩＩａが凝集し沈殿が生じた。

実施例５ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化担体による抗体吸着量の測定
（１）粒子径１０μｍの多孔質親水性ポリマー粒子表面に存在する水酸基をヨードアセチル基で活性化後、当該活性化担体に実施例１から４ならびに比較例２で製造したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓをそれぞれ反応させることで、ＦｃＲ３６ｉ固定化担体を得た。

（２）（１）で作製した固定化担体１ｍＬに対し５０％スラリーとなるよう、ＰＢＳ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）を添加した。

（３）作製したスラリーを均一化後、当該スラリー１００μＬ（固定化担体としては５０μＬ）をスピンカラム（コスモスピンフィルターＨ０．４５μｍ、ナカライテスク製）へ添加し、３０００ｒｐｍで１分間遠心することで、サクションドライの固定化担体を調製した。

（４）サクションドライの固定化担体にＰＢＳを１５０μＬ添加し、３０００ｒｐｍで１分間遠心した。本操作を３回繰り返すことで固定化担体を洗浄した。

（５）洗浄後の固定化担体にＰＢＳを１５０μＬおよび人免疫グロブリン（グロブリン筋注１５００ｍｇ／１０ｍＬ「ＪＢ」、日本血液製剤機構製）を６０μＬ順次添加し、２５℃にて２時間撹拌することで、固定化担体に免疫グロブリン（抗体）を吸着させた。

（６）（５）の吸着操作後、スピンカラムを３０００ｒｐｍで１分間遠心することにより未吸着の抗体を含んだ溶液とゲルを分離した。

（７）固定化担体にＰＢＳを１５０μＬ添加し、３０００ｒｐｍで１分間遠心した。本操作を３回繰り返すことで固定化担体を洗浄した。

（８）ゲルに５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を１５０μＬ添加し、３０００ｒｐｍで１分間遠心した。本操作を３回繰り返すことで固定化担体に吸着した抗体を溶出した。溶出液の吸光度を測定することで抗体の濃度を算出し、ＦｃＲ３６ｉ固定化担体への抗体の吸着量を求めた。

結果を表２に示す。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ保存溶液として終濃度５％（ｗ／ｖ）から４０％（ｗ／ｖ）のグリセロールを用いたとき（実施例１から４）、当該ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化した担体における抗体吸着量はそれぞれ担体１ｇあたり１０ｍｇと、保存したヒトＦｃγＲＩＩＩａが有する抗体結合能を維持していることがわかる。一方、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液として終濃度５０％（ｗ／ｖ）のグリセロールを用いたとき（比較例２）、当該ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化した担体における抗体吸着量は担体１ｇあたり１ｍｇ未満となり、保存したヒトＦｃγＲＩＩＩａが有していた抗体結合能が大幅に減少していた。以上の結果から、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液として添加するグリセロールは、終濃度として３％（ｗ／ｖ）から４５％（ｗ／ｖ）までがよいことがわかる。

Claims

ヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液であって、３％（ｗ／ｖ）から４５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含む、前記保存溶液。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａと３％（ｗ／ｖ）から４５％（ｗ／ｖ）のグリセロールとを接触させる工程を含む、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの安定化方法。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液をクロマトグラフィ用担体充填カラムにアプライし、当該担体にヒトＦｃγＲＩＩＩａを吸着させる工程と、
溶出緩衝液を前記カラムにアプライし、前記担体に吸着したヒトＦｃγＲＩＩＩａを溶出させる工程と、
溶出したヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む画分を回収する工程と、
回収した画分を保存する工程とを含む、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの製造方法であって、
保存する工程を請求項１に記載の保存溶液で保存する、前記製造方法。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドである、請求項１に記載の保存溶液。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１９９番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１９９番目までのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。