JP6802349B2 - アルカリ耐性が向上した変異型免疫グロブリン結合タンパク質 - Google Patents
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Description
[技術的課題]
そこで、本発明者らは、無作為突然変異法を利用して、アスパラギンの他に別の残基についても無作為に多様なアミノ酸に置換させることで、アルカリ耐性が向上したプロテインAリガンドを発明するために鋭意努力を傾けた結果、プロテインAのドメインA又はその機能的変異体において、18番目、36番目、43番目及び52番目からなる群から選ばれたいずれか一つ以上の位置におけるアミノ酸残基が突然変異すると、アルカリ耐性が向上した免疫グロブリン結合タンパク質を得られることを発見して、本発明を完成した。
前記の本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号2で定義されたタンパク質又はその機能的変異体において、18番目、36番目、43番目及び52番目になされた群から選ばれた、一つ以上の位置におけるアミノ酸残基が突然変異したことを特徴とする免疫グロブリンタンパク質を提供する。
A(Ala):アラニン;C(Cys):システイン;D(Asp):アスパラギン酸;E(Glu):グルタミン酸;F(Phe):フェニルアラニン;G(Gly):グリシン;H(His):ヒスチジン;I(IIe):イソロイシン;K(Lys):リジン;L(Leu):ロイシン;M(Met):メチオニン;N(Asn):アスパラギン;O(Ply)ピロリシン;P(Pro):プロリン;Q(Gln);グルタミン;R(Arg):アルギニン;S(Ser):セリン;T(Thr):トレオニン;U(Sec):セレノシステイン;V(Val):バリン;W(Trp):トリプトファン;Y(Tyr):チロシン。
a)免疫グロブリンを含む溶液を試料として提供する段階;
b)前記試料を前記の突然変異タンパク質又は多量体又はマトリックスと吸着させる段階;
c)前記クロマトグラフィーマトリックスを洗浄して、未結合の汚染物質を除去する段階;及び
d)前記マトリックスから標的分子を回収する段階を含むことができる。
好ましくは、試料に含まれている免疫グロブリンが、マトリックス上に存在するリガンドに吸着できる条件(例えば、pH、塩濃度等)を設定した後、試料の流れを十分に緩くしてマトリックスを通過させて、免疫グロブリンがマトリックスに十分に吸着されるようにする。
好ましくは、マトリックスの試料に使用された水溶液又はアルカリ製剤などを利用してマトリックスを洗浄して、未結合物質又は汚染物質を除去することを特徴とする。
a)標的化合物を含む溶液を試料として提供する段階;
b)前記試料を、前記の突然変異タンパク質又は多量体又はマトリックスを通過させて、標的化合物をマトリックス上のリガンドに吸着させる段階;
c)前記クロマトグラフィーマトリックスを洗浄して、緩く結合される物質及び未結合物質を除去する段階;及び
d)溶出剤を前記マトリックス上に通過させて標的化合物を溶出させる段階、を含む一つ以上の標的化合物が分離される方法、すなわち、クロマトグラフィー法を提供する。
本発明の“標的化合物”とは、アルカリ耐性が向上した変異型免疫グロブリン結合タンパク質によって精製されるタンパク質を意味し、好ましくは免疫グロブリンでもある。
本発明は、耐アルカリ性が向上され、多数のアルカリ洗浄に対する安定性が向上した抗体精製用免疫グロブリン結合タンパク質リガンド及びマトリックスを提供することができる。
改良のための組換え免疫グロブリンGのFcタンパク質製造
ヒトのIgG1からのFcポリペプチドをコードする配列は、NCBIサイトのBlastを通じて探して(GenBank accession no. Y14735)、コスモジンテック社(大田、韓国)に依頼して合成した。
pET-Fcプラスミドは、前記実施例<1−1>で収得したFc遺伝子を、pET29a(+)ベクター(Stratagene社、米国)のNdeIとXhoI制限酵素認識部位に挿入して製造した。詳しくは下記の通りである。
大腸菌BL21(DE3)の形質転換体を種菌培養するために、カナマイシン抗生物質が含有されたLB液体培地5mLが分注された50mLのコニカルチューブに接種した後、37℃、200rpmの条件で16時間振盪培養した。前記培養液を、LB液体培地200mLが分注された500mLの三角フラスコに、種菌培養液の1%(v/v)を接種した後、37℃、200rpmで振盪培養して、OD600=約0.6で、最終濃度が1mMになるようにIPTG(isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside)を添加して、37℃、200rpm、18時間の追加振盪培養をした。このフラスコ培養液を遠心分離(4℃、1,000rpm、30分)して菌体を回収した後、PBSバッファー(pH7.4)(イントロンバイオテクノロジー、韓国)10mLの溶液に懸濁して、4℃で、超音波破砕機で15分間破砕し、4℃、10,000rpmの条件で30分間遠心分離して、上澄み液だけを取った。ニッケル親和性レジンのNi-NTA Chelating AgaroseCL-6B(Incospharm社、韓国)1mLを充填したカラムに5mLの結合バッファー(20mM NaH2PO4、30mM NaCl、10mM Imidazole pH 7.4)を流して、前記の上澄み液2.5mLと結合バッファー5mLを混合した後、カラムに流した。洗浄バッファー(20mM NaH2PO4、30mM NaCl、20mM Imidazole pH 7.4) 5mLを流した後、溶出バッファー(20mM NaH2PO4、30mM NaCl、300mM Imidazole pH 7.4) 2.5mLを15mLのコニカルチューブに受けた。精製されたタンパク質は、PD10カラムを利用して脱塩を行った。
スタフィロコッカスアウレウス(Staphylococcus aureus)由来のプロテインAのAドメイン発現ベクター製作
スタフィロコッカスアウレウス(Staphylococcus aureus)由来のプロテインAの三番目のドメインのAドメイン遺伝子に、後に続くタンパク質精製を考慮してHQ tagを含めた遺伝子を、コスモジンテック社(大田、韓国)に依頼して合成した。
pBC-wAdプラスミドは、前記実施例<2−1>で収得したAドメイン遺伝子を、pBCKS(+)ベクター(Stratagene社、アメリカ)のNdeIとNotI制限酵素認識部位に挿入して製造した。詳しくは下記のように行った。前記実施例<2−1>で合成を通じて得たwAd遺伝子DNA産物を、制限酵素NdeIとNotIで切断した後、精製キット(QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen社、ドイツ)で精製して、これを挿入DNAに使用した。また、pBCKS(+)ベクターDNAを制限酵素NdeIとNotIで切断し、CIPで脱リン酸化したDNA断片をベクターDNAに使用した。前記の挿入DNAとベクターDNAを、T4 DNAリガーゼ(Roche社、ドイツ)を利用して、16℃で12〜16時間かけて接合(ligation)させた後、前記接合液を利用して、電気穿孔法(electroporation)で大腸菌DH5α菌株に形質転換を行った。前記菌株を20μg/mL濃度のクロラムフェニコール抗生物質を含有したLB寒天培地に塗抹して、37℃で一晩静置培養することにより、形質転換体を選別した。この形質転換体からプラスミドを分離して、挿入DNAの塩基配列を決定することにより、配列番号1の塩基配列を有する野生型Aドメイン遺伝子を含むpBC-wAdプラスミドを製造した。前記pBC-wAdプラスミドは、配列番号2で表示される野生型Aドメインタンパク質を発現する。
エラー誘発性重合酵素連鎖反応(error prone PCR)方法を利用したwAd改良
合成したwAd遺伝子の塩基配列に人為的に無作為で突然変異を誘発するために、エラー誘発性重合酵素連鎖反応を行うことにより、突然変異ライブラリを製造した。具体的な突然変異ライブラリの製造過程は次の通りである。エラー誘発性重合酵素連鎖反応は、Diversity Random Mutagenesis kit(クローンテック、アメリカ)を使用して、1000bp当たり1〜2個の突然変異が起こるように誘導し、PCR反応液の組成は、鋳型DNAとして1ngのpBC-wAdプラスミド、各10pmolのEP-Fプライマー(配列番号14)とT7プライマー(配列番号15)、40μM dGTP、Diversity dNTP mix、TITANIUM Taq polymeraseで、最終嵩は100μLに調製して行った。PCRはTakara PCR Thermal Cycler(タカラ、日本)を使用し、反応条件は、反応混合液を94℃で30秒間、前変性させ、変性を94℃で30秒、アニーリングを55℃で30秒、及び重合を68℃で3分間遂行する反応を16回繰り返した後、68℃で1分間、後重合させた。前記条件のエラー誘発性重合酵素連鎖反応を通じて得られたそれぞれの各変異wAd遺伝子のPCR産物を、制限酵素NdeIとNotIで切断し、QIAEX Gel Extraction Kit(キアゲン、ドイツ)を使用して精製した後、挿入DNAとして使用し、pBC-KS(+)プラスミドを制限酵素NdeIとNotIで切断して回収した3.4kbの大きさのDNA断片を、ベクターDNAに使用した。前記の挿入DNAとベクターDNAを、T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs、スウェーデン)を利用して16℃で16時間かけて接合させた後、前記接合液を利用して、電気穿孔法で大腸菌DH5α菌株の形質転換を行った。前記菌株を20μg/mL濃度のクロラムフェニコール抗生物質を含有したLB寒天培地に塗抹して、37℃で一晩、静置培養をすることにより、無作為突然変異ライブラリを製造した。
前記突然変異が誘発された変異wAd遺伝子が含まれている大腸菌DH5α形質転換体をクロラムフェニコール抗生物質が含有されたLB液体培地に600μLずつ分注した96ディープウェルプレート(バイオニア、韓国)に接種した後、37℃、280rpmの条件で18時間振盪培養した。具体的なタンパク質精製過程は、Promega HisLink(商標) 96 Protein Purification System(Promega社、アメリカ)を使用して行った。600μLの培養液に60μLのFastBreak(商標) Cell Lysis Reagent, 10X及びDNase I solutionを入れて45μLのHisLink(商標) Resinを各ウェルに装着させた後、100rpmの条件で30分かけて混合した。反応液と樹脂は、Filtrationプレートに移し、Vac-Man Vacuum Manifold(Promega社、アメリカ)を利用して、10秒間真空を加えてフィルタリングした。次に、250μLの洗浄バッファーを96ウェルに添加した後、10秒間真空を加えた。同じ方法で3回洗浄した。プレートに溶出バッファー(100mM HEPES、50mM Imidazole、pH7.5)を200μL添加して、10分間反応させた後、1分間真空を与えて、新たな96ウェルプレートに精製されたタンパク質を得た。
部位飽和突然変異(site-saturation mutagenesis)法を利用したwAd改良
追加的にアルカリ耐性を付与するために、実施例<3−2>で選ばれた6個のアミノ酸残基(N18、N23、N28、D36、N43、N52)に対して、部位飽和突然変異ライブラリを製造した。具体的には、18番目のアミノ酸が変異したライブラリを製造するために、pBC KS(+)ベクターに挿入されているAEP1(配列番号3)を鋳型として、18-Fプライマー(配列番号16)と18-Rプライマー(配列番号17)、pFU-x Reactionバッファー、10mM dNTP、pFU-x polymeraseで最終嵩は50μLに調製して行った。反応条件は、反応混合液を95℃で1分間、前変性させ、変性を95℃で50秒、アニーリングを53℃で50秒、及び重合を68℃で3分間行う反応を18回繰り返した後、68℃で10分間、後重合させた。前記条件のPCR産物を獲得して制限酵素DpnIで18時間処理し、精製キット(PCR purification Kit;コスモジンテック、韓国)で精製して、これを直ぐに電気穿孔法(electroporation)で大腸菌DH5α菌株に形質転換を行った。前記菌株を20μg/mL濃度のクロラムフェニコール抗生物質を含有したLB寒天培地に塗抹して、37℃で一晩、静置培養することにより、部位飽和突然変異ライブラリを製造した。
<3−2>で行われた同じ方法を利用してライブラリを探索した結果、wAd対比アルカリ耐性が向上した変異体に、AES(N23A)、AES(N23E)、AES(N23H)、AES(N23K)、AES(N23L)、AES(N23P)、AES(N23S)、AES(N23Y)、AES(N28G)、AES(N28R)、AES(N28F)、AES(N28I)、AES(N43L)が追加的に選抜された(図2)。
最終アルカリ耐性が向上したmAd変異体開発
<5−1>mAF遺伝子合成
前記実施例4で選抜された置換残基を参考にして、突然変異残基の位置に、最も残存活性が高かった残基をwAdに導入することを試みた。変異体でN18H/N23L/N28W/D36V/N43Y/N52S変異体をデザインして、mAF(配列番号9)と命名して、HQ tagを含む遺伝子をコスモジンテック社(大田、韓国)に依頼して合成した。
前記実施例<5−1>で収得したmAF遺伝子を、前記実施例<1−2>の方法と同じくpBC KS(+)ベクター(Stratagene社、アメリカ)にクローニングして、pBC-mAFプラスミドを製造した。前記pBC-mAFプラスミドは、配列番号10で表示されるmAFタンパク質を発現する。
前記実施例<1−3>と同じ方法でタンパク質精製をして、<実施例3>と同じ方法で時間によるアルカリ耐性を比較した(図3)。
mAF四量体のアルカリ耐性調査
実施例<5−3>の正確なアルカリ耐性の結果を確認するために、重合酵素連鎖反応を行うことにより、mAF遺伝子四量体を製造した。詳しくは下記のように行った。
大腸菌BL21(DE3)形質転換体を種菌培養するために、カナマイシン抗生物質が含有されたTB液体培地5mLが分注された50mLのテストチューブに接種した後、37℃、200rpmの条件で16時間振盪培養した。前記培養液を、TB液体培地500mLが分注された2000mLの三角フラスコに、種菌培養液の1%(v/v)を接種した後、37℃、200rpmで振盪培養し、OD600=約0.6で、最終濃度が1mMになるようにIPTG(isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside)を添加して、37℃、200rpm、18時間振盪培養した。このフラスコ培養液を遠心分離(4℃、10000rpm、30分)して、菌体を回収した後、PBSバッファー(pH7.4)(イントロンバイオテクノロジー、韓国)20mLの溶液に懸濁して、4℃で、超音波破砕機で30分破砕し、4℃、10,000rpmの条件で30分間遠心分離して上澄み液だけをとった。Ni NTA Chelating Agarose CL-6B(インコースパーム社、韓国)5mLを充填させたカラムに、25mLの結合バッファー(20mM NaH2PO4、30mM NaCl、10mM Imidazole pH7.4)を流して、前記の上澄み液20mLと結合バッファー40mLを混合した後、カラムに流した。洗浄バッファー(20mM NaH2PO4、30mM NaCl、20mM Imidazole pH7.4)25mLを流した後、溶出バッファー(20mM NaH2PO4、30mM NaCl、300mM Imidazole pH7.4)40mLを50mLのコニカルチューブに受けた。精製されたタンパク質は、PD10カラムを利用して脱塩を行った。
実施例<6−2>で精製した4mAFをNHS(N-hydroxysuccinimide)-activated sepharose 4 Fast flow(GE Healthcare社、スウェーデン)にカップリングした。製作された4mAFレジンを、アルカリ耐性が高いと知られた市販のレジンMabSelect Sure (GE Healthcare Life Scicences社、アメリカ)と、アルカリ耐性を比較した。Disposable columns(ThermoFisher社、アメリカ)にレジン100μlと5mLの0.5N NaOHを入れて密封した後、徐々に揺さぶりながらアルカリ処理を行った。一定時間後には、密封をなくし、NaOHを重力で流して除去した後、PBSバッファー(pH 7.4)(イントロンバイオテクノロジー、韓国)でレジンを5回洗浄した。2mg/mLのウサギ由来の精剤抗体(ヤングインフロンティア、韓国)5mLをレジンと混ぜて再び密封した後、徐々に揺さぶりながら3時間室温で結合反応させた。結合しなかった抗体タンパク質は重力で流して除去し、PBSバッファーで3回洗浄した。溶出バッファー(0.1M GlycineHCl、pH3.0)3mLを流して結合された抗体を分離した。分離された抗体は、中性化バッファー(1M Tris-HCl、pH8.5)300μlが含まれたチューブに全量を受けて、回収されたタンパク質の量を測定した。結合分析が終わった後には、溶出バッファーとPBSバッファーで交互に洗浄し、再び5mLの0.5N NaOHと混合して、追加的にアルカリ処理した。
Claims (13)
- 配列番号2で定義されたタンパク質において、36番目及び43番目からなる群から選ばれたいずれか一つ以上の位置におけるアミノ酸残基が突然変異したことを特徴とする免疫グロブリン結合タンパク質であって、
前記突然変異は、D36V及びN43Y/Lからなる群から選ばれたいずれか一つ以上であることを特徴とする免疫グロブリン結合タンパク質。 - N18H及びN52Sからなる群から選ばれたいずれか一つ以上のアミノ酸残基の突然変異を追加して含むことを特徴とする請求項1記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
- 前記タンパク質において、23番目及び28番目からなる群から選ばれたいずれか一つ以上の位置におけるアミノ酸残基突然変異を追加して含むことを特徴とする請求項1又は2記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
- 前記23番目の位置における突然変異は、N23T、N23A、N23E、N23H、N23K、N23L、N23P、N23S及びN23Yからなる群から選ばれ、前記28番目の位置における突然変異は、N28W、N28G、N28R、N28F及びN28Iからなる群から選ばれることを特徴とする請求項3記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
- 前記免疫グロブリン結合タンパク質は、配列番号9で定義されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項3記載の免疫グロブリン結合タンパク質。
- 請求項1記載の突然変異タンパク質単位を含み、反復単位を二つ以上含む多量体。
- ブドウ球菌プロテインAのE、D、A、B及びCドメインのうち、一つ以上を追加して含むことを特徴とする請求項6記載の多量体。
- 請求項1記載の免疫グロブリン結合タンパク質又は請求項6記載の多量体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項8記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項9記載のベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求項1記載の免疫グロブリン結合タンパク質を含む複数のリガンドが、固体支持体にカップリングされたクロマトグラフィー用マトリックス。
- 請求項1記載の突然変異タンパク質又は請求項6記載の多量体又は請求項11記載のマトリックスが使用される免疫グロブリンの単離方法。
- 請求項1記載の突然変異タンパク質又は請求項6記載の多量体又は請求項11記載のマトリックスの吸着によって液体から一つ以上の標的化合物が分離されるクロマトグラフィー法。
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